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摘要
客观的胰腺导管腺癌(PDAC)是一种未满足医疗需求的疾病。虽然嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞的免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中显示出很大的前景，但它们对实体肿瘤的疗效受到了挑战，因为缺乏肿瘤特异性抗原来避免靶向和非肿瘤效应。可切换CAR-T细胞，即CAR-T细胞的活性由肿瘤抗原特异性重组fab为基础的“开关”的剂量控制，以提供完全可调的反应，可以克服这一翻译障碍。
设计在本研究中，我们使用常规和可切换的CAR-T细胞靶向HER2抗原，HER2在肿瘤细胞上上调，但在正常人体组织中也存在低水平。我们使用了来自IV期PDAC患者的患者来源的异种移植模型，这些模型模拟了PDAC最具侵袭性的特征，包括严重的肝和肺转移。
结果可切换CAR-T细胞，然后针对人表皮生长因子受体2 (HER2)进行切换，在难以治疗的患者来源的晚期胰腺肿瘤模型中诱导完全缓解。在体内测试一系列不同的CAR-T细胞剂量时，可切换的HER2 CAR-T细胞与传统的HER2 CAR-T细胞一样有效。
结论这些结果表明，可切换的CAR-T系统对来自晚期PDAC患者的侵袭性和弥散性肿瘤有效，同时提供了控制开关的潜在安全性。
- 胰腺癌
- 干细胞
- 免疫疗法
- 肝转移
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用属性4.0 Unported (CC BY 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人出于任何目的复制、重新分发、重新混合、转换和构建此作品，前提是原始作品被正确引用，提供到许可证的链接，并表明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞疗法在血液病中取得了显著的临床成功。
通过靶向HER2的CAR-T细胞治疗胰腺癌在基于细胞系的模型中显示出有希望的结果。
由于肺和其他组织中HER2低水平表达，潜在的靶向非肿瘤效应可能导致患者危险的毒性;因此，一种可滴定的CAR-T系统可能在不影响疗效的情况下提供安全性的潜力。
新的发现是什么?
可切换的CAR-T细胞，然后使用基于fab的靶向HER2的开关，对难以治疗的患者来源的晚期胰腺肿瘤非常有效
在患者来源的异种移植模型中，可切换的HER2平台在一系列不同的CAR-T细胞剂量下与传统的HER2 CAR-T细胞一样有效。
HER2开关的剂量可诱导体内可切换CAR-T细胞产生显著的细胞因子，这表明在体内可切换CAR-T细胞的活性可通过给药(或不给药)调节。
可切换的HER2平台有望成为一种有吸引力的治疗选择，用于控制针对HER2抗原的CAR-T细胞的激活，HER2在肿瘤中上调，但与正常组织共享。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
由于其可滴定性，抗HER2的可切换CAR-T细胞平台具有安全改善晚期胰腺癌患者预后的潜力。
简介
胰腺导管腺癌(PDAC)是癌症相关死亡的第四大常见原因，5年生存率不到10%。由于缺乏早期症状，该疾病大多在晚期(IV期)被诊断出来，只有不到20%的患者表现为局部肿瘤，因此可切除。1由于目前对晚期患者的治疗只能延长几个月的生存期，PDAC被认为是一种迫切的、未得到满足的医疗需求的疾病。现在已经了解到，固有的或迅速演变的化疗耐药和随后的复发是由具有干细胞样特性的细胞亚群驱动的。2 - 4任何针对PDAC开发的新治疗方法也必须有效地针对这种癌症干细胞(CSC)群体，以实现持久的反应。5
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)在对抗表达cd19的B细胞白血病方面取得了巨大成功。6 7相比之下，实体肿瘤的CAR-T细胞治疗受到以下几个因素的阻碍:(1)肿瘤微环境(TME)僵硬的结缔组织可塑性，这为T细胞的进入创造了物理障碍;8(2)免疫抑制TME引起T细胞衰竭和无能，9(3)肿瘤抗原在重要组织(包括正常组织的干细胞室)上的共同表达;(4)在PDAC的情况下，疾病的侵袭性以及诊断通常处于晚期且有大量肿瘤扩散的事实。与B细胞抗原CD19不同，几乎所有的实体肿瘤抗原都低表达，但在各种正常组织中广泛表达，这导致了临床中CAR-T治疗转化为实体肿瘤时的严重毒性。例如，一项使用碳酸酐酶IV (CAIX) CAR-T细胞治疗转移性肾癌的临床试验由于与CAIX阳性胆管上皮交叉反应相关的肝毒性而不得不停止。10在另一项试验中，一名接受靶向HER2的第三代CAR治疗的转移性结肠癌患者死于呼吸衰竭，原因是CAR- t细胞识别出肺上皮上表达的低水平HER2。11
CAIX和HER2都可以被单克隆抗体安全地靶向，其中肿瘤杀伤机制是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，并且可以通过给药方案安全地控制典型免疫反应的活性。12日13然而，CAR-T细胞是一种活的药物，它通过CAR增强了T细胞的信号传递，并在抗原识别上广泛增殖;这种夸大的效力减少了靶向在健康组织上表达的抗原(如CAIX和HER2)的治疗窗口，从而增加了治疗相关的毒性。因此，已经做出了一些努力来控制CAR-T细胞的活性，以使靶向具有毒性的抗原成为可能。我们开发了一种基于抗体的可切换CAR系统，其活性可以在体内滴定。14日15这些可切换的CAR-T细胞结合一种特定的肽，该肽被遗传地移植到肿瘤结合Fab分子上(图1一个)．这个“开关”充当了靶细胞和效应细胞之间的桥梁，并控制着抗原特异性、激活和最终的肿瘤清除。这些开关具有Fab片段半衰期相对较短和使用免疫原性有限的肽标签的优点。16日17这种多功能系统已被证明在白血病和乳腺癌的临床前模型中是有效的。15 - 17日
HER2在局部I/II期和晚期IV期PDAC患者PDAC培养物中的表达(A)可切换CAR-T系统示意图。(B) HER2在人原发性I/II期PDAC培养物中的表达(红色)与仅使用二抗(蓝色)作为对照(左)，用平均荧光强度(MFI)作为插入物的标准流式细胞仪评估(左)，用Hoechst 33 342作为核染色和亮场(BF)成像流式细胞仪显示细胞形态(右);MCF7乳腺癌细胞被用作HER2表达的阳性对照。(C)标准流式细胞仪检测的HER2在IV期PDAC粘附培养(红色)和仅二抗(灰色)中表达(上)。成像流式细胞术双染HER2和泛细胞角蛋白(CK)， DAPI为核染色(下)。(D) HER2在PDAC培养的富含csc的球中表达，(E) HER2与CD133在富含csc的球培养中混合。表达水平以百分数(%)表示。CAR-T，嵌合抗原受体T;CSC，癌症干细胞; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PNE, peptide neoepitope; VH, variable domain, heavy chain; VL, variable domain, light chain.
据报道，HER2/ERBB2在PDAC中表达，18 19尽管对其患病率的估计差异很大，从10%不等20.到60%。21在这里，我们显示了相当一部分PDAC肿瘤表达HER2的可检测水平。我们还表明，HER2在包含的CSC及其分化的子代(非CSC)中表达相似，并且可以被健康供体和患者来源的CAR-T细胞靶向。我们使用从当前IV期PDAC患者新生成的高侵袭性异种移植模型，并证明即使表达相对温和的HER2水平，局部和播散性疾病也可以有效靶向。通过对CAR-T细胞的剂量滴定，我们证明了在原位和转移性PDAC模型中，可切换的CAR-T细胞与传统的HER2 CAR-T细胞具有相当的疗效，并且可切换的CAR-T细胞(与传统的HER2 CAR-T细胞不同)的体内活性取决于切换的管理。我们的数据表明，可切换CAR-T细胞的可滴定性可能允许在临床环境中安全靶向HER2。
结果
HER2在胰腺CSC和非CSC中的表达
在组织微阵列上评估HER2表达，我们在一组PDACs上发现了一个表达范围，其中6/16个样本HER2表达高(3+)，3/16个样本HER2表达中等(2+)，7/16个样本HER2表达低(1+)(在线)补充表1,在线补充图1a)．接下来，我们评估了一组早期传代PDAC培养物(培养<1个月)中的HER2表达，这些培养物是从I/II期PDAC患者的原发肿瘤手术切片中分离出来的。这种培养比永生化PDAC细胞系更受欢迎，原因如下:(1)原代培养再现了原发肿瘤的遗传异质性，更有可能预测住院患者的肿瘤反应;(2)原代培养与原发肿瘤相似，包含代表疾病根源的CSC亚群22(3)原代培养中的CAR-target抗原表达更准确地反映了原始PDAC肿瘤的生理状况，而不是长期细胞培养的人工产物。我们在该小组中发现了HER2表达谱，其中一些样本的HER2表达水平与乳腺癌细胞系MCF-7 (图1 b)．培养的人T细胞和新鲜分离的原代人外周血单个核细胞(PBMC)，其亚群均不表达HER2，被用作阴性对照(在线)补充图1b)．
我们现在还从IV期PDAC患者中生成了各种PDAC模型，这是临床中最常见的患者群体(c75, c76, c102, c135, c139和c142)。相应的培养物拥有最多的转移亚群，CXCR4的强表达、高侵袭性和显著的体内转移活性证明了这一点，因此对晚期PDAC具有高度代表性。23我们发现所有病例中都有HER2表达，从中度表达到强烈表达(图1 c,在线补充图1c)．
CSCs代表PDAC的层次根源，驱动对常规治疗的抵抗，是疾病复发的主要原因。因此，测试任何PDAC治疗对胰腺CSC的疗效是很重要的。因此，我们生成球体培养来富集CSC，并探测球体来源细胞的HER2表达。我们发现在分化程度更高的粘附PDAC培养中HER2表达水平相似，这表明HER2在胰腺CSC中没有改变。CD133特异性追踪CSC进一步证实了HER2在CSC上的表达(图1 d, E)．
接下来，我们将I/II期的PDAC 215和354以及IV期的c76培养物转导，以稳定表达GFP和荧光素酶，以供进一步分析。重新检测这些培养物表明，基因改造后HER2的表达得以维持，PDAC 215的表达量最高(在线)补充图1d)．因此，我们使用这些原代培养物进行进一步的体外和体内实验。
HER2 CAR-T细胞介导表达HER2的PDAC培养物的细胞毒性
我们使用了传统的CAR-T细胞和可切换的CAR-T细胞，它们通过基于抗体(Fab)的“开关”分子起作用，允许控制体内活性(图1一个)．为了首先评估原代PDAC培养对HER2 CAR-T细胞靶向的敏感性，我们从正常供体中生成了具有4-1BB共刺激结构域的第二代HER2 CAR-T细胞，发现其CD4和CD8表达水平与未转导的T细胞相似(在线)补充图2a)．HER2 CAR-T细胞被发现破坏PDAC 215, 354和c76培养物的单层，HER2 CAR-T细胞对靶细胞的裂解被证实，并使用WST-1活力测定(图2一个)．同时，我们还观察到与HER2 CAR-T细胞孵育时靶细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)补充图2b)．
CAR-T细胞介导的对大块PDAC细胞的细胞毒性。(A)在HER2 CAR-T细胞或未转导的T细胞存在时，裂解表达绿色荧光蛋白(GFP)的PDAC靶细胞培养物的融合层(阴性对照)。使用与活靶细胞成比例的吸光度单位的WST-1测定靶细胞活力的定量;n = 6 * p < 0.05。(B)从IV期PDAC患者c76分离的T细胞被转导表达HER2 CAR，代表性的流式细胞术分析显示(上图)。来自患者c76的效应T细胞被覆盖在来自c76的自体PDAC靶点或异基因PDAC 215靶点上。通过荧光显微镜(左下)和WST-1活力测定(右下)定量表达gfp的PDAC靶细胞的靶细胞死亡。由于可以从该患者身上分离的T细胞数量有限，因此无法在该病例中进行复制。(C)使用具有不同浓度HER2开关的可切换CAR-T效应剂对IV期PDAC靶标和对照细胞进行LDH释放试验。(D)使用可切换CAR-T效应器和c76靶标以20:1的比例进行细胞毒性试验，并以最高浓度10添加HER2开关4点。通过光镜和WST-1活性测定评估靶细胞死亡;n = 3, p < 0.05。CAR-T，嵌合抗原受体T;PDAC，胰导管腺癌;SSC-A，侧面散射区。
体外靶向原代PDAC细胞在自体环境下对临床应用更有意义;然而，从同一患者身上获得PDAC细胞和效应T细胞是一个挑战。由于c76患者在研究时仍然活着，我们有一个独特的机会来研究自体CAR-T细胞效应，并探索这些靶细胞中相对温和的HER2表达水平是否足以成功地进行HER2 CAR-T细胞治疗。我们从这个病人身上分离出T细胞作为效应细胞。经过两轮转导后，发现约50%的T细胞表达HER2 CAR (图2 b)．将患者c76来源的HER2 CAR-T细胞应用于表达c76的gfp -荧光素酶细胞和PDAC 215细胞的融合层导致单层裂解，而未转导的T细胞则没有影响(图2 b)．因此，我们的数据表明，患者来源的T细胞可以有效地重新靶向自体肿瘤。
为了评估可切换CAR-T细胞对PDAC培养物的活性，来自健康供体的T细胞被转导到具有4-1BB共刺激结构域的第二代可切换CAR。17体外细胞毒性实验是通过可切换CAR-T细胞与目标PDAC细胞共培养进行的，HER2开关的剂量滴定存在，PNE肽融合到4D5 HER2 Fab (HER2开关)的c端，这代表了我们之前发表的最佳开关设计。16日17使用由野生型(WT) HER2 Fab组成的非活动开关作为对照。通过LDH释放评估，HER2开关介导的各种PDAC培养物的有效、剂量依赖性裂解具有最大水平的细胞毒性，与相对HER2表达水平相关(图2 c)．在MDA MB 453 HER2 +细胞上观察到相当水平的细胞毒性。WT HER2 Fab对PDAC细胞没有影响，证明了可切换CAR-T细胞+HER2开关对HER2表达细胞的特异性(图2 d)．我们进一步证明了可切换CAR-T细胞在高(104pM)使用荧光显微镜和WST-1活力测定对PDAC细胞进行HER2开关浓度的检测(在线补充图2c)．在这些实验中，可切换CAR-T细胞+非活性开关对PDAC培养物几乎没有活性。此外，我们证明了可切换CAR-T细胞+ HER2开关介导的PDAC靶标LDH释放水平明显高于可切换CAR-T细胞+非活性开关(在线)补充图2d)．
富含csc的3D培养物对HER2 CAR-T细胞诱导的细胞毒性具有敏感性
富含csc的球培养物中的致密基质概括了PDAC微环境的特征，并为T细胞与肿瘤细胞的接触创造了一个物理屏障。因此，我们将PDAC球与来自四种不同T细胞供体的效应CAR-T细胞(1:1效应:靶细胞(E:T)比)共培养，以测试CAR-T细胞对癌症(干细胞)的杀伤是否保留在3D环境中。在所有情况下，HER2 CAR-T细胞介导PDAC 215和354球培养物的裂解，而未转导的T细胞没有影响(图3一)．我们还评估了荧光素酶活性作为靶细胞活力的衡量标准。我们发现与HER2 CAR-T细胞共培养后荧光素酶表达显著降低，证明了HER2 CAR-T细胞靶向富集csc的PDAC培养的能力(图3 b)．在裂解之前，用光学显微镜对球进行成像，并观察到HER2 CAR-T细胞靶向，与荧光素酶的结果一致(在线)补充图3a)．接下来，我们探索了CAR-T细胞的细胞溶解杀伤机制的激活，并发现粘附性和球形PDAC共培养中干扰素γ (IFNγ)的强烈上调(图3 c)．一致地，HER2 CAR-T细胞在与粘附性和球形培养的HER2抗原接触时特异性地脱粒。然而，对球形培养进行脱颗粒的T细胞比例小于贴壁细胞，这很可能是由于3D培养中抗原暴露的减少和包含CSC的潜在免疫逃避机制。24值得注意的是，在与表达HER2水平高于PDAC 354的PDAC 215细胞共培养时，观察到更高水平的脱颗粒，而未转导的T细胞在两种条件下都没有脱颗粒(图3 d)．为了进一步说明CAR-T细胞在共培养3天后PDAC球靶存在时的活化，我们使用Hyperion成像质量细胞仪(IMC, Fluidigm)对表面和细胞内T细胞标记物进行了多重染色，显示T细胞增殖显著增加，细胞毒分子颗粒酶B的产生增强(在线)补充图3b)．
CAR-T细胞介导的细胞毒性作用。(A)在HER2 CAR-T细胞或未转导的T细胞(对照)存在下，以1:1效应靶比裂解表达gfp的PDAC215和PDAC354靶细胞培养物。我们使用了来自四个不同供体的效应细胞，结果一致。(B)荧光素酶活性定量靶细胞活力;n=3，与HER2 CAR-T细胞共培养的球与未转导的T细胞相比，*p<0.05。(C)效应T细胞与PDAC 215、PDAC 354和PDAC c76贴壁靶细胞和球形靶细胞共培养时，ELISA定量IFNγ分泌;n=6，与未处理的(UT) T细胞相比，HER2 CAR-T细胞*p<0.05。(D)效应细胞和靶细胞共培养6小时后CD107a脱颗粒试验。(E)表达gfp的PDAC 215细胞被嵌入到Matrigel中以形成PDAC类器官。7天后，标记的CAR-T细胞或对照T细胞(红色)覆盖在基质上，T细胞与类器官共培养3天后，荧光显微镜(上)和共聚焦显微镜(下)用于观察类器官的完整性。 CAR-T, chimeric antigen receptor T; CSC, cancer stem cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
为了进一步探测CAR-T细胞在可能作为物理屏障的微环境下的活性，我们生成了嵌入在Matrigel(富含几种细胞外基质蛋白的基底膜制剂)中的PDAC 215类器官培养物。培养7天后，PDAC 215类器官完全形成，T细胞覆盖在基质上。3天后，我们观察到在HER2 CAR-T细胞存在时，类器官发生裂解，但未转导的T细胞未发生裂解(图3 e)．
常规CARs和靶向HER2的转换CARs在正位IV期PDAC模型中同样有效
为了测试HER2 CAR-T和可切换CAR-T细胞在体内的疗效，我们使用了高级PDAC的原位模型。我们选择使用IV期c76 PDAC细胞有两个原因:(1)c76细胞以相对适中的水平表达HER2，从而为CAR-T治疗设置了严格的条件;(2)c76细胞建立了极具侵略性的原发肿瘤，并迅速转移到肝脏和肺部，这让人想起晚期PDAC患者。我们将1e5 c76 PDAC细胞植入免疫功能受损的NSG小鼠的胰腺中，以形成侵袭性原位肿瘤，主要转移到肝脏和肺部(图4一)．采用无创生物发光成像(IVIS)监测疾病负担。第17天，各组分别使用HER2 CAR-T细胞、可切换CAR-T细胞或不进行治疗。接受可切换CAR-T细胞的动物分别服用(1)HER2开关或(2)非活性开关。T细胞注射4小时后开始切换注射，此后每隔一天进行一次，共注射14次(图4一)．
CAR-T细胞在体内有效地靶向晚期PDAC。(A)分离、培养和原位注射来自IV期患者的PDAC细胞，使其在胰腺局部扩张并主要转移到肝脏和肺部的示意图。将c76 PDAC细胞原位注入胰腺，17天后再注入CAR-T细胞。CAR-T细胞注射后4小时开始切换，此后每48小时切换一次，共14次。(B)局部肿瘤进展(动物左侧)和肝转移(动物右侧)之后，从CAR-T细胞注射前11天开始测量生物发光(IVIS)，直到注射后148天。对148天内所有队列的肿瘤进展进行量化;n = 4 * p < 0.05。(C)在第63天显示肿瘤生物发光的代表性图像。(D)通过人细胞角蛋白19 (CK19)的免疫组化和HER2(红色)和pan-CK(绿色)的免疫荧光鉴定原发性原位肿瘤、肝转移和肺转移。CAR-T，嵌合抗原受体T; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
在T细胞注射后的第3天，可切换CAR-T+HER2开关组和常规HER2 CAR-T组的肿瘤减少，到第10天，根据IVIS评估，肿瘤消失。在实验期间，这些小鼠继续保持健康，没有肿瘤。相比之下，“非活性开关”和“无T细胞”组的肿瘤继续进展，所有动物都发育成巨大的、快速生长的原位肿瘤，这表明可切换的CAR-T细胞需要活性开关(图4 b, C,在线补充图4a)．通过高分辨率超声获得一致的结果(在线补充图4b)．在随后的时间点，在这些对照组小鼠中也观察到显著的肝转移和较少的肺转移，并且在原发肿瘤和转移中发现HER2表达保持不变(图4 d)．
我们在HER2 CAR-T组的一只动物身上观察到肿瘤在第109天的原位复发，并在随后的17天观察到HER2表达肿瘤细胞的快速生长(在线)补充图4a)．第126天再次使用来自同一供体的HER2 CAR-T细胞导致肿瘤在3天内快速消退(在线)补充图4a)．在HER2切换组或常规HER2 CAR-T组中，其他任何动物均未观察到肿瘤复发，所有动物在研究期间都保持健康，没有发病迹象。
为了比较可切换CAR-T + Her2开关和Her2 CAR-T细胞的疗效，我们接下来设置了T细胞的剂量滴度(剂量为20e6、10e6、5e6和1e6)，与之前一样，给承载原位PDAC c76肿瘤的NSG小鼠。使用可切换CAR-T细胞的动物总共接受了10剂量的HER2开关。一组动物作为阴性对照，接受20e6个具有非活性开关的可切换CAR-T细胞。在所有积极治疗组中观察到肿瘤消退，在可切换CAR-T和HER2 CAR-T组中，每只动物几乎完全清除5e6个T细胞(图5一个)．用1e6 T细胞治疗的组表现出不同的肿瘤，在可切换CAR-T和HER2 CAR-T组之间具有可比性。在20e6(最高T细胞剂量)HER2 CAR-T细胞队列中，5只动物中有2只出现了gvhd样症状，并在第52天被处死补充图5)．
减少可切换CAR-T和HER2 CAR-T剂量在体内的比较疗效。(A)减少CAR-T细胞的剂量，以测试两种CAR-T细胞效应类型的比较疗效。局部肿瘤进展(动物左侧)和肝转移(动物右侧)后进行IVIS。量化所有队列中长达64天的肿瘤进展;n=5，所有治疗组与可切换CAR-T+非激活开关相比，*p<0.05。(B) CAR-T细胞给药24小时后分离的小鼠外周血血浆中的人细胞因子分析(白细胞介素-2 (IL-2)、干扰素- γ (IFNγ)和肿瘤坏死因子- α (TNFα);N =5 /组，各组*p<0.05。CAR-T，嵌合抗原受体。
接下来，我们比较了可切换CAR-T细胞(剂量为0.5 mg/kg HER2开关)与HER2 CAR-T细胞的体内活性，即CAR-T细胞给药24小时后循环中细胞因子的释放。在每个T细胞剂量下观察到相似的IFNγ和TNFα细胞因子释放，与两种效应细胞类型介导的相似抗肿瘤活性一致，但与可切换的CAR-T细胞+HER2开关相比，HER2 CAR-T细胞群中的IL-2更高。重要的是，我们在注射20e6可切换CAR-T细胞的小鼠中发现，用非活性开关处理的可切换CAR-T细胞中几乎没有细胞因子，这证明了可切换CAR-T细胞激活对开关的严格要求(图5 b)．
为了评估CAR-T细胞在体内的长期活性，我们在最高剂量(20e6)队列中，在最终切换给药后21天采集了外周血补充图6)．从每组3只小鼠抽取100 μ L血液，然后对人类CD2进行分类，我们在每组中仅在一只动物中检测到超过100个事件的人类CAR-T细胞。这可能是由于技术限制(用于分选的细胞数量较少)和供体依赖的可变性，但可用于分析的样本表明，在HER2开关存在的情况下，可切换的CAR-T细胞数量增加了5.7倍补充图6a, b)．通过Hyperion成像质量细胞仪进行的多重表型分析表明，可切换CAR-T+HER2开关和HER2 CAR-T队列中的T细胞均以CD8为主+，与4-1BB共刺激结构域驱动CD8细胞扩增一致25(在线补充图6b)．表型上，两组均为CD45RA−CCR7−，表示效应记忆细胞。在这里，我们观察到两组在细胞内溶细胞酶颗粒酶B和增殖标志物Ki67的表达上存在显著差异。我们的数据表明，在HER2 CAR-T细胞中持续存在高水平的激活和复制，而可切换的CAR-T细胞在最后一次HER2切换后21天仍然存在，但显示出静止表型(在线)补充图6b,c)．HER2 CAR-T细胞中细胞毒性分子的持续增殖和产生可能是由于移植物抗宿主病(GvHD)诱导的激活。另一种解释是，在无病的长期癌症幸存者中仍然可以检测到残留的休眠癌细胞。26日27日然而，CAR-T细胞与共享的正常组织靶点持续的信号传递可能会在临床中产生不利影响。因此，我们的数据表明，与传统的CAR-T细胞不同，可切换CAR-T细胞的体内活性取决于开关的使用。
在侵袭性转移模型中靶向her2表达PDAC肿瘤
最后，我们研究了在一个最具挑战性的转移模型中靶向HER2的疗效，在该模型中，来自IV期患者的c76 PDAC细胞被注入NSG小鼠脾内，由于从脾脏直接引流到门静脉，迅速形成转移。7天后，进行脾切除术以形成大的肝转移，这通常会导致大约5周的终末期疾病(图6)．通过IVIS监测小鼠的肿瘤发展。
CAR-T细胞有效靶向PDAC转移。(A)实验设置和时间过程示意图。IV期c76 PDAC细胞注入脾脏(第15天)。7天后(第8天)进行脾切除术，15天后(第0天)进行CAR-T细胞治疗。CAR-T细胞治疗4小时后开始注射开关，此后每48小时注射一次，共14次。(B)所有队列中肿瘤进展的量化;n = 3 * p < 0.05。CAR-T，嵌合抗原受体T;PDAC，胰腺导管腺癌。
肿瘤治疗后15天，给予CAR-T细胞，4小时后注射HER2和非活性开关，并在随后的14天内每隔一天继续注射。在可切换CAR-T细胞+HER2开关和常规HER2 CAR-T细胞队列中观察到快速的肿瘤清除。相比之下，可切换CAR-T细胞+无活性开关组的3只动物中有2只迅速发展为肝转移以及脾切除术部位的局部肿瘤(图6)．小鼠在第26天被处死，证实了肝转移的存在补充图7)．细胞角蛋白19 (CK19)免疫组化28使用人CK19特异性抗体进一步验证了肝脏中存在微转移和大转移。可切换CAR-T+非活性切换组的其余动物在第64天发生了大的肝转移。可切换CAR-T+HER2切换组和常规HER2 CAR-T组的所有动物在研究期间均无肿瘤，研究定义为T细胞注射后5个月。由于gvhd样症状的出现，常规HER2 CAR-T队列中的动物在t细胞注射后30、43和103天被处死。经IVIS、大体解剖和CK19免疫组化组织学检查证实无肿瘤。因此，我们的数据证实了HER2通过传统的CAR-T细胞或可切换的CAR-T系统靶向弥散性转移性PDAC肿瘤的有效性。
讨论
CAR-T细胞在胰腺癌治疗中面临着独特的挑战。为了确保良好的临床结果，必须将所有CAR-T细胞固有的肿瘤外效应降至最低，并且必须成功地归巢和渗透到结缔组织间质。在小鼠异种移植模型中重现人类疾病最具侵袭性的特征，是开发新疗法以及针对特定患者的个性化治疗的有用工具。我们实验室和其他实验室的工作表明，患者来源的异种移植模型可以重现人类疾病的许多特征，如组织学特征、侵袭性肿瘤生长和在某些情况下的转移，尽管需要注意的是，TME的细胞成分不能在免疫缺陷动物中建模。有趣的是，我们的许多PDAC患者在使用他们的组织进行体内研究时仍然活着，因此小鼠可以作为真正的阿凡达模型，其中对治疗的反应由小鼠代理测试。29本研究中使用的PDAC c76来源于一名患有广泛转移性疾病的IV期PDAC患者，表明常规和可切换的CAR-T细胞在介导肿瘤消退方面具有相似的疗效。可切换CAR-T的一个主要优势是它们在开关存在时的特异性激活，这代表了肿瘤抗原在健康组织中表达的有利特征。
我们实验室之前的研究表明，CSC是散装PDAC肿瘤中的一个独特群体，与分化的PDAC细胞具有不同的特性4 5 30CSC对传统疗法产生了最大的抵抗。31日32我们已经证明，原代PDAC培养物比细胞系更类似于PDAC肿瘤，因为它们具有相对较大的CSC隔室，在动物模型中具有高度致瘤性，并模拟疾病的自然过程。3 33 34我们还表明，靶向胰腺CSC隔室有效地防止疾病复发，从而导致长期生存。35 36在验证了富含csc的球培养物表达HER2后，我们证明了这些球培养物可以被HER2 CAR-T细胞有效靶向。
接下来，在两个不同的体内模型中，我们发现单次注射可切换CAR-T细胞足以诱导持久缓解，仅注射5次HER2切换后肿瘤就无法检测到。在这两个模型中，我们继续使用开关共注射10-14次，导致所有治疗动物的长期缓解。重要的是，在体内停止HER2开关给药3周后，我们观察到体内的可切换CAR-T细胞持续存在，但静止不动，这可以通过缺乏增殖和颗粒酶B的产生来证明。这些数据证明了有效消除所有癌细胞，包括致瘤性最强的CSC，验证了可切换的CAR-T细胞是强大而可控的抗癌工具。
几个实验室正在进行的工作集中在确定CAR-T细胞治疗实体肿瘤的新的真正特异性靶点。一些抗原在正常组织中表达相当有限，如间皮素(胸膜和腹膜)。37和癌胚抗原(CEA)(结肠)，38而其他如CD24也在正常组织的干细胞室中表达。39 40迄今为止，像CD19这样的抗原还没有被确定为实体肿瘤，而且可能永远也不会。因此，已经开发了几种策略来减轻肿瘤中上调但与正常组织共享的抗原的肿瘤外靶向外毒性。这些方法包括仅在两种肿瘤抗原存在时激活的分裂CAR系统41iCARs被正常组织表达的抗原抑制。42与之前的报告一致，15 - 17日我们发现可切换CAR-T系统具有类似的抗肿瘤作用，这表明可切换CAR-T系统的抗肿瘤功效并未受到影响。重要的是，这表明基于fab的开关能够与可开关的CAR-T细胞共定位，以消除纤维化胰腺癌病变和癌细胞(干细胞)。
值得注意的是，我们的两个模型都代表了局部疾病和传播性疾病;所有给予原位肿瘤的对照组动物都发生了广泛的肝转移，在转移模型中，三分之二的对照组动物由于脾脏周围组织的快速侵袭而发生了局部肿瘤。因此，我们的数据强调了可切换CAR-T系统对抗侵袭性IV期PDAC的多功能性和有效性。过继转移的T细胞已被证明可以运输到抗原阳性和抗原阴性的肿瘤以及各种外周组织，43这可能解释了HER2开关和可切换CAR-T细胞的成功归巢和疾病的快速消退。
总之，我们证明了可切换CAR-T系统和先进的小鼠异种移植模型能够有效地概括先进的人类PDAC的大多数特征，是开发这种致命恶性肿瘤的潜在更安全、更有效的治疗方法的有效工具。
材料与方法
原发性人类癌细胞
从PDAC患者的血液和肿瘤中获得所有患者的书面同意。根据Barts胰腺组织库协议(REC参考文献13/SC/0592, IRAS项目ID 142061 -样本c75, c76, c102, c135, c139, c142)，西班牙马德里西班牙国家癌症研究中心(CNIO)生物库(参考文献1204090835chmh -样本Panc 215和354)，意大利维罗纳罗西大学医院的ARC-NET生物库(参考文献6.B。04 - Panc 10953、12560、12556、12707和12975样本-文献6.B.04)，以及德国慕尼黑工业大学Klinikum Rechts der Isar外科生物库(慕尼黑工业大学医学院伦理委员会，文献1926/07 - Panc 140114样本)。
酶联免疫吸附试验
根据制造商的说明，使用eBioscience(88-7316-88)的试剂盒，在指定时间点对细胞毒性共培养的无细胞上清进行IFNγ ELISA检测。此外，我们进行了LEGENDplex多重免疫测定(bilegend)来测量IFNgamma、TNFalpha和IL-2的水平。
HER2靶向序列
HER2单链抗体蛋白序列为:
ARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI
YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR
TGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKG
LEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSSAAA。
全长HER2 CAR(含信号肽、scFv、CD8a铰链、CD137和CD3zeta结构域):
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR
TGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKG
LEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF
YAMDYWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD
FACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRF
PEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR
RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP
公关。
细胞毒性检测
细胞毒性检测使用LDH细胞毒性检测试剂盒II (RayBiotech;68CX-LDH-S500)根据制造商的说明。使用抗pne CAR-T细胞和不同浓度pne标记的HER2 Fab开关进行细胞毒性试验，使用基于LDH释放的CytoTox 96非放射性细胞毒性试验(Promega)进行。我们使用不同的PDAC培养物作为靶细胞，并将以下乳腺癌细胞系作为HER2状态确定的阳性对照:HCC1954 (HER2 3+)、MDA MB453 (HER2 2+)、MDA MB435S (HER2 1+)和MDA MB468 (HER2 0)。CAR-T细胞与靶细胞以效应:靶细胞比10:1孵育，同时保持总细胞浓度为106/毫升。加入pne标记的开关，在完整的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)中与10% (vol/vol)热灭活胎牛血清(FCS)在37°C下孵育20-24小时。使用罗氏试剂盒(05015944001)，对粘附的PDAC培养进行了WST-1活性测定，在对T细胞进行细胞毒作用后，随后去除T细胞。使用Promega (E1910)的试剂盒检测萤火虫荧光素酶的体外活性。
PDAC215的类器官培养是在覆盖了Matrigel的96孔板上产生的，上面覆盖了5000个PDAC215细胞，嵌入50%的Matrigel和50%的培养基中。培养进一步以类器官培养基为基质，44由adDMEM、B27、青霉素/链霉素、2 mM谷氨酰胺、10 mM HEPES、1.25 mM n -乙酰半胱氨酸、10 μ M Y-27632、100 ng/mL Noggin、500 ng/mL R-Spondin、0.5 μ M A83-01、10 nM胃泌素、50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF10、5 ng/mL bFGF、20 ng/mL Wnt-3a、1 μ M PGE2和1 mg/mL Primocin组成。在与PDAC类器官共培养之前，根据制造商的说明，用CellTracker Red CMTPX染料(C34552, Thermofisher Scientific)对T细胞进行染色。
流式细胞术
球源性胰腺癌细胞和分化的癌细胞用TrypleE Express (Thermofisher)分离，用含fbs的培养基填充，用冷PBS洗涤一次。球体通过40µM细胞过滤器过滤。使用Herceptin Biosimilar (HER35-M, Source Bioscience Lifesciences)检测HER2表达，细胞在4℃下孵育1小时。再次用冷PBS洗涤细胞，用Alexa Fluor 647偶联山羊抗人抗体(10337882,Fisher Scientific)作为二抗，在4℃条件下以1:200稀释30分钟。在一些实验中，用CD133-PE (Miltenyi Biotec;1:400)在4°C的黑暗中进行30分钟。在用冷PBS进行最后一次洗涤后，将细胞重新悬浮在含有dapi的FACS缓冲液中，并在BD LSR Fortessa (BD Biosciences)上使用流式细胞仪进行分析。
将PDAC细胞与CAR-T细胞或未转导的T细胞共培养24小时后，进行CD107a (Biolegend 328611)表达的脱粒实验。简单地说，将5µL CD107a-Alexa Fluor 647添加到共培养PDAC和T效应细胞的200µL培养基中。30分钟后，再加Monensin (Biolegend) 90分钟，接着加Brefeldin (1×;生物传说)4小时，在37°C。最终，我们使用CD3- pecy7 (Biolegend 317333)对CD3+ T细胞进行染色。对于所有表面染色，抗体在PBS中以1:50在室温下使用10分钟，活细胞对4 '，6-二氨基氨基-2-苯林dol (DAPI;1µg/mL, Sigma)在Fortessa上进行分析或使用ARIA II细胞分选仪进行排序(均为BD)。为了将HER2的表面表达与定量高分辨率形态学结合起来，我们使用了成像流式细胞术(Imagestream, Amnis)和Cytokeratin-FITC (Miltenyi Biotec130-112-931;1:10)在RT下用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS+0.1% Tween-20 (PBS- t)渗透后鉴定上皮细胞。
体内实验
通过使用来自Addgene的PGK-GFP-IRES-Luciferase Lentivector系统转导细胞，建立了表达PDAC的萤火虫荧光素酶细胞。使用FACS BD Aria II仪器(BD, Heidelberg, Germany)对细胞进行GFP表达分类，随后在体外进行扩增。然后，50 μ L 1×105(原位注射)或0.25×105(脾注射)PDAC-Luc细胞分别手术注射到6-8周龄NSG小鼠的脾脏或胰腺(NOD。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ;查尔斯河)。为了进行手术，用异氟烷(2%)麻醉小鼠，并在镇静镇痛后在左侧皮肤上做一个切口。然后，通过腹膜进行第二次切口，观察脾脏和邻近的胰腺，以便注射PDAC细胞。用6/0缝线缝合腹膜(B/Braun;0022002)后，用外科钉缝合皮肤。使用IVIS-200系统(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA)每周进行体内荧光素酶成像。小鼠用异氟醚(2%)麻醉，腹腔注射150 mg/kg荧光素(Caliper Life Sciences)， PBS稀释15 mg/mL。荧光素注射后每30秒获得序列图像(荧光素注射后最大发光时间为20分钟)。荧光素酶活性的单位是光子每秒每平方厘米每立体体(p/s)−1厘米−2老−1)．使用活体图像软件(Caliper Life Sciences)进行图像分析。一旦肿瘤被检测到，老鼠被随机分配到各种治疗中。所有的动物程序都按照3Rs进行，并由研究所的机构动物护理和使用委员会(PPL70-8129)批准。
成像细胞术(IMC)
为了从小鼠血液中纯化人T细胞，我们首先用FACS对CD2表达进行分类，然后对剩余CD2进行IMC+T细胞按照制造商的说明(Fluidigm)使用抗体1:100。使用以下金属偶联抗人抗体(均来自Fluidigm): CD45-Y89、CD3-Er170、CD8-Er168、CD4-Nd145、Granzyme-Yb171、Ki67-Dy162、PD1-Yb174、Tim3-Sm154、Lag3-Nd150、CD45RA-Eu153和CCR7-Er167。在分配治疗后，从IV期患者来源的PDAC体内模型中提取人CAR-T细胞之前，我们在体外验证了上述抗体在HER2 CAR-T细胞上的存在或不存在激活人PDAC球体培养物。使用MCD查看软件进行分析，并使用Morpheus可视化和分析软件生成热图。
低传代PDAC培养
如前所述，从PDX中获得胰腺肿瘤。3.使用GentleMACS Dissociator将肿瘤均质，然后用胶原酶P在37°C下酶解15分钟，并在DMEM+10% FCS中培养。在低黏附条件下培养以培养CSCs和人胰腺癌异种移植细胞之前已经有过描述。22将细胞重悬于添加20 ng/mL FGF-2 (CellGS)、0.4% amphotericin B、1%盘尼西林/链霉素、2% B27补剂(Gibco)和200 mM l -谷氨酰胺(Gibco)的1× DMEM/F-12 (Gibco)中培养富集CSCs的球。然后制备10000个细胞/mL的细胞悬液，并将其分布到超低附着表面烧瓶(Corning, New York, USA)中1周。在使用前，对球体进行过滤(40µM)。
CAR-T细胞的产生
简单地说，我们将抗gcn4 scFv(克隆52SR4)和抗HER2 scFv(克隆4D5)的编码序列亚克隆到慢病毒质粒prrl -罪恶- ef1 α- wpre中，并连接到CD8跨膜区域(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD)和人类4-1BB和CD3ζ的细胞质区域，创建了我们的第二代CAR构建物(关于HER2 CAR的序列，见上文)。通过将慢病毒构建物转染到HEK293FT人胚胎肾细胞中产生慢病毒颗粒。使用FugeneHD (Promega)转染pRRL-SIN-EF1α-WPRE、pMDL、pREV和pVSVG质粒。健康志愿者的人体T细胞是在斯克里普斯研究所的机构审查委员会批准下，通过Ficoll-Pacque方法从正常供者全血中纯化pbmc，从斯克里普斯综合临床研究中心的斯克里普斯研究所正常献血者服务部获得的。在感染前，用CD3/ cd28涂层磁珠进一步激活pbmc 24小时。将浓缩慢病毒在5µg/mL硫酸精蛋白和50 IU/mL IL-2 (R&D)存在下应用于活化的人T细胞，在32℃下以1000× g离心2小时。使用Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher)标记的抗人或抗鼠IgG，通过流式细胞仪测定HER2 CAR的表达水平，而使用Alexa Fluor 488标记的GCN4测定可切换CAR的表达水平。
HER2开关生产
对于GCN4 (PNE序列:NYHLENEVARLKKL)融合，将编码4D5重链或轻链的基因片段，含或不含GCN4，亚克隆到pFuse载体中。在自由式293表达系统中通过瞬时转染表达不同重链或轻链组合的融合。简单地说，HEK293F细胞以10的密度转染6细胞/mL，质粒DNA与293fectin比例为1:2 (Life Technologies)。细胞在37°C和5% CO2孵育96小时。在48小时和96小时收获含有重组蛋白的上清液，用蛋白G层析进一步纯化。
免疫组织化学
使用Ventana Discovery XT系统(Roche)对2.5µM切片进行免疫组化染色。切片被脱蜡、水化并装载到发现号XT上。用柠檬酸缓冲液进行抗原提取。内源性过氧化物酶用H2O2试剂(Ventana)。抗细胞角蛋白19一抗(Abcam ab9221;1:10 00)孵育20 min，使用抗兔二抗和ChromaMap DAB检测试剂盒(Ventana)检测。组织用苏木精反染色，图像分析使用全景观察软件(3DHISTECH)。
在一些实验中，抗原提取后，人工用赫赛汀生物仿制药(HER35-M, Source Bioscience Lifesciences)对载玻片进行1小时的染色，然后用Alexa Fluor 647偶联的山羊抗人抗体(10337882,Fisher Scientific)按1:200稀释30分钟。在0.1%吐温20的PBS中进行1:10)，实验时间为30分钟。所有实验都在室温下进行。一旦加入荧光抗体，就把载玻片放在黑暗中。载玻片使用DAPI(赛默飞世尔科学公司)的extend Gold安装介质进行安装。使用LSM 710共聚焦显微镜(Zeiss)或Pannoramic 250 flash III扫描仪(3DHISTECH)获取图像。
统计分析
除非另有说明，结果以平均值±SD表示。采用SPSS V.22.0进行统计分析，采用非参数Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验比较连续变量。显著性为p<0.05。
致谢
我们非常感谢George Elia在免疫组化方面的专家帮助以及Barts癌症研究所的核心设施。我们也非常感谢向巴茨胰腺组织库(BPTB)捐赠组织的胰腺癌患者。我们还要感谢Claude Chelala教授、Archana Ambily女士、Thomas Dowe先生、Dayem Ullah博士和对本研究做出贡献的组织获取委员会。
参考文献
脚注
贡献者DR制定研究概念，获取、分析和解释数据，起草和撰写手稿;M-HY、DaR、ENH、JB、DL、IG采集并分析数据;AM帮助进行体内实验;DP和HMK采集胰腺癌患者样本;JGK分析了组织样本;TSY, AA和CH制定了研究概念，获得了资金，解释了数据并撰写了手稿。
资金研究由ERC高级研究员资助(Pa-CSC 233460给CH)和欧洲共同体第七框架计划(FP7/2007-2013)根据资助协议n°602783 (CAM-PaC给CH)，新南威尔士大学SHARP种子基金(给CH)，英国胰腺癌根据资助协议RIF2014_CH, RIF2015_CH(给CH)和RIF2015_AA(给AA)，美国癌症协会(RSG-16-200-01-LIB给TSY)和英国癌症研究中心资助BCI (C16420/A18066)支持。巴茨胰腺组织库(BPTB)由胰腺癌研究基金资助。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准所有实验都得到了动物实验伦理委员会的批准(内政部项目许可证PPL 70/8129)，并按照动物护理和使用的道德行为准则进行。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明本研究没有其他未发表的数据。
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