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肝脏病学
原文
特异表达激活在急性肝衰竭胎儿肝脏的项目
  1. Jeongeun Hyun1,2,
  2. Seh-Hoon哦1,
  3. 理查德T份永久性1,
  4. 辛西娅·D的家伙3,
  5. 卡尔·L伯格1,
  6. 安娜发美1
  1. 1医学系的,杜克大学,达勒姆,北卡罗莱纳美国
  2. 2再生下一个,杜克大学医学院的,达勒姆,北卡罗莱纳美国
  3. 3病理学系,杜克大学,达勒姆,北卡罗莱纳美国
  1. 对应到医学系的安娜寄梅本博士杜克大学,杜伦大学,27710年数控,美国;annamae.diehl在}{duke.edu

文摘

客观的不确定性治疗急性肝功能衰竭(ALF)发病机制的限制。我们推测,阿尔夫结果过度活化诱导的胎儿肝脏计划在肝细胞严重受伤肝脏再生。评估这一假设,我们专注于两个分子与已知瘤胎属性在肝脏,Yes-associated蛋白1 (YAP1)和胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3 (IGF2BP3)。

设计我们比较正常肝移植肝脏的阿尔夫来确定患者YAP1和IGF2BP3诱导;评估这些因素是否调节小鼠肝脏再生;确定如果YAP1 IGF2BP3配合成人肝细胞激活胎儿计划;和确定上游信号控制这些因素,从而在恢复从肝损伤肝细胞的成熟。

结果阿尔夫患者的肝脏大量富含肝细胞表达IGF2BP3 YAP1和其他胎儿标记。更广泛,瞬态类似fetal-like细胞增殖和积累能力的anchorage-independent增长发生在老鼠的肝脏急性损伤后再生。胎儿肝细胞重编程是YAP1-dependent和涉及YAP1-driven相互调制let7小分子核糖核酸和IGF2BP3负面因素相互调节控制胎儿细胞命运的决定。直接操纵IGF2BP3表达式控制fetal-like表型不管YAP1活动,证明IGF2BP3的近端中介YAP1-directed命运。

结论急性肝损伤后肝细胞由YAP1-dependent fetal-like细胞重新编程机制,不同调节let7 IGF2BP3,识别阿尔夫的新治疗靶点。

  • 急性肝衰竭
  • 细胞生物学
  • 肝细胞
  • 肝再生

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2018 - 317603

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 死于急性肝功能衰竭(ALF)的结果失去至关重要的肝脏功能。

    • 除了肝移植、肝脏辅助装置和其它干预措施,旨在重建这些函数在降低阿尔夫死亡率通常是无效的。

    • 改善阿尔夫发病机制的理解是必要的开发方法,将在阿尔夫患者肝脏功能恢复至关重要。

    有什么新发现吗?

    • 我们表明肝脏患者阿尔夫是大规模利用fetal-appearing肝细胞,这些细胞的特征,表明小数量的类似细胞是暂时性的积累在小鼠肝脏急性损伤后再生有效。

    • 我们发现fetal-like肝细胞在肝脏受伤的积累是由与伤害有关的激活Yes-associated蛋白1和胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3,两个胎儿因素,通常沉默在健康成人肝细胞。

    • 我们确定了胎儿的节目切换机制和在肝细胞。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 这个新知识识别小说在阿尔夫预后和治疗目标。

    介绍

    快速进行性肝功能衰竭(被称为急性肝衰竭,阿尔夫)可以发生急性肝损伤和导致死后尽管密集的医疗护理。然而,急性损伤原本健康的肝脏通常只造成瞬态恶化至关重要的肝脏功能和良好的耐受性。1 2为什么急性肝损伤发生显著不同的反应是未知。解释不可能煽动侮辱本身因为阿尔夫可以导致药物、毒素、病毒感染和自身免疫性疾病,通常导致温和,或更多的慢性损伤。不管煽动代理,阿尔夫组织学特点是急性纤维化和积累的细胞类型中不寻常的肝脏健康,包括祖细胞和myofibroblasts。慢性肝脏疾病,发生在肝硬化和慢性肝衰竭表现出进步的积累类似的细胞,和肝硬化患者可以开发一个ALF-like综合症(被称为“acute-on-chronic”肝衰竭)。3 - 5Acute-on-chronic肝衰竭并非罕见的:它发生在24% - -40%的住院肝硬化患者,已成为肝硬化死亡的一个主要原因。3 4

    提高康复方法类型的阿尔夫是迫切需要的,因为肝移植,唯一证明拯救生命的干预,1 2只有少数的患者是可行的。一个解决方案可能是利用肝脏的巨大的再生能力。6然而,证据表明,再生肝衰竭的缺陷可能会使这种方法具有挑战性。报道,恢复一些acute-on-chronic肝衰竭患者提高了移植脂肪间充质干细胞或与细胞因子动员骨髓干细胞治疗表明,祖不足导致肝功能衰竭。7 8然而,矛盾的数据表明,祖细胞过于丰富的阿尔夫患者9并表明祖积累和祖基因表达水平预测急性死亡率。10 11祖积累过多的概念阿尔夫进一步支持最近的功能分析的RNA序列数据从致命的小鼠模型和亚致死的acetaminophen-induced阿尔夫。肝脏受到致命伤害的极大丰富与转录本编码因素促进胎儿的肝脏,就好像功能(如细胞增殖、发展、分化)与肝脏亚致死的伤害或健康的肝脏。12在一起,这些研究结果表明,阿尔夫的失调可能导致胎儿重组机制,对于有效的肝再生是必要的。

    我们建议对肝脏再生有效,一些幸存的肝细胞必须de-differentiate瞬变更加fetal-like redifferentiating回他们之前成熟的表型,但那压倒性的胎儿的肝脏,就好像计划招聘的肝细胞,这种状态的持久性,侵蚀的能力成人肝脏功能和导致肝功能衰竭。评估这一假说和描绘胎儿重组机制在肝脏受伤,我们关注Yes-associated蛋白1 (YAP1)和胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3 (IGF2BP3),因为这些分子肝瘤胎属性。胚胎发育过程中高度表达,出生时大幅下调,几乎检测不到健康成人肝脏,但调节原发性肝癌,尤其是肿瘤起始干细胞样细胞,促进fetal-like特征。13 - 15YAP1成为成人部分肝切除术后肝细胞再生激活瞬变(PH),16但是现在还不知道如果IGF2BP3响应类似于一个再生的挑战。

    YAP1协调转录反应促进细胞迁移和增殖。17 18在肝脏,YAP1逐渐灭活的河马激酶所诱导的信息接触,19提供一种机制,促进肝上皮细胞成熟。相反,本构成熟肝细胞的激活YAP1足以使他们de-differentiate成干细胞样细胞。20.本构YAP1活动导致进行性肝肿大和致癌PH值后,21表明YAP1活动必须严格监管的有效再生反应。然而,机制尚不清楚。IGF2BP3是一种rna结合蛋白对肿瘤和恶性转化至关重要的小鼠胚胎成纤维细胞。22IGF2BP3调节本地化、稳定和翻译的直接目标(即rna IGF2BP共识图案),以及大量的间接目标,由其直接目标控制。因为IGF2BP3立即是直接转录后调节基因表达,但它的一些行为最终影响基因转录,IGF2BP3规定直接和长期变化在细胞的命运。13日23这表明IGF2BP3可能是守恒的调节器的再生反应两个急性和慢性肝损伤。在干细胞样细胞,IGF2BP3 let7家庭活动严格约束的小分子核糖核酸(miR): let7大鹏直接绑定到和破坏IGF2BP3信使rna;相反,IGF2BP3蛋白抑制let7活动。14日24这种相互负反馈循环可能解释了为什么IGF2BP3 let7相互表达了在胎儿肝脏(低let7、高IGF2BP3)和健康的成年肝脏(高let7、低IGF2BP3)。然而,目前还不清楚如果let7-IGF2BP3轴参与成人肝再生或是否与YAP1控制胎儿重组。我们检查了所需的阿尔夫患者移植肝肝移植来确定YAP1和IGF2BP3诱导;评估这些瘤胎upregulation因素是否发生在小鼠肝再生;确定如果YAP1 IGF2BP3配合更加fetal-like让肝细胞;和确定上游信号控制这些因素,从而在恢复从肝损伤肝细胞的成熟。结果确定小说的诊断,预后和治疗目标在人类阿尔夫,肝损伤的结果,目前在大多数人是致命的。

    结果

    胎儿细胞“重编程”的过程是健壮的人类阿尔夫

    在阿尔夫肝脏特异性的损失函数驱动死亡率,胎儿重组有望抑制成熟肝细胞表型。因此,我们使用免疫组织化学比较两个因素的表达,促进胎儿肝脏计划(YAP1和IGF2BP3)从7岁的肝脏供体肝活检没有已知的肝脏疾病和移植的肝脏肝移植所需的8个成人患者生存阿尔夫各种目的(在线补充表S1,图1 a, B,在线补充数据S1-S2)。虽然明显比成人小阿尔夫肝脏,肝脏健康的孩子展示YAP1或IGF2BP3可以忽略不计。相比之下,患病的成年肝脏是大规模利用IGF2BP3-positive和YAP1-positive细胞。再生集群(RC)与这些细胞病变的肝脏特别丰富。这些细胞是强阳性核磷酸化SMAD2(在线补充图开通),支持先前的结果,改变增长factor-β信号增加YAP1再生肝细胞中激活。25RC也积累细胞表达SOX9和多个细胞角蛋白(pan-CK),承认导管肝祖细胞的标志。26日27日相比之下,细胞在RC通常缺乏核染色CCAAT / enhancer-binding蛋白α(C / EBPα),成熟肝细胞的转录因子表达28和在肝细胞容易证明原子核的肝脏健康的孩子。定量形态测量学证实成人阿尔夫肝脏明显富含胎儿肝细胞表达标记显著但耗尽细胞的成熟肝细胞标记(图1 b,在线补充数据S3-S5)。IGF2BP3 Coimmunohistochemistry(绿色)与YAP1 SOX9或C / EBPα证明IGF2BP3局部细胞阳性核YAP1和C / EBPαSOX9但消极(图1 c)。这些发现表明,人类阿尔夫与伤害有关重组过程的上下文中发展导致存活肝细胞获得更多fetal-like特征。

    Hepatocytes expressing IGF2BP3 and other fetal liver cell markers accumulate in human livers with acute liver failure (ALF). (A) Representative H&E staining in explanted liver tissues of patients with ALF. Left panel: RC, regenerating cluster (dashed line); right panel: ductal-appearing cells. 100× magnification; scale bar=100 µm. (B) Immunohistochemistry (IHC) for IGF2BP3, YAP1, SOX9 and C/EBPα in explanted liver tissues of patients with ALF. Left panels: 100× magnification; right panels: 400× magnification. Scale bar=100 µm. The mean±SEM results from morphometric analysis are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with normal liver (n=10 100×  fields/section, **p<0.005). (C) Double IHC for IGF2BP3 (green) with nuclear YAP1, SOX9 or C/EBPα (brown). Red arrows indicate double positive cells. Representative images are shown at 400× magnification; scale bar=20 µm. C/EBPα, CCAAT/enhancer-binding protein alpha; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    肝细胞表达IGF2BP3胎儿肝细胞标记和其他积聚在人类肝脏急性肝功能衰竭(ALF)。(A)代表)染色的患者在移植肝组织阿尔夫。左面板:钢筋混凝土,再生集群(虚线);右面板:ductal-appearing细胞。100×放大;酒吧= 100µm规模。(B)免疫组织化学(包含IHC) IGF2BP3, YAP1、SOX9和C / EBPα移植肝组织阿尔夫的患者。左面板:100×放大;右面板:400×放大。酒吧= 100µm规模。 The mean±SEM results from morphometric analysis are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with normal liver (n=10 100×  fields/section, **p<0.005). (C) Double IHC for IGF2BP3 (green) with nuclear YAP1, SOX9 or C/EBPα (brown). Red arrows indicate double positive cells. Representative images are shown at 400× magnification; scale bar=20 µm. C/EBPα, CCAAT/enhancer-binding protein alpha; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3.

    胎儿重组发生瞬变期间有效的小鼠肝脏再生

    确定类似的重组发生在再生机制有效地重建健康的成人肝实质,我们检查了两个小鼠急性肝损伤模型的快速复苏的功能性肝质量被认为需要成熟肝细胞的再生,也就是说,CCl PH值和急性四氯化碳急性70%4)注入。29-31在两个模型中,我们专注于时间点成熟肝细胞的复制活动最大时(即24 - 72小时后PH值和CCl急性后2 - 4天4注射)。期间发现的最大的肝细胞再生比较与受伤的肝脏(时间0)和受伤几乎已经恢复肝脏恢复健康(即post-CCl post-PH肝脏96小时或7天4注射)。在健康的人类肝脏(在线补充图印地),在健康小鼠肝脏只有罕见的细胞表达IGF2BP3通过免疫组织化学方法显示(图2一个)。然而,hepatocytic-appearing IGF2BP3(+)细胞出现后24小时内的PH值;这些细胞的数量达到峰值后48小时PH值,然后逐渐下降到接近基底的水平96小时后博士肝细胞表达IGF2BP3 CCl还堆积在肝脏的受伤区域4又老鼠(在线补充图S6A),总肝组织的定量一分析证明了最大的表达Igf2bp3post-CCl mRNA在4天4注入,高峰的时候G2 / M期细胞周期蛋白的表达,细胞周期蛋白B1,表明肝细胞增殖的模型(在线峰值补充图S6B)。地貌形态示量分析表明,IGF2BP3(+)区高度与有丝分裂CCl后肝细胞的数量4全身的伤害(在线补充图S6C)。我们曾报道,YAP1瞬变积累在PH值后肝细胞的细胞核,也在复制期间达到顶峰下沉到几乎检测不到的水平作为再生完成。16因此,动力学IGF2BP3感应YAP1激活再生肝细胞的相似之处。YAP1促进肝脏增长后PH值。15 32我们发现许多IGF2BP3(+)肝细胞进行有丝分裂从48到72小时post-PH (图2 b)。更值得注意的是,三分之二或更多的有丝分裂细胞在这些时间点表达IGF2BP3 (图2 cIGF2BP3)和数字(+)有丝分裂数据几乎完全的表达相关细胞周期蛋白B1(图2 d)。此外,原发性肝细胞表达核IGF2BP3 coexpressed Ki67,细胞增殖标记,在48小时内post-PH核Ki67表达高峰时肝细胞室(图2 e)。在CCl再生肝脏后观察4全身的伤害(在线补充图S6B),肝细胞的数量表达IGF2BP3和Ki67 PH值在肝脏再生显著相关(r = 0.665, p = 0.018)。25因此,扩大IGF2BP3(+)人口增长可能解释了瞬态Igf2bp3信使rna (图2 f)和蛋白表达(图2 g),我们观察到在原发性肝细胞分离收获post-PH从24到72小时。总的来说,这些结果表明,增殖再生肝脏的肝细胞瘤胎两个因素的表达,IGF2BP3 YAP1。

    Effectively regenerating livers transiently accumulate proliferative IGF2BP3-positive cells. (A) Immunohistochemistry for IGF2BP3 in mouse liver sections obtained at the time of 70% partial hepatectomy (PH) (0 hour) or at 24 hours, 48 hours, 72 hours or 96 hours after PH. Representative images are shown. Scale bar=100 µm. High magnification image of 48 hours post-PH liver shows that IGF2BP3 protein localises in the cytoplasm, as well as in nuclei with mitotic figure (indicated by red arrows). (B) The number of IGF2BP3-positive hepatocytic cells were counted in 19 randomly selected 100× magnification fields/section. The proportion of IGF2BP3(+) cells in mitosis is indicated by hatched marking. The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with baseline, pre-PH (0 hour) (n=3 mice/time point, *p<0.05 and **p<0.005 for total positive cells, or $$p<0.005 for positive mitotic figures). (C) The percentage of total mitotic hepatocytes with IGF2BP3-positive mitotic figures was derived by counting mitotic cells in 19 randomly selected 100× magnification fields/section. The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with pre-PH (0 hour) liver (n=3 mice/time, **p<0.005). (D) Bar graph shows the mean±SEM results of qRT-PCR analysis for the G2-M cyclin, Cyclin B1, in primary hepatocytes freshly isolated from livers of mice before (0 hour) or after PH (24, 48, 72 or 96 hours). Significance was analysed using two-tailed Student’s t-test compared with baseline (0 hour) (n=3–6 mice/time, *p<0.05). Line graph shows the mean±SEM of the number of IGF2BP3-positive mitotic figures at these times. The correlation between the number of IGF2BP3-positive mitotic figures and hepatocyte expression of Cyclin B1 mRNA was analysed using Pearson’s r (r, correlation coefficient). (E) Double immunofluorescence staining for IGF2BP3 (green) with a cell proliferation marker, Ki67 (red), in hepatocytes isolated at 48 hours post-PH. Nuclear counterstaining was done by DAPI (blue) and merged images are shown. Scale bar=20 µm. (F) qRT-PCR analysis for Igf2bp3 in primary hepatocytes isolated from mice pre-PH (0 hour) or post-PH (1, 6, 24, 48, 72, 96 or 120 hours). The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with baseline, pre-PH (0 hour) (n=3–6 mice/time, *p<0.05, **p<0.005). (G) Immunoblot for IGF2BP3 normalised to total protein in lysates of primary hepatocytes freshly isolated from livers of mice at designated time points after PH. Representative blots are shown among three independent blots with similar results. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; MF, mitotic figure; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    有效地再生肝脏是暂时性的积累增生性IGF2BP3-positive细胞。(一)免疫组织化学IGF2BP3在小鼠肝脏部分获得70%的部分肝切除术(PH)(0小时)或在24小时,48小时、72小时或96小时后博士代表图片所示。酒吧= 100µm规模。48小时post-PH肝高放大图像表明,IGF2BP3蛋白定位在细胞质中,以及在核有丝分裂图(红色箭头)。(B)的数量IGF2BP3-positive hepatocytic细胞数在19个随机选择的100×放大领域/部分。的比例IGF2BP3(+)细胞有丝分裂被孵化的标记表示。均值±SEM结果使用双尾画和统计分析学生的学习任务与基线相比,pre-PH(0小时)(n = 3老鼠/时间点,* * * p < 0.05和p < 0.005总阳性细胞,或积极的有丝分裂人物$ $ p < 0.005)。(C)总有丝分裂与IGF2BP3-positive肝细胞有丝分裂的百分比是派生的数据计算有丝分裂细胞19随机选择100×放大领域/部分。均值±SEM结果使用双尾画和统计分析学生的学习任务而pre-PH(0小时)肝脏(n = 3 /时间的老鼠,* * p < 0.005)。(D)条形图显示了均值±SEM的结果中存在分析G2-M细胞周期蛋白,细胞周期蛋白B1在原发性肝细胞刚从肝脏分离的老鼠(0小时)之前或之后的PH值(24、48、72或96个小时)。意义分析了使用双尾学生与基线相比t(0小时)(n = 3 - 6 /时间的老鼠,* p < 0.05)。线图显示了均值±SEM IGF2BP3-positive数量的有丝分裂在这些时间数据。IGF2BP3-positive数量之间的相关性有丝分裂人物和肝细胞的表达细胞周期蛋白B1信使rna进行了分析使用皮尔逊的r (r,相关系数)。(E)双重免疫荧光染色法对IGF2BP3(绿色)细胞增殖标记,Ki67(红色),在48小时post-PH肝细胞分离。核复染色是由DAPI(蓝色)和合并后的图片所示。酒吧= 20µm规模。(F)中存在的分析Igf2bp3原发性肝细胞与小鼠pre-PH(0小时)或post-PH(1、6、24、48、72、96或120个小时)。均值±SEM结果使用双尾画和统计分析学生的学习任务与基线相比,pre-PH(0小时)(n = 3 - 6小鼠/时间,* * * p < 0.05, p < 0.005)。(G)免疫印迹IGF2BP3正常化的总蛋白在原发性肝细胞溶解产物刚从肝脏分离后在指定时间点的老鼠博士代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。DAPI 4′, 6-diamidino-2-phenylindole;IGF2BP3,胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3;曼氏金融,有丝分裂图;存在,定量一结论。

    除了比成熟肝细胞增殖,胎儿肝细胞不同于成熟肝细胞肝祖标记的表达和anchorage-independent增长的能力。33 34因此,我们比较这些参数在原发性肝细胞分离,从老鼠虚假手术后(0)或博士与时间0肝细胞相比,再生肝细胞表达高水平的几个祖标记(例如,Fn14,法新社,Cd133,Sox9),但低水平的mrna和大鹏展翅,成熟的肝细胞,包括C / ebpα和多个let7米尔家族成员(图3 a - c)。有趣的是,我们发现原发性肝细胞刚从健康成年小鼠的肝脏分离之前PH值表示更高水平的42 kD C / EBPα(第42页)比(C / e) 30 kD对碘氧基苯甲醚EBPα。PH值后,第42页的水平C / EBPα在原发性肝细胞是暂时性的表达下调(24小时和72小时post-PH),然后恢复(96小时post-PH)肝再生结束(图3 c)。这些结果与以前的出版物一致。351993年,据报道,第42页:e比率增加肝细胞在肝脏发展和e C / EBPα不是抗有丝分裂的,而全身的第42页C / EBPα抑制细胞增殖。36最近的一项研究在急性髓系白血病细胞显示e C / EBPα诱发致癌长非编码RNA转录,UCA1(维持细胞增殖),而页C / EBPα压制UCA1转录。37因此,综合数据表明,PH值后,C / EBPα成人肝细胞表达谱变得更加fetal-like proproliferative。祖标记浓缩也展示了从CCl急性肝脏再生4全身的肝损伤(在线补充图S7A, B)。进一步,当anchorage-independent增长条件下培养7天,再生肝脏肝细胞分离形成的12倍,明显增大,non-adherent球状体比non-regenerating肝脏肝细胞分离(0)(图3 d e)。再生肝脏肝细胞分离是异构的,然而:一些细胞形成的球状体,而其他人则成为附着到培养板尽管接触条件,支持anchorage-independent增长。重点分析这两个亚种群的证明的成熟肝细胞标记的表达,C / ebpα相对丰富,贴壁细胞。相比之下,表达Igf2bp3和Cd133(胎儿肝脏标记)在球状体高出许多倍。球状体,但不贴壁细胞,也表达了端粒酶逆转录酶(叔),一个标记将再生与不可再生肝细胞在最近血统追踪研究38(图3 f, G)。综合数据表明,亚种群的肝细胞再生肝脏变得更加胎儿肝细胞的增殖和获得与众不同的特征。

    Regenerating hepatocytes exhibit fetal liver cell-like traits. (A and B) qRT-PCR analysis for (A) fetal liver/progenitor-cell markers including Fn14, Afp, Cd133 and Sox9, and a marker of mature hepatocytes, C/ebpα, and (B) let7 microRNAs (let-7a-5p, let-7c-5p, let-7e-5p, let-7f-5p and let-7g-5p) in primary hepatocytes freshly isolated from livers of mice pre-PH (0 hour) or post-PH (24, 48, 72 or 96 hours). The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with baseline, pre-PH (0 hour) (n=3–6 mice/time, *p<0.05, **p<0.005). (C) Immunoblots for SOX9 and C/EBPα (p42 and p30 isoforms) in protein lysates of primary hepatocytes freshly isolated from livers of mice at designated time points after PH. Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry normalised to total protein levels are displayed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with 0 hour (n=3–6 mice/time, *p<0.05, **p<0.005). (D and E) Sphere formation assay used primary hepatocytes isolated from mice pre-PH (0 hour) or 48 hours post-PH. Representative micrographs show spheroids created by quiescent (0 hour) hepatocytes (E) or regenerating hepatocytes (48 hours post-PH) (D and E) during 7 days of culture. The relative number and size of spheroids were analysed after 7 days of culture using the ImageJ software. The mean±SEM results from triplicate experiments are graphed and two-tailed Student’s t-test was used to determine significance of differences versus pre-PH hepatocytes (0 hour) (n=3 repeats/time point, **p<0.005). Scale bar=50 µm. (F) qRT-PCR analysis for Igf2bp3, Tert, Cd133 and C/ebpα in primary hepatocytes freshly isolated from mouse livers pre-PH (0 hour) or from either adherent hepatocytes or spheroid-forming free-floating hepatocytes which were cultured under non-adherent condition for 7 days after isolation from mice at 48 hours post-PH. The mean±SEM results are graphed. Two-tailed Student’s t-test was used to determine significance of differences between 48 hours post-PH hepatocytes and hepatocytes isolated pre-PH (0 hour) (n=3 repeats/group, *p<0.05, **p<0.005). (G) Representative images of double immunofluorescence staining for IGF2BP3 (green) and CD133 (red) in cytospin samples of free-floating spheroids. Nuclei were counterstained with DAPI (blue) and the merged image is shown. C/EBPα, CCAAT/enhancer-binding protein alpha; DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; PH, partial hepatectomy; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    再生肝细胞表现出胎儿肝细胞样的特征。(A和B)中存在分析胎儿肝脏/祖细胞标记包括(A)Fn14,法新社,Cd133和Sox9成熟肝细胞的一个标志,C / ebpα和(B) let7小分子核糖核酸(let-7a-5p,let-7c-5p,let-7e-5p,let-7f-5p和let-7g-5p)在原发性肝细胞刚从肝脏分离小鼠pre-PH(0小时)或post-PH(24、48、72或96个小时)。均值±SEM结果使用双尾画和统计分析学生的学习任务与基线相比,pre-PH(0小时)(n = 3 - 6小鼠/时间,* * * p < 0.05, p < 0.005)。(C)免疫印迹SOX9和C / EBPα(第42页和e亚型)在原发性肝细胞蛋白质溶解产物刚从肝脏分离后在指定时间点的老鼠博士代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。均值±SEM的结果带微正常化总蛋白质含量显示和统计分析使用双尾学生的学习任务与0小时(n = 3 - 6小鼠/时间,* * * p < 0.05, p < 0.005)。实验(D和E)球面形成原发性肝细胞分离小鼠pre-PH(0小时)或post-PH 48小时。代表显微图显示由静止的球状体(0小时)肝细胞(E)或再生肝细胞(post-PH 48小时)(D和E)在7天的文化。球状体的相对数量和规模进行分析使用ImageJ软件经过7天的文化。均值±SEM结果一式三份实验是画和双尾学生的学习任务是用来确定意义的差异与pre-PH肝细胞(0小时)(n = 3重复/时间点,* * p < 0.005)。酒吧= 50µm规模。(F)中存在的分析Igf2bp3,叔,Cd133和C / ebpα原发性肝细胞刚从小鼠肝脏分离pre-PH(0小时)或从附着肝细胞或spheroid-forming non-adherent条件下自由浮动的肝细胞培养7天后隔绝在48小时post-PH老鼠。均值±SEM结果是画的。双尾的学生的学习任务是用来确定意义差异48小时post-PH肝细胞和肝细胞孤立pre-PH(0小时)(n = 3重复/组* * * p < 0.05, p < 0.005)。(G)代表图像双重免疫荧光染色IGF2BP3(绿色)和CD133(红色)在cytospin自由浮动的球状体的样品。核与DAPI复染色(蓝色)和合并后的图像显示。C / EBPαCCAAT / enhancer-binding蛋白α;DAPI 4’, 6-diamidino-2-phenylindole;IGF2BP3,胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3;PH值,部分肝切除术;存在,定量一结论。

    IGF2BP3和YAP1合作变得更加增生性和fetal-like让肝细胞

    负责成人肝细胞重编程的机制获得fetal-like表型在再生肝脏是未知但必须划定为了适当地限制过程和改善患者的肝功能阿尔夫。因为我们的数据与胎儿肝脏链接IGF2BP3计划,我们评估了对胎儿肝脏的影响项目后给小干扰RNA (si)抑制IGF2BP3表达人类肝癌细胞内源性高表达IGF2BP3 (Hep3B细胞)。结果与Hep3B细胞相比,同样的待遇和小干扰rna或培养的新治疗。击倒IGF2BP3显著抑制mRNA和蛋白的表达法新社,SOX9和细胞周期蛋白B1,减少anchorage-independent增长(图4 a - c)。相反,治疗主要健康小鼠肝细胞(勉强表达IGF2BP3)IGF2BP3互补DNA过度表现IGF2BP3显著提高C / EBPαSOX9表达式和压抑的表达式(图4 d)。有趣的是,过度的IGF2BP3 Hep3B细胞有相似的影响,尽管他们高IGF2BP3的内源性表达(图4 d e)。这些结果表明,IGF2BP3可以直接调节罹成人肝细胞命运决定,导致这些细胞变得更fetal-like和增殖,属性,它也促进恶性肝细胞。

    Fetal liver cell-like phenotype is controlled by IGF2BP3. (A) qRT-PCR analysis for IGF2BP3, AFP, SOX9 and Cyclin B1 (CCNB1) in the Hep3B human hepatoblastoma cell line, untreated (untr) or transfected with 10 nM of IGF2BP3 siRNA (siR) or same concentration of non-targeting (nt) siRNA for 96 hours. The mean±SEM results from four unique experiments are graphed. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA with Tukey corrections (n=4 repeats/group, *p<0.05, **p<0.005). (B) Immunoblots for IGF2BP3, AFP, SOX9, CCNB1 and β-actin. Blots representative of three or four independent blots are shown. The mean±SEM results of band densitometry normalised to β-actin on all blots are graphed and statistical significance assessed using ANOVA with Tukey corrections. (C) Sphere formation assay in Hep3B untreated or transfected with either nt or IGF2BP3 siR (10 nM). The number and size of spheres were analysed after 14 days of culture. The mean±SEM results from triplicate experiments are graphed and ANOVA with Tukey corrections was used to compare significance of results in treated group with untreated or non-targeting transfection groups (n=3 repeats/group, **p<0.005). Representative images are shown. Upper panel: 40× magnification; lower panel: 100× magnification; scale bar=250 µm. (D) Immunoblots for IGF2BP3, SOX9, C/EBPα (p42 and p30 isoforms) and β-actin in mouse primary hepatocytes (mHep) or Hep3B transfected with 0.5 µg/well of empty vector (Empty) as a negative control or pDESTmycIGF2BP3 vector (IGF2BP3 DNA) in six-well plate for 48 hours. The mean±SEM results of band densitometry normalised to β-actin are graphed and two-tailed Student’s t-test was used to compare IGF2BP3 DNA cells with cells treated with empty vector (n=3 repeats/group, *p<0.05). (E) qRT-PCR analysis for IGF2BP3 and C/EBPα in Hep3B transfected with either Empty or IGF2BP3 DNA for 48 hours. The mean±SEM results from triplicate experiments are graphed. Statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test (n=3 repeats/group, *p<0.05, **p<0.005). ANOVA, analysis of variance; C/EBPα, CCAAT/enhancer-binding protein alpha; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR; siRNA, small interfering RNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    胎儿肝细胞样的表型是由IGF2BP3控制的。(一)存在分析IGF2BP3,法新社,SOX9和细胞周期蛋白B1(CCNB1)Hep3B人类肝胚细胞瘤细胞系,未经处理(untr)或与10 nM的转染IGF2BP3核(先生)或相同浓度的新(nt)核96小时。均值±SEM结果从四个独特的实验是画。统计分析了使用单向方差分析和图基修正(n = 4重复/组* * * p < 0.05, p < 0.005)。(B)的免疫印迹IGF2BP3,法新社、SOX9, CCNB1β-actin。墨迹的代表三个或四个独立的墨迹图所示。均值±SEM的结果带微正常化β-actin墨迹图都画和统计学意义评估使用方差分析和图基修正。(C)球面形成分析Hep3B未经处理或与nt或转染IGF2BP3先生(10 nM)。球体的数量和规模进行分析后14天的文化。均值±SEM结果一式三份实验是画和方差分析图基修正被用来比较的意义结果在治疗组与未经处理或新转染组(n = 3重复/组* * p < 0.005)。代表性的图片所示。上面板:40×放大;较低的面板:100×放大;酒吧= 250µm规模。(D)免疫印迹,IGF2BP3 SOX9、C / EBPα(第42页和e亚型)和β-actin鼠标主要肝细胞(mHep)或Hep3B转染与0.5µg /空向量(空的)是一种消极控制或pDESTmycIGF2BP3向量(IGF2BP3 DNA) six-well板48小时。均值±SEM的结果带微正常化β-actin画和双尾学生的学习任务是用来比较IGF2BP3 DNA细胞与细胞治疗空向量(n = 3重复/组,p < 0.05)。(E)中存在的分析IGF2BP3和C / EBPα在Hep3B转染空或IGF2BP3 DNA 48小时。均值±SEM结果一式三份实验是画。统计分析是使用双尾执行学生t (n = 3重复/组* * * p < 0.05, p < 0.005)。方差分析,方差分析;C / EBPαCCAAT / enhancer-binding蛋白α;IGF2BP3,胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3;存在,定量一;核,小干扰RNA。

    在肝癌的发展过程中,肝细胞成熟的特点是微分rna结合蛋白的表达。不像IGF2BP3晚期分化肝细胞中表达下调,RNA剪接因子,上皮拼接监管protein-2 (ESRP2)是诱导。防止ESRP2诱导促进肝细胞增殖和逮捕肝细胞在肝脏发展成熟,大概维持ESRP2-regulated目标的表达,抑制肝细胞分化,如YAP1。39尽管PH值在成人肝细胞,诱导YAP116我们的数据表明,再生肝细胞变得更fetal-like (图2 - 3),这些细胞是否抑制ESRP2尚不清楚。因此,我们跟踪ESRP2表达式在原发性肝细胞收获后不同时间的PH值,发现ESRP2 mrna迅速减少~ 550%基础水平,才恢复~ 120小时post-PH (图5一个)。互惠IGF2BP3表达的变化发生在这个时间间隔(图2 f),免疫组织化学证实,增生的肝细胞表达IGF2BP3但不是ESRP2 post-PH 48小时,而non-proliferative时间0肝脏的肝细胞ESRP2-positive和IGF2BP3-negative (图2和图5 c)。免疫印迹分析(图5 b)和免疫组织化学(图5 c)展示的预期upregulation YAP1 post-PH再生肝细胞从24到72小时,并进一步的免疫印迹分析数据(图2 f和图5 b)证实肝细胞表达YAP1和IGF2BP3强烈相关(r = 0.8843, p = 0.0464)。公布结果证明YAP1激活让成人肝细胞变得更增生性和fetal-like,20.但现在还不知道如果YAP1 IGF2BP3并行交互或操作影响这样的重组。我们的数据表明,YAP1和IGF2BP3余导出在肝脏的肝细胞严重失败(图1,在线补充图S1和S2),以及有效地鼠肝脏再生(图2和图5,在线补充数据S6-S7)。因此,我们如何评估hepatocyte-specific损耗Yap1影响胎儿的重组注入健康的成年人Yap1液氧/液氧小鼠腺相关病毒载体,有选择地介绍了Cre重组酶为成熟肝细胞(AAV8-TBG-Cre) PH值前6天,和评估再生反应博士与后48小时Yap1液氧/液氧老鼠同等对待控制向量(AAV8-TBG-luciferase),从而证明了在肝细胞没有Cre染色,AAV8-TBG-Cre-treatedYap1液氧/液氧老鼠广泛Cre染色在肝细胞细胞核的PH值(0)和post-PH 48小时(图5 c)。这些结果证实了我们的方法的靶向特异性和证明健康成熟肝细胞能够存活Yap1损耗。重要的是,相比之下,Yap1足够的肝脏、Yap1缺乏肝脏表达减少Igf2bp3信使rna PH值(之前和之后都图5 d)。与这个结果一致,耗尽Yap1PH值之前阻止IGF2BP3积累(+)肝细胞,抑制有丝分裂活动,明显抑制诱导祖基因,和减毒抑制肝细胞分化标记,包括ESRP2、PH值后(图5 c, E,在线补充图S8)。hepatocyte-specific删除的负面影响Yap1在post-PH胎儿胎儿特征相比,重组更加明显,当我们在原发性肝细胞分离Yap1耗尽,Yap1足够的肝脏。Yap1损耗显著抑制祖标记的表达和降低细胞周期素E1,但马克成熟肝细胞增强表达的因素,包括C / ebpαEsrp2和多个let7家庭成员(图5 f)。免疫印迹分析表明,击倒Yap1基本上消除YAP1蛋白在肝细胞和蛋白表达降低IGF2BP3 ~ 74% (图5克)。重要的是,这些Yap1 / IGF2BP3减少肝细胞表现出显著降低anchorage-independent能力增长(图5 h)。证据表明胎儿一起计划也直接影响操作IGF2BP3(图4),Yap1击倒的首次实验证明这两种瘤胎蛋白,YAP1 IGF2BP3,相互合作,让亚种群的肝细胞严重受伤时变得更加增生性和fetal-like肝脏再生。因为我们的分析患者的肝脏阿尔夫表明胎儿重组过于旺盛的阿尔夫(图1),它是至关重要的澄清什么控制YAP1 IGF2BP3堆积在肝脏修复。

    Targeted depletion of YAP1 in hepatocytes inhibits accumulation of IGF2BP3-positive cells and prevents livers from becoming fetal-like after a regenerative challenge. (A) qRT-PCR analysis for Esrp2 in primary hepatocytes isolated from mice pre-PH (0 hour) or post-PH (1, 6, 24, 48, 72, 96 or 120 hours). The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test compared with baseline, pre-PH (0 hour) (n=3–6 mice/time, *p<0.05, **p<0.005). (B) Immunoblot for YAP1 normalised to total protein in lysates of primary hepatocytes freshly isolated from livers of mice at designated time points after PH. Representative blots are shown among three independent blots with similar results. (C) Yap1 flox/flox mice were injected with either AAV8-TBG-Luciferase (Luc, Yap1-WT) or AAV8-TBG-Cre recombinase (Cre, Yap1-KO), and livers were harvested either immediately pre-PH (0 hour) or at 48 hours post-PH. Representative images of liver sections analysed for Cre recombinase, YAP1 and ESRP2 expression are shown. Scale bar=50 µm. (D) qRT-PCR analysis for Igf2bp3 in liver tissues of Yap1-WT or Yap1-KO mice before or after PH. The mean±SEM results are graphed and significance was analysed using two-tailed Student’s t-test compared with each baseline (0 hour) or between AAV8-TBG-Luc and AAV8-TBG-Cre groups at each time point (n=4–7 mice/group/time, *p<0.05). (E) Immunohistochemistry for IGF2BP3 in liver sections of Yap1-WT or Yap1-KO mice sacrificed at 48 hours post-PH. Representative images are shown. Scale bar=100 µm. The number of IGF2BP3-positive hepatocytes was counted in five randomly selected 10× magnification fields/section. The proportion of IGF2BP3-positive cells with a mitotic figure is shown with hatched marking. The mean±SEM results are graphed and statistical analysis was performed using two-tailed Student’s t-test (n=4 mice/group, *p<0.05 for total positive cells). (F) qRT-PCR analysis for Fn14, Afp, Cd133, C/ebpα, Esrp2, Cyclin E1 (Ccne1) and let7 microRNAs in primary hepatocytes freshly isolated from livers of Yap1-WT or Yap1-KO mice at 48 hours post-PH. The mean±SEM results are graphed and two-tailed Student’s t-test was used to compare Yap1-KO with Yap1-WT (n=4 mice/group, *p<0.05, **p<0.005). (G) Immunoblots for YAP1, IGF2BP3 and β-actin in protein lysates of primary hepatocytes freshly isolated from livers of Yap1-WT or Yap1-KO mice at 48 hours after PH. Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry normalised to β-actin for all blots are displayed and statistical significance was assessed using two-tailed Student’s t-test (n=4 mice/group, *p<0.05, **p<0.005). (H) Sphere formation assay was performed with primary hepatocytes isolated from Yap1-WT or Yap1-KO mice at 48 hours post-PH. Representative micrographs show spheroids created by regenerating hepatocytes isolated from designated groups during 7 days of culture. The relative number and size of spheroids were analysed after 7 days of culture using the ImageJ software. The mean±SEM results from triplicate experiments are graphed and two-tailed Student’s t-test was used to assess statistical significance (n=3 repeats/group, **p<0.005). Scale bar=50 µm. C/EBPα, CCAAT/enhancer-binding protein alpha; ESRP2, epithelial splicing regulatory protein-2; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; PH, partial hepatectomy; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR; YAP1, Yes-associated protein-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    YAP1目标减少肝细胞抑制IGF2BP3-positive细胞和防止肝脏积累成为fetal-like再生后的挑战。(一)存在分析Esrp2原发性肝细胞与小鼠pre-PH(0小时)或post-PH(1、6、24、48、72、96或120个小时)。均值±SEM结果使用双尾画和统计分析学生的学习任务与基线相比,pre-PH(0小时)(n = 3 - 6小鼠/时间,* * * p < 0.05, p < 0.005)。(B)免疫印迹YAP1正常化的总蛋白在原发性肝细胞溶解产物刚从肝脏分离后在指定时间点的老鼠博士代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。(C)Yap1液氧/液氧老鼠注射AAV8-TBG-Luciferase (Luc,Yap1wt)或AAV8-TBG-Cre重组酶(CreYap1ko),肝脏是收获要么立即pre-PH post-PH(0小时)或在48小时。代表图像肝部分分析Cre重组酶,YAP1和ESRP2表达式所示。酒吧= 50µm规模。(D)中存在的分析Igf2bp3肝组织中Yap1wt或Yap1ko小鼠博士之前或之后均值±SEM结果画和意义进行了分析使用双尾学生的学习任务与每个基线(0小时)或AAV8-TBG-Luc和AAV8-TBG-Cre组之间在每个时间点(n = 4 - 7 /组/时间的老鼠,* p < 0.05)。(E)免疫组织化学的IGF2BP3肝脏的部分Yap1wt或Yap1在48小时post-PH ko小鼠牺牲。代表性的图片所示。酒吧= 100µm规模。IGF2BP3-positive肝细胞的数量计入5随机选择10×放大领域/部分。IGF2BP3-positive细胞有丝分裂图的比例与孵化标记显示。均值±SEM结果画和统计分析使用双尾学生t (n = 4 /组的老鼠,总阳性细胞* p < 0.05)。(F)中存在的分析Fn14,法新社,Cd133 C / ebpα,Esrp2,细胞周期素E1(Ccne1)和let7 microrna在原发性肝细胞刚从肝脏分离Yap1wt或Yap1在48小时post-PH ko小鼠。均值±SEM结果画和双尾学生的学习任务是用来比较Yap1ko和Yap1wt (n = 4 /组的老鼠,* * * p < 0.05, p < 0.005)。(G)免疫印迹,YAP1 IGF2BP3和β-actin蛋白质溶解产物原发性肝细胞刚从肝脏分离Yap1wt或Yap1ko小鼠在48小时后博士代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。均值±SEM的结果带微正常化为所有墨迹显示和统计意义β-actin评估使用双尾学生t (n = 4 /组的老鼠,* * * p < 0.05, p < 0.005)。执行(H)球面形成分析原发性肝细胞分离Yap1wt或Yap1在48小时post-PH ko小鼠。代表显微图显示由球状体再生肝细胞分离出指定的文化团体在7天。球状体的相对数量和规模进行分析使用ImageJ软件经过7天的文化。均值±SEM结果一式三份实验是画和双尾的学生的学习任务是用来评估统计学意义(n = 3重复/组* * p < 0.005)。酒吧= 50µm规模。C / EBPαCCAAT / enhancer-binding蛋白α;ESRP2监管protein-2上皮拼接;IGF2BP3,胰岛素样生长因子2 rna结合蛋白质3;PH值,部分肝切除术;存在,定量一; YAP1, Yes-associated protein-1.

    Let7大鹏展翅的核心作用在调节肝细胞积累YAP1 IGF2BP3

    发现Yap1消耗相互地调节let7和IGF2BP3成熟肝细胞的抑制可能是重要的,因为后者两个因素彼此在许多干细胞样细胞。14日24因此,澄清YAP1之间的关系,let7 IGF2BP3肝细胞,我们与不同剂量的verteporfin Hep3B细胞治疗,药理抑制剂YAP1活动。40存在剂量依赖的相关性和时间抑制YAP1和IGF2BP3 verteporfin反映其相互存在剂量依赖的相关性和时间感应多个let7家庭成员(图6模拟,在线补充图S9A),支持一个模型即YAP1活动相互地调节的相对丰度在肝细胞rna结合蛋白促进胎儿计划(如IGF2BP3)和大鹏压制这胎儿计划促进肝细胞成熟(如let7s)。符合这个概念,verteporfin-related抑制YAP1存在剂量依赖的相关性和时间损失引起的胎儿肝脏特征Hep3B细胞(图6 eg,在线补充图S9B, C)。值得注意的是,仅仅overexpressing IGF2BP3 verteporfin-treated(即YAP1-inactivated)胎儿细胞足以拯救计划(图6 h),证明IGF2BP3直接介导YAP1的最终行为。进一步,当IGF2BP3表达式Hep3B细胞,恢复YAP1蛋白的表达增加,而ESRP2下降,表明IGF2BP3可能诱发YAP1部分通过抑制ESRP2, RNA剪接因子,通常会使YAP1肝脏发展目的。39展示多个IGF2BP3结合位点ESRP2信使rna在硅片分析支持这个概念(在线补充图S10A)。重要的是,肝脏的肝细胞积累IGF2BP3和YAP1阿尔夫associates患者显著的损失从肝细胞细胞核ESRP2(网上补充图S10B),这表明IGF2BP3也可能与ESRP2调节YAP1罹成人肝细胞。聚合数据揭示小说转录后的机制会影响快速和关键改变成人肝细胞的表型(图6我),因此对疾病产生潜在的影响发生在成熟肝细胞功能丧失,包括急性和acute-on-chronic肝衰竭。

    YAP1 and IGF2BP3 regulate each other during fetal programming. (A) qRT-PCR analysis for YAP1 and IGF2BP3 in Hep3B treated for 24 or 48 hours with 2 or 10 µM of a pharmacological inhibitor of YAP1 activity, verteporfin (VP), or 0.1% DMSO as a vehicle control (Veh). (B) Immunoblots for YAP1, IGF2BP3 and β-actin in Veh-treated or VP-treated Hep3B (2 or 10 µM). Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry of all blots are shown in online supplementary figure S9. (C) Immunofluorescence staining for YAP1 and IGF2BP3 (green) in Hep3B treated with Veh or VP (2 or 10 µM) for 24 hours. White-coloured arrows indicate the nuclear localisation of YAP1. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Representative images are shown. Scale bar=20 µm. (D) qRT-PCR analysis for let-7a, c, e, f, g-5p in Veh-treated or VP-treated Hep3Bs. All qRT-PCR data are graphed as mean±SEM results from triplicate experiments (n=3 repeats/group/time, *p<0.05, **p<0.005). (E) Immunoblots for AFP, SOX9, CCNE1, CCNB1 and β-actin in Veh-treated or VP-treated Hep3B. Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry for all blots are displayed in online supplementary figure S9C. (F) Cell viability/proliferation was assessed by Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay in Hep3B treated with either Veh or VP. The mean±SEM results are graphed (n=6 repeats/group/time, **p<0.005). (G) Sphere formation assay in Hep3B treated with Veh or VP (2 or 10 µM). The number and size of spheres were analysed after 14 days of culture. The mean±SEM results from triplicate experiments are graphed (n=3 repeats/group, **p<0.005). Representative images are shown. Upper panel: 40× magnification; lower panel: 100× magnification; scale bar=250 µm. Statistical significance of all differences was assessed using two-tailed Student’s t-test. (H) Immunoblots for IGF2BP3, SOX9, CCNB1, YAP1, ESRP2 and β-actin in Hep3B treated with 2 µM of VP for 24 hours 1 day after treatment with either empty vector (Empty) or pDESTmycIGF2BP3 vector (IGF2BP3 DNA). Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry for all blots are displayed, and statistical analysis was assessed using two-tailed Student’s t-test compared with empty vector-treated Hep3B (n=3 repeats/group, *p<0.05, **p<0.005). (I) Putative model of post-transcriptional mechanisms regulating the phenotype of adult hepatocytes by YAP1, ESRP2, let7 and IGF2BP3. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; DMSO, dimethyl sulfoxide; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR; YAP1, Yes-associated protein-1. 
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    “胎儿规划期间YAP1和IGF2BP3相互调节。(一)存在分析YAP1和IGF2BP3在Hep3B治疗24或48小时2到10µM YAP1药理抑制剂的活动,verteporfin(副总裁),或0.1% DMSO作为车辆控制(阿明费)。(B)免疫印迹,YAP1 IGF2BP3和β-actin Veh-treated或VP-treated Hep3B(2到10µM)。代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。均值±SEM的结果带在线微的墨迹图所示补充图S9。(C)免疫荧光染色YAP1和IGF2BP3(绿色)在Hep3B对待Veh或副总裁(2 - 10µM) 24小时。YAP1 White-coloured箭头表示核本地化。核与DAPI复染色(蓝色)。代表性的图片所示。酒吧= 20µm规模。(D)中存在的分析let-7a, c, e, f, g-5p在Veh-treated或VP-treated Hep3Bs。所有的画中存在数据均值±SEM结果从实验一式三份(n = 3重复/组/时间,* * * p < 0.05, p < 0.005)。对法新社(E)免疫印迹,SOX9、CCNE1, CCNB1β-actin Veh-treated或VP-treated Hep3B。代表墨迹图所示三个独立的屁股中类似的结果。均值±SEM的结果带微墨迹显示在在线补充图S9C。(F)细胞生存能力/扩散进行细胞计数Kit-8 (CCK8)测定在Hep3B对待阿明费或副总裁。均值±SEM结果画(n = 6 /组/时间重复,* * p < 0.005)。(G)球面形成分析Hep3B Veh或副总裁处理(2到10µM)。球体的数量和规模进行分析后14天的文化。均值±SEM结果一式三份实验画(n = 3重复/组* * p < 0.005)。代表性的图片所示。上面板:40×放大;较低的面板:100×放大;酒吧= 250µm规模。 Statistical significance of all differences was assessed using two-tailed Student’s t-test. (H) Immunoblots for IGF2BP3, SOX9, CCNB1, YAP1, ESRP2 and β-actin in Hep3B treated with 2 µM of VP for 24 hours 1 day after treatment with either empty vector (Empty) or pDESTmycIGF2BP3 vector (IGF2BP3 DNA). Representative blots are shown among three independent blots with similar results. The mean±SEM results of band densitometry for all blots are displayed, and statistical analysis was assessed using two-tailed Student’s t-test compared with empty vector-treated Hep3B (n=3 repeats/group, *p<0.05, **p<0.005). (I) Putative model of post-transcriptional mechanisms regulating the phenotype of adult hepatocytes by YAP1, ESRP2, let7 and IGF2BP3. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; DMSO, dimethyl sulfoxide; IGF2BP3, Insulin-like growth factor-2 RNA-binding protein-3; qRT-PCR, quantitative reverse transcription-PCR; YAP1, Yes-associated protein-1.

    讨论

    死亡率在人类肝衰竭是可靠地预测的算法,反映正常肝脏胆红素解毒能力丧失,凝血因子合成和稳态调节的其他器官。事实上,肝功能衰竭的严重程度估计这些评分系统建立了肝移植的优先事项。41然而,因为肝移植是许多患者肝功能衰竭不可行,替代治疗阿尔夫和acute-on-chronic肝衰竭是迫切需要的。本研究提出了一个可能性,也许能减轻肝衰竭的干预措施,促进肝细胞分化。我们的工作证实了早些时候报道,表明相对大量的未成熟/ fetal-like细胞积聚在患者的肝脏阿尔夫。9 - 11 42重要的是,我们也证明肝浓缩与未成熟的细胞是一个正常的肝脏再生的特点。hepatocytic各亚群细胞和胎儿肝细胞标记和生长特性成为鼠标CCl PH值或急性肝脏再生后70%4全身的肝损伤。这些不成熟的肝细胞来源于成熟的肝细胞,由于存活肝细胞重新繁衍肝细胞在这一背景下的来源。29 43通常,de-differentiation过程严格限制,因为不成熟肝细胞的数量累积和持续时间,浓缩与不成熟hepatocytic细胞持续严格限制再生后刺激诱发CCl PH值或急性治疗4。这些新数据是一致的证据表明,肝脏功能障碍通常是这些侮辱后轻度和短暂的。因此,我们得出这样的结论:机制,调节肝细胞的分化(即可塑性)成人肝脏成为手术过程中有效的肝再生,但这样肝细胞特异表达de-differentiation主要见于肝衰竭,导致危及生命的损失hepatocyte-specific函数作为肝脏试图修复至关重要。

    我们的研究还发现了易处理的机制,调节肝细胞可塑性的肝细胞de-differentiation控制程度发生在肝脏再生。特别是,我们发现这个过程是由瞬时活化的机制,调节肝细胞分化在肝脏发育。更具体地说,成人肝脏再生诱导rna结合蛋白的表达,IGF2BP3,胎儿肝细胞中高度表达,肝干细胞样细胞,但通常沉默在健康成人肝脏。相反,它们会抑制大鹏展翅的表达在健康的成人肝细胞广泛流行的但通常是罕见的胎儿肝细胞(如let7家庭成员)。IGF2BP3微分变化的模式和let7内容符合出版资料表明这些因素是相互对立的,也就是说,IGF2BP3抑制let7,反之亦然。14日24此外,肝细胞的相互变化的内容IGF2BP3 rna结合蛋白和let7大鹏再生挑战预测的结果,也就是说,de-differentiation成人肝细胞更加不成熟的表型。这些结果令人兴奋的临床意义,因为他们认为,补充let7s可能恢复失败的肝脏的肝细胞成熟,鉴于let7s抑制IGF2BP3我们表明IGF2BP3 fetal-like的近端效应在肝细胞表型。适当的评价这个问题将是一个挑战,但战略似乎希望基于早先的出版物,报道说,外源性表达let7足以废除小鼠肝癌的生长依赖于类似干细胞IGF2BP3(+)肿瘤起始细胞。44最后,我们发现了一个以前未知的YAP1和let7-IGF2BP3轴之间的关系。这个发现在成人肝细胞可能有广泛的影响,因为YAP1激活抵销上皮分化在许多组织,包括肝脏。20 45 46在我们的研究中,hepatocyte-specific删除Yap1阻塞let7抑制和诱导IGF2BP3并导致抑制肝细胞de-differentiation和扩散。此外,overexpressing IGF2BP3在verteporfin-treated (YAP1-inactivated)肝胚细胞瘤细胞恢复YAP1 YAP1-inducible基因标记的表达细胞增生性fetal-like(如SOX9, CCNB1),而压制ESRP2的表达,通常抑制YAP1 RNA剪接因子,抑制肝细胞增殖和促进肝细胞成熟的肝脏发展。39这些小说的结果确定YAP1作为监管机构和目标let7-IGF2BP3轴,从而表明抑制YAP1激活可能是另一种方法改变肝细胞de-differentiation和阿尔夫恢复肝脏功能。

    总之,功能齐全的有效再生肝损伤后肝实质需要替换的死与健康成熟的肝细胞肝细胞。这个过程需要精确调节肝细胞可塑性这祖人口动员也无言。重要hepatocyte-specific损失函数,肝功能衰竭,随之而来当过程变得偏向有利于积累不成熟的肝细胞。机制,计划细胞是干细胞/祖细胞在胎儿发育等重新激活,然后沉默,在肝细胞有效的再生反应。操纵驾驶“胎儿规划的因素,包括YAP1 IGF2BP3 let7,能够限制未成熟的细胞积累在肝脏受伤,确定这些因素和途径调节小说从肝衰竭治疗靶点改善复苏。

    材料和方法

    实验动物模型

    男,成人C57BL / 6 j野生型小鼠(WT)(杰克逊实验室,巴尔港)(n = 42)Yap1液氧/液氧老鼠(从Udayan博士的利润率,堪萨斯大学)(n = 21) PH值或虚假的手术。肝细胞或肝收获0、24、48、72或96小时后。男性Yap1液氧/液氧老鼠通过尾静脉注射5×1011基因组等价物AAV8-TBG-Luc或AAV8-TBG-Cre(宾夕法尼亚大学病毒载体的核心)博士6天前十二个额外WT老鼠牺牲0,2、4、7天后一个CCl注入4(0.753毫升/公斤溶解在橄榄油)。47

    人类的肝脏样本

    Formalin-fixed石蜡包埋的正常肝移植(n = 1)和肝脏患者的阿尔夫(n = 8)获得与MetaMorph公爵病理档案和分析软件(分子设备)。

    统计数据

    结果表示为±SEM和分析了双尾学生的t- - - - - -测试或单向方差分析,因果图基的测试。显著性差异p < 0.05。所有相关分析分析了皮尔森相关系数(r)。

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    脚注

    • 贡献者JH:帮助的设计研究,进行实验,获取数据,分析数据,提供试剂、写作手稿。S-HO:进行实验,获取数据。RTP:进行实验,获取数据。CDG:提供人类肝脏样本。CLB:提供人类肝脏样本。AMD:设计研究、分析数据,撰写的手稿,获得资助的研究。

    • 资金这项工作得到了国家卫生研究院的基金DK106633, AA010154 DK077794,佛罗伦萨去医学教授(AMD)和一个奖项公爵再生下一个倡议(JH)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准动物实验进行了下一个杜克大学IACUC批准协议的国家研究委员会的指导实验室动物保健和使用的。人类肝脏获得和分析按照杜克大学的机构审查委员会批准了协议(Pro00087196)。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 病人同意出版不是必需的。

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