你在这里

条文本

菜单条

下载PDF

XML
肠道微生物群
原文
TLR4在帕金森病的肠-脑轴中的作用:一项从人到小鼠的转译研究
  1. Paula Perez-Pardo1，
  2. Hemraj B Dodiya2，
  3. 菲利普一个企业2，
  4. 克里斯托弗·B福赛斯2，
  5. 安德里亚米Huschens1，
  6. Maliha谢赫2，
  7. 罗宾·M沃伊特2，
  8. Ankur Naqib3.，
  9. 斯蒂芬J绿色3.，4，
  10. 杰弗里·H Kordower5，
  11. 凯瑟琳·米香农5，
  12. 约翰Garssen1，6，
  13. Aletta D Kraneveld1，7，
  14. 阿里沙1，2
  1. 1乌得勒支科学系药理学研究所药理学部，乌得勒支大学，乌特勒支、荷兰
  2. 2内科消化疾病与营养科，拉什大学医学中心，芝加哥，伊利诺斯州美国
  3. 3.测序核心研究资源中心，伊利诺伊大学芝加哥分校，芝加哥，伊利诺斯州美国
  4. 4生物科学系，伊利诺伊大学芝加哥分校，芝加哥，伊利诺斯州美国
  5. 5神经内科，拉什大学研究生院，芝加哥，伊利诺斯州美国
  6. 6纽迪希亚的研究，乌特勒支、荷兰
  7. 7兽医学院风险评估科学研究所，乌得勒支大学，乌特勒支、荷兰
  1. 对应到Paula Perez-Pardo博士，乌得勒支大学，乌得勒支3584CG，荷兰;p.perezpardo在{}uu.nl

摘要

客观的最近的证据表明，肠源性炎症在脑疾病中的重要作用，为探索肠-脑轴在神经退行性疾病中的可能作用开辟了新的方向。鉴于帕金森病(PD)患者中生物失调和结肠功能障碍的突出表现，我们认为toll样受体4 (TLR4)介导的肠功能障碍可能导致PD相关神经退行性疾病的肠道和中枢炎症。

设计为了验证这一假设，我们在人体组织和小鼠模型中进行了研究。在PD受试者、健康对照受试者和鱼藤酮或载体处理小鼠的结肠样本中测量炎症、免疫激活和菌群组成。为了进一步评估TLR4信号在PD诱导的神经炎症中的作用，我们使用TLR4敲除(KO)小鼠联合口服鱼藤酮给药建立PD模型。

结果与对照组相比，PD患者结肠活检样本中存在肠道屏障破坏、微生物易位标记物增强和促炎基因谱升高。在这方面，我们发现PD受试者中细菌内毒素特异性配体TLR4、CD3+ T细胞表达增加，结肠活组织检查中细胞因子表达增加，以生成scfa的结肠细菌丰度减少为特征的生物失调。与鱼藤酮治疗的野生型动物相比，鱼藤酮治疗的TLR4-KO小鼠显示较少的肠道炎症、肠道和运动功能障碍、神经炎症和神经退行性变，尽管TLR4-KO小鼠存在不良菌群。

结论综上所述，这些研究表明tlr4介导的炎症在肠道和/或大脑炎症中起着重要作用，这可能是导致PD神经退行性变的关键因素之一。

  • 炎症
  • 短链脂肪酸
  • 大脑/肠道交互
  • 结肠微生物区系

这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是原创作品被正确引用，给予适当的荣誉，任何更改都被注明，且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2018-316844

来自Altmetric.com的统计

    请求的权限

    如果您希望重用这篇文章的任何部分或全部，请使用下面的链接，它将带您访问版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和以多种不同方式重用内容的即时许可。

    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 帕金森病(PD)的症状超出了运动功能障碍，因为患者经常出现非运动问题，包括胃肠功能障碍。

    • 胃肠道症状可能在运动症状出现前几十年就开始了，是PD患者生活质量的主要决定因素。

    • 肠道可能是PD神经退行性变的主要炎症来源。

    新的发现是什么?

    • 与健康对照组相比，PD患者结肠中细菌内毒素特异性配体toll样受体4 (TLR4)表达增加，肠道屏障破坏，细菌易位制造者增强，促炎基因谱升高。

    • 鱼藤酮治疗tlr4敲除小鼠显示较少的肠道炎症。与鱼藤酮治疗的野生型动物相比，肠道和运动功能障碍，脑神经炎症和神经退行性变。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • TLR4(肠道)介导的炎症可能参与PD的发展，因此可能是PD未来治疗的一个重要靶点。

    • 需要进一步研究tlr4介导的肠道和神经炎症以及肠脑相互作用在PD发病中的作用。

    简介

    帕金森病(PD)神经退行性变的机制尚不清楚，但越来越多的证据表明炎症衍生的氧化应激和细胞因子毒性可能起着关键作用。1 - 7肠道可能是PD神经退行性过程的一个贡献因素。包括便秘在内的肠功能障碍在帕金森病中很常见，可能在运动症状出现前几十年就开始了。对此，我们小组进行了研究8 9和其他人10 - 13这表明肠道，特别是结肠及其微生物群落，14可能是导致神经退行性变的炎症的主要来源。

    我们的研究小组和其他研究人员报道，PD患者表现出促炎菌群特征9 12 15 - 17日减少了短链脂肪酸等有益产品的摄入。13利用我们PD患者的粪便，在无菌α-突触核蛋白(α-syn)转基因PD小鼠中重建粪便微生物群，加剧了PD模型中的运动症状和病理。18此外，微生物通过代谢产物的产生等机制可以影响免疫和炎症途径，导致外周和中枢免疫激活和炎症。19日20最后，肠屏障是将肠内促炎物质从体循环中分离出来的关键。PD患者可观察到肠道高通透性8并可能导致PD中微生物群引发的炎症。

    肠道失调和/或肠道屏障功能障碍的后果包括免疫激活和炎症。例如toll样受体(TLR)通路激活和CD3 T细胞等异常免疫激活的参与。增加的t细胞运输到结肠粘膜是便秘PD患者的一个特征。21此外，各种TLRs的激活，特别是TLR4是有趣的，因为革兰氏阴性菌激活这个受体。如果微生物组的异常(特别是有利于脂多糖(LPS)生产者)是肠道PD发病的初始触发点，那么TLR4可能是微生物相互作用的第一个点。

    继发于肠道失调或肠道屏障功能障碍的肠道炎症和免疫激活可能导致中枢神经系统病理，其潜在机制有几种。炎症和免疫激活可在肠神经系统中启动α-syn病理，然后以朊病毒样方式通过迷走神经扩散到下脑干，然后是质(SN)。22我们的研究小组和其他研究小组发现，在运动症状出现之前，PD患者的结肠组织中就有α-syn蛋白的积累。第23 - 25另外，肠道衍生的细菌产物或外周炎症反应(如细胞因子的产生)可能通过包括在PD患者中观察到的血脑屏障破坏在内的系统机制影响大脑。26因此，肠道和外周免疫细胞和促炎细胞因子的慢性激活可能启动或促进导致PD的神经退行性变。

    综上所述，我们假设微生物群失调和肠道对细菌内毒素的泄漏激活了tlr4介导的炎症级联反应，导致PD中的神经退行性变。为了验证这一假设，我们在人体组织和小鼠模型中进行了研究。炎症和免疫激活在PD受试者、健康对照组(HC)受试者和鱼藤酮或载体治疗小鼠的结肠粘膜样本中进行测量。为了进一步评估TLR4受体的作用，我们使用TLR4敲除(KO)小鼠联合口服鱼藤酮给药建立PD模型。

    方法

    第一部分:人类研究

    健康对照组和PD组

    HC受试者(n=6)和非便秘的PD患者(n=6)由Rush大学医学中心(RUMC)(芝加哥，伊利诺伊州，美国)招募(在线)补充表S1)．所有受试者都签署了一份同意书，同意使用他们的样本和数据作为RUMC机构审查委员会批准的GI知识库和正在进行的研究的一部分。HC受试者无胃肠道或神经系统疾病史。根据英国帕金森病研究协会脑库标准诊断的帕金森病受试者是根据先前发表的方案招募的。23

    补充文件2

    收集结肠活检，粪便和血液样本

    研究样本在一夜禁食后收集，收集后给予晨剂量的左旋多巴。受试者接受了未经准备的乙状结肠受限镜检查，作者之一(AK)从乙状结肠远端提取了8个粘膜活检样本，并从每个受试者收集了之前发表的粪便23网上有描述过补充材料和方法．使用正常的无菌技术采集了6毫升血液。血浆经1500×g离心分离，在4°C下分离15分钟，并在−80°C下保存，用于测量lps结合蛋白(LBP)。

    补充文件1

    肠通透性和内毒素(LBP)测定

    所有患有PD和HC的受试者都遵循我们建立的方法来测量总肠道通透性。8所有受试者禁食一夜，随后摄入含有2克甘露醇、7.5克乳果糖、40克蔗糖和1克三氯蔗糖的糖混合物。口服糖探针给药24小时后收集尿液样本，冷冻在液氮中进行气相色谱分析27测量排出的总糖含量。根据我们建立的程序，使用LBP测量PD受试者(n=5)和HC受试者(n=5)的全身细菌内毒素水平。28

    免疫细胞化学和显微分析

    对人体活检(6例PD患者和6例HC患者)进行免疫荧光染色和显微镜分析，以评估先前发表的紧密连接蛋白闭塞带1 (ZO-1)和TLR4标记的完整性29网上有描述过补充材料和方法．

    信使rna表达分析

    针对微生物群诱导的肠道炎症和肠道功能障碍的特异性基因根据已发表的协议进行了评估，30.网上有描述过补充材料和方法．

    统计分析

    所有数据均以平均值±SEM表示。采用双尾t检验对HC组与PD组的差异进行统计学分析。使用非参数分析进行相关性分析。p<0.05时选择显著性。使用Graph Pad Prism V.1.5进行分析。

    第二部分:小鼠研究

    动物房

    7周龄的C57BL/6J野生型(WT)和TLR4-KO小鼠(Jackson实验室)被置于12小时的光/暗周期下。食物和水是随意提供的。

    帕金森病小鼠模型

    WT和TLR4-KO小鼠口服鱼藤酮(Sigma-Aldrich，荷兰)溶液(10 mg/kg新鲜悬浮在4%羧甲基纤维素和1.25%氯仿载体中)，每日1次，连续28天，如上所述。31对照组动物接受车辆。第28天，处死小鼠，取脑组织和肠组织进行分析。

    运动功能评估

    采用前文所述的旋转杆试验评估小鼠的运动功能31正如网上所描述的补充材料和方法．

    肠通过与结肠长度

    牺牲小鼠前30分钟，灌胃2.5%埃文斯蓝(Sigma-Aldrich) 1.5%甲基纤维素溶液(0.3 mL /只)。安乐死后，测量从幽门到最远端迁移点的距离。此外，还测量了结肠的长度。

    肠道屏障完整性评估

    我们选择评估小鼠结肠中紧密连接蛋白的完整性，作为肠道屏障功能的标记，使用免疫细胞化学和图像分析，如在线描述的那样补充材料和方法．这一选择的依据是:1)已有证据表明，像ZO-1这样的顶端连接复合体蛋白的破坏是肠屏障功能破坏的可靠标志32 332)我们的研究结果显示ZO-1表达与尿三氯蔗糖水平之间存在强大而显著的相关性(在线)补充表S2)．

    免疫细胞化学

    如先前发表的，对大脑和肠道样本进行免疫过氧化物酶和免疫荧光染色31并在网上解释过补充材料和方法．

    微生物群分析

    如前所述，使用16S核糖体RNA测序对人类和小鼠的菌群组成进行了分析9 34网上有描述过补充材料和方法．

    统计分析

    实验结果以平均值±SEM表示。动物实验组间差异采用双向方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较检验进行统计学分析。旋转杆试验结果采用一般线性模型重复测量方差分析，包括受试者内因子时间和受试者间因子处理(载药vs鱼藤酮)和基因型(WT vs TLR4-KO)。皮尔逊相关性被应用于将不同症状与接触鱼藤酮的小鼠联系起来。当p值<0.05时，认为结果有统计学意义。采用SPSS V.22.0进行分析。

    结果

    第一部分:以PD和HC为主体的人体研究

    PD患者表现为肠屏障功能障碍

    使用结构化的GI症状严重程度指数和布里斯托大便评分评估排便习惯，没有PD患者出现临床显著的便秘(在线)补充表S1)．使用统一帕金森病分级量表(UPDRS)和改进的Hoehn和Yahr量表(HYStage)评估PD症状(在线)补充表S1)．35 36目前的研究证实了PD患者的肠道高通透性(平均±SEM: 2.33%±0.30%)，而HC(0.97±0.28)，如我们之前报道的那样。8具体来说，PD受试者在摄入鸡尾酒糖后24小时尿中三氯蔗糖的排泄量显著高于对照组(n=6，未配对双尾t检验:t（10）= 3.36, p = 0.01;图1一个)．然而，在5小时尿乳糖、甘露醇或乳糖/甘露醇比值(数据未显示)中未观察到组间差异，提示PD患者肠屏障功能的破坏主要涉及结肠。

    Patients with Parkinson’s disease (PD) show increased colonic permeability and associated colonic inflammatory as well as immune markers in their biopsies compared with healthy controls (HC). (A) Per cent excretion of sucralose in the urine samples as an intestinal permeability marker. (B) Levels of LPS-binding protein (LBP) as a marker for systemic endotoxin in plasma samples. (C) Photomicrographs of immunofluorescence staining of tight junction protein zonula occludens 1 (ZO-1) in HC (a, b) and PD (c, d) colonic mucosa. (D) Integrity scoring for ZO-1 tight junction protein expression in colonic samples. (E) Photomicrographs of stained toll-like receptor 4 (TLR4)+ cells in lamina propria of the HC (a, b) and PD mucosa (c, d). (G) Photomicrographs of stained CD3+ T cells in colonic mucosa of HC (a, b) and PD (c, d). (H) Assessment of CD3+ cells in lamina propria of colonic samples. Scale bars: C(c)=50 µm and C(d)=20 µm, E(c)=75 µm and E(d)=25 µm, G(c)=40 µm and G(d)=25 µm. *P<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001. Data represent mean±SEM.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    与健康对照(HC)相比，帕金森病(PD)患者的活检显示结肠通透性和相关的结肠炎症和免疫标记物增加。(A)尿液样本中作为肠通透性标志的三氯蔗糖排泄率的百分比。(B)血浆样本中作为全身内毒素标记的lps结合蛋白(LBP)水平。(C) HC (a, b)和PD (C, d)结肠黏膜紧密连接蛋白咬合带1 (ZO-1)免疫荧光染色显微照片。(D)结肠样本ZO-1紧密连接蛋白表达完整性评分。(E) HC (a, b)和PD (c, d)固有层中toll样受体4 (TLR4)+细胞染色的显微照片。(G) HC (a, b)和PD (c, d)结肠黏膜中CD3+ T细胞染色的显微照片。(H)结肠样本固有层中CD3+细胞的评估。规模的酒吧:C (C) = 50µm和C (d) = 20µm E (C) = 75µm和E (d) = 25µm G (C) = 40µm和G (d) = 25µm。* * * P < 0.05, P < 0.001, * * * P < 0.0001。数据表示的意思是±SEM。

    肠屏障功能障碍允许细菌和细菌产物(如LPS)进入肠粘膜和体循环。LPS与可溶性急性期蛋白LBP结合，将LPS呈现给细胞表面模式受体，如CD14和TLR4，这些受体负责随后的先天免疫。低水平的LBP通过促进LPS分子转移到其受体CD14，增强了细胞对LPS的反应，37而高水平的LBP通过将LPS转移到高密度脂蛋白来抑制细胞对LPS的反应38或通过促进LPS内化而不触发炎症细胞刺激。39与我们之前的报告相似，28PD组血浆中LBP含量降低(15.73±3.75 μ g/mL)， HC组血浆中LBP含量降低(33.47±6.20 μ g/mL) (n=5，无配对双尾t检验:t（8）= 2.45, p = 0.04;图1 b)．

    肠道屏障由一系列连接蛋白维持，其中包括一个主要的紧密连接蛋白ZO-1。HC免疫荧光染色显示ZO-1蛋白在隐窝顶端表面连续表达(图1 c - a, b)．相反，PD患者结肠乙状结肠黏膜ZO-1免疫荧光降低(图1碳碳,d)．每组的平均完整性评分数据显示，在隐窝顶端连接和上皮衬里合并时，PD组的ZO-1表达显著中断(1.58±0.05)，而HC组的ZO-1表达中断(2.32±0.18)(n=6，未配对双尾t检验:t（10）= 3.917, p = 0.0029;图1 d)．综上所述，这些数据表明PD患者破坏了结肠屏障的完整性。pd相关的结肠ZO-1表达减少和尿三氯蔗糖水平较低程度增加均与结肠炎症介质mRNA表达增强和LBP血浆水平升高显著相关(ZO-1评分和LBP: p<0.05, R=0.831)(在线)补充表S2和S3)．尽管这些相关性并不等同于因果关系，但这些关系让我们可以推断出潜在的原因。

    PD患者表现出粘膜炎症和免疫激活的证据

    HC在固有层偶见TLR4免疫反应(图1 a等,b)．这种染色剖面在PD受试者中增强(图1英汉,d)．对固有层TLR4+细胞的分析支持定性观察。HC显示(41.30±9.76)个细胞;显著低于PD(127.9±30.47)例(n=6;未配对双尾t检验:t（10）= 2.71, p = 0.02,图1 f)．为了进一步评估，进行了免疫荧光染色。共聚焦显微镜显示，HC标本中隐窝顶端TLR4免疫反应性受限，固有层表达量极低。与HC受试者相比，PD受试者的活检显示，在隐窝的根尖表面和基底外侧表面TLR4免疫反应性，但重要的是，在结肠组织固有层中也观察到TLR4免疫反应性。这些数据表明PD与肠黏膜中TLR4+细胞的增加有关。

    HC样本的固有层中偶见CD3+ T细胞(图1 g, b)．这些细胞靠近隐窝的基底外侧表面。相比之下，PD受试者在固有层中表现出更高的CD3+ t细胞数量，而不是在靠近基底外侧表面的位置(图1 g c, d)．分析显示PD患者固有层中CD3+ T细胞数量(89.02±14.43)明显高于HC(28.63±5.89)(n=6;未配对双尾t检验:t（10）= 3.87, p < 0.001;图1 h)．这些数据表明，PD患者的肠黏膜中存在CD3+细胞。

    为了进一步表征PD黏膜的免疫途径和炎症，对乙状结肠黏膜样本进行了微阵列分析，包括50个与微生物易位和炎症途径相关的基因(图2)．在50个基因中，PD组与HC组的活检结果显示，15个基因显著上调，1个基因显著下调。与组织学结果一致的是，PD活检组织中TLR4 mRNA的表达明显高于HC。与TLR4激活相关的下游信号分子的改变与TLR4信号的增加一致。PD组结肠活检组织中IRAK2表达增加，而抑制分子TOLLIP水平明显低于HC组(图2)．与HC相比，PD乙状结肠黏膜细胞因子(白细胞介素(IL)-1β，干扰素(IFN)-γ， CCL5 (RANTES))和趋化因子(CCL2, CCL5, CCR5)升高。图2)．此外，PD组的组织中CD3+ T细胞标记物(CD3G, CD3E)和T辅助因子(Th)1/Th17炎症因子(IFN-γ， IL-1β， IFN-β， IL-17A, IL-8)和IL-7R的mRNA表达明显高于HC组。这些数据与TLR4和/或CD3+免疫激活增加一致。其他TLRs mRNA水平无明显变化。

    Higher pro-inflammatory milieu was observed in the colonic biopsies of subjects with Parkinson’s disease (PD) compared with healthy control (HC) subjects. Genes specific for microbiota-induced intestinal inflammation and gut dysfunction were evaluated from HC subjects (HC1, HC2, HC3 and HC4) and subjects with PD (PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, PD6). *P<0.03 denotes significantly different gene in PD compared with HC. Green colour indicates lower expression and red colour indicates higher expression of gene.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    与健康对照组(HC)相比，帕金森病(PD)受试者结肠活检中观察到更高的促炎环境。从HC受试者(HC1, HC2, HC3和HC4)和PD受试者(PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, PD6)中评估微生物群诱导的肠道炎症和肠道功能障碍的特异性基因。*P<0.03表示PD与HC基因差异显著。绿色表示低表达，红色表示高表达。

    PD受试者的菌群组成显示短链脂肪酸产生者减少

    这6例PD患者的菌群组成已经被报道为我们38例PD患者的大队列的一部分9这6例患者观察到的变化与我们之前的报道相似。在属的分类水平上，假定的“抗炎”scfa -丁酸生成细菌在PD和HC的粘膜和粪便样本中较少(在线补充表S4)．与HC科目相比，属DoreaPD黏膜中Log2FC相对丰度明显降低;属Roseburia而且Anaerostipes在PD粪便样本中，Log2FC相对丰度下降最多补充表S4)．

    第二部分:鱼藤酮诱导的PD小鼠模型

    TLR4-KO小鼠对鱼藤酮诱导的肠道作用有部分保护作用

    鱼藤酮模型概括了与PD相关的肠功能障碍的几个方面。鱼藤酮治疗组小鼠结肠长度较对照组缩短(p<0.0001;图3一)以及延迟的肠道转运(即埃文斯蓝染料在肠道内移动的距离缩短)(F(26)= 81.53, p < 0.0001;图3 b)．wt载体处理的小鼠结肠上皮壁周围有一个完整的紧密连接屏障和连续的格子图案。相比之下，wt -鱼藤酮小鼠ZO-1表达水平降低/中断(p<0.01) (图3 c, D)与PD患者的观察结果相当(图1 c)．

    Rotenone Parkinson’s disease (PD) model recapitulates GI physiology as observed in human patients with PD and toll-like receptor 4 (TLR4)-knockout (KO) partially protects against them. (A) Colon length. (B) Intestinal transit distance. (C) Photomicrographs of immunofluorescence staining for zonula occludens 1 (ZO-1). (D) ZO-1 integrity scores. (E) Photomicrographs of TLR4 immunofluorescence staining. Graphs represent TLR4+ cell counts in (c) ileum and (f) colon samples. (F) Photomicrographs of CD3 stained cells in colonic samples. Black number sign (#) in panel (b) represent increased CD3+ T cells infiltration into lamina propria. (G) Quantitative analyses of cell counts for CD3+ T cells in lamina propria. Scale bars C(d), E(e), F(d)=100 µm. ***P<0.001, **P< 0.01, *P< 0.05. Data represent as mean+SEM.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    鱼藤酮帕金森病(PD)模型重现了在人类PD患者中观察到的GI生理，toll样受体4 (TLR4)敲除(KO)可部分预防它们。(一)结肠长度。(B)肠道通过距离。(C)闭合带1 (ZO-1)免疫荧光染色显微照片。(D) ZO-1完整性评分。(E) TLR4免疫荧光染色显微照片。图示为(c)回肠和(f)结肠样本中的TLR4+细胞计数。(F)结肠样本中CD3染色细胞的显微照片。图(b)中黑色数字符号(#)表示CD3+ T细胞浸润到固有层增多。(G)固有层中CD3+ T细胞计数的定量分析。 Scale bars C(d), E(e), F(d)=100 µm. ***P<0.001, **P< 0.01, *P< 0.05. Data represent as mean+SEM.

    与人类PD活检组织相似，鱼藤酮处理的小鼠肠道黏膜中TLR4+细胞和CD3+细胞数量相对于灌胃剂处理的小鼠增加。鱼藤酮处理的小鼠在结肠组织黏膜中有更多的TLR4+细胞，而对照组小鼠在靠近基底外侧隐窝的地方偶有TLR4表达。具体来说，鱼藤酮治疗的小鼠有免疫激活的证据，回肠和结肠中TLR4+细胞的数量高于灌胃剂治疗的小鼠(图3 e, F) (p < 0.0001)。体视学分析显示，WT鱼藤酮治疗小鼠结肠中CD3+ T细胞数量较对照小鼠增加(图3 g）;根据我们在帕金森病人类研究中看到的结果(图3 g)．

    为了确定TL4对这种作用是否至关重要，我们在TLR4-KO小鼠中检测了鱼藤酮的作用。TLR4-KO对鱼藤酮诱导的结肠长度减少无影响(图3一）;然而，TLR4-KO小鼠对鱼藤酮诱导的肠通过时间缺陷有部分保护作用(p<0.05) (图3 b)．最后，虽然鱼藤酮显著降低了WT小鼠的ZO-1完整性，但TLR4-KO小鼠不受鱼藤酮对肠道屏障完整性的破坏作用(图3 c, D)．

    鱼藤酮诱导的WT小鼠粘膜中CD3+ T细胞的增加在TLR4-KO小鼠(F(36)= 91.98, p < 0.0001,图3 g, H)．基因型(F(36)=8.97, p<0.01)以及鱼藤酮与基因型(F(36)= 9.30, p < 0.01)。

    我们的下一步是确定这些免疫标记的变化是否伴随着生物变化。因此，我们评估了GFAP作为肠胶质活性和肌间神经丛α-syn积累的标记物。与wt - TLR4-KO相比，wt -鱼藤酮组小鼠的肌间丛中GFAP+肠胶质细胞数量增加，鱼藤酮组小鼠的GFAP+肠胶质细胞表达减少(图4一)．分析显示wt -鱼藤酮小鼠的肌丛中GFAP染色增加，而TLR4-KO小鼠不受影响(F(36)= 9.25, p < 0.01;图4 b)．基因型(F(36)=7.86, p<0.01)(36)= 9.15, p < 0.01)。事后分析显示，tlr4 - ko -鱼藤酮组肌间丛GFAP强度与TLR4-KO-vehicle和WT-vehicle相近，但极显著低于wt -鱼藤酮组(p<0.01)。分析显示在肌肠丛中α-syn阳性结构较高(图4 c)与其他组比较。wt -载体、tlr4 - ko -载体和tlr4 - ko -鱼藤酮之间的α-syn免疫反应性无差异(图4 c)．α-syn光强(图4 d)显示wt -鱼藤酮α-syn表达增加(F(36)= 34.19, p < 0.0001)。基因型对结肠α-syn表达有影响(36)=28.68, p<0.0001)和治疗与基因型之间的相互作用(F(36)= 24.82, p < 0.0001)。事后分析显示tlr4 - ko -鱼藤酮组α-syn水平较wt -鱼藤酮组低(p<0.0001)。

    Toll-like receptor 4 (TLR4)-knockout (KO) mice were partially protect against rotenone-induced enteric glial inflammation and α-syn expression in the colon. Photomicrographs represent histology for (A) GFAP and (C) α-syn markers in colon. (B) Quantitative analyses of optical density (OD) data for GFAP in myenteric plexuses and (D) OD data for α-syn expression in myenteric plexuses. Scale bars A(d), C(d)=100 µm. Scale bar in panel represents 100 µm. *P<0.05, ***p<0.0001. Data represented as mean+SEM.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    toll样受体4 (TLR4)敲除(KO)小鼠对鱼藤酮诱导的肠胶质细胞炎症和结肠α-syn蛋白表达有部分保护作用。显微照片显示结肠中(A) GFAP和(C) α-syn标记物的组织学。(B)肌间丛中GFAP光密度(OD)数据的定量分析和(D)肌间丛中α-syn表达的光密度数据。比例尺A(d)， C(d)=100µm。面板上的比例尺代表100µm。* * * * P < 0.05, P < 0.0001。数据以均值+SEM表示。

    TLR4-KO小鼠在大脑中受到鱼藤酮诱导作用的部分保护

    小胶质细胞是一种形态和功能动态的中枢神经系统细胞，在激活时，小胶质细胞从具有高度分枝扩展的薄细胞体转变为具有较少分支的变形虫细胞40这些形态变化预示着向促炎/吞噬小胶质细胞的转变。该分析集中在与PD高度相关的SN区域。与载药处理的WT小鼠相比，WT-鱼藤酮小鼠的小胶质细胞分支数量减少(p<0.001，图5一个)，分支终点数目减少(p<0.01，图5 b)，分支长度减少(p<0.05，图5 c)和细胞体大小/总细胞大小比值增加(p<0.01，图5 d)．WT与TLR4-KO鱼藤酮处理小鼠比较发现，与WT-鱼藤酮处理小鼠相比，TLR4-KO小鼠的分支数量显著增加(p<0.05)，分支长度显著增加(p<0.05)，细胞体大小/总细胞大小比显著降低(p<0.01)。在WT或TLR4-KO小鼠中，鱼藤酮治疗导致了分支终点数量的类似减少。

    Toll-like receptor (TLR4)-knockout (KO)-rotenone mice showed less pro-inflammatory microglia, less dopaminergic cell loss and less behaviour deficits compared with wild-type (WT)-rotenone. (A–D) Average number of branches, branches end points, branch length and the ratio cell body size/total cell size of microglia in the substantia (SN). (E) Photomicrographs of microglial cells for each condition. TLR4-KO mice showed microglia with less pro-inflammatory phenotype in the SN compared with WT-rotenone mice. (F) Photomicrographs of tyrosine hydroxylase (TH) stained dopaminergic cells. (G) Cell counts for TH stained dopaminergic cells into SN. WT-rotenone showed profound loss of TH cells while TLR4-KO-rotenone showed a mitigated TH+ cell loss in the SN. (H) Rotarod data to assess motor function associated behaviour deficits. TLR4-KO-rotenone group showed reduced rotenone-induced motor-dysfunction compared with WT-rotenone. Scale bars: E(d)=10 µm, F(d)=200 µm. *P<0.05, **p<0.001, ***p<0.0001. Data represented as mean+SEM.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    与野生型(WT)鱼藤酮相比，toll样受体(TLR4)敲除(KO)鱼藤酮小鼠表现出更少的促炎小胶质细胞，更少的多巴胺能细胞损失和更少的行为缺陷。(A-D)质(SN)中小胶质细胞的平均分支数、分支端点、分支长度和胞体大小/总细胞大小的比值。(E)每种情况下的小胶质细胞显微照片。与wt -鱼藤酮小鼠相比，TLR4-KO小鼠SN区小胶质细胞促炎表型较低。(F)酪氨酸羟化酶(TH)染色的多巴胺能细胞的显微照片。(G) TH染色的多巴胺能细胞进入SN的细胞计数。wt -鱼藤酮在SN中TH细胞损失严重，而tlr4 - ko -鱼藤酮在SN中TH+细胞损失减轻。（H)旋转tarod数据以评估运动功能相关的行为缺陷。与wt -鱼藤酮相比，tlr4 - ko -鱼藤酮组鱼藤酮诱发的运动功能障碍减轻。比例尺:E(d)=10µm, F(d)=200µm。* * * P < 0.05, P < 0.001, * * * P < 0.0001。数据以均值+SEM表示。

    用酪氨酸羟化酶(TH)染色检测PD相关脑区多巴胺能神经元数量。分析表明，WT组鱼藤酮处理后SN中TH+细胞数量明显低于对照(图5 f)．在WT小鼠中，鱼藤酮显著减少SN中TH+细胞的数量;然而，鱼藤酮对TLR4-KO小鼠TH+细胞数量的影响较小(图5 f)．细胞计数分析显示wt -鱼藤酮组SN中TH+细胞数量明显低于其他组(F(36)= 35.89, p < 0.0001) (图5克)．在处理(鱼藤酮vs载体)和基因型(WT vs KO) (F(36)= 6.48, p < 0.05)。事后分析显示wt -鱼藤酮组TH+细胞数量明显低于tlr4 - ko -鱼藤酮组(p<0.05) (图5克)．

    旋转杆测试用于评估运动功能，数据以秒为单位的下降延迟表示(图5 h)．鱼藤酮与对照剂的整体效果(F(32)=60.11, p<0.0001)和基因型(F(32)=9.60, p<0.01)。重复测量显示时间的影响(F(96)= 22.49, p < 0.0001)。与WT-vehicle相比，wt -鱼藤酮组随时间推移表现出更大的运动功能障碍(交互作用treatment×time F(96)= 1.33, p < 0.0001)。从第21天开始，wt -鱼藤酮小鼠与WT-vehicle (F(32)=6.20, p<0.05(34)=72.14，第28天p<0.0001)。试验第28天，基因型(F(34)=8.05, p<0.001)。事后分析显示，与wt -鱼藤酮相比，tlr4 - ko -鱼藤酮小鼠在旋转杆上的表现显著更好(p<0.05) (图5 h)．

    支持鱼藤酮诱导的PD小鼠肠道-免疫-脑轴参与的证据

    为了努力了解多个变量是如何相似或不相似的，进行了相关分析。虽然相关性不等于因果关系，但这些关系让我们可以推断出潜在的关系。ZO-1完整性评分与结肠中CD3+ T细胞数量呈负相关(r=−0.64,p<0.0001;图6)．结肠内T细胞数量与结肠内α-syn蛋白呈正相关(r=0.59, p<0.0001;图6 b)．结肠中的α-Syn与SN中小胶质细胞激活的标记物(即小胶质细胞体大小/总细胞大小之比)呈正相关(r=0.76, p<0.0001;图6 c)．同样，SN中吞噬样小胶质表型的存在(细胞体大小/总细胞大小的比值增加)与SN中多巴胺能细胞(TH+细胞)的数量呈负相关(r=−0.63,p<0.01;图6 d)．最后，SN中多巴胺能细胞的数量与运动功能(旋转行走跌倒的潜伏期)呈正相关(r=0.72, p<0.0001;图6 e)．

    Correlations support the gut-immune-brain axis involvement in rotenone-induced Parkinson’s disease (PD)-like in mice. (A) Zonula occludens 1 (ZO-1) integrity score, decreased with rotenone treatment, was inversely associated with the number of T cells in colon. (B) The number of T cells in colon, significantly increased with rotenone, was positively associated with alpha-synuclein (α-syn) expression in colon. (C) α-Syn expression in colon was positively correlated with the ratio microglial cell body size/total cell size in the substantia (SN). Rotenone exposure changed microglial phenotype into a more pro-inflammatory state (increased ratio cell body size/total cell size) in the SN. (D) This state inversely correlated with the number TH+ cells in the SN. (E) The number of TH+ cells in the SN, decreased after rotenone exposure, was positively associated with motor function (latency to fall in the rotarod).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    相关研究支持鱼藤酮诱导的小鼠类帕金森病(PD)中肠道-免疫-大脑轴的参与。(A)闭合带1 (ZO-1)完整性评分随鱼藤酮治疗而降低，与结肠内T细胞数量呈负相关。(B)结肠中T细胞的数量，鱼藤酮显著增加，与结肠中α-突触核蛋白(α-syn)的表达呈正相关。(C)结肠中α-Syn的表达与小胶质细胞体大小/细胞总大小的比值(SN)呈正相关。鱼藤酮暴露使SN中的小胶质细胞表型进入更有利于炎症的状态(细胞体大小/总细胞大小比值增加)。(D)这种状态与SN中TH+细胞的数量呈负相关。(E) SN中TH+细胞的数量在鱼藤酮暴露后减少，与运动功能(旋转杆下降的延迟)呈正相关。

    尽管鱼藤酮改变了TLR4-KO小鼠的黏膜和腔内微生物组，但TLR4-KO小鼠仍具有上述的有益作用

    我们评估了WT和TLR4-KO(有或没有鱼藤酮治疗)小鼠的盲肠黏膜和盲肠腔菌群。正如之前报道的,34我们证实鱼藤酮治疗对盲肠粘膜相关菌群和腔内菌群均有影响。此外，我们现在表明，无论鱼藤酮治疗与否，TLR4-KO小鼠都有改变的菌群分布(基因型效应)。

    α多样性、丰富度显示鱼藤酮治疗效果显著，仅在盲肠黏膜(双向方差分析:F(36)= 12.97, p = 0.0009)。基因型及鱼藤酮与基因型的互作均无显著影响(p>0.05)。鱼藤酮使wt -鱼藤酮的丰富度显著高于wt -载药小鼠(p依据小于0.001)(图7)．其他alpha多样性指数(Simpson指数、Shannon指数和均匀度)显示，鱼藤酮或基因型在两个采样点均无显著变化(数据未显示)。

    Microbiome analysis assessing mice wild type (WT) or toll-like receptor 4 (TLR4)-knockout (KO) (with or without rotenone treatment). (A) Caecal sample sites were examined for alpha diversity’s richness between all four mouse groups, at the taxonomic level of genus. Data expressed as mean+SEM and analysed with two-way analysis of variance (ANOVA): within the caecum mucosa, richness showed a significant rotenone treatment effect (F(1,36)=12.97, p=0.0009). Bonferroni post hoc test: **p=0.01, ***p=0.001. (B) Ordination plots (nMDS plots) of microbial community structure at the taxonomic level of genus, using analysis of similarity ANOSIM (Global R and P values shown), comparing WT-vehicle (pink triangles), WT-rotenone (green triangles), TLR4-KO-vehicle (red triangles) and TLR4-KO-rotenone (blue triangle) treated mice caecum mucosa and luminal content samples. (C) Firmicutes-to-bacteriodetes (F/B) ratio comparisons between mice caecal sample sites, at the taxonomic level of phylum. Data expressed as mean+SEM and analysed with two-way ANOVA: F/B ratio in the caecal mucosa showed a significant rotenone treatment effect (F(1,35)=5.135, p=0.0297), geneotype effect (F(1,35)=9.391, p=0.0042) and interaction between rotenone and genotype effect (F(1,35)=6.149, p=0.0181). The F/B ratio in the luminal content showed a significant effect of interaction between rotenone and genotype effect (F(1,34)=5.243, p=0.0284). Bonferroni post hoc test: *p=0.05, **p=0.01, ***p=0.001. (D, E) Caecal mucosa and luminal content stacked column plots depicting the relative abundances of individual bacterial genera (˂1%); significant (FDR-p) genus taxa are bolded.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    微生物组分析评估小鼠野生型(WT)或toll样受体4 (TLR4)敲除(KO)(有或没有鱼藤酮治疗)。(A)在属的分类学水平上，对盲肠样本点进行alpha多样性的丰富度检查。数据表达为均值+扫描电镜，并进行双向方差分析(ANOVA):在盲肠粘膜内，丰富度显示鱼藤酮治疗效果显著(F(36)= 12.97, p = 0.0009)。Bonferroni事后检验:**p=0.01， ***p=0.001。(B)属分类学层面微生物群落结构排序图(nMDS图)，采用ANOSIM相似度分析(Global R和P值所示)，比较wt -载药(粉色三角形)、wt -鱼藤酮(绿色三角形)、tlr4 - ko -载药(红色三角形)和tlr4 - ko -鱼藤酮(蓝色三角形)处理过的小鼠盲肠黏膜和腔内含量样品。(C)在门的分类水平上，小鼠盲肠样品点的厚壁菌和细菌(F/B)比值比较。数据以均值+扫描电镜(SEM)表达，并进行双向方差分析:盲肠黏膜F/B比值显示鱼藤酮治疗效果显著(F(35)=5.135, p=0.0297)(35)=9.391, p=0.0042)、鱼藤酮与基因型效应的相互作用(F(35)= 6.149, p = 0.0181)。腔内含量的F/B比显示鱼藤酮与基因型效应(F(34)= 5.243, p = 0.0284)。Bonferroni事后检验:*p=0.05， **p=0.01， ***p=0.001。(D, E)盲肠黏膜和腔内含量堆叠柱图，描述单个细菌属的相对丰度(小于等于1%);显著(FDR-p)属分类单元加粗。

    在beta多样性检验上，在属的分类学水平上，微生物群落结构总体上存在显著差异(ANOSIM黏膜:全局R=0.635;p = 0.001;ANOSIM腔内含量:全局R=0.572;p = 0.001) (图7 b)在盲肠黏膜和管腔内容物中均有显著变化。指定两个小鼠组比较的显著差异(例如，wt -载药vs wt -鱼藤酮;WT-vehicle vs TLR4-KO-vehicle(基因型))在网上有描述补充表S5．

    厚壁菌门与拟杆菌门(F/B)比值是不同实验组间微生物群落整体变化的可靠指标，是确定宿主SCFA水平的预测指标41（图7 c)．在盲肠黏膜中，鱼藤酮处理对F/B比值有显著影响(双向方差分析:F(35)=5.135, p=0.0297)，基因型效应(双向方差分析:F(35)=9.391, p=0.0042)和鱼藤酮与基因型效应的相互作用(双向方差分析:F(35)= 6.149, p = 0.0181)。事后分析显示，与WT-vehicle相比，wt -鱼藤酮的F/B比显著降低(p<0.01)。此外，tlr4 - ko -载药小鼠与wt -载药相比F/B比显著降低(p<0.001)，但tlr4 - ko -鱼藤酮小鼠与tlr4 - ko -载药相比无显著变化(p<0.001)。图7 c)．与盲肠黏膜相比，腔内含量样品的F/B比仅表现出鱼藤酮与基因型效应的交互作用的显著效应(双向方差分析:F(34)= 5.243, p = 0.0284)。事后分析显示，与WT-vehicle相比，TLR4-KO-vehicle的F/B比值显著降低(p<0.05) (图7 c)．总之，这些数据表明，无论灌胃剂/鱼藤酮治疗与否，TLR4-KO小鼠的F/B比明显低于WT-vehicle和鱼藤酮治疗，仅WT小鼠的F/B比较低。

    在属的分类水平上评估所有组的个体分类群差异(图7 d, E)．总体而言，盲肠黏膜分类群相对丰度差异大于腔内含量分类群(图7D, E, 8A和9A)．为了进一步描述类群差异，我们进行了两只小鼠模型比较，结果描述在图8B-E和9B-E．

    Caecum mucosa differential abundances of genus taxonomic level operational taxonomic units (OTU). (A) The number of significantly increased relative abundant genus taxa (FDR-p), per mouse caecal mucosa group. Volcano plot of estimated log2 fold change (FC) differences in genus (OTU) abundance between: effect of rotenone, (B) wild-type (WT)-vehicle vs WT-rotenoneand toll-like receptor 4 (TLR4)-knockout (KO)-vehicle vs TLR4-KO-rotenone; effect of TLR4-KO genotype, (C) WT-vehicle vs TLR4-KO-vehicleand WT-rotenone vs TLR4-KO rotenone, with corresponding Benjamini-Hochberg adjusted FDR-p values (q), derived from Kruskal-Wallis test in R programing language. The red dotted line indicates the 5% false discovery threshold. Prevalence indicates percentage of mice groups in which a given genus OTU is present. Abundance indicates mean relative abundance (%) of a given genus OTU. Name of genus OTUs differentially abundant at FDR≤5% are given at the lowest classified rank in Greengenes (Greengenes ID). The parameter log2FC was calculated for each mouse group according to the formula log2FC=log2(mean intervention/mean control). o, order; f, family; g, genus.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    盲肠黏膜属分类水平操作分类单位(OTU)的差异丰度。(A)每只小鼠盲肠黏膜组相对丰富的属类群(FDR-p)数量显著增加。火山图估计的log2倍变化(FC)之间的属(OTU)丰度差异:鱼藤酮的影响，(B)野生型(WT)载具vs WT-鱼藤酮和toll样受体4 (TLR4)敲除(KO)载具vs TLR4-KO-鱼藤酮;TLR4-KO基因型的影响(C) wt -载虫vs TLR4-KO载虫、wt -鱼藤酮vs TLR4-KO鱼藤酮，对应的Benjamini-Hochberg调整FDR-p值(q)，由R编程语言Kruskal-Wallis检验得出。红色虚线表示5%的错误发现阈值。患病率表示存在特定OTU属的小鼠群体的百分比。丰度表示给定OTU属的平均相对丰度(%)。差异丰度在FDR≤5%的OTUs属命名在Greengenes (Greengenes ID)分类秩中最低。根据公式log2FC=log2(平均干预/平均对照)计算各组小鼠的参数log2FC。o,秩序; f, family; g, genus.

    Caecum luminal content differential abundances of genus taxonomic level operational taxonomic units (OTU). (A) The number of significantly increased relative abundant genus taxa (FDR-p), per mouse caecal luminal content group. Volcano plot of estimated log2 fold change (FC) differences in genus (OTU) abundance between: effect of rotenone, (B) wild-type (WT)-vehicle vs WT-rotenone and toll-like receptor 4 (TLR4)-knockout (KO)-vehicle vs TLR4-KO-rotenone; effect of TLR4-KO genotype (C)WT-vehicle vs TLR4-KO-vehicle, (E) WT-rotenone vs TLR4-KO rotenone, with corresponding Benjamini-Hochberg adjusted FDR-p values (q), derived from Kruskal-Wallis test in R programing language. The red dotted line indicates the 5% false discovery threshold. Prevalence indicates percentage of mice groups in which a given genus OTU is present. Abundance indicates mean relative abundance (%) of a given genus OTU. Name of genus OTUs differentially abundant at FDR≤5% are given at the lowest classified rank in Greengenes (Greengenes ID). The parameter log2FC was calculated for each mouse group according to the formula log2FC=log2(mean intervention/mean control). o, order; f, family; g, genus.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9
    图9

    盲肠腔内含量差异丰度属分类水平操作分类单位(OTU)。(A)每只小鼠盲肠腔含量组相对丰富的属类群(FDR-p)数量显著增加。估计log2倍变化(FC)属(OTU)丰度差异的火山图:鱼藤酮的影响，(B)野生型(WT)载具vs WT-鱼藤酮和toll样受体4 (TLR4)敲除(KO)载具vs TLR4-KO-鱼藤酮;TLR4-KO基因型的影响(C) wt -载虫vs TLR4-KO载虫，(E) wt -鱼藤酮vs TLR4-KO鱼藤酮，对应的Benjamini-Hochberg调整FDR-p值(q)，由R编程语言Kruskal-Wallis检验得出。红色虚线表示5%的错误发现阈值。患病率表示存在特定OTU属的小鼠群体的百分比。丰度表示给定OTU属的平均相对丰度(%)。差异丰度在FDR≤5%的OTUs属命名在Greengenes (Greengenes ID)分类秩中最低。根据公式log2FC=log2(平均干预/平均对照)计算各组小鼠的参数log2FC。o,秩序; f, family; g, genus.

    总的来说，WT小鼠盲肠黏膜样品显示鱼藤酮处理可显著增加未分类Rikenellaceae、未分类细菌属的相对丰度(FDR-p < 0.05)S24-7，未分类的梭状芽胞杆菌和Allobaculum与wt -载药小鼠比较(图8 b）;鱼藤酮处理TLR4-KO小鼠可使未分类的Lachnospiraceae、未分类的Clostridiales和乳酸菌与tlr4 - ko载药小鼠相比(图8 c)．重要的是，在WT和TLR4-KO小鼠中，鱼藤酮处理均显著降低了假设的有益属的相对丰度(FDR-p < 0.05)双歧杆菌,在盲肠粘膜样本中。盲肠腔内含量的相对丰度变化类似，但不太明显(图9B和C)．

    当检测盲肠黏膜TLR4-KO基因型效应时，TLR4-KO载药小鼠显示出未分类理肯菌科(Rikenellaceae)未分类的推定“促炎”菌属的相对丰度显著增加(FDR-p依据0.05)S24-7而且拟杆菌；假定的“有益”植物属的相对丰度下降(FDR-p依据0.05)。双歧杆菌属而且乳酸菌，与wt -载药小鼠比较(图8 d)．此外，tlr4 - ko -鱼藤酮小鼠仅显示该属的相对丰度显著降低(FDR-p < 0.05)乳酸菌与wt -鱼藤酮相比(图8 e)．在盲肠腔内含量也有类似的，但相对丰度较低的个体类群变化。总之，这些数据表明，TLR4-KO小鼠显示出改变的菌群图谱，而鱼藤酮治疗导致了相似的菌群图谱，而与基因型无关。

    讨论

    已有研究表明，神经炎症和氧化应激参与了α-syn蛋白的错误折叠和聚集。42-46我们9和其他人12 13日18他们提出，触发这种神经炎症和大脑中的免疫激活的是肠道菌群。有大量的文献表明，对肠道菌群的操纵会影响大脑功能和炎症。47-49更具体地说,我们9和其他人12 13 15 17 50-53已经显示PD患者体内存在促炎不良菌群。因此，我们假设不良菌群通过TLR4信号通路触发结肠黏膜免疫激活，导致PD的神经炎症和神经退行性变。这一假设基于已发表的研究结果:PD患者有:(1)不良的菌群，其特征是产生内毒素的细菌数量增加，9(2) PD患者血清LBP升高时内毒素(LPS)泄漏和全身内毒素泄漏的证据。8 28为了验证我们的假设，我们首先评估了PD患者结肠黏膜中的TLR4通路。我们选择结肠(乙状结肠组织)进行研究是因为:(1)PD患者的结肠粘膜样品主要是结肠肠高通透性，而不是小肠高通透性，且有LPS易位8(2) PD患者粪便中结肠细菌发酵产物SCFA水平明显低于健康人。13正如我们所预测的，我们发现PD患者结肠中存在促炎状态，其表现为CD3+ T细胞、TLR4+细胞的增加，促炎细胞因子和趋化因子的增加，PD患者结肠组织中产生scfa的结肠细菌的丰度降低。增加的t细胞运输到结肠粘膜是与PD相关的一个特征。最近的一项研究报告了便秘的PD患者的结肠黏膜中t细胞的运输增加。21同样，本研究中PD患者的活检组织分析显示，与HC患者相比，PD患者的CD3+细胞数量更高，同时CCR5等趋化信号增加，这可能是PD结肠中CD3+ T细胞增加的原因。鱼藤酮治疗小鼠结肠中CD3+ T细胞也增加。有可能是肠屏障功能障碍8和/或PD患者中发现的异常菌群12 13 15 17 50-53促进t细胞进入肠道然而，未来的肠道菌群操纵研究有必要验证这一效果。

    根据我们的假设，我们首次发现，PD患者结肠黏膜中TLR4 mRNA和蛋白以及TLR4信号的上调与IRAK2的增加/ TOLLIP的减少以及TLR4激活的myd88依赖通路介导的细胞因子IL-1β、IFN-γ、IFN-β和CCL5水平的升高有关。有趣的是，TLR4信号的标记物与尿三氯蔗糖之间有很强的相关性，这表明肠道通透性的增加可能是TLR4介导的结肠炎症状态的结果。

    为了更直接地证明TLR4信号在PD的肠道和大脑炎症以及免疫激活中的关键作用，我们使用了一个PD病理的鱼藤酮小鼠模型，并表明TLR4- ko小鼠对鱼藤酮诱导病理的许多PD样结果具有保护作用。我们和其他人已经证明，口服鱼藤酮治疗的小鼠结肠黏膜中CD3+ T细胞和TLR4+细胞数量增加，这种促炎状态与GFAP+肠胶质细胞数量增加和结肠肌肠丛中α-syn病理有关。31日54 55综上所述，这些发现可能表明肠道炎症导致肠胶质细胞的激活。在PD患者中也报道了肠胶质细胞激活的增加。56在本研究中，我们发现TLR4的缺失显著减轻了鱼藤酮对肠屏障完整性、肌间丛GFAP表达、结肠α-syn、SN微胶质激活以及多巴胺能细胞损失和运动功能障碍的影响。我们的发现证实了之前的研究，即敲除TLR4可以减轻大脑中的神经炎症。57综上所述，我们在人类样本和啮齿动物模型中的研究结果强烈表明tlr4介导的信号通路可能在PD的肠道渗漏、肠道源性炎症、神经炎症和神经退行性变中发挥作用。

    在PD患者的结肠和大脑中观察到tlr4介导的免疫激活可能是继发于肠道菌群的变化。我们的研究结果支持这一观点，并表明鱼藤酮治疗和关键细菌识别受体TLR4的丢失都导致了“促炎症”的不良菌群组成。例如，我们发现F/B比率下降，推定的抗炎菌属的相对丰度降低双歧杆菌属和/或乳酸菌,未分类的Rickenellaceae的推定促炎症肠道细菌属的相对丰度增加，Allobaculum而且拟杆菌在wt -鱼藤酮和/或tlr4 - ko载药小鼠中。我们的研究结果表明，TLR4受体的缺失导致菌群失调，这并不令人惊讶，而且与之前的研究一致，发现TLR2、5、NLRP3等关键黏膜免疫分子的缺失导致促炎性菌群失调组成。58 59这些研究表明，存在一种双向的相互作用机制，宿主的先天免疫系统(即TLR4、2、5受体和NLRP3)潜在地塑造了微生物群的组成，然后微生物群塑造了宿主的免疫系统，导致肠道、全身和神经炎症。因此，推测TLR4- ko不能完全保护鱼藤酮诱导的PD样病理的一个原因是TLR4的丢失导致了促炎不良菌群。需要进一步的介入研究，如共住和粪便移植，或TLR4通路的基因沉默，以直接验证这一假设，并建立TLR4、菌群、肠道和中枢神经系统炎症和PD神经退行性变之间的直接联系。

    我们的研究有一些局限性。首先，我们承认PD的样本量很小。我们选择只研究没有便秘的新诊断患者，以避免便秘和长时间的疾病对我们的结果测量的潜在影响。招募愿意接受乙状结肠镜检查和乙状结肠活检的非便秘PD患者是非常困难的。重要的是，即使样本量很小，我们在PD和HC受试者之间检测到TLR4和CD3反应性、屏障完整性破坏、结肠中促炎基因谱和粪便微生物群组成的显著差异。尽管PD和对照组之间没有统计学上的差异，我们也承认PD患者队列中的年龄差异。

    总之，我们的概念证明和翻译研究进一步支持了微生物群和肠源性炎症过程参与PD和TLR4信号通路中的神经炎症和神经退行性变的概念，至少部分介导了这种相互作用。需要进一步的介入动物研究来建立TLR4和PD病理之间的直接因果关系。此外，我们的研究样本量有限，需要进一步使用大的PD队列进行人体研究来证实我们的发现。尽管如此，我们的研究表明TLR4是一个有前景的PD治疗靶点，并为未来的介入研究提供了科学前提。

    参考文献

    1. ↵
      2. 赫希电子商务，
      3. Hunot年代
      ．帕金森病的神经炎症:神经保护的目标?柳叶刀神经2009；8：382- - - - - -97．doi: 10.1016 / s1474 - 4422 (09) 70062 - 6
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    2. ↵
      2. 赫希电子商务，
      3. Vyas以及年代，
      4. Hunot年代
      ．帕金森病的神经炎症．帕金森症遗传代数Disord2012；18增刊1（增刊1)：S210- - - - - -S212．doi: 10.1016 / s1353 - 8020 (11) 70065 - 7
      OpenUrl
    3. ↵
      2. XanthosDN，
      3. SandkuhlerJ
      ．神经源性神经炎症:神经活动引起的中枢神经系统炎症反应．Nat转速>2014；15：43- - - - - -53．doi: 10.1038 / nrn3617
      OpenUrl CrossRef PubMed
    4. ↵
      2. Garcia-EsparciaP，
      3. LlorensF，
      4. 卡蒙米，等
      ．帕金森病脑免疫反应的细胞因子和介质的复杂失调和表达是区域依赖性的．大脑病理学研究2014；24：584- - - - - -98．doi: 10.1111 / bpa.12137
      OpenUrl CrossRef PubMed
    5. ↵
      2. Mogi米，
      3. 原田米，
      4. NarabayashiH，等
      ．白介素(IL)-1 β、IL-2、IL-4、IL-6和转化生长因子- α在青少年帕金森症和帕金森病脑室脑脊液中的水平升高．>列托人1996；211：13- - - - - -16．0304 - 3940 . doi: 10.1016 / (96) 12706 - 3
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    6. ↵
      2. BrodackiB，
      3. StaszewskiJ，
      4. ToczyłowskaB，等
      ．血清白介素(IL-2, IL-10, IL-6, IL-4)， TNFalpha和INFgamma浓度在非典型和特发性帕金森病患者中升高．>列托人2008；441：158- - - - - -62．doi: 10.1016 / j.neulet.2008.06.040
      OpenUrl CrossRef PubMed
    7. ↵
      2. Reale米，
      3. IarloriC，
      4. 托马斯。一个，等
      ．外周细胞因子在帕金森病中的分布．大脑Behav Immun2009；23：55- - - - - -63．doi: 10.1016 / j.bbi.2008.07.003
      OpenUrl CrossRef PubMed
    8. ↵
      2. 福赛斯CB，
      3. 香农公里，
      4. KordowerJH，等
      ．肠通透性增加与乙状结肠黏膜α -突触核蛋白染色和早期帕金森病内毒素暴露标志物相关．《公共科学图书馆•综合》2011；6：e28032．doi: 10.1371 / journal.pone.0028032
    9. ↵
      2. 克沙一个，
      3. 绿色SJ，
      4. 企业巴勒斯坦权力机构，等
      ．帕金森病的结肠细菌组成．运动障碍2015；30.：1351- - - - - -60．doi: 10.1002 / mds.26307
      OpenUrl CrossRef PubMed
    10. ↵
      2. 狄维士D，
      3. LebouvierT，
      4. LardeuxB，等
      ．帕金森病的结肠炎症．一般人说2013；50：42- - - - - -8．doi: 10.1016 / j.nbd.2012.09.007
      OpenUrl CrossRef PubMed
    11. ↵
      2. 棕褐色啊，
      3. 摩诃提婆年代，
      4. Thalha我，等
      ．帕金森病的小肠细菌过度生长．帕金森症遗传代数Disord2014；20.：535- - - - - -40．doi: 10.1016 / j.parkreldis.2014.02.019
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      2. ScheperjansF，
      3. 哦V，
      4. 佩雷拉帕布，等
      ．肠道菌群与帕金森病及临床表型相关．运动障碍2015；30.：350- - - - - -8．doi: 10.1002 / mds.26069
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      2. 昂格尔毫米，
      3. 明镜J，
      4. DillmannKU，等
      ．短链脂肪酸和肠道菌群在帕金森病患者和年龄匹配的对照组之间存在差异．帕金森症遗传代数Disord2016；32：66- - - - - -72．doi: 10.1016 / j.parkreldis.2016.08.019
      OpenUrl CrossRef PubMed
    14. ↵
      2. Helander高频，
      3. Fandriksl
      ．消化道表面-重新检查．Scand杂志2014；49：681- - - - - -9．doi: 10.3109 / 00365521.2014.898326
      OpenUrl CrossRef PubMed
    15. ↵
      2. 效果F，
      3. Kunstner一个，
      4. 穆勒上海，等
      ．德国北部队列研究中帕金森病的肠道菌群．大脑Res2017；1667：41- - - - - -5．doi: 10.1016 / j.brainres.2017.04.019
      OpenUrl
    16. ↵
      2. 彼得罗夫弗吉尼亚州，
      3. Saltykova4，
      4. 可娃IA，等
      ．帕金森病患者肠道菌群分析．布尔生物医学院2017；162：734- - - - - -7．doi: 10.1007 / s10517 - 017 - 3700 - 7
      OpenUrl CrossRef PubMed
    17. ↵
      2. Bedarf小，
      3. 希尔德布兰德F，
      4. 科埃略LP，等
      ．早期帕金森病患者肠道微生物和病毒宏基因组变化的功能意义L-DOPA-naïve．基因组医学2017；9：39．doi: 10.1186 / s13073 - 017 - 0428 - y
      OpenUrl CrossRef PubMed
    18. ↵
      2. 桑普森TR，
      3. DebeliusJW，
      4. 刺T，等
      ．肠道菌群调节帕金森病模型中的运动缺陷和神经炎症．细胞2016；167：1469- - - - - -80．doi: 10.1016 / j.cell.2016.11.018
      OpenUrl CrossRef PubMed
    19. ↵
      2. 克莱恩摩根富林明，
      3. O’mahonySM
      ．微生物-肠道-大脑轴:从肠道到行为．Neurogastroenterology &能动性2011；23：187- - - - - -92．doi: 10.1111 / j.1365-2982.2010.01664.x
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    20. ↵
      2. ·莱特米
      ．微生物-肠道-大脑轴上的微生物内分泌学:细菌产生和利用神经化学物质如何影响行为．公共科学图书馆Pathog2013；9：e1003726．doi: 10.1371 / journal.ppat.1003726
      OpenUrl CrossRef PubMed
    21. ↵
      2. 陈Y，
      3. 余米，
      4. 刘X，等
      ．帕金森氏病患者便秘的临床特征及外周血T细胞亚群．临床经验病理学2015；8：2495- - - - - -504．
      OpenUrl
    22. ↵
      2. BraakH，
      3. 德尔TrediciK
      ．散发性帕金森病的神经系统病理学．神经学2008；70：1916- - - - - -25．wnl.0000312279.49272.9f doi: 10.1212/01.
      OpenUrl CrossRef PubMed
    23. ↵
      2. 香农公里，
      3. 克沙一个，
      4. Dodiya乙肝，等
      ．结肠中的突触核蛋白是运动前帕金森病的生物标志物吗?来自3个病例的证据．运动障碍2012；27：716- - - - - -9．doi: 10.1002 / mds.25020
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      2. 希尔顿D，
      3. 史蒂芬斯米，
      4. 柯克l，等
      ．帕金森病临床前期患者肠道中α-突触核蛋白的积累．Acta Neuropathol2014；127：235- - - - - -41．doi: 10.1007 / s00401 - 013 - 1214 - 6
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    25. ↵
      2. Stokholm毫克，
      3. Danielsen嗯，
      4. Hamilton-DutoitSJ，等
      ．前驱症状帕金森病患者胃肠道组织中的病理性α-突触核蛋白．安神经2016；79：940- - - - - -9．doi: 10.1002 / ana.24648
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      2. 关J，
      3. PavlovicD，
      4. DalkieN，等
      ．帕金森病的血管变性．大脑病理学研究2013；23：154- - - - - -64．doi: 10.1111 / j.1750-3639.2012.00628.x
      OpenUrl CrossRef PubMed
    27. ↵
      2. 谢赫米，
      3. 拉詹K，
      4. 福赛斯CB，等
      ．尿糖探针同步气相色谱法评估肠通透性:利用时间过程分析优化其评估区域肠通透性的应用．中国詹学报2015；442：24- - - - - -32．doi: 10.1016 / j.cca.2014.12.040
      OpenUrl
    28. ↵
      2. 朋友GD，
      3. 谢赫米，
      4. 福赛斯CB，等
      ．异常的脂多糖结合蛋白作为帕金森病胃肠道炎症的标志．前>2015；9：306．doi: 10.3389 / fnins.2015.00306
      OpenUrl
    29. ↵
      2. 企业巴勒斯坦权力机构，
      3. Dodiya乙肝，
      4. Naqib一个，等
      ．肠源性炎症在多系统萎缩中的潜在作用．J帕金森氏病说2017；7：331- - - - - -46．doi: 10.3233 /詹妮弗- 160991
      OpenUrl
    30. ↵
      2. 沃伊特RM，
      3. 克沙一个，
      4. LosurdoJ，等
      ．hiv相关粘膜基因表达:区域特异性改变．艾滋病2015；29：537- - - - - -46．doi: 10.1097 / QAD.0000000000000569
      OpenUrl CrossRef PubMed
    31. ↵
      2. Perez-PardoP，
      3. Dodiya乙肝，
      4. BroersenLM，等
      ．帕金森病模型的脑-肠和脑-肠轴:尿苷和鱼油饮食的影响．减轻>201712．
    32. ↵
      2. Balda女士，
      3. 事K
      ．紧密连接一目了然．J细胞科学2008；121：3677- - - - - -82．doi: 10.1242 / jcs.023887
      OpenUrl 免费的全文
    33. ↵
      2. PoritzLS，
      3. GarverKI，
      4. 绿色C，等
      ．葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎中紧密连接蛋白ZO-1的丢失．Res病理学杂志2007；140：12- - - - - -19．doi: 10.1016 / j.jss.2006.07.050
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    34. ↵
      2. Perez-PardoP，
      3. Dodiya乙肝，
      4. 企业巴勒斯坦权力机构，等
      ．帕金森氏症小鼠模型的肠道细菌组成．Benef微生物2018；9：799- - - - - -814．doi: 10.3920 / BM2017.0202
      OpenUrl
    35. ↵
      2. 扬科维奇J，
      3. 麦克德莫特米，
      4. 卡特J，等
      ．帕金森病的可变表达:DATATOP队列的基线分析帕金森研究小组．神经学1990；40：1529- - - - - -34．doi: 10.1212 / WNL.40.10.1529
      OpenUrl CrossRef PubMed
    36. ↵
      2. GoetzCG，
      3. PoeweW，
      4. RascolO，等
      ．运动障碍社会工作小组关于hoehn和yahr分期量表的报告:现状和建议．Mov Disord2004；19：1020- - - - - -8．doi: 10.1002 / mds.20213
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    37. ↵
      2. GutsmannT，
      3. 穆勒米，
      4. 卡罗尔科幻小说，等
      ．脂多糖(LPS)结合蛋白在中和LPS和增强LPS诱导的单个核细胞活化中的双重作用．感染Immun2001；69：6942- - - - - -50．doi: 10.1128 / iai.69.11.6942 - 6950.2001
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    38. ↵
      2. Wurfel毫米，
      3. Kunitake圣，
      4. LichensteinH，等
      ．脂多糖(LPS)结合蛋白被携带在脂蛋白上，并作为中和脂多糖的辅助因子．J Exp地中海1994；180：1025- - - - - -35．doi: 10.1084 / jem.180.3.1025
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    39. ↵
      2. Gegner晶澳，
      3. UlevitchRJ，
      4. 托拜厄斯PS
      ．脂多糖(LPS)信号转导和清除。LPS结合蛋白和膜CD14的双重作用．J临床生物化学1995；270：5320- - - - - -5．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    40. ↵
      2. ErnyD，
      3. Hraběde旧金山艾尔，
      4. JaitinD，等
      ．宿主菌群持续控制着中枢神经系统小胶质细胞的成熟和功能．Nat >2015；18：965- - - - - -77．doi: 10.1038 / nn.4030
      OpenUrl CrossRef PubMed
    41. ↵
      2. 费尔南德斯J，
      3. 苏W，
      4. Rahat-Rozenbloom年代，等
      ．肥胖、肠道菌群和粪便短链脂肪酸在成年人中是有联系的．减轻糖尿病2014；4：e121．doi: 10.1038 / nutd.2014.23
      OpenUrl CrossRef PubMed
    42. ↵
      2. Deleidi米，
      3. 夸夸其谈的人T
      ．炎症在散发和家族性帕金森病中的作用．细胞分子生命科学2013；70：4259- - - - - -73．doi: 10.1007 / s00018 - 013 - 1352 - y
      OpenUrl CrossRef PubMed
    43. ↵
      2. 迪亚斯V，
      3. JunnE，
      4. 额度远远没毫米
      ．氧化应激在帕金森病中的作用．J公园说2013；3.：461- - - - - -91．
      OpenUrl
    44. ↵
      2. 玻璃CK，
      3. SaijoK，
      4. 赢家B，等
      ．神经退行性炎症的潜在机制．细胞2010；140：918- - - - - -34．doi: 10.1016 / j.cell.2010.02.016
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    45. ↵
      2. 月神E，
      3. 陆KC
      ．弯曲变形:α-突触核蛋白错误折叠与帕金森病致病途径的趋同．2月列托人2015；589：3749- - - - - -59．doi: 10.1016 / j.febslet.2015.10.023
      OpenUrl
    46. ↵
      2. 凯蒂RM
      ．神经炎症如何导致神经退行性变．科学2016；353：777- - - - - -83．doi: 10.1126 / science.aag2590
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    47. ↵
      2. 意图K，
      3. DinanTG，
      4. 克莱恩摩根富林明
      ．微生物群:压力和神经炎症的关键调节器．一般人的压力2016；4：23- - - - - -33．doi: 10.1016 / j.ynstr.2016.03.001
      OpenUrl
    48. ↵
      2. DinanTG，
      3. 克莱恩摩根富林明
      ．肠道本能:微生物群是大脑发育、衰老和神经退行性变的关键调节器．杂志2017；595：489- - - - - -503．doi: 10.1113 / JP273106
      OpenUrl CrossRef PubMed
    49. ↵
      2. DinanTG，
      3. 克莱恩摩根富林明
      ．2016年的脑-肠轴:脑-肠-菌群轴-情绪、代谢和行为．Nat Rev胃肠醇2017；14：69- - - - - -70．doi: 10.1038 / nrgastro.2016.200
      OpenUrl
    50. ↵
      2. 长谷川年代，
      3. 转到年代，
      4. 信H，等
      ．帕金森氏病的肠道失调和血清脂多糖结合蛋白降低．《公共科学图书馆•综合》2015；10：e0142164．doi: 10.1371 / journal.pone.0142164
    51. ↵
      2. Hill-Burns新兴市场，
      3. DebeliusJW，
      4. 莫顿JT，等
      ．帕金森氏症和帕金森氏症的药物具有不同的肠道微生物群特征．运动障碍2017；32：739- - - - - -49．doi: 10.1002 / mds.26942
      OpenUrl CrossRef PubMed
    52. ↵
      2. 李W，
      3. 吴X，
      4. 胡X，等
      ．帕金森病肠道菌群的结构变化及其与临床特征的相关性．中国科学:生命科学2017；60：1223- - - - - -33．doi: 10.1007 / s11427 - 016 - 9001 - 4
      OpenUrl CrossRef PubMed
    53. ↵
      2. 彼得罗夫弗吉尼亚州，
      3. Saltykova4，
      4. 可娃IA，等
      ．帕金森病患者肠道菌群分析．布尔生物医学院2017；162：734- - - - - -7．doi: 10.1007 / s10517 - 017 - 3700 - 7
      OpenUrl CrossRef PubMed
    54. ↵
      2. Pan-MontojoF，
      3. AnichtchikO，
      4. 德宁Y，等
      ．小鼠灌胃鱼藤酮可重现帕金森病病理进展．《公共科学图书馆•综合》2010；5：e8762．doi: 10.1371 / journal.pone.0008762
    55. ↵
      2. Drolet再保险，
      3. 大炮小，
      4. 蒙特l，等
      ．长期接触鱼藤酮可重现帕金森氏症胃肠道神经病理．一般人说2009；36：96- - - - - -102．doi: 10.1016 / j.nbd.2009.06.017
      OpenUrl CrossRef PubMed
    56. ↵
      2. ClairembaultT，
      3. Leclair-Visonneaul，
      4. Neunlist米，等
      ．肠胶质细胞:帕金森病的新参与者?运动障碍2015；30.：494- - - - - -8．doi: 10.1002 / mds.25979
      OpenUrl
    57. ↵
      2. 梅斯米，
      3. Kubera米，
      4. LeunisJC
      ．抑郁症患者的肠-脑屏障:肠黏膜功能障碍伴革兰氏阴性肠杆菌(漏肠)LPS易位增加在抑郁症的炎症病理生理中起作用．神经性列托人2008；29：117- - - - - -24．
      OpenUrl PubMed
    58. ↵
      2. Henao-MejiaJ，
      3. ElinavE，
      4. 金C，等
      ．炎症体介导的生物失调调节NAFLD和肥胖的进展．自然2012；482：179- - - - - -85．doi: 10.1038 / nature10809
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    59. ↵
      2. 金C，
      3. Henao-MejiaJ，
      4. Flavell类风湿性关节炎
      ．先天免疫受体:代谢性疾病进展的关键调节因子．细胞金属底座2013；17：873- - - - - -82．doi: 10.1016 / j.cmet.2013.05.011
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学

    脚注

    • PP-P和HBD贡献相当。

    • ADK和AK贡献相等。

    • 贡献者(1)研究项目:A.构思，B.组织，C.执行;d .监督;(2)统计分析:A.设计，B.执行，C.审查和评价;(3)备稿:A.初稿撰写，B.审稿批改。Pp-p: 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 3a, 3b。Hbd: 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 3a, 3b。Pae: 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3b。Cbf: 1b, 1c, 1d, 2c, 3b。嗯:1b, 1c, 2b, 3b。老师:1b, 2c, 3b。 RMV: 1B, 2C, 3B. JHK: 1B, 2C, 3B. KMS: 1B, 2C, 3B. JG: 1B, 2C, 3B. ADK: 1A, 1C, 1D, 2C, 3B. AK: 1A, 1C, 1D, 2C, 3B.

    • 资金作者们还没有从任何公共、商业或非营利部门的资助机构为这项研究宣布具体的资助。

    • 相互竞争的利益JG教授是荷兰乌得勒支纽迪西亚研究公司的雇员。其他所有作者都表示没有潜在的利益冲突。

    • 伦理批准动物实验经荷兰乌得勒支大学动物研究伦理委员会批准。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。