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背景和目的慢性炎症引起的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞癌(HCC)的风险增加。然而,对与乙型肝炎病毒有关的肝癌的免疫景观及其影响的设计有效的癌症免疫治疗。
方法我们审问的免疫微环境与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC使用免疫组织化学和血细胞计数的飞行时间(CyTOF)。在识别独特的免疫子集丰富与乙型肝炎病毒有关的肝癌,我们进一步审问他们的表型和功能使用下一代测序(上天)和体外t细胞增殖化验。
结果深入审讯的免疫景观显示,调节性T细胞(T注册)和CD8+居民记忆T细胞(TRM)富含与乙型肝炎病毒有关的肝癌,而Tim-3+CD8+T细胞和CD244+自然杀伤细胞在non-viral-related HCC丰富。总会在孤立的T注册和TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC识别不同的功能特征与t细胞受体信号有关,t细胞聚集有关,抗原表示和程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)信号。T注册和TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌表达更多PD-1,功能抑制和疲惫比non-virus-related肝癌。此外,由PD-1免疫抑制+T注册可以逆转anti-PD-1封锁。使用多路复用组织免疫荧光,我们进一步表明,T注册和TRM导致整体病人生存:T注册与不良预后相关,TRM与肝细胞癌的预后良好。
结论我们已经表明,与乙型肝炎病毒有关的肝癌微环境免疫抑制和疲惫比non-viral-related肝癌微环境。这样深入的理解具有重要影响的疾病管理和适当的免疫治疗中的应用。
- 乙型肝炎
- 肝细胞癌
- 免疫疗法
- 癌症免疫生物学
- 免疫调节
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
与乙型肝炎病毒有关的肝癌的肿瘤微环境(时间)的上下文中主要研究一个特定的免疫子集或通过对比与乙型肝炎病毒有关的肝癌肝脏慢性乙型肝炎病毒感染患者或健康人群。
全面、多维分析关注与乙型肝炎病毒有关的肝癌和缺乏non-viral-related肝癌。
有什么新发现吗?
我们分析了时间与乙型肝炎病毒有关的肝癌相比non-viral-related HCC使用CyTOF和门店。
我们确定了不同免疫富集在HCC目的子集,并发现与乙型肝炎病毒有关的肝癌免疫景观包括更多的免疫抑制和疲惫的表型。
T注册和rTRM丰富的与乙型肝炎病毒有关的肝癌与整体有关病人生存在相反的方向。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
深入理解时间与乙型肝炎病毒有关的与non-viral-related HCC将允许我们设计合理结合的免疫治疗特定的病因学。
新型免疫治疗目标唯一的通路与乙型肝炎病毒有关的肝癌或non-viral-related HCC可能为更好的疾病管理而设计的。
介绍
肝细胞癌(HCC)是男性最常见的癌症之一,第三个癌症相关死亡的最常见原因,全球。乙型肝炎病毒感染肝细胞癌是最常见的原因;全球多达4亿个人生活与慢性乙型肝炎病毒感染和高患肝癌的风险,与大多数情况下发现在亚洲和非洲。1 2
肝细胞癌的不同目的,尤其是那些因慢性病毒性肝炎,很好地描述,但对肿瘤微环境的影响(时间)和疾病管理的后续影响不清楚。在这个领域许多研究都集中在一个免疫子集或将viral-related肝癌的免疫状况与健康肝脏或肝脏暴露于慢性肝炎病毒感染。3 4全面研究不同免疫景观和肝癌的潜在机制有或没有慢性乙型肝炎病毒感染仍然是未知的。有一种普遍的共识,即免疫系统是关键在确定临床肝癌患者的命运。5病毒也可能让他们的免疫微环境诱导的免疫抑制,外围公差在慢性感染,最终,tumourigenesis。6因此,我们考虑一个更好的理解免疫与乙型肝炎病毒有关的风景和non-viral-related HCC将极大地帮助我们评估时间在疾病进展和预后的影响。
理解在癌症免疫景观的构成也是我们了解反应的免疫疗法的核心。最近突破癌症免疫疗法,特别是免疫抑制剂检查站的发展,已经取得了有前景的结果在临床试验中多种癌症,包括肝细胞癌。7 8尽管有这些进展,基本差异等病人反应治疗原因不明。有些人认为这些差异突变的肿瘤负担9或者neo-antigen-specific T细胞的存在,10而其他人则强调tumour-immune浸润的重要性。11大规模转录组和免疫遗传学分析分层癌症免疫风景试图阐明这一领域最近也报道。12日13检查点抑制剂的响应率,nivolumab (anti-PD-1单克隆抗体)肝癌-20% ~ 15%,并且没有明显区别与乙型肝炎病毒有关的或non-viral-related HCC已被确认。14鲜为人知的机制病人对治疗的反应。近年来,我们和其他人使用CyTOF为≤41细胞参数,同时分析单个细胞immunophenotype许多疾病,包括肝细胞癌。15 - 17日这种多维分析帮助我们深刻理解时间和免疫治疗的影响疾病进展和响应。
这里,我们结合CyTOF,门店和多路复用组织immunoflorescence(如果)比较免疫之间的景观与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related肝癌。通过这种方法,我们发现了几个不同的免疫人群特定与乙型肝炎病毒有关的肝癌具有独特的功能,并确定影响影响患者的总生存期(OS)。
材料和方法
病人
新鲜肿瘤组织,相邻non-tumour组织和血液样本收集来自23个肝癌患者接受手术切除新加坡国立癌症中心或新加坡总医院(功能减退)(在线补充表S1)。Tumour-infiltrating白细胞(尖)和non-tumour-infiltrating白细胞(NILs)孤立使用100 U /毫升静脉注射胶原蛋白。外周血单核细胞(PBMCs)与术前使用Ficoll-Pague +(通用电气医疗集团)血液样本,如前所述。18Formalin-fixed和石蜡包埋(FFPE)组织芯片(TMA)幻灯片获得从一个独立的肝癌组(n = 102)的病理学、功能减退(在线补充表S2)。进一步的FFPE组织切除肝癌患者(n = 116)收集的功能减退(n = 37);玛丽女王医院、香港(n = 42)和苏黎世大学医院,瑞士(n = 37)(在线补充表S3)。病人同意后得到每个机构审查委员会的指导方针。
补充文件1
血细胞计数的飞行时间
尖,尼尔斯和PBMCs 23肝癌患者(在线补充表S1由CyTOF)进行分析,有或没有5小时的刺激与佛波醇12-myristate 12-acetate (PMA) / Ionomycin如前所述。16短暂,细胞被解冻,休息一夜之间在罗斯威尔公园纪念研究所媒体有10%的人类血清和沾染了35位抗体(在线补充表S4)和三anti-CD45-antibody条形码同时样本处理如前所述。19生成的文件是debarcoded (CD45+),封闭的基于DNA的大小和内容标签与DNA-intercalater(德国焊接学会科学)和活细胞对顺铂不利。个人文件downsampled 10 000 - CD45生活+免疫细胞和分析使用内部开发Multidimensional-Automated减少和可视化软件17基于非线性降维算法的组合(Barnes-Hut SNE)和k-means-clustering算法。20.独立CyTOF数据也验证使用FlowJo软件(V.X.0.7,树星)(在线补充表S1)。
新一代测序
尖被孤立于与乙型肝炎病毒有关的肝癌(n = 3 - 4)和non-viral-related肝癌(n = 3)和彩色表面标记:CD45, CD3, CD4, CD8、CD45RO、CD103从Biolegend(所有),和PD-1 (BD生物科学)。调节性T细胞(T注册)(CD4+CD25+CD127- - - - - -)和居民记忆T细胞(TRM;CD8+CD103+使用FACSAria-III CD45RO +)排序(BD生物科学)-99%纯度为95%。总RNA分离使用Picopure RNA-Isolation工具包(Arcuturus Ambion)和cDNA生成使用智能Seqv4超低输入RNA工具包(Clontech),根据制造商的指示。Illumina-ready图书馆准备从cDNA使用Illumina-NexteraXT DNA-Library-Prep工具包(Illumina公司)。测序了新加坡捷平台基因组研究所HiSeq 2500平台上使用HighOutput V.3。
原始测序读通过分层索引映射为拼接对齐的成绩单Human-Assembly-GRCh38的引用。p7运用。一致读然后排序使用SAMtools和原始基因数量与高通量测序数据提取。21磨边机工具被用来分析两组样本之间的差异基因表达。经验贝叶斯quasi-likelihood野生是广义线性模型中使用管道gene-wise统计分析。基因与叠化> 2,p < 0.01。数据呈现出来的热量地图使用R-Script和进一步注释Reactome途径分析。
体外t细胞抑制试验
T细胞抑制试验进行根据先前发表的方法,使用少量tissue-isolated T注册。22短暂,尖沾以下反抗体:CD45, CD3, CD4, CD8、CD25、CD45RO、CD103, CD127(所有从Biolegend)和PD-1 (BD生物科学)。同时,自体PBMCs与CellTrace prelabelled紫色染料(C34557,生活技术),然后用反人类的抗体染色:CD45, CD3、CD4细胞CD25和CD127。FACSAria-III (BD生物科学)是用来隔离PD-1+T注册或PD-1- - - - - -T注册(PD-1+/ PD-1- - - - - -CD45+CD3+CD4+CD25+CD127罗细胞)和TRM或non-TRM(CD103+/ CD103- - - - - -CD45+CD8+CD45RO+从尖细胞),CellTrace Violet-labelled响应者T细胞(Tresp;CD45+CD3+CD4+CD25- - - - - -CD127嗨自体的细胞)PBMCs从网上(n = 7与乙型肝炎病毒有关的肝癌补充表S1)。Tresp 96 -孔板细胞cocultured PD-1为5天+T注册,PD-1- - - - - -T注册TRM或non-TRM以1:1比例(20 000个细胞),有或没有20 000个人类T注册抑制检查员珠子(Miltenyi研究)。在另一项实验中,抑制试验进行的反人类的PD-1或编程death-ligand 1 (PD-L1)抗体与各自的同形像控制抗体从Biolegend(所有)。这些实验结束时,细胞收获和信号从CellTrace紫色染料进行了分析使用BD LSR FORTESSA五个激光(BD生物科学)。数据分析是使用FlowJo执行软件。
多路复用组织如果
多路复用组织如果执行使用OpalMultiplex免疫组织化学系统,图像是在威达3.0自动定量病理学成像系统(珀金埃尔默),如前所述。234′,6-Diamidino-2-phenylindole用作核标记,在网上列出使用的抗体补充表S5。积极染色细胞的量化进行了使用威达3.0系统和手动计算验证了5 - 10个随机领域100×放大。来自各个领域的平均数量每个病人样本用于计算细胞密度(数量/毫米2)。
统计分析
Mann-Whitney U测试是用于森林图的两组之间的微分分析节点集群。磨边机包24用于微分表达式RNA-seq数据的分析。FlowJo数据分析使用Mann-Whitney U测试或成对的学生的学习任务,两面和双向方差分析测试图基的多重比较测试后(GraphPad棱镜V.6.0f)。单变量和多变量分析使用Cox比例风险模型。
结果
与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related肝癌是由不同的免疫子集
基于假设慢性乙型肝炎病毒感染会产生重大影响肝癌碰头,我们首先旨在确定颜料与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC是截然不同的。在这里,我们使用CyTOF执行免疫景观的深入immunoprofiling HCC目的。我们CyTOF面板由35表面和胞内免疫标记(在线补充表S4),可以检查尖的全球免疫表型,NILs PBMCs于与乙型肝炎病毒有关的(n = 12)和non-viral-related (n = 11)肝癌肿瘤(图1一个和在线辅助表S1)。免疫血统的分布与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC尖(包括CD8+T细胞CD4+T细胞,CD56+自然杀伤(NK)细胞、CD3+CD56+NKT细胞CD14+肿瘤相关巨噬细胞(TAM))被视为二维(2 d) t-SNE情节(图1 b)。每个免疫血统的百分比在每个直到手动使用FlowJo大门,零和PBMC,验证CD4的浓缩+T细胞在尖与乙型肝炎病毒有关的肝癌(图1 c)。值得注意的是,其他主要血统和胡麻密度显示两个肝癌亚型之间无显著差异(数据没有显示)。
免疫的景观与乙型肝炎病毒有关的肝癌。(A)研究管道:尖,NILs PBMCs收集从血液样本和肿瘤邻近肿瘤组织与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者和病毒性肝细胞癌,CyTOF进行分析。独特的免疫子集被CyTOF使用RNA序列分析和排序进行进一步分析。独立验证了使用多路复用组织免疫荧光FFPE患者样本。(B)的二维t-SNE插图的CyTOF数据尖隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC,封闭的CD4(彩色编码)+CD8 T细胞,+T细胞,CD56+NK细胞、CD3+CD56+NKT细胞CD14+HLA-DR+TAM。在每个HCC箭头显示丰富的集群。(C) CD4的百分比+T细胞从尖,NILs PBMCs vs non-viral-related与乙型肝炎病毒有关的肝癌HCC,手动封闭使用FlowJo软件对每组(n = 7)。数据代表了意味着±SD;* p < 0.05(未配对学生t)。(D)维恩图显示的数量(百分比)之间的共同和差异表达节点与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related肝癌。通过飞行时间CyTOF,血细胞计数;FFPE, formalin-fixed和石蜡包埋;肝癌,肝细胞癌;NIL, non-tumour-infiltrating白细胞;NK,自然杀伤细胞;PBMC,外周血单核细胞; TAM, tumour-associated macrophages; TIL, tumour-infiltrating leukocytes.
接下来,我们进行降维CyTOF数据生成节点和集群(免疫子集)immune-marker表达谱相似,如前所述。16总共有456个节点,应用Mann-Whitney U检验后,我们发现389个节点(85.3%)之间共享两个肝癌子组,42(9.2%)和25(5.5%)节点被浓缩在与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related HCC,分别为(图1 d)。这些数据表明,一般免疫与乙型肝炎病毒有关的风景和non-viral-related HCC非常相似,与< 10%的差异每个肝癌亚型的免疫数量丰富。
T注册和TRM在与乙型肝炎病毒有关的肝癌细胞丰富,Tim-3+CD8+T细胞和CD244+NK细胞在non-viral-related HCC丰富
我们进一步审问的频率差异表达与乙型肝炎病毒有关的节点和non-viral-related肝细胞癌(图2一个)和生成一个2 d热图这些标记表达谱的差异表达节点(图2 b)。这里,我们观察到整体non-viral-related HCC高等多种炎性标记物的表达,即干扰素(IFN) -γ、白介素(IL) -17, granzyme B和肿瘤坏死因子(TNF) -α(图2 b)。这一观测结果与假设一致的是,慢性乙型肝炎病毒感染导致免疫抑制微环境。25
免疫子集丰富与乙型肝炎病毒有关的肝癌和non-viral-related肝癌。(A)的频率差异表达节点(免疫子集)与乙型肝炎病毒有关的肝癌vs non-viral-related HCC,被未配对Mann-Whitney U测试。梯度每一种颜色都代表一个病人。(B)的二维热地图35免疫标记的微分表达式与乙型肝炎病毒有关的尖(红条)或non-viral-related尖(黑条)。免疫子集代表这些节点基于标记表达式表示。框显示的主要不同免疫子集丰富或尖。(C) T的百分比注册(CD4+Foxp3+CTLA-4+),TRM(CD8+CD103+CD69+),Tim-3+CD8+T细胞和CD244+NK细胞从尖,NILs或从与乙型肝炎病毒有关的肝癌或PBMCs non-viral-related肝癌作为通过手动闸门使用FlowJo软件。数据代表了意味着±SD;双向方差分析测试图基的多重比较测试后。π=交互p值(病毒之间的相互作用状态和尖/ NILs / PBMCs);公关(病毒状态)p值=行因素;电脑=列因子(尖/ NILs / PBMCs) p值;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。肝癌,肝细胞癌;NIL, non-tumour-infiltrating白细胞;NK,自然杀伤细胞; ns, non-significant; PBMC, peripheral blood mononuclear cells; TIL, tumour-infiltrating leukocytes.
我们也注意到不同的子集,可以区分与乙型肝炎病毒有关的肝癌尖non-viral-related HCC尖。这些子集包括T注册(CD4+CTLA-4+Foxp3+)和TRM(CD8+CD103+CD45RO+CD69+)丰富的与乙型肝炎病毒有关的肝癌尖和Tim-3+CD8+T细胞和CD244+CD56+NK细胞丰富的non-viral-related HCC尖(图2 b和在线补充图S1A-C)。其他免疫子集,例如CD4+CD8 T细胞,+T细胞和CD14+TAM只显示两组之间的细微差别(图2 b)。手动控制使用FlowJo(在线upplementary图S2A-C)证实,T注册和TRM确实是丰富的尖与乙型肝炎病毒有关的肝癌(图2 c)。进一步的分析表明,T注册特别富含尖与NILs和PBMCs相比,和TRM在尖而丰富PBMCs与乙型肝炎病毒有关的肝癌(图2 c)。相反,Tim-3+CD8+T细胞和CD244+CD56+NK细胞富集在non-viral-related尖(图2 c)。综上所述,与乙型肝炎病毒有关的肝癌的免疫景观有别于non-viral-related HCC与T的浓缩注册和TRM。
从与乙型肝炎病毒有关的肝癌表达更多PD-1尖
如CyTOF数据所示,与乙型肝炎病毒有关的肝癌的时差是有别于non-virus-related肝癌。我们进一步研究了免疫标记表达式在两组之间的尖(在线补充图S3A-E相比),具体的表达不同costimulatory coinhibitory分子(在线补充图S3E)。在这里,我们发现CD4 OX40表情之间的显著区别+CD4 T细胞和PD-1表达+T细胞、CD8+T细胞(图3一)。进一步审问OX40和PD-1表情T注册细胞(在HBV-TILs丰富)表明,T注册相比于与乙型肝炎病毒有关的肝癌的确表达了更多的OX40和PD-1 non-virus-related肝细胞癌(图3 b)。同样,TRM尖和尼尔斯从与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者表示PD-1相比non-virus-related肝细胞癌(图3 c)。
T的表型注册和TRM丰富的与乙型肝炎病毒有关的肝癌。(一)二维细胞t-SNE情节CyTOF数据显示差异表达标记的尖隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌vs non-viral-related肝癌。红框表示节点丰富与乙型肝炎病毒有关的肝癌或non-viral-related肝癌,分别。(B) Ox-40百分比+和PD-1+T注册。(C) PD-1百分比+TRM。(D)的百分比TNF-α+ IFN-γ+ TRMnon-stimulated (Non-stim)或刺激和PMA / Ionomycin(敌人)。(E)代表情节TNF-α和IFN-γT的显示表达式RM于与乙型肝炎病毒有关的或non-viral-related HCC non-stimulated (Non-stim)或刺激和PMA / Ionomycin(敌人)。罪犯:数据是通过手动控制使用FlowJo软件,每个图表示意味着±SD;B和C:双向方差分析测试图基的多重比较测试后。π=交互p值(病毒之间的相互作用状态和尖/ NILs / PBMCs);公关(病毒状态)p值=行因素;电脑=列因子(尖/ NILs / PBMCs) p值;D:未配对的学生的学习任务。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。通过飞行时间CyTOF,血细胞计数;肝癌,肝细胞癌; IFN, interferon; NIL, non-tumour-infiltrating leukocytes; ns, non-significant; PBMC, peripheral blood mononuclear cells; PD-1, programmed cell death protein 1; TIL, tumour-infiltrating leukocytes; TNF, tumour necrosis factor.
然后我们检查是否更高PD-1表情TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌与低表达TNF-αPMA / Ionomycin和IFN-γ刺激。事实上,PD-1-expressing TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌表达TNF-α和IFN-γ相比,从non-viral-related HCC与PMA刺激时/ Ionomycin (图3 d和图3 e)。一般来说,尖于与乙型肝炎病毒有关的肝癌PD-1表达式和一个更疲惫表型表现出高于non-viral-related肝细胞癌,这是符合我们的假设和以前的数据,慢性乙型肝炎病毒感染诱发免疫抑制时间。尽管这一发现,刺激T的能力RM表达促炎细胞因子表示,他们仍然功能适当地激活intratumourally时主管和细胞毒性。
T注册和TRM隔绝与乙型肝炎病毒有关的或non-viral-related HCC具有不同的转录组签名
我们的数据表明,T注册和TRM丰富的制造时间与乙型肝炎病毒有关的肝癌,我们决定研究这些细胞是否有独特的功能或转录组配置文件取决于他们居住在与乙型肝炎病毒有关的或病毒性相关肝细胞癌。这一目标,我们孤立的CD4细胞+CD25+CD127- - - - - -T注册和CD8+CD103+CD45RO+TRM于与乙型肝炎病毒有关的(n = 3或4)和non-viral-related (n = 4)肝癌和执行门店在这些细胞(在线分类补充figureS4A)。捷的结果表明微分基因签名T注册和TRM于与乙型肝炎病毒有关的和non-viral-related肝细胞癌(图4一),289年和166年的总差异表达基因,分别。我们分析了丰富基因从T注册基因(58)和TRM(111个基因)隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌使用Reactome功能分析工具(图4 b,在线补充表S6和S7)。
T的转录组分析注册和TRM隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌vs non-viral-related肝癌。(一)被挥动的差异表达基因分析T注册和TRM隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌vs non-viral-related肝癌。(B) Reactome途径丰富基因的分析确定了从T注册和TRM隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌而non-viral-related肝癌。肝癌,肝细胞癌;门店,下一代测序。
T注册于与乙型肝炎病毒有关的肝癌显示更高的表达FOXP3(图4一)和il - 10的其他基因信号通路等IL1R1和TNFRSF1B(图4 b和在线补充表S6),表明免疫抑制T的表型注册隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌与T注册从non-virus-related肝癌。il - 10的信号也已被证明能够维持FOXP3的表达,从而稳定T注册的表型和功能。26LAG3exhaustion-related基因也丰富,T注册从与乙型肝炎病毒有关的肝癌(图4一)以前曾有报道称,这是为其最大抑制的重要活动。27此外,据报道,LAG-3表达T注册丰富的肿瘤微环境和免疫抑制基于其高表达的il - 10和转化生长因子(TGF) -β。28细胞的显著upregulation cycle-related通路(图4 b)表明,这些T注册增生性。综上所述,这些研究结果符合我们早些时候的数据显示出更多的免疫抑制T的表型注册于与乙型肝炎病毒有关的肝癌而non-viral-related肝癌。
丰富的基因TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌表现出一种疲惫的状态,所涉及的疲惫标记基因的高表达等PDCD1(PD-1),LAG3,HAVCR2(Tim-3)和CTLA4(图4一和在线补充表S7)。这些数据又符合我们CyTOF耗尽时间的分析和支持我们的假设与乙型肝炎病毒有关的肝癌。其他常见途径相关基因丰富TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌包括干扰素信号、细胞因子信号和适应性免疫系统可能表明之前激活导致这些细胞衰竭(图4 b)。总之,我们的转录组分析的T注册和TRM进一步验证的时差与乙型肝炎病毒有关的肝癌免疫抑制/疲惫比病毒性肝细胞癌。
PD-1嗨T注册免疫抑制和他们的表型可以减少PD-1 / PD-L1封锁
我们接下来研究T的函数注册和TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌使用体外t细胞抑制试验。22与乙型肝炎病毒有关的肝癌是富含PD-1+T注册(图3 b),我们首先旨在解决PD-1是否+T注册和PD-1- - - - - -T注册在功能上是不同的。我们孤立PD-1+T注册和PD-1- - - - - -T注册一起TRM和non-TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌肿瘤检查抑制CD4细胞的增殖的能力+CD127+CD25- - - - - -Tresp细胞与自体PBMCs隔离(在线补充图S5A和图S5B)。事实上,我们观察到显著抑制由PD-1 Tresp细胞增殖+T注册和PD-1- - - - - -T注册,PD-1+T注册被抑制的明显多于其PD-1- - - - - -同行(图5一个和在线补充图S6A尽管他们表达可比Foxp3(补充图S5A)水平。TRM没有显著的抑制增殖的作用Tresp细胞(图5一个)表示,尽管他们疲惫的表型没有免疫抑制功能。进一步询问是否抑制t细胞增殖由PD-1+T注册细胞可以被阻塞,我们和孵化PD-1重复了这个实验+T注册anti-PD-1或anti-PD-L1抗体。PD-1的抑制效应+T注册显著降低了接触anti-PD-1或anti-PD-L1抗体(图5 b和在线补充图S6B)与控制同形像抗体。值得注意的是,我们CyTOF PD-1数据显示+T注册也表达了PD-L1(在线补充图S5C)。此外,我们发现抑制T的表型注册通过coculturing T尚未受到影响RM另一个HBV-TIL-enriched子集(图5 c)。
抑制T的函数注册隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌。(一)代表分析CellTrace Violet-labelled Tresp有或没有人类T细胞注册抑制检查员用珠子珠子(上半部分),以及不同的免疫隔离从尖(PD-1子集+/ PD-1- - - - - -CD4+CD25+CD12 7- - - - - -T注册和CD103+ / -CD8+CD45RO+TRM/ non-TRM)与乙型肝炎病毒有关的肝癌(下图)。P1表示的百分比、Tresp和Pn表示增殖Tresp的百分比。增殖Tresp细胞的百分比不同coculture条件下右边的图所示(n = 7在每个条件复制)。(B)代表分析CellTrace Violet-labelled Tresp细胞有或没有珠(上半部分)和珠子,PD-1+T注册又反PD-1,反PD-L1或控制同形像抗体(下图)。P1表示、Tresp和Pn表示增殖Tresp。增殖Tresp细胞的百分比不同coculture条件下有或没有检查点封锁右边的图所示(n = 7在每个条件复制)。(C)细胞增殖Tresp cocultured PD-1时的百分比+T注册TRM或两个尖结合(n = 7在每个条件复制)。a - c:成对的学生的学习任务。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。肝癌,肝细胞癌;ns,非重要;PD-1,程序性细胞死亡蛋白1;PD-L1,编程death-ligand 1; TIL, tumour-infiltrating leukocytes
这些功能的数据表明,与乙型肝炎病毒有关的肝癌的身上,这是富含PD-1+T注册(图3 b免疫抑制),可能比non-virus-related HCC的身上。然而,这种免疫抑制可能被逆转应用anti-PD-1 / anti-PD-L1阻止抗体。
Tumour-infiltrating T注册和TRM有相反的影响肝癌患者的总体生存吗
我们迄今为止的数据表明,T注册和TRM是两个主要的免疫子集丰富与乙型肝炎病毒有关的肝癌。然后我们调查了他们的贡献HCC患者的总生存期(OS)。使用多路复用组织如果TMA队列(n = 102)(在线补充表S2),我们首先验证这两个T注册(CD4+Foxp3+)和TRM(CD8+CD103+)丰富与non-viral-related相比,与乙型肝炎病毒有关的肝癌肝细胞癌(图6)。接下来,我们隔离病人为高或低T注册或TRM根据中间细胞的数量/毫米2kaplan meier和检查了他们的操作系统配置文件的分析。有趣的是,我们发现这两个immune-subsets反对影响操作系统:高tumour-infiltrating T的数字注册与贫穷的生存姿态有关,而更多的tumour-infiltrating TRM是关联到一个更好的生存资料(图6 b)。这些发现与之前的研究相一致,显示肿瘤浸润的T注册在肝细胞癌与不良预后相关。29日然而,T的协会RM更好的肝细胞癌的预后是一个有趣而新颖的观察。由于反对T(平衡)的影响注册和TRM的操作系统,我们期望与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者相当于non-viral-related HCC患者。实际上,当我们比较的操作系统与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者与non-viral-related肝癌从同一TMA队列(n = 102),我们观察到没有显著差异(图6 c)。这些数据进一步验证,通过分析操作系统的国际肝癌组来自新加坡、香港和苏黎世(n = 116;在线补充表S3和图6 d)。此外,我们进行单变量和多变量分析以及几个临床参数,证明了intratumoural T注册和TRM密度是独立和优越的操作系统在这些患者的预后因素与肝细胞癌(表1)。深入分析的主要免疫子集与乙型肝炎病毒有关的肝癌已经确定免疫细胞浓缩和操作系统之间的复杂关系的肝癌患者。
T注册和TRM浓缩在与乙型肝炎病毒有关的肝癌对患者生存的影响。(A)多重免疫荧光染色FFPE HCC组织微阵列显示丰富T (n = 102)注册(CD4+Foxp3+)和TRM(CD8+CD103+)在肿瘤组织中与乙型肝炎病毒有关的肝癌vs non-viral-related肝癌。放大10倍;酒吧,规模50µm。较低的图像显示高亮框(X, Y) 20 X的放大,Foxp3和CD4 (T注册)和CD103 CD8 (TRM)分别显示。T的密度注册或TRM(没有。细胞/毫米2右边的图所示)。* p < 0.05。(B) kaplan meier分析显示整个病人生存资料基于高(嗨)或低(Lo) T注册或TRM。截止是基于平均密度的T注册和TRM分别(生存率较)。(C) kaplan meier生存分析基于病毒在肝细胞癌患者中包括组织微阵列组(n = 102)。(D) Kaplain-Meier独立生存分析基于病毒在肝细胞癌组来自新加坡、香港和苏黎世(n = 112)。DAPI 4′, 6 d iamidino-2-phenylindole;FFPE, formalin-fixed和石蜡包埋;肝癌,肝细胞癌。
讨论
几项研究已经审问与乙型肝炎病毒有关的肝癌的免疫景观,3 4但大多数只专注于单一免疫子集或困局与乙型肝炎病毒有关的肝癌没有cross-comparison non-viral-related肝癌。这些研究只提供一个受限制的观点肝癌的免疫景观;更广泛地了解预测临床结果至关重要,设计有效的疾病管理策略。我们目前的研究提供了一个综合考试的intratumoural免疫的风景与乙型肝炎病毒有关的肝癌与病毒性引起的肝细胞癌相比,使用高维分析工具:CyTOF和门店。这种方法允许我们解决基本的底层在直到表型的影响。首先,我们确定了免疫子集之间的不同与乙型肝炎病毒有关的和non-viral-related肝癌。具体来说,T注册和TRM丰富与乙型肝炎病毒有关的肝癌和Tim-3吗+CD8+T细胞和CD244+NK细胞富集在病毒性肝细胞癌。我们也可以清楚地想象一个更免疫抑制或耗尽时间与乙型肝炎病毒有关的肝癌。鉴于T注册中标识与乙型肝炎病毒有关的肝癌表达高水平的PD-1,我们测试的影响PD-1 / PD-L1通道封锁T注册函数,发现确实可以减少T注册抑制的表现型。最后,我们描述了两个与乙型肝炎病毒有关的HCC-enriched对立的效果免疫子集,T注册和TRM,操作系统在肝细胞癌患者。正如所料,那些高T注册表现出更糟糕的操作系统,但有趣的是,那些高TRM显示,更有利的操作系统。
我们发现intratumoural T的更高的密度注册与乙型肝炎病毒有关的肝癌与先前的研究一致,已经确定了更高的T注册数字在慢性乙型肝炎病毒感染。30.其他研究人员也表示,TRM数字增加肝脏慢性乙型肝炎病毒感染与健康的肝脏。31日最近的大规模的T细胞单细胞RNA-sequencing大部分与乙型肝炎病毒有关的肝癌还发现,T注册和疲惫CD8+T细胞(类似的基因签名作为我们当前的研究)是丰富的肿瘤。32NK细胞的重要角色在乙型肝炎病毒感染和肝细胞被广泛描述。33 34CD244/2B4期间重要有效的免疫控制慢性病毒感染35;减少CD244在NK细胞与增加TGF-β持久乙型肝炎病毒感染的免疫宽容的阶段。36CD244比例越低+NK细胞于与乙型肝炎病毒有关的肝癌在我们的研究因此符合这些先前的报道。CD244也调节NK细胞的抗肿瘤活性,37这表明病毒性相关肝细胞癌的重要作用,这是富含CD244+NK细胞。相反,Tim-3是调节多种免疫子集,包括T细胞和NK细胞在慢性乙型肝炎病毒感染。38 39Tim-3越高+CD8+水平观察病毒性肝细胞癌在我们的研究从而对比这一普遍的共识。许多先前的研究相比,慢性的免疫档案HBV-infected患者健康的个体,很难确定是否相同的结论应该是期望从我们的研究中,肝细胞癌患者相比,或没有乙型肝炎病毒感染。
T的免疫抑制活性注册及其在肿瘤进展已经有据可查的作用在许多癌症,40包括肝细胞癌。41更高密度的T注册外周血细胞,intratumourally或,被认为是一个可怜的肝癌患者生存预后标记,29日符合我们当前的发现。我们和其他人,也报道CD8肝癌的预后因素。34 42TRM建议对部分免疫反应在慢性乙型肝炎病毒感染吗31日据报道,最近与其他癌症存活率更高。43 44此外,浓缩的CD80通过TRM于与乙型肝炎病毒有关的肝癌所示我们门店分析(图4一和在线补充表S6表达细胞因子刺激()和能力图3 d)表明潜在的t细胞细胞毒性。因此,我们的研究是第一个的独特描述对方的影响这两个HCC患者免疫系统的子集。
增加表达的PD-1 T注册和TRM在与乙型肝炎病毒有关的肝癌与病毒诱导免疫抑制/耗尽时间一致。我们的门店数据也支持更多的免疫抑制/ T的疲惫的表型注册和TRM隔绝与乙型肝炎病毒有关的肝癌。作为这两个人口PD-1表达,我们将假设PD-1抑制剂的应用将呈现一种生存受益。然而,这个假设是不支持的结果从最近的将军040年临床试验发现在反应率无显著差异与乙型肝炎病毒有关的或对nivolumab non-viral-related HCC患者。14从我们目前的结果,我们观察一个缓解免疫抑制表型当阻塞PD-1 / PD-L1 PD-1通路+T注册细胞。相比之下,其他人已经报道,阻塞PD-1 / PD-L1途径将扩大T注册人口导致整体免疫抑制表型。45高数量的PD-1-expressing TRM细胞也并不一定会转变成一个山免疫反应能力PD-1封锁,这些PD-1+CD8+T细胞在慢性病毒感染可以成为晚期筋疲力尽。46PD-1 / PD-L1封锁的影响在多个免疫子集与乙型肝炎病毒有关的肝癌需要进一步调查。然而,基于当前的发现我们考虑免疫疗法的目标T注册PD-1-expressing细胞毒性T细胞是一个理性的组合策略与乙型肝炎病毒有关的肝癌。相比之下,免疫疗法这一目标NK细胞或Tim-3+CD8+T细胞在non-viral-related HCC可能更有效。
总之,我们的研究是其中一个最全面的分析免疫风景的肝癌患者有或没有感染乙肝病毒。这样深immunophenotyping策略是至关重要的在加强我们对肿瘤免疫的理解癌症源于不同的目的,将有助于指导设计新颖的免疫治疗策略。
确认
作者要感谢菲奥娜倪倪苏莫和Phang Ting从新加坡总医院(功能减退)教授阿齐姆韦伯从苏黎世大学医院和罗尼教授Poon皇后嫁给香港医院的患者样本收集和协调协助取得患者的同意。作者要感谢京姚明梁博士和苏珊在协助免疫子集进行排序。最后,作者还要感谢洞察力编辑伦敦语言编辑之前提交的手稿。
引用
脚注
CJL和YHL同样起到了推波助澜的作用。
SA和VC同样起到了推波助澜的作用。
贡献者YHL CJL执行大多数实验,分析数据,并准备手稿;LP捷分析数据;我协助CyTOF数据采集;CC RNA序列进行实验;司法院协助免疫子集排序;MW进行单变量和多变量分析;TKHL和司法院(病理学家)准备并提供组织样本;HCT(肿瘤学家)建议患者招募和临床分析;赛西尔维,BKPG和AC(外科医生)协助病人招聘和提供样品;MH(苏黎世)和IOLN(香港)提供的样本来自海外军团; PC provided clinical advice, recruited and provided samples for most patients; SA designed the study pipeline and assisted in writing the manuscript; VC designed the studies, analysed the data and wrote the manuscript.
资金这项工作是支持的国家医学研究委员会、新加坡(ref数字:MOHIAFCAT2001, TCR15Jun006, CIRG16may048, CSAS16Nov006, NMRC /明星/ 020/2013,CIRg13nov032, NMRC / mohiafcat1 - 6003和NMRC / MOHIAFCAT2/005/2015), * *生物医学研究Council-Economy发展委员会(BMRC-EDB IAF: IAF311020和SPF2014/005)和Duke-NUS SingHealth。MH支持由一个伦理委员会齿轮格兰特(HepatoMetaboPath)和证期局179年和209年。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准IRB中心。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。