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摘要
客观的尽管影像学、血清CA19-9和病理评价有所改善，但区分良恶性胆管狭窄仍然是一个诊断难题。下一代测序(NGS)的最新发展为癌症的早期检测和管理提供了新的机会，但迄今为止，尚未严格应用于胆道标本。
设计我们利用内窥镜逆行胰胆管造影从胆管狭窄患者获得的胆道标本，前瞻性地评估了一个28基因NGS组(BiliSeq)。对252例患者(57例训练，195例验证)346例胆道标本进行血清CA19-9、病理评估和BiliSeq的诊断性能评估。
结果BiliSeq对恶性狭窄的敏感性和特异性分别为73%和100%。相比之下，血清CA19-9升高和病理评估的敏感性分别为76%和48%，特异性分别为69%和99%。BiliSeq联合病理评估将敏感性提高到83%，特异性保持在99%。BiliSeq提高了恶性肿瘤病理评估的敏感性，胆道刷诊从35%提高到77%，胆道活检从52%提高到83%。在原发性硬化性胆管炎(PSC)患者中，BiliSeq的敏感性为83%，而病理评估的敏感性为8%。在20例(8%)患者中发现了治疗相关的基因组改变。两名患者ERBB2-放大胆管癌接受曲妥珠单抗为基础的治疗方案，并有可测量的临床放射反应。
结论BiliSeq联合胆道标本的病理评估增加了恶性狭窄的检出率，特别是在PSC患者中。此外，BiliSeq还确定了可能对患者进行特定抗癌治疗的分层改变。
- 壶腹
- 胆管
- 胆管癌
- 发育不良
- 基因组学
- 分子
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- 胰腺癌
- 精密医学
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数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
尽管多学科的方法，区分良性和恶性胆管狭窄可能是具有挑战性的。
全外显子组和全基因组测序研究已经确定了胆管系统发生和继发肿瘤的遗传格局。
一项可以检测涉及胆管系统的恶性肿瘤关键基因组改变的测试可能对内镜逆行胰胆管造影(ERCP)获得的胆道标本具有诊断实用价值。
本研究的意义
新的发现是什么?
我们在临床实验室改进修订认证和美国病理学家学院认证的实验室中开发并验证了一种高灵敏度、有针对性的下一代测序(NGS)检测方法(BiliSeq)，用于检测涉及胆管系统的恶性肿瘤中通常突变、扩增和/或缺失的28个基因。
一项对ercp获得的胆道标本的大型前瞻性分析显示，BiliSeq提高了胆道刷诊和胆道活检标本病理评估的敏感性。
在原发性硬化性胆管炎患者中，BiliSeq在检测至少高级别胆道发育不良方面优于血清CA19-9和病理评估。
BiliSeq为一部分患者确定了潜在的可操作的基因组改变和可证明的化疗反应。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些结果强调了基于ngs检测的ercp胆道标本在恶性胆管狭窄患者早期发现和治疗中的诊断适用性。
简介
胆管狭窄可分为良性和恶性病变。1良性胆管狭窄可能是由于原发性硬化性胆管炎(PSC)、igg4相关硬化性胆管炎、医源性损伤、感染和其他较少见的病因所致。恶性原因包括胰胆管癌、腹水壶腹癌、肝癌和极少数转移性癌。然而，区分良性和恶性胆管狭窄可能具有挑战性，依赖于临床检查、生化检测(如血清CA19-9)、x线成像、内窥镜手术和辅助研究的病理评估等多学科方法。2考虑到一些良性狭窄的病因可能是恶性肿瘤的诱发因素，这种区别更加艰巨。例如，与一般人群相比，PSC与胆管癌风险增加400倍有关。
内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)通过确定形态成像特征和疾病受累程度，在评估胆管狭窄中起着关键作用。3.然而，在透视中没有病理特征可以区分良恶性。此外，直接胆管镜分级不准确，观察者之间的一致性较差。4个5在ERCP中，胆管刷诊和胆管钳活检是病理确认的首选方法;然而，检测恶性肿瘤的敏感性可在8%至67%之间。4 6尺11寸为了提高恶性狭窄的检测，开发了辅助技术，包括数字图像分析，喀斯特突变检测和荧光原位杂交。12 - 18然而，这些测定方法的灵敏度在14%到60%之间。考虑到病理评估和可用的辅助研究的低敏感性，患者为了诊断目的经常接受多次ERCP手术并不奇怪。因此，恶性狭窄的治疗决定往往延迟几周到几个月，这使患者处于疾病进展的风险中。相反，误诊为良性胆管狭窄可导致不必要的手术切除。据报道，在因疑似恶性狭窄而接受手术的患者中，高达15%的人患有良性疾病。19日20考虑到这些手术切除与相对较高的发病率和死亡率相关，这是令人担忧的。21 - 24日因此，需要更多创新的术前方法来改善良恶性狭窄患者的分层。
在过去的几年里，在了解胆管系统发生或继发肿瘤的基因组景观方面取得了巨大的进展。全外显子组和全基因组测序研究已经报道了在相对少数的致癌基因和肿瘤抑制基因中反复发生的基因组改变，例如喀斯特，TP53，CDKN2A而且SMAD4．25 - 34此外，这些基因组改变的子集，如自动取款机而且ERBB2，可能会导致对特定抗癌疗法的敏感性。同时，新型分子诊断学的引入为术前标本的研究提供了新的机会。35 36胆管标本通常以少量诊断材料为特征，由异质细胞群组成，这可能掩盖或模拟恶性过程。因此，对于分子检测来说，高度敏感地检测这些标本中的小比例突变细胞是至关重要的。下一代测序(NGS)结合了高分析灵敏度和多基因分析，因此是评估胆管狭窄的一个有吸引力的选择。
在这项研究中，我们开发了一种高度敏感的靶向NGS检测方法，称为BiliSeq，用于检测涉及胆管系统的恶性肿瘤中通常突变、扩增和/或缺失的28个基因。25至34岁这个37该测试在临床实验室改进修正案(CLIA)认证和美国病理学家学院(CAP)认证的临床实验室进行，使用ercp获得的胆管刷和/或活检。不同于从细胞涂片/切片、酒精固定(如CytoLyt)或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织中提取DNA，这可能会降低总体产量和质量，在获得常规标本进行病理评估后，直接提交专用的胆管刷刷和/或活检进行BiliSeq检测。我们的目标是前瞻性地评估大量患者的BiliSeq检测，以:(1)确定其在恶性狭窄检测中的准确性，(2)比较其作为其他诊断方法的辅助手段的性能，(3)评估在胆管标本中检测到基因组改变时对患者管理的影响。
材料与方法
患者人群
2014年9月至2016年4月，由匹兹堡大学病理学系资助，匹兹堡大学医学中心(UPMC)的标准ERCP前瞻性收集了57例胆管狭窄患者的胆管标本。在培训队列完成后，2016年9月至2018年8月期间前瞻性累积了195名患者的验证队列，部分资金由匹兹堡大学精确医学研究所提供。共收集163例胆道刷诊和172例胆道活检进行病理评估，收集160例胆道刷诊和135例胆道活检进行BiliSeq检测。胆管标本在ERCP手术后24-48小时内送至UPMC解剖病理实验室进行常规细胞病理和病理评估，并送至UPMC分子与基因组病理学(MGP)实验室进行BiliSeq检测。回顾病历记录，记录患者的人口统计学、临床表现、ERCP结果、并发内镜超声(EUS)和EUS细针穿刺(FNA)、血清CA19-9水平以及相应的刷诊和/或活检的病理诊断。对重复ERCP程序进行了单独的分析，其中产生了24次胆道刷诊和29次胆道活检以进行病理评估，24次刷诊和27次活检用于BiliSeq测试。狭窄的病因是基于手术切除标本或活检标本(尸检、开放或腹腔镜手术切除/活检、经皮针或ercp获得的胆道活检)的诊断病理学(n=145)和/或随访≥12个月后的临床标准(n=75)。由于报道的胆道刷诊的特异性<100%，因此对刷诊标本的病理评价结果不作为诊断性病理。此外，ercp活检阴性不被认为支持良性病因。如果在≥12个月的随访中重复成像或ERCP记录了先前导管异常的解决或稳定性，则狭窄被指定为良性胆管疾病。 In contrast, a clinical diagnosis of malignancy was defined by the combination of a mass on radiographic imaging in the absence of acute cholangiopathy, and clinical or radiographic progression after ≥12 months of follow-up, or death clinically and radiographically determined to be due to a malignancy involving the bile duct. For surgical resection and biopsy specimens, diagnoses were rendered on the basis of standard histomorphological criteria.38诊断和临床随访信息，包括每个患者的随访方法都在网上详细描述补充表1．
样本采集
样本在ERCP过程中获得，包括细胞学刷诊，钳活检或两者兼有。对于细胞学刷，在狭窄部位多次来回运动收集样本。用于细胞病理检查的刷子被放入15 mL ThinPrep CytoLyt溶液(Hologic, Marlborough, Massachusetts, USA)中，并在24小时内转移进行标本处理。使用单独的刷子进行BiliSeq测试，并将其放入含有基于洗涤剂的DNA裂解缓冲液的收集瓶中。然后在24小时内将收集瓶运送到UPMC MGP实验室并进行相应处理。类似的方法用于钳活检，分别进行病理检查和BiliSeq测试。试验不要求最小样本细胞数。所有的标本，无论是涂刷还是活检，处理都是一样的。
BiliSeq测试
NGS是临床护理的一部分，在UPMC MGP实验室进行，该实验室同时获得clia认证和cap认证，为期10天。用MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒(Roche，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)在Compact MagNA Pure (Roche)上同样地对刷检和活检标本进行基因组DNA分离。在同时提交了涂刷和活检标本的情况下，将两个标本的DNA结合起来进行后续分析。提取的DNA使用dsDNA HS检测试剂盒(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)在Qubit 2.0荧光仪上定量。利用引物对感兴趣的基因组区域进行基于扩增的靶向NGS (https://mgp.upmc.com/Applications/mgp/Content/OncoSeq_Hotspots.pdf)在下列基因内:AKT1，碱性，自动取款机，BRAF，CDKN2A，CTNNB1，表皮生长因子受体，ERBB2，ERBB4，FGFR1，FGFR2，FGFR3，GNA11，GNAQ，玲娜，极品，IDH1，IDH2，工具包，喀斯特，见过，国家管制当局方面，PDGFRA，PIK3CA，PTEN，SMAD4，TP53而且VHL如前所述。39扩增子被条形码编码，纯化并与特定的适配器连接。DNA数量和质量检查使用2200 TapeStation(安捷伦科技，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国)。Ion One Touch 2和One Touch ES用于准备和丰富模板，并通过半导体芯片上的离子球粒子进行测试。根据制造商说明书(赛默飞飞科学公司)，在离子质子系统上进行大规模并行测序，并使用Torrent Suite Software V.3.4.2分析点突变、小插入/删除和拷贝数更改。根据2017年分子病理学协会(AMP)/美国临床肿瘤学会(ASCO)/美国病理学家学院(CAP)联合共识指南，使用基于层次的系统解释癌症序列变异，对每个变异进行了优先级排序。40报告了Tier I, Tier II和Tier III变体;然而，只有Tier I和Tier II变体被用于后续分析。符合第I级或第II级变异的基因组改变被认为是“阳性”BiliSeq结果，而“阴性”BiliSeq结果被确定为没有第I级或第II级变异。检测限为3%突变等位基因频率(AF)。测试的最小覆盖深度为500×。对于每个确定的突变，AF根据突变等位基因相对于野生型等位基因的读取数计算，并以百分比形式报告。35拷贝数变异分析如前所述。41如前所述，基因扩增的定义是存在≥6个副本的变体，并使用荧光原位杂交(FISH)分析进行验证。41 42
可靶向基因组改变的分类
临床相关的基因组改变被定义为目前市场上可用的抗癌药物或注册临床试验中可靶向的改变。已报道的激酶抑制剂可能靶向的基因组改变(在野生型的设置中)喀斯特，国家管制当局方面而且极品基因组改变)包括:碱性，BRAF，表皮生长因子受体，ERBB2，FGFR1、FGFR2，FGFR3而且见过．43-46内部的基因组改变自动取款机以铂为基础的方案和多聚(adp -核糖)聚合酶抑制可能是靶向的。47此外，药物抑制剂对个体具有高度特异性IDH1而且IDH2已经出现了突变。48 49
统计分析
本研究中使用的训练队列的样本量估计/乘方计算是基于我们机构胆管狭窄中恶性肿瘤的患病率为60%，以及相应的通过ercp获得的标本的病理评估检测恶性肿瘤的敏感性为40%。因此，至少50例患者的样本量将产生>80%的功效，alpha为0.05。使用二元变量的Fisher精确检验比较评估突变状态差异的统计分析。对于训练队列，使用约登指数生成受试者工作特征(ROC)曲线来比较生物标志物的表现，并建立截止水平。根据梯形法计算的曲线下面积(AUC)，选择最终截距以使其最大化。然而，也考虑了生物学原理和模型的简单性。敏感性和特异性使用确诊病理病例的标准2×2列联表计算。除非另有说明，重复测试不用于计算单个生物标志物的敏感性和特异性。所有统计分析均采用SPSS统计软件V.25 (IBM, Armonk, New York, USA)进行，p值<0.05为统计学显著性。
结果
训练组和验证组的血清CA19-9表现、病理评估和BiliSeq测试
57例因胆管狭窄而接受ERCP的患者的训练队列被前瞻性累积用于生物标志物分析，并在表1,在线补充数据与表1．57例患者中有56例(98%)进行了血清CA19-9研究、胆管刷诊和/或病理评估活检和BiliSeq检测，只有1例患者在临床表现时未检测出CA19-9。考虑到CA19-9作为恶性狭窄的标志物缺乏共识，我们对CA19-9水平进行了探索性研究(在线补充图1)．通过ROC曲线分析，血清CA19-9能够区分良恶性狭窄，AUC为0.727。在尤登指数选择的阈值≥44 U/mL时，CA19-9升高对检测恶性肿瘤的敏感性为62%，特异性为77% (表2)．用于病理评估的ERCP标本包括22例(39%)患者胆道刷诊，22例(39%)患者胆道活检，13例(22%)患者胆道刷诊和活检。至少可疑的腺癌病理诊断与恶性肿瘤的敏感性和特异性分别为46%和100%。
配对但单独的胆道刷检和/或活检标本也被提交用于BiliSeq测试。然而，在13例同时进行了涂刷和活检标本进行病理评估的患者中，只有2例患者进行了配对的涂刷和活检标本用于BiliSeq检测。其余11例患者提交相应的涂刷标本进行BiliSeq检测，但未提交活检标本。共对57例患者的59例胆管标本进行了BiliSeq评估。基因组改变仅在恶性狭窄中被检测到，而在良性胆管病中未出现(图1)．BiliSeq鉴定的基因组改变的敏感性和特异性分别为63%和100%。
胆道刷诊/活检病理检查的训练组和验证组的相关发现，以及来自BiliSeq检测的个体基因组改变，以及相应的患者随访。通过BiliSeq检测确定的基因组改变与至少涉及胆管系统的高级别胆道发育不良的更高敏感性(74% vs 50%)和更高特异性(100% vs 99%)相关。按递减顺序排列，最常见的基因组改变包括喀斯特，TP53，CDKN2A，SMAD4，PIK3CA，玲娜和其他人。
前瞻性收集验证队列，包括195例患者，随访163例(84%)患者(表1,在线补充数据与表1)．163例患者中有144例(88%)在发病时检测了血清CA19-9。提交进行病理评估的标本包括49例(30%)患者胆道刷诊，57例(35%)患者胆道活检，57例(35%)患者胆道刷诊和活检。成对但单独的涂刷和/或活检标本也被提交用于BiliSeq测试。在57例同时进行了涂刷和活检标本进行病理评估的患者中，27例(47%)也分别提交了涂刷和活检标本进行BiliSeq检测。在其余30例患者中，分别有24例患者和6例患者进行了相应的刷诊或活检，用于BiliSeq检测。共有163例患者的190个胆管标本被提交用于BiliSeq检测。
基于≥44 U/mL的临界值，在验证队列中，血清CA19-9对至少高度胆道发育不良的敏感性为81%，特异性为65% (表2)．与训练队列相似，病理评估和BiliSeq检测的敏感性和特异性分别为49%和98%，76%和100%。对包括220例随访患者的训练和验证队列的总体分析显示，血清CA19-9、病理评估和BiliSeq检测的敏感性和特异性分别为76%和69%，48%和99%，73%和100%。病理评估和BiliSeq检测的结合将两种检测方法的敏感性提高到83%，并保持了99%的高特异性。在病理评价和BiliSeq检测中加入血清CA19-9，敏感性进一步提高至95%，但特异性下降至68%。
胆管标本亚型、PSC病史和重复ERCP生物标志物检测的亚组分析
共有132例胆道刷诊和114例胆道活检进行了病理评估和BiliSeq测试(表3)．胆道刷诊和胆道活检病理评价的敏感性和特异性分别为35%和98%，52%和100%。相比之下，胆道刷诊和胆道活检的BiliSeq检测的敏感性分别为71%和75%，特异性为100%。114份胆道活检标本中，28份标本通过数字胆管镜获得，其余标本通过胆管造影获得。胆管镜引导下的胆道活检与胆管造影引导下的胆道活检在敏感性和特异性上无统计学差异(在线)补充表2)．29例患者提交了匹配的胆道刷诊和胆道活检标本，用于病理评估和BiliSeq检测。对这些病例进行病理检查和活检的敏感性分别为26%、39%、70%和78%，特异性为100%。
EUS-FNA可提高恶性胆管远端狭窄的诊断。随访的141例患者出现远端胆管狭窄，86例患者同时行EUS, 61例患者同时行FNA。在同时行ERCP和EUS-FNA的61例患者中，ERCP胆道标本和EUS-FNA胆道标本病理评价发现恶性远端胆管狭窄的敏感性和特异性分别为59%和95%，58%和100%。相比之下，BiliSeq检测的敏感性为76%，特异性为100%。此外，结合ercp标本的病理评估和BiliSeq检测，恶性肿瘤的敏感性为90%，特异性为95%。加入EUS-FNA评价后，敏感性提高到93%，特异性保持在95%。
220例患者中37例(17%)有PSC病史。该队列包括12例胆管狭窄伴高度以上胆道发育不良患者和25例胆管狭窄伴良性胆管病变患者。根据美国肝病研究协会(AASLD)指南，在高危人群中，血清CA19-9 >129 U/mL是疑似胆管癌的标志。50因此，基于129 U/mL的临界值，血清CA19-9对至少高度胆道发育不良的敏感性为67%，特异性为84%。病理评估的敏感性仅为8%，特异性为100%。相比之下，BiliSeq检测的敏感性和特异性分别为83%和100%。联合血清CA19-9与BiliSeq检测的敏感性提高到92%，但特异性降低到84%。在BiliSeq检测中加入病理评价并不能提高BiliSeq单独检测的敏感性。
220例(9%)患者中有20例(在线)进行了重复ERCP、胆道刷诊和/或活检以进行病理评估和Biliseq测试补充表3)．16例重复1次，2例重复2次，2例重复3次。经随访，15例为恶性狭窄，5例为良性狭窄。在15例恶性狭窄患者中，BiliSeq在初始和重复胆管标本上检测到8例患者的基因组改变。然而，相应的初始胆道刷诊和/或活检病理评估均为恶性肿瘤阴性。事实上，术前对8个恶性狭窄中的5个至少有可疑恶性肿瘤的诊断从未被提出。对于其余7例患者，通过病理评估，重复生物标志物检测为恶性肿瘤阳性，2例患者通过BiliSeq检测可检测到基因组改变(“阳性”);2例病理阴性，BiliSeq阳性;一名患者的两种诊断方式均为阴性。重复ERCPs的加入略微增加了病理评估、BiliSeq检测和两者联合检测的敏感性和特异性，分别达到51%和99%，75%和100%，87%和99%。
配对ercp胆管标本与诊断病理标本的BiliSeq比较检测
220例患者中有145例(66%)诊断病理资料可用，包括134例恶性肿瘤和11例良性胆管病变。对134例恶性肿瘤中的54例(40%)的诊断病理标本进行BiliSeq检测补充表4)．54例患者均检测到基因组改变，其中12例患者的ercp胆管标本经BiliSeq检测均为阴性。在剩下的42个肿瘤中，有4个病例的基因组谱不同，其中包括比BiliSeq使用ercp获得的胆管标本检测到的更多基因组改变。
治疗相关的基因组改变和治疗数据
在先前报道的可操作靶点和化疗反应的预测标记物的基础上，BiliSeq对ercp获得的胆管标本进行了检测，确定了150种癌症中的20种(13%)的治疗相关基因组改变(在线)补充图2)．参与受体酪氨酸激酶(RTK)/Ras/丝裂原活化蛋白(MAP)激酶信号通路的基因改变，包括ERBB2(n = 6),见过(n = 4),碱性(n = 2),FGFR2(n = 3)FGFR3(n=2)，在大多数病例中检出(n= 13,65%)。还发现了其他潜在的可操作的改变自动取款机(n = 2),IDH1(n = 1)IDH2(n = 2)。
在ERBB2-改变的恶性肿瘤，两名患者，其腺癌的拷贝数增加ERBB2，接受针对HER2/neu的靶向化疗，而不是单纯的标准化疗。第一个病人(在线补充表1患者157)为老年女性，表现为黄疸，腹痛加重一周，肝功能升高，血清CA19-9为55 U/mL, CT扫描显示胆结石和肝内导管扩张。ERCP显示肝内胆管狭窄，并进行了病理评估和BiliSeq测试。胆道病理检查显示高度非典型上皮细胞，怀疑为腺癌。然而，BiliSeq测试检测到一种ERBB2拷贝数增益和aTP53突变(p.C242fs*5和c.723delC)。2周内，随后的三期CT扫描显示4B/5段2.1 cm的转移性肝病灶(图2一个)，血清CA19-9为422.4 U/mL。经重复ERCP及胆管刷诊及活检确诊为恶性肿瘤，为侵袭性中分化腺癌。临床认为是肝内胆管癌，患者开始使用吉西他滨、顺铂和曲妥珠单抗。治疗3个月内，患者血清CA19-9降至14 U/mL，肝转移灶降至0.6 cm。此外，随访ERCP注意到患者胆管狭窄的改善补充图3)．诊断一年后，患者目前生活状况良好。患者血清CA19-9仍在正常范围内，转移灶最大尺寸为0.3 cm (图2 b)．
2例患者对曲妥珠单抗的放射学反应ERBB2BiliSeq测试放大。老年女性(患者157)的轴向CT图像ERBB2(A)在吉西他滨、顺铂和曲妥珠单抗治疗1年后(B)转移性肝内胆管癌，边缘增强性低密度肝转移的大小从2.1 cm减小到0.3 cm。在一名中年男性患者(患者166)中也发现了类似的反应，他患有由肝门周围胆管癌(C)引起的2.6厘米边缘强化低密度肝转移ERBB2放大。(D)一线联合曲妥珠单抗治疗后，患者转移灶在8个月内缩小至0.7 cm。
第二个病人(在线补充表1患者166)为中年男性，表现为黄疸、上腹痛、肝功能升高，血清CA19-9升高2383 U/mL, CT示肝门周围胆管增厚，MRCP示肝门狭窄。ERCP检查发现Bismuth IIIa狭窄，胆管刷诊和活检均为腺癌阳性。患者相应的BiliSeq测试显示了一个拷贝数增加ERBB2拷贝数丢失TP53而且CDKN2A．患者被转介进行肝移植，但进一步检查发现在7/8节段有2.6厘米的转移性病变(图2 c)．在血清CA19-9为7959 U/mL时，患者开始了吉西他滨、顺铂和曲妥珠单抗治疗临床肝门周围胆管癌的方案。3个月后，患者血清CA19-9恢复正常至9.4 U/mL。诊断8个月后，患者目前存活良好。患者血清CA19-9继续在正常范围内，转移灶最大尺寸减小至0.7 cm (图2 d)．
讨论
尽管横断面成像、血清研究、内窥镜技术和病理评估都有了改进，但良性和恶性胆管狭窄的区分仍然是一个诊断难题。在目前的研究中，我们开发并独立临床验证了一种用于评估胆管狭窄的靶向NGS检测方法。我们发现，我们的靶向NGS检测方法BiliSeq在检测涉及胆管的高级别胆道发育不良时，比单独的病理评估具有更高的敏感性(73% vs 48%)和更高的特异性(100% vs 99%)。此外，两种检测(BiliSeq和病理评估)的联合检测比单独的任何一种检测都有更高的敏感性(83%)，同时保持高特异性(99%)。
迄今为止，一些研究已经研究了靶向NGS在胆管狭窄中的应用。最近,Bankov等发表了一项与BiliSeq设计相似的NGS检测结果，采用了16例随访胆管活检不确定和胆管癌患者的回顾性队列。51作者没有评估胆道刷刷标本，从FFPE组织块中提取NGS的DNA。作者承认，由于FFPE组织DNA的低输入和低质量，需要DNA富集技术进行后续分析。虽然没有使用良性对照组进行比较，但他们的检测灵敏度为81%，与BiliSeq相当。Dudley对胆管标本的NGS测试进行了更全面的评估et al。6作者评估了73个胆管和8个主要胰管刷标本的队列。与班科夫相反等他们的研究队列不包括胆管活检。此外，从保存在cytolyt的标本中提取DNA，而不是获得专门的DNA分离刷。由于酒精固定可能导致DNA降解，73份刷检标本中有8份(11%)未通过NGS检测也就不足为奇了。在我们的研究中，没有一个胆道刷诊和/或活检标本不通过BiliSeq测试。不管怎样，在剩下的65个胆道标本中，达德利等报道的敏感性为68%，特异性为97%，优于病理评价。然而，作者确实发现了一个假阳性结果。对于该病例，NGS检测后的随访时间尚不清楚，根据作者的说法，不能排除胆管系统发育不良的可能性。
尽管BiliSeq没有发现任何假阳性病例，但在考虑重复测试后，有37例(25%)假阴性病例。为了确定NGS假阴性结果的原因，我们对这37种恶性肿瘤中的12种进行了BiliSeq检测。在我们的分子小组中，28个基因中至少有一个被检测到基因组改变。考虑到胆管标本的采集在技术上是困难的，并且已知有取样失败的情况发生，狭窄取样不足可能是一个可能的解释。另外，低标本肿瘤细胞也可能是一个因素。我们的NGS检测最低限度是大约3%的突变等位基因或杂合突变，如喀斯特，肿瘤细胞率6%。因此，如果肿瘤细胞的比例低于6%，那么BiliSeq将无法检测到致病的基因组改变。虽然这一发现可能被视为一种技术限制，但控制BiliSeq的敏感性可能是有益的，特别是对特定基因。先前使用手术切除材料的研究已经证明喀斯特低级别胆道发育不良和良性胆管病变病例中的突变。52因此，增加BiliSeq的灵敏度喀斯特突变可导致至少高级别胆道发育不良的特异性降低。同样重要的是要强调的是，涉及胆管的恶性肿瘤的一个子集可能包含我们的测试没有检测到的基因组改变。例如，染色质重塑基因(例如，ARID1A),FGFR2融合基因在高达20%的肝内胆管癌中存在。26 30 32-34因此，BiliSeq的敏感性可能会通过目标扩增/富集技术和扩展的基因面板来提高。
从我们的研究中，另一个有趣但初步的观察是，在PSC患者中，BiliSeq和病理评估之间的敏感性存在显著差异，至少是高级别胆道发育不良。PSC是一种自身免疫性疾病，与胆管癌的终生发病率相关，发病率在6%至36%之间。53-56胆管癌的风险在PSC诊断的前2年内最高，这表明早期发现的机会可能是一个窗口。55 57然而，炎症性狭窄背景下的小胆管癌尤其难以取样，通过病理评估诊断具有挑战性。虽然我们队列中PSC患者数量相对较少，但病理评价的敏感性仅为8%。相比之下，BiliSeq对至少高级别胆道发育不良的敏感性达到83%，为进一步探索其改善高危患者临床结果的潜力提供了有力的证据。
除了NGS检测外，临床还开发了一些辅助技术来评估胆管狭窄，如数字图像分析、单基因测序和染色体多聚体的多灶FISH。在这些辅助研究中，多色FISH已成为许多学术机构十多年来采用的工具。15与BiliSeq类似，多色FISH的前提是发现涉及胆管的发育不良和恶性肿瘤通常以高频率的数值染色体异常为特征。然而，在过去的几年里，这种测试的技术改进很少，通常只能达到35%-60%的灵敏度。13 15 18多色FISH价格昂贵，劳动密集型，容易出现主观解释错误，需要大量的技术专长。事实上，多色FISH的解释需要有经验的病理学家，因为需要对标本进行配对形态学评估，以确保对感兴趣的上皮细胞进行染色体异常评估。虽然我们没有在BiliSeq和多色鱼之间进行正式的比较，但Dudley等6发现他们的NGS检测比多色FISH有更高的灵敏度。这并不奇怪，因为NGS测试可以检测多个基因中的拷贝数改变和单核苷酸变异。此外，随着成本的降低和在一次运行中批量处理多个样品的能力，NGS测试已广泛应用于学术和非学术机构。因此，在评价胆管标本时，NGS检测可能是比多色FISH更可取的选择。证明BiliSeq对ercp获得的胆道标本的临床可行性，也为NGS检测在非侵入性标本类型(如胆汁和血清(如循环肿瘤DNA和外泌体)上的进一步应用奠定了基础。58 - 61
除了早期检测，广泛采用NGS技术的主要动力是实体瘤基因分型。发生或继发于胆管系统的恶性肿瘤通常是顽固性的，目前标准的化疗方案与有限的疗效相关。关于一线或二线化疗后的复发或进展，对肿瘤子集的综合基因组分析已经确定了对特定治疗反应的潜在靶向性或预测性标记的变化。26日28日例如,ERBB2在肝内胆管癌、肝门周/远端胆管癌和胆囊腺癌中均有扩增的报道，其患病率分别为5%、17%和19%。28 62在8名患有ERBB2-扩增或HER2/ nue过表达胆囊癌等46据报道，3例患者病情稳定，4例患者部分缓解，1例患者对靶向治疗(曲妥珠单抗或曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗)完全缓解。值得注意的是，8例患者中有5例在靶向治疗前接受了一线化疗或放化疗。在我们的研究中，BiliSeq测试确定了两名患有ERBB2放大:肝内胆管癌1例，肝门周围胆管癌1例。两例患者均接受曲妥珠单抗联合标准一线化疗(吉西他滨和顺铂)，均表现出可测量的放射学反应和血清CA19-9正常化，目前均存活良好。虽然我们认识到标准化疗的好处，但似乎合理地假设将曲妥珠单抗纳入化疗方案，是对两例患者观察到的显著和长期治疗效果负责的。还应该强调的是，在诊断时识别出可靶向的改变有助于个性化的治疗方法。此外,ERBB2并不是BiliSeq检测到的唯一可能赋予抗癌治疗易感性的基因组改变。
我们承认这项研究有一些局限性。虽然分析了大量胆管标本，但仅66%的患者可获得随访诊断病理。然而，大多数恶性肿瘤累及胆管系统的患者通常表现为不可切除的疾病或不适合手术。此外，为了保证NGS检测有足够的DNA, BiliSeq检测采用了与病理评价标本不同的胆管标本。该方案可能解释了病理评估和BiliSeq测试对部分病例结果不一致的原因。此外，本研究并没有提出最佳的基因组或结合基于ngs的分子检测来评估胆管狭窄的方法。为了尽量减少重复取样的需要，我们在初次ERCP时对所有潜在恶性狭窄的患者常规执行BiliSeq。BiliSeq阳性结果加快了适当的外科和/或肿瘤亚专科医生的转诊过程。BiliSeq阴性结果为病理阴性评价提供了额外的保证。因为这些诊断方法都没有达到>95%的敏感性，很少有患者可以根据BiliSeq阴性而完全解除监测。 A similar approach has been adopted by investigators using multicolour FISH. It is also important to recognise that recent advancements in cholangioscopy and increasing use of EUS-FNA may potentially improve the detection of malignant strictures.63 64虽然本研究中有少数患者接受了胆管镜检查，但我们发现胆管镜和胆管造影之间的诊断表现特征相似。65据报道，EUS-FNA用于胆管狭窄，特别是远端狭窄，与传统ERCP方法相比，可以增强组织采集。66然而，在我们的研究队列中，使用这两种技术评估的患者在敏感性上没有显示出任何统计学上的显著差异。事实上，BiliSeq比单独的ERCP或EUS-FNA产生了更高的敏感性，并与任何一种方法联合使用，将检测远端恶性狭窄的敏感性提高到至少90%。最后，我们对可靶向基因组改变的定义是基于无数研究的聚合。在进行前瞻性临床试验之前，任何给定药物对特定基因组改变的真正临床用途都是未知的。然而，通过配对基因组改变，我们至少能够证明临床益处的轶事证据，例如ERBB2扩增，使用特定的抗癌治疗(如曲妥珠单抗)。
总之，我们报道了一项最大的前瞻性研究，以检验基于ngs的分子(BiliSeq)检测在评估胆管狭窄中的作用。我们的结果支持结合BiliSeq对胆管标本进行标准病理评估的临床应用。此外，BiliSeq具有识别靶向基因组改变的潜力，因此，为特定的化疗方案对患者进行分层。然而，未来的研究需要探索将BiliSeq和类似的基于ngs的检测方法整合到当前胆管狭窄患者的监测和管理指南中。
致谢
作者要感谢凯特·史密斯夫人出色的行政协助。这项研究得到了匹兹堡大学精确医学研究所、UPMC希尔曼癌症中心、Shear家族基金会、匹兹堡大学匹兹堡肝脏研究中心和匹兹堡大学医学中心以及天空基金会(给ADS)的部分支持。
参考文献
脚注
贡献者研究概念与设计:ADS, MNN和AS。数据采集:全部作者。数据分析和解释:ADS, MNN和AS。文稿起草:ADS和AS。
资金这项研究由匹兹堡大学精确医学研究所资助。
相互竞争的利益ADS收到了Foundation Medicine, Inc.的酬金。
伦理批准研究已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准(irb# PRO17030748)。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
患者发表同意书获得的。