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肝脏病学
原文
酒精通过FoxO1在肝细胞中异常调控miR-148a，通过TXNIP过表达促进焦亡
  1. Mi Jeong Heo1，
  2. 金泰贤1，
  3. Jueng Soo You2，
  4. 迪莉娅Blaya3.，
  5. 加索尔Sancho-Bru3.，
  6. 金尚建1
  1. 1药学院药科研究所“，，首尔大学，首尔，大韩民国
  2. 2医学院生物化学系“，，建国大学，首尔，大韩民国
  3. 3.肝细胞可塑性与组织修复实验室“，，Institut d ' investigions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS)， Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticasy消化室(CIBERehd)，巴塞罗那、西班牙
  1. 对应到Sang Geon Kim博士，首尔国立大学药学院，首尔08826;sgk在{}snu.ac.kr

摘要

客观的酒精性肝病(ALD)是慢性肝病中导致死亡的主要原因。但其发病机制尚未完全确定。MicroRNAs (miRNAs)是肝脏疾病进展的关键因素。本研究探讨了ALD导致肝细胞丰富的miRNAs失调、其对肝细胞损伤的影响及其基础。

设计酒精性肝炎(AH)人类和动物肝脏样本和肝细胞被用于评估miR-148a水平。Pre-miR-148a使用慢病毒在体内特异性地传递到肝细胞。在细胞模型中进行免疫印迹、荧光素酶报告分析、染色质免疫沉淀和免疫荧光分析。

结果通过miRNA谱图和PCR分析，我们发现AH患者肝脏中的miR-148a显著降低。在Lieber-DeCarli酒精饮食或大量饮酒的小鼠中，miR-148a水平也显著降低。在培养的肝细胞和小鼠肝脏中，酒精暴露抑制叉头盒蛋白O1 (FoxO1)的表达，这与miR-148a水平相关，在人AH标本中显著降低。FoxO1被鉴定为转录因子MIR148Atransactivation。MiR-148a直接抑制硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达。因此，用乙醇处理肝细胞导致TXNIP过表达，激活NLRP3炎症小体和caspase-1介导的焦亡。这些事件被miR-148a mimic或TXNIP小干扰RNA转染逆转。肝细胞特异性传递miR-148a给小鼠可消除酒精诱导的TXNIP过表达和炎症小体激活，减轻肝损伤。

结论酒精通过FoxO1降低肝细胞中miR-148a的表达，促进TXNIP过表达和NLRP3炎症小体激活，从而诱导肝细胞焦亡。我们的发现为降低ALD的发病率和进展提供了新的靶点。

  • 饮酒导致的损伤
  • 炎症
  • 细胞死亡
  • 细胞信号传导

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2017-315123

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 在肝病进展过程中，过度饮酒会促进肝细胞功能障碍和死亡。

    • 包括miR-182、miR-155和miR-217在内的一组microRNAs (miRNAs)在酒精性肝病(ALD)中表现出异常升高。然而，下调的mirna很少被研究。

    • MiR-148a属于肝细胞中丰富的mirna，调控肝细胞分化。MIR148A基因受转录因子SREBP-1、MYB和p53调控。

    • 硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)与NLRP3相关，在非酒精性脂肪性肝病进展过程中激活炎症小体途径。

    新的发现是什么?

    • 在酒精性肝炎(AH)患者或乙醇喂养动物的肝脏中，MiR-148a水平失调。

    • 叉头盒蛋白O1被认为是一种未被识别的转录调节因子MIR148A在AH患者或动物模型中，其肝脏表达减少，降低miR-148a水平。

    • TXNIP被发现是miR-148a的直接靶标，并在ALD进展过程中过表达。

    • 酒精处理通过TXNIP过表达引起caspase-1介导的焦亡，这一事件被miR-148a转染逆转。一致地，miR-148a的肝细胞特异性传递可缓解酒精性肝损伤。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的研究结果表明，miR-148a通过抑制TXNIP改善酒精诱导的肝细胞炎症小体激活和焦亡，这为ALD治疗的新靶点和潜在策略提供了线索。

    简介

    过度饮酒会促进酒精性肝病(ALD)，如脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化到肝硬化，最后发展为肝细胞癌，这是所有慢性肝病中导致死亡的主要原因。在西方国家，酒精性肝炎(AH)合并肝硬化约占死亡率的50%。1由于中国和印度等其他国家的酒精消费量迅速增加，ALD的患病率在全球范围内也有所增加。2然而，由于患者特征不充分、诊断和预后措施差以及缺乏适当的药物，无法获得成功的治疗措施。了解ALD的发病机制和分子调控可能有助于开发良好的诊断标志物，以及预防和/或治疗方法。

    microRNAs (miRNAs)参与多种病理生理过程。包括miR-182、miR-155和miR-217在内的一组miRNAs显示ALD异常升高。3 - 5更重要的是，miRNA的减少及其靶细胞的过表达也可能是理解肝细胞死亡和疾病进展过程的关键。然而，miRNAs下调在ALD中的意义很少被探讨(除了miR-122的调控异常)。6本研究旨在鉴定一种肝脏特异性miRNA，它在ALD进展过程中与其靶标一起下调，并研究它们在决定肝细胞命运和潜在分子基础中的作用。

    酒精摄入和解毒过程对肝细胞有直接影响，如无菌危险信号、尿酸和细胞外ATP的释放。7受损肝细胞释放的信号激活多种炎症通路，促进ALD。8此外，AH患者的肿瘤坏死α和白细胞介素1 (IL-1)水平升高，9日10支持炎症反应是ALD进展的主要驱动力的假设。此外，肝细胞中的酒精代谢促进活性氧(ROS)的产生和线粒体功能障碍，使肝细胞对炎症细胞因子敏感。11日12除了免疫细胞介导的炎症外，肝细胞中也报道了炎症小体依赖性IL-1β的产生。13然而，饮酒是否促进肝细胞的炎症小体激活，如果是这样，对肝细胞命运的后果是什么，还没有被探索。

    在这里，我们报道了miR-148a在AH患者和实验动物模型中显著降低，并且miR-148a的异常调节促进硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)在肝细胞中的过表达，促进ALD中焦亡(一种依赖于caspase-1的程序性细胞死亡)。此外，我们发现叉头盒蛋白O1 (FoxO1)作为一个转录因子MIR148A基因表达和酒精抑制FoxO1表达的能力。使用两种不同的酒精喂养动物模型、基于细胞的测定和分子方法来评估miR-148a水平降低对肝细胞txnip介导的炎性小体激活和随后的细胞命运决定(即焦亡)的影响。最后，我们使用肝细胞特异性的体内miRNA传递系统来确认已确定的ALD发病机制。

    材料与方法

    AH患者肝脏样本

    AH肝样本取自巴塞罗那医院诊所肝脏部。AH患者和健康对照的临床特征已在前面描述过。3.

    动物治疗

    6 - 8周龄的雄性C57BL/6小鼠被随意喂食含有5% (vol/vol)乙醇(36%乙醇衍生卡路里)的Lieber-DeCarli饮食(dyts)或等热量液体饮食4-6周。狂饮酒精模型，胃插管给药乙醇(5 g/kg体重)，每天2次，连续7天，对照组给水。在体内miRNA传递实验中，小鼠通过尾静脉注射表达control或pre-miR-148a的慢病毒。

    染色质免疫沉淀试验

    染色质免疫沉淀(ChIP)检测按照EZ-ChIP检测试剂盒(Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York, USA)进行。分析步骤在网上有描述补充材料和方法．

    流式细胞分析

    使用FAM-FLICA体外Caspase-1检测试剂盒(ImmunoChemistry Technologie, Bloomington, Minnesota, USA)分析焦亡。分析步骤在网上有描述补充材料和方法．

    数据分析

    采用学生t检验或单向方差分析检验，必要时采用Bonferroni方法或Fisher 's Least significant Difference进行多重比较，以评估统计学上显著性差异。数据以均数±标准差表示。相关系数(r)由Pearson相关法确定。统计学意义的标准为P<0.05或P<0.01。

    更多详细信息在网上补充材料和方法．

    结果

    AH或ALD动物模型患者miR-148a的异常调节

    为了确定AH患者中miRNA失调的身份，我们首先分析了使用AH患者和正常肝脏样本(GSE59492)完成的miRNA微阵列谱。在本分析中，与对照组相比，AH患者的miR-148a水平显著下调(图1一个)．定量反转录PCR (qRT-PCR)检测证实miR-148a在人类AH样本中存在明显的调控异常(图1 b)．由于miR-148b和miR-152具有相同的种子序列，我们进一步检测了miR-148b和miR-152的水平，并没有发现miRNAs水平的变化补充图1A)．随意或胃内乙醇喂养的动物模型显著增强了对ALD发病机制的认识，尽管在临床特征的制作上存在一些局限性。14日15我们采用Lieber-DeCarli酒精饮食法和狂饮法。在这两个模型中，酒精喂养显著降低了肝脏中的miR-148a水平(图1 c)．同样，miR-148b和miR-152水平没有改变补充图1B)．我们证实了Lieber-DeCarli酒精饮食小鼠的肝细胞损伤和伴随的炎症(图1 d上)。肝脏miR-148a水平与血液生化参数(即血清谷丙转氨酶(ALT)活性和甘油三酯(TG)含量)变化相关(图1 d低)。用原代肝细胞或AML-12细胞获得的结果证实了酒精介导的MiR-148a失调(图1 e)．乙醇以剂量依赖的方式降低MiR-148a水平(50-200 mM, 48小时)(见在线补充图2A)．在随后的实验中，我们主要选择了100 mM乙醇处理(48小时)的条件。总的来说，我们的结果显示，ALD中miR-148a水平显著降低。

    Dysregulation of miR-148a in patients with AH or ALD animal models. (A) Expression heatmap of the significantly downregulated miRNAs in patients with AH (n=13) as compared with normal controls (n=6) (GSE59492) (fold change <0.5, P<0.01). (B) qRT-PCR assays for miR-148a in normal control or liver samples of patients with AH (n=6 or 12 each). Each point represents one sample, and the horizontal line indicates the mean value. (C) qRT-PCR assays for miR-148a in mouse liver samples. Mice were fed on either control diet or Lieber-DeCarli alcohol diet for 6 weeks (n=6 or 10 each) or received oral gavage of 5 g/kg body weight of alcohol two times daily for 7 days (n=7 each). Data were shown as box and whisker plot. Box, IQR; whiskers, 5–95 percentiles and horizontal line within box, median. (D) Liver histopathology (H&E, scale bar, 50 µm), blood biochemical parameters and correlations between miR-148a levels and serum ALT activities (or TG contents) using the same samples from the Lieber-DeCarli mouse model (n=6 or 10 each). (E) qRT-PCR assays for miR-148a in hepatocytes. Mouse primary hepatocytes or AML-12 cells were exposed to 100 mM ethanol for 48 hours (n=3 each). For (D) and (E), data represent the mean±SEM, **P<0.01. AH, alcoholic hepatitis; ALD, alcoholic liver disease; ALT, alanine aminotransferase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; H & E, hematoxylin and eosin; qRT, quantitative reverse transcription; TG, triglyceride.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    AH或ALD动物模型患者miR-148a的异常调节。(A) AH患者(n=13)与正常对照组(n=6)相比显著下调的miRNAs表达热图(GSE59492)(折叠变化<0.5,P<0.01)。(B)正常对照或AH患者肝脏样本中miR-148a的qRT-PCR检测(各n=6或12)。每个点代表一个样本，水平线表示平均值。(C)小鼠肝脏样本中miR-148a的qRT-PCR检测。小鼠喂食对照饮食或Lieber-DeCarli酒精饮食6周(n=6或10只)，或口服5 g/kg体重的酒精，每天两次，连续7天(n=7只)。数据以盒须图表示。盒子,差;须，5-95百分位和框内的水平线，中位数。(D)肝脏组织病理学(H&E，标尺，50µm)，血液生化参数和miR-148a水平与血清ALT活性(或TG含量)之间的相关性，使用Lieber-DeCarli小鼠模型的相同样本(n=6或10个)。 (E) qRT-PCR assays for miR-148a in hepatocytes. Mouse primary hepatocytes or AML-12 cells were exposed to 100 mM ethanol for 48 hours (n=3 each). For (D) and (E), data represent the mean±SEM, **P<0.01. AH, alcoholic hepatitis; ALD, alcoholic liver disease; ALT, alanine aminotransferase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; H & E, hematoxylin and eosin; qRT, quantitative reverse transcription; TG, triglyceride.

    FoxO1作为一种转录因子的鉴定MIR148A

    为了探索酒精降低miR-148a表达的分子机制，我们接下来使用K-mean聚类(K=4)分析了基因表达综合(GEO)数据集(GSE28619)，并提取了AH患者肝脏中下调的基因簇。其中，约有3310个下调基因比其他基因受到更多的抑制(图2一个左)。使用DAVID数据库进行基因本体分析，使我们能够找到参与“转录阳性调控”和“程序性细胞死亡抑制性调控”生物过程的分子。此外，利用STRING数据库进行网络分析，发现FoxO1作为核心分子，与上述两个过程中重叠的其他12个基因相互作用(图2一个右)。qRT-PCR检测证实调控异常FOXO1在人类AH肝脏样本中(图2 b)．在大量饮酒的小鼠的分析中，肝脏FoxO1转录水平下降(图2 c)．免疫印迹试验证实FoxO1蛋白在两种动物模型中均被抑制(图2 d)．作为比较评估，FoxO3a水平没有下降。

    Inhibition of FoxO1 in patients with AH or ALD animal models. (A) K-mean cluster and gene ontology analyses using the liver samples of patients with AH. FoxO1 was predicted as an inhibitor of alcohol-induced cell death among the most highly differentially expressed genes in GEO dataset (GSE28619). Blue, underexpression; red, overexpression (left). The genes were selected in the categories of two gene ontology pathways (P<0.05) associated with transcriptional regulation and programmed cell death (right). (B) qRT-PCR assay for FOXO1 in the liver of patients with AH (n=5 or 12 each). Each point represents one sample, and the horizontal line does the mean value. (C) qRT-PCR assay for FoxO1 in the liver of mice subjected to binge alcohol drinking (n=7 each). Data were shown as box and whisker plot. Box, IQR; whiskers, 5–95 percentiles and horizontal line within box, median. (D) Immunoblottings for FoxO1 and FoxO3a in the livers from the Lieber-DeCarli or binge alcohol animal models. AH, alcoholic hepatitis; ALD, alcoholic liver disease; Con, control; EtOH, ethanol treatment; FoxO1, forkhead box protein O1; GEO, Gene Expression Omnibus; mRNA, messenger RNA; qRT, quantitative reverse transcription.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    AH或ALD动物模型患者FoxO1的抑制作用(A)使用AH患者肝脏样本进行K-mean聚类和基因本体分析。在GEO数据集(GSE28619)中，FoxO1被预测为一种酒精诱导细胞死亡的抑制剂。蓝色,underexpression;红色，过度表达(左)。从与转录调控和程序性细胞死亡相关的两种基因本体论通路类别(P<0.05)中选择基因(右)。(B) qRT-PCR检测FOXO1在AH患者的肝脏中(n=5或12)。每个点代表一个样本，水平线代表平均值。(C) qRT-PCR检测FoxO1在酗酒小鼠的肝脏中(n=7只)。数据以盒须图表示。盒子,差;须，5-95百分位和框内的水平线，中位数。(D) Lieber-DeCarli或酗酒动物模型的肝脏中FoxO1和FoxO3a的免疫印迹。AH，酒精性肝炎;酒精性肝病;案子,控制;EtOH，乙醇处理;FoxO1，叉头盒蛋白O1; GEO, Gene Expression Omnibus; mRNA, messenger RNA; qRT, quantitative reverse transcription.

    为了寻找miR-148a调控异常与FoxO1水平下降的潜在机制，进行了相关性分析。在人类肝脏样本中，FOXO1与miR-148a水平高度相关(图3一)．在动物模型中也观察到这种正相关(图3 b)．然后，我们使用细胞模型，发现FoxO1的强制表达显著提高了miR-148a的初级和成熟形式的水平(图3 c)．之前的一项研究已经确定MIR148A基因转录起始位点。16验证FoxO1对MIR148A转录时，我们试图评估FoxO1结合MIR148A启动子。PROMO分析使我们能够预测人类−3 kb启动子区域内的三个假定的FoxO1结合位点MIR148A（图3 d上)。在ChIP检测中，FoxO1特异性结合在- 1546 bp至- 1535 bp区域的近端位点(RE3)，而不与其他位点(RE1和RE2)结合。FoxO1与DNA结合的特异性得到了PCR检测结果的支持，该PCR检测使用了针对不相关区域的非特异性引物(图3 d低)。FoxO1诱导转激活的能力MIR148A荧光素酶测定结果增强;FoxO1的下调显著抑制荧光素酶活性(图3 e)，这种影响在使用RE3突变结构的分析中完全被消除。所有这些结果都有力地证明FoxO1具有转录控制作用MIR148A表达式。

    Transcriptional induction of MIR148A by FoxO1. (A) Correlations between FOXO1 transcript and miR-148a levels in patients with AH. (B) Correlations between FoxO1 protein and miR-148a levels in ALD animal models. (C) qRT-PCR assays for primary or mature forms of miR-148a in AML-12 cells transfected with Mock or FoxO1. (D) ChIP assays for FoxO1 binding to the promoter regions of MIR148A. HepG2 cells were transfected with Mock or FoxO1 overexpression vector. DNA–protein complexes precipitated with anti-FoxO1 antibody were subjected to PCR amplifications using the primers flanking the indicated FoxO1 response elements (FoxO1-REs). IgG immunoprecipitation represents negative control. The specificity of FoxO1 binding was verified using the primers targeting an irrelevant region in the promoter. One-tenth of cross-linked lysates served as the input control. (E) MIR148A promoter reporter assays using FoxO1-RE3 WT or Mut luciferase constructs in HepG2 cells transfected with si Con or si FoxO1. For (C)–(E), data represent the mean±SEM (n=3 each, *P<0.05, **P<0.01). AH, alcoholic hepatitis; ALD, alcoholic liver disease; ChIP, chromatin immunoprecipitation; Con, control; EtOH, ethanol treatment; FoxO1, forkhead box protein O1; miRNA, microRNA; Mut, mutant; n.s., non-significant; qRT, quantitative reverse transcription; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    转录诱导MIR148AFoxO1。(A)之间的相关性FOXO1转录因子和miR-148a水平的变化。(B) ALD动物模型中FoxO1蛋白与miR-148a水平的相关性。(C)在Mock或FoxO1转染的AML-12细胞中，对miR-148a的初级或成熟形式进行qRT-PCR检测。(D) ChIP检测FoxO1结合到的启动子区域MIR148A．用Mock或FoxO1过表达载体转染HepG2细胞。用抗FoxO1抗体沉淀的dna -蛋白复合物进行PCR扩增，所用引物位于FoxO1反应元件(FoxO1- res)两侧。IgG免疫沉淀为阴性对照。使用针对启动子中不相关区域的引物验证了FoxO1结合的特异性。十分之一的交联裂解物作为输入对照。(E)MIR148A在转染了si Con或si FoxO1的HepG2细胞中，使用FoxO1- re3 WT或Mut荧光素酶构建子报告子进行检测。对于(C) - (E)，数据表示平均值±SEM (n=3， *P<0.05， **P<0.01)。AH，酒精性肝炎;酒精性肝病;ChIP，染色质免疫沉淀;案子,控制;EtOH，乙醇处理;FoxO1，叉头盒蛋白O1;microRNA, microRNA;傻瓜,突变体; n.s., non-significant; qRT, quantitative reverse transcription; WT, wild type.

    miR-148a调控异常导致乙醇诱导TXNIP过表达

    在确定了乙醇对miR-148a的抑制作用以及FoxO1在调控其转录中的作用后，我们接下来试图找到miR-148a调控的靶基因及其在酒精诱导的肝细胞死亡中的生理作用。由于肝脏miR-148a水平与血清ALT活性变化以及Lieber-DeCarli模型中的TG水平相关，我们使用Targetscan和DAVID数据库选择了脂质/糖代谢过程和程序性细胞死亡途径相关的候选基因。在这两种途径所涉及的分子中，我们重点研究了TXNIP，因为它在上述两个生物学过程中具有独特的重叠功能(图4一)．此外，在其他生物信息学数据库(PicTar, miRanda和DIANA-mirPath)的分析中，TXNIP被预测为miR-148a的假定靶点。的水平TXNIP在AH患者中似乎增加，但变化无统计学意义(图4 b上)。与miR-148a呈显著负相关TXNIP信使RNA (mRNA)水平(图4 b低)。为了验证患者样本中TXNIP蛋白水平的变化，我们另外使用了两组来自纤维化或肝硬化患者的不同肝脏样本，发现酒精诱导纤维化患者的TXNIP水平高于特发性纤维化患者(见在线)补充图3A)．在酒精性肝硬化患者中，TXNIP染色强度似乎与正常对照组相比没有变化，这可能是由于功能性肝细胞的大量损失(见在线)补充图3B)．在酗酒模型中，TxnipmRNA水平也被发现显著增强(图4 c)．然而，在Lieber-DeCarli模型中，这种效应在统计学上不显著。更重要的是，在两种模型中，肝脏中的TXNIP蛋白水平显著升高。此外，TXNIP在乙醇处理的原代肝细胞和AML-12细胞中均过表达(图4 d)，支持乙醇对肝细胞中识别的目标的直接作用。

    TXNIP overexpression as a result of miR-148a dysregulation by ethanol. (A) Gene ontology analysis of putative target genes of miR-148a using two selected gene ontology categories (programmed cell death and lipid/glucose metabolism pathways). (B) qRT-PCR assays for TXNIP in liver samples of patients with AH (upper). Each point represents one sample, and the horizontal line does the mean value. Correlations between miR-148a and TXNIP levels were analysed (lower). (C) qRT-PCR or immunoblotting assays for TXNIP in the liver samples from control or Lieber-DeCarli (n=6 or 10 each) and control or binge alcohol (n=7 each) mouse models. Data were shown as box and whisker plot. Box, IQR; whiskers, 5–95 percentiles and horizontal line within box, median. (D) Immunoblottings for TXNIP in the lysates of mouse primary hepatocytes or AML-12 cells treated with 100 mM ethanol for 48 hours. Band intensities represent values relative to respective control (control, 1). (E) qRT-PCR or immunoblotting assays for TXNIP in the lysates of AML-12 cells transfected with miR-148a mimic for 48 hours (left), or miR-148a ASO for 72 hours (right). (F) TXNIP-3′UTR luciferase activity assays using HEK293 cells transfected with control mimic or miR-148a mimic or HepG2 cells transfected with Con ASO or miR-148a ASO for 72 hours. (G) qRT-PCR or immunoblotting assays for miR-148a-modulated primary hepatocytes isolated from the mice that had been treated with binge alcohol for 7 days. For (D)–(G), data represent the mean±SEM (n=3 or 4 each, *P<0.05). ASO, antisense oligonucleotide; Con, control; EtOH, ethanol treatment; qRT, quantitative reverse transcription; n.s., non-significant; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    乙醇诱导miR-148a调控异常导致TXNIP过表达。(A)使用两个选定的基因本体类别(程序性细胞死亡和脂质/糖代谢途径)对miR-148a假定靶基因进行基因本体分析。(B) AH患者肝脏样本TXNIP的qRT-PCR检测(上)。每个点代表一个样本，水平线代表平均值。miR-148a与TXNIP水平分析(较低)。(C)在对照或Lieber-DeCarli(各n=6或10)和对照或酗酒(各n=7)小鼠模型的肝脏样本中进行TXNIP的qRT-PCR或免疫印迹检测。数据以盒须图表示。盒子,差;须，5-95百分位和框内的水平线，中位数。(D)用100 mM乙醇处理48小时的小鼠原代肝细胞或AML-12细胞的裂解物中TXNIP的免疫印迹。条带强度表示相对于各自对照的值(对照，1)。(E)转染miR-148a mimic 48小时(左)或miR-148a ASO 72小时(右)的AML-12细胞裂解液中TXNIP的qRT-PCR或免疫印迹试验。(F) txnick -3 ' utr荧光素酶活性测定，使用转染control mimic或miR-148a mimic的HEK293细胞或转染Con ASO或miR-148a ASO的HepG2细胞进行72小时。(G)对mir -148a调控的原代肝细胞进行qRT-PCR或免疫印迹检测，这些原代肝细胞是从狂饮酒精7天的小鼠中分离出来的。对于(D) - (G)，数据代表平均值±SEM (n=3或4，*P<0.05)。 ASO, antisense oligonucleotide; Con, control; EtOH, ethanol treatment; qRT, quantitative reverse transcription; n.s., non-significant; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.

    为了评估miR-148a对TXNIP的影响，我们在AML-12细胞中转染miR-148a，发现转染miR-148a降低了TXNIP mRNA和蛋白水平，而其反义寡核苷酸(ASO)转染则增加了它们的水平(图4 e)．鉴于TXNIP-3 '非翻译区(UTR)与miR-148a种子序列之间的近乎完美配对(图4 f左)，接下来我们使用体外实验更精确地定义了miR-148a抑制TXNIP的能力。正如预期的那样，转染miR-148a的HEK293细胞可以阻止pEZX-TXNIP-3'UTR荧光素酶构建物的荧光素酶表达，而转染miR-148a ASO则产生相反的效果(图4 f右)。突变TXNIP 3’utr报告基因(5’-TCGTGAG-3’和5’- ggtgaca3’)结构的荧光素酶表达没有变化。为了验证miR-148a对酒精刺激中已识别目标的影响，我们使用原代肝细胞进行了进一步的实验。用miR-148a转染从乙醇处理小鼠分离的肝细胞(1周)显著抑制TXNIP mRNA和蛋白水平(图4 g)．miR-148a ASO转染增强了TXNIP的表达。miR-148a mimic或ASO转染后，miR-148a水平的调节在AML-12细胞或原代肝细胞中得到证实补充图4A,B)．

    在GEO数据集(GSE67456)的分析中，喂食Lieber-Decarli日粮的小鼠体内的蛋白质含量增加Txnip肝脏中的转录水平(见在线补充图5A)．之间存在显著的负相关Foxo1而且Txnip记录。FoxO1对TXNIP的抑制作用和miR-148a ASO的拮抗作用在基于细胞的实验中得到了证实。FoxO1过表达阻止了酒精诱导的TXNIP表达，而miR-148a ASO转染恢复了这一表达(参见在线补充图5B)．流式细胞术分析证实了FoxO1和miR-148a ASO转染对乙醇处理细胞中TXNIP的影响补充图5C)．所有这些结果都表明，肝细胞暴露于酒精中，通过foxo1介导的miR-148a表达失调，诱导TXNIP过表达。

    乙醇对肝细胞NLRP3炎性小体的激活作用

    炎症小体活化是促进包括ALD在内的肝脏疾病进展的原因。17由于TXNIP通过与NLRP3结合促进NLRP3炎性小体的激活，18我们重点研究了TXNIP-NLRP3炎性小体在酒精诱导的肝细胞损伤中的作用。在GEO数据集(GSE97234)分析中，Nlrp3, ASC (Pycard)而且Il1b与对照组相比，AH小鼠肝脏中的mRNA水平均上调(图5一个)．乙醇处理增加原代肝细胞或AML-12细胞NLRP3表达(图5B和C，见网上补充图6A)．活性caspase-1和ASC水平也上调(图5 c)．在AH患者中，NLPR3转录水平趋于下降(见在线补充图6B)．然而，在酒精喂养的小鼠中，NLRP3蛋白表达增加补充图6C)．的caspase-1(CASP1)和ASC(PYCARD)转录水平也增加，与之呈负相关FOXO1AH患者数据集中的mRNA水平(GSE28619)(见在线补充图7)．为了评估NLRP3和TXNIP的定位，进行了免疫细胞化学检测。正如预期的那样，TXNIP和NLRP3在乙醇处理后共定位，其染色强度增强(图5 d)．此外，乙醇处理增加了TXNIP和NLRP3结合的强度，这是由miR-148a mimic转染所阻止的(图5 e上)。TXNIP的下调导致活性caspase-1水平下降，NLRP3水平无变化(图5 e低)。miR-148a转染减弱了TXNIP和NLRP3的共定位(图5 f)．由于caspase-1促进焦亡，19我们想知道酒精是否能够诱导肝细胞焦亡(如先前报道的，在本试验中使用了200 mM乙醇20.)．在使用焦亡生物标志物(即活性caspase-1和碘化丙啶(PI))的流式细胞分析中，观察到乙醇处理增加了AML-12细胞中caspase-1/PI双阳性的群体，而这种影响通过miR-148a转染(图5克)．TXNIP敲除也得到了类似的结果。此外，miR-148a ASO转染增加了caspase-1/ pi双阳性细胞的数量。FoxO1过表达导致caspase-1/PI双阳性细胞群减少(见在线补充图8)．

    Pyroptosis of hepatocytes as mediated by TXNIP-dependent inflammasome activation. (A) Expression heatmap of Nlrp3, Pycard (ASC) and Il1b in the RNA-seq database (GSE59492) from control and AH mice (n=3 each) (P<0.01). (B, C) qRT-PCR or immunoblotting assays for NLRP3 or other inflammasome markers in mouse primary hepatocytes or AML-12 cells treated with 100 mM ethanol for 48 hours. Data represent the mean±SEM (n=4 each, *P<0.05, **P<0.01). Band intensities represent values relative to respective control (control, 1). (D) Confocal images of TXNIP and NLRP3 in AML-12 cells treated with 100 mM ethanol for 48 hours. (E) Immunoprecipitation or immunoblottings for TXNIP and NLRP3 inflammasome markers in AML-12 cells exposed to 100 mM ethanol for 48 hours immediately after transfection with miR-148a mimic (or Con mimic) (upper) or TXNIP siRNA (or Con siRNA) for 48 hours (lower). (F) Confocal images of TXNIP and NLRP3 in AML-12 cells treated with 100 mM ethanol for 48 hours after miR-148a mimic (or Con mimic) transfection. (G) Flow cytometric analyses using propidium iodide and active caspase-1 markers. AML-12 cells were similarly transfected, and then treated with 200 mM ethanol for 48 hours. miR-148a mimic or miR-148a ASO transfection and TXNIP knockdown experiments were separately done. AH, alcoholic hepatitis; ASO, antisense oligonucleotide; Con, control; EtOH, ethanol treatment; qRT, quantitative reverse transcription; siRNA, small-interfering RNA; TXNIP, thioredoxin- interacting protein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    txnip依赖的炎性小体激活介导的肝细胞焦亡。(A)的表达热图Nlrp3, Pycard (ASC)而且Il1b对照组和AH小鼠RNA-seq数据库(GSE59492)中(n=3) (P<0.01)。(B, C)用100mm乙醇处理48小时的小鼠原代肝细胞或AML-12细胞中NLRP3或其他炎症小体标记物的qRT-PCR或免疫印迹试验。数据代表均数±SEM (n=4， *P<0.05， **P<0.01)。带强度表示相对于各自对照的值(对照，1)。(D) TXNIP和NLRP3在100 mM乙醇处理48小时的AML-12细胞中的共聚焦图像。(E)转染miR-148a mimic(或Con mimic)(上)或TXNIP siRNA(或Con siRNA) 48小时(下)后，AML-12细胞暴露于100 mM乙醇中48小时后，TXNIP和NLRP3炎症小体标记物的免疫沉淀或免疫印迹。(F)转染miR-148a mimic(或Con mimic)后，用100 mM乙醇处理48小时的AML-12细胞中TXNIP和NLRP3的共聚焦图像。(G)使用碘化丙啶和活性caspase-1标记物进行流式细胞分析。同样转染AML-12细胞，用200 mM乙醇处理48小时。分别进行miR-148a mimic或miR-148a ASO转染和TXNIP敲低实验。AH，酒精性肝炎; ASO, antisense oligonucleotide; Con, control; EtOH, ethanol treatment; qRT, quantitative reverse transcription; siRNA, small-interfering RNA; TXNIP, thioredoxin- interacting protein.

    为了了解在酒精诱导的肝损伤过程中肝细胞中炎症小体的作用，我们接下来使用体内巨噬细胞衰竭模型检测了酒精对肝脏中炎症小体激活的影响。在免疫染色实验中，观察到氯膦酸脂质体处理降低了Lieber-DeCarli饮食小鼠肝脏中的F4/80染色强度(图6)．氯膦酸钠既没有引起肝脏的任何组织病理学改变，也没有增强乙醇诱导的肝损伤(图6 b)．乙醇和乙醇加氯膦酸钠治疗组TXNIP、活性caspase-1和ASC水平均升高(图6 c)．乙醇加氯膦酸钠处理组肝脏NLRP3和IL-1β水平部分降低。乙醇喂养组FoxO1表达降低，与氯膦酸钠处理无关。氯膦酸钠没有显著改变ALT或AST活性(图6 d)．在免疫组化(IHC)染色中，TXNIP和caspase-1水平在喂食含或不含氯膦酸钠的乙醇后升高(图6 e)．末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记(TUNEL)的结果证实了这一效应补充图9)．总的来说，我们的结果表明，酒精通过txnip介导的NLRP3炎症小体激活诱导肝细胞焦亡，这是miR-148a调控异常的结果。

    Ethanol-induced inflammasome activation in hepatocytes from mice treated with clodronate. (A, B) Representative IHC for F4/80 (scale bar, 100 µm), and H&E staining (scale bar, 50 µm). C57BL/6 mice were first intravenously injected with 10 mL/kg body weight of clodronate (or vehicle), and after a week, they were subjected to Lieber-DeCarli diet (or control diet) with additional injections of clodronate (5 mL/kg body weight, intraperitoneal, every 4 days) for 5 weeks. (C) Immunoblottings for TXNIP, inflammasome or other biomarkers. Densitometric band intensities represent values relative to respective control (control, 1). (n=3 each). (D) Serum ALT and AST activities. (n=3–6/group). (E) IHC for TXNIP or caspase-1. Representative liver sections were shown (n=3 each). Scale bar, 100 µm. For (C)and (D), data represent the mean±SEM (statistical comparisons among groups by one-way ANOVA with Fisher’s least significant difference (C) or Bonferroni correction (D) for multiple comparisons, *P<0.05, **P<0.01). AH, alcoholic hepatitis; ALT, alanine aminotransferase; ANOVA, analysis of variance; ASO, antisense oligonucleotide; AST, aspartate transaminase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; IHC, immunohistochemostry; IL-1β, interleukin 1β; n.s., non-significant; qRT, quantitative reverse transcription; siRNA, small-interfering RNA; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    氯膦酸钠处理小鼠肝细胞乙醇诱导的炎症小体激活。(A, B)具有代表性的免疫组化F4/80(比例尺，100µm)， H&E染色(比例尺，50µm)。C57BL/6小鼠首先静脉注射10 mL/kg体重的氯膦酸钠(或对照物)，一周后给予Lieber-DeCarli饮食(或对照饮食)，并额外注射氯膦酸钠(5 mL/kg体重，腹腔注射，每4天一次)，持续5周。(C) TXNIP、炎性小体或其他生物标志物的免疫印迹。密度带强度表示相对于各自对照(对照，1)的值(各n=3)。(D)血清ALT和AST活性。(n = 3 - 6 /组)。(E)免疫组化TXNIP或caspase-1。示有代表性的肝脏切片(各3个)。比例尺，100µm。 For (C)and (D), data represent the mean±SEM (statistical comparisons among groups by one-way ANOVA with Fisher’s least significant difference (C) or Bonferroni correction (D) for multiple comparisons, *P<0.05, **P<0.01). AH, alcoholic hepatitis; ALT, alanine aminotransferase; ANOVA, analysis of variance; ASO, antisense oligonucleotide; AST, aspartate transaminase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; IHC, immunohistochemostry; IL-1β, interleukin 1β; n.s., non-significant; qRT, quantitative reverse transcription; siRNA, small-interfering RNA; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.

    通过肝细胞特异性递送miR-148a改善肝损伤

    为了验证miR-148a在肝细胞中对酒精诱导的肝损伤的生理影响，我们最终使用慢病毒进行了体内基因传递。构建从白蛋白启动子下游克隆的包含转录miR-148a基因的慢病毒载体，并将包装好的病毒注射到小鼠(白蛋白启动子用于肝细胞特异性基因表达)。在Lieber-DeCarli饮食喂养的小鼠中，肝细胞特异性miR-148a的递送改善了ALD的发病机制，这可以通过改善组织病理学特征来证明，如肝细胞肿胀和异常脂质积聚的减少(图7上)。qRT-PCR检测证实miR-148a的传递(图7低)。肝匀浆中TXNIP、活性caspase-1、ASC和IL-1β的免疫印迹证实炎性小体活化受到抑制(图7 b)．FoxO1水平恢复，而NLRP3或CYP2E1水平保持不变。在IHC中，与对照组相比，慢病毒递送miR-148a后，肝组织中的TXNIP和caspase-1染色强度降低(图7 c)．miR-148a抑制炎性小体激活的能力通过血清IL-1β水平的降低得到验证补充图10A)．肝切片的TUNEL染色证实了miR-148a传递对肝细胞死亡的抑制作用(见在线)补充图10B)和免疫印迹法检测PARP-1裂解(见在线补充图11)．一致地，肝细胞特异性的miR-148a递送显著抑制乙醇诱导的肝脏体重比、ALT活性以及血清和肝脏TG含量的增加(图7 d)．总的来说，我们的结果表明，miR-148a通过抑制TXNIP来保护肝细胞免受酒精诱导的炎症小体激活和肝细胞焦亡(图7 e)．

    Inhibition of inflammasome and liver injury after hepatocyte-specific lentiviral delivery of miR-148a. (A) H&E staining (scale bar, 50 µm) and qRT-PCR assays for miR-148a in the liver. Mice were intravenously injected with a single dose of albumin promoter-pre-miR-148a lentiviruses (or Lv-control), and after a week, they were fed on a Lieber-DeCarli diet for 4 weeks as depicted in the scheme (n=4–6/group). (B) Immunoblotting assays for TXNIP, inflammasome or other biomarkers in liver homogenates. Densitometric band intensities represent values relative to respective control (control, 1) (n=3 each). (C) IHC for TXNIP or caspase-1. Representative liver sections were shown (n=3 each). Scale bar, 100 µm. (D) Liver-to-body weight ratio and representative blood biochemical parameters. (E) A scheme illustrating the mechanism by which ethanol induces pyroptosis of hepatocytes. For (A), (B) and (D), data represent the mean±SEM. Significantly different compared with each control, *P<0.05, **P<0.01. For (A), statistical significance of differences between two groups indicated (unpaired t-test). For (B) and (D), statistical comparisons among multiple groups by one-way ANOVA with Fisher’s least significant difference (B) or Bonferroni correction (D). ALD, alcoholic liver disease; ALT, alanine aminotransferase; ANOVA, analysis of variance; AST, aspartate transaminase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; FoxO1, forkhead box protein O1; IL-1β, interleukin 1β; qRT, quantitative reverse transcription; TG, triglyceride; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    肝细胞特异性慢病毒传递miR-148a后炎性小体和肝损伤的抑制(A) H&E染色(比例尺，50µm)和肝脏中miR-148a的qRT-PCR检测。小鼠静脉注射单剂量白蛋白启动子-pre- mir -148a慢病毒(或lv对照)，一周后，按照方案所述，给小鼠喂食Lieber-DeCarli饮食4周(n=4 - 6/组)。(B)肝匀浆中TXNIP、炎性小体或其他生物标志物的免疫印迹试验。密度带强度表示相对于各自对照(对照，1)的值(各n=3)。(C)免疫组化TXNIP或caspase-1。示有代表性的肝脏切片(各3个)。比例尺，100µm。(D)肝体重量比及代表性血液生化参数。(E)说明乙醇诱导肝细胞焦亡机制的方案。 For (A), (B) and (D), data represent the mean±SEM. Significantly different compared with each control, *P<0.05, **P<0.01. For (A), statistical significance of differences between two groups indicated (unpaired t-test). For (B) and (D), statistical comparisons among multiple groups by one-way ANOVA with Fisher’s least significant difference (B) or Bonferroni correction (D). ALD, alcoholic liver disease; ALT, alanine aminotransferase; ANOVA, analysis of variance; AST, aspartate transaminase; Con, control; EtOH, ethanol treatment; FoxO1, forkhead box protein O1; IL-1β, interleukin 1β; qRT, quantitative reverse transcription; TG, triglyceride; TXNIP, thioredoxin-interacting protein.

    讨论

    MiRNAs在肝脏中调节多种生物功能。特定miRNAs水平的改变促进肝脏疾病的发生和进展(见在线补充表1)．21由于肝细胞主要受到乙醇毒性的影响，因此肝细胞中丰富的miRNAs可能对酒精暴露更敏感。在我们对AH患者肝脏标本的GEO数据(GSE59492)分析中，只有2%的miRNAs被发现显著下调。其中，miR-148a被深度且显著抑制。由于miR-148a属于肝脏中含量最多的mirna22之前没有研究过，我们关注的是miR-148a在ALD进展中的失调。在这里，我们发现miR-148a水平在AH患者中显著和特异性下降，这一下降被两种不同ALD动物模型的结果进一步证实。此外，我们从原代肝细胞或细胞系获得的数据证实了酒精对miR-148a调控异常的影响。

    FoxO1属于应激反应通路相关的关键转录因子。23特别是，FoxO1在肝脏中起着代谢调节和肿瘤抑制的作用。24日25日在本研究中，FoxO1被预测为与其他基因相互作用的“正向转录调节”和“程序性细胞死亡抑制调节”过程的中心分子。此外，我们在AH和ALD动物模型患者肝脏中发现FoxO1明显被抑制，这证实了酒精对FoxO1的抑制作用。这与我们发现的miR-148a水平与血清ALT活性(或TG含量)呈负相关，或与酒精对NAD的已知影响相一致+/NADH比值和脂糖代谢。代谢途径FoxO1水平的降低促进了3T3L1脂肪细胞中ROS和促炎细胞因子的产生。29同样，暴露于乙醇和不饱和脂肪酸的肝细胞FoxO1核表达减少。30.在另一项研究中，Foxo1在Lieber-Decarli大鼠模型中，31可能反映了酒精代谢能力的物种差异。总的来说，我们的研究结果强化了FoxO1水平降低促进ALD进展与miR-148a调控异常相关的概念。在这里，我们证明FoxO1是一个转录因子MIR148A．尽管一些转录因子如SREBP-1、MYB和p53可能调控miR-148a的水平，16 32 33在ALD中未显示出与miR-148a的任何相关性。我们的数据显示了miR-148a和FoxO1之间的强相关性，同时确定了人体内存在功能活跃的FoxO1结合位点MIR148A突变试验结果证实了这一点。

    乙醇消耗可能导致表观遗传变化，这也可能导致miR-148a在ALD进展中的失调。此前已有研究表明，miR-148a基因启动子的高甲基化与肝癌中miR-148a的沉默有关34IL-6通过降低恶性胆管细胞中的miR-148a/152来增强DNMT1活性和甲基化依赖的肿瘤抑制基因。35然而，在我们的研究中，乙醇处理改变了肝细胞中miR-148a启动子区域的甲基化(见在线补充图12)．

    在肝细胞中丰富的miRNAs中，miR-148a在调控肝细胞分化、诱导成人肝脏表型等方面发挥重要作用。34然而，miR-148a的作用和靶点主要在肿瘤生物学领域进行研究。据我们所知，miR-148a对TXNIP的调控是肝脏疾病进展中的一个新事件。在基于细胞的实验中，转染MiR-148a阻止了酒精诱导的TXNIP的表达，这表明MiR-148a能够通过TXNIP调节ALD。这一观点与TXNIP使细胞易受氧化应激和损伤的报道一致。18 36 37在AH患者或Lieber-DeCarli饮食小鼠中，TXNIP mRNA水平轻度或中度升高可能反映了mirna调节蛋白翻译的特征。TXNIP蛋白在酒精性纤维化中的增加也通过人体样本进行了验证。总之，我们的研究结果显示FoxO1对miR-148a的调控、TXNIP水平的变化、FoxO1与TXNIP在动物实验和数据库分析中的相互关系，以及FoxO1恢复miR-148a和抑制TXNIP水平的能力，都有力地支持了FoxO1在miR-148a调控TXNIP中的作用。

    我们研究的另一个有趣的发现是发现酒精诱导TXNIP过表达促进肝细胞NLRP3炎症小体激活。NLRP3炎性小体通路的完全功能激活经历两个步骤。第一个启动信号是炎症小体成分基因的转录增加，而第二步是低聚物复合物(NLRP3/ASC/caspase-1)的形成和激活，TXNIP增强了这一过程。通过TXNIP结合NLRP3炎性小体的充分激活，然后诱导活跃的caspase-1和IL-1β释放作为标志。因此，在本研究中，TXNIP的下调降低了活跃的caspase-1水平，但不影响NLRP3和ASC水平。这些结果与先前的报道一致，抑制TXNIP不会降低NLRP3和ASC蛋白水平，但会降低炎症小体的激活(即降低caspase-1水平和IL-1β分泌)。38 39

    宿主衍生的危险信号，如某些代谢物和ROS，激活NLRP3炎症小体途径。40NLRP3也可能在肝细胞中被激活，以应对内毒素挑战，这是一种由酒精摄入促进的情况。41在缺乏nlrp3的小鼠中，酒精诱导的肝脏脂肪变性和损伤得到改善。42可见，NLRP3水平升高可促进肝细胞损伤。在酒精喂养的小鼠中，NLRP3蛋白水平的增加与报告显示的NLRP3转录物在酒精喂养后上调是一致的。43我们的数据显示，AH患者NLRP3 mRNA的轻微下降可能与代偿反应有关。此外，在AH患者中FoxO1水平与炎症小体标记物之间的负相关关系加强了这一结论，即酒精降低FoxO1有助于txnip介导的ALD中NLRP3炎症小体激活。

    多种机制促进肝细胞死亡，导致ALD的后续进展。炎症小体的过度和不受控制的激活对宿主具有破坏作用，诱导不受控制的炎症反应和随后的细胞死亡。44然而，抑制凋亡细胞死亡并不足以消除酒精诱导的肝损伤，45提示其他类型的肝细胞死亡机制也可能存在。我们发现的一个有趣的方面是，酒精诱导的肝细胞炎症小体通路的激活促进了焦亡，这依赖于TXNIP的过表达。这一观察结果与发现的caspase-1在AH患者的肝细胞中被激活是一致的。46一致地，TXNIP缺乏导致细胞增殖增强和对细胞死亡的抵抗力增加。47此外，转染miR-148a改善了酒精诱导的焦性细胞死亡，这支持了miR-148a及其相关分子可能是ALD新靶点的观点。

    炎症小体活化在巨噬细胞中被广泛研究。近年来，肝细胞本身在这方面引起了人们的关注。48 49然而，肝实质细胞中NLRP3炎症小体激活在酒精性肝损伤中的具体作用及其相关分子机制尚不清楚。我们的结果是，酒精摄入增加了氯膦酸钠预处理小鼠的所有肝脏炎症小体成分，这加强了酒精对肝细胞中炎症小体激活的影响。在这些动物中，与对照组相比，IL-1β分泌减少(数据未显示)，这可能是因为巨噬细胞中炎症小体的激活受到抑制。其他类型的细胞(如免疫细胞和肝星状细胞)可能有一些影响。然而，我们的数据显示，血清ALT活性在巨噬细胞耗竭后仍然升高，进一步支持酒精对肝细胞NLRP3炎性小体激活的直接影响。更重要的是，使用肝细胞特异性慢病毒传递miR-148a的体内实验结果加强了这一假设。值得注意的是，在乙醇喂养的小鼠中，miR-148a的传递导致肝脏FoxO1表达的恢复，这可能反映了肝功能的改善。这一事件可能与AKT活性的改变有关，AKT是一种通过磷酸化降解FoxO1的激酶，因为急性乙醇处理已被证明可以激活PI3K/AKT通路。50

    总的来说，我们的研究结果表明，酒精通过激活由mir -148a依赖的TXNIP过表达介导的NLRP3炎性小体来诱导肝细胞的焦亡。目前鉴定miR-148a作为焦亡调节因子，以及FoxO1对基因表达的转激活作用，为ALD治疗提供了新的靶点和潜在策略。

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    脚注

    • 贡献者MJH:研究概念与设计;数据采集;数据分析和解释;文稿起草;统计分析。THK:研究理念与设计;数据采集;数据分析和解释。JSY研究理念与设计;数据采集; analysis and interpretation of data; administrative, technical or material support. DB: acquisition of data; analysis and interpretation of data; statistical analysis. PS-B: study concept and design; human sample analysis and interpretation of data; administrative, technical or material support. SGK: study concept and design; analysis and interpretation of data; writing of the manuscript; critical revision of the manuscript for important intellectual content; statistical analysis; obtained funding; administrative, technical or material support and study supervision.

    • 资金本研究由韩国国家研究基金会(NRF)资助，由韩国政府(MSIP)资助(NRF- 2015r1a2a1a10052663)， MJH得到教育部基础科学研究计划(NRF- 2018r1a6a3a01011724)的支持。sanjo - bru P得到了Carlos III Salud研究所、Miguel seret CP11/00071和FIS PI14/00320的支持，并由欧洲Fondo euroo de Desarrollo Europeo (FEDER)， Unión Europea， ' Una manera de hacer Europa'共同资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人的同意获得的。

    • 伦理批准首尔大学伦理委员会和巴塞罗那医院诊所。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。供资说明已更新。

    • 发表于本手稿中包含的部分数据在2017年韩国药学学会春季国际大会(2017)上发表。