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摘要
客观的本研究旨在开发一种基于独特B细胞表位的新型治疗性疫苗，并在动物模型中研究其对慢性乙型肝炎(CHB)的治疗潜力。
方法在hbv耐受小鼠中评估了一系列多肽和载体蛋白，以获得优化的治疗分子。系统地研究了候选蛋白的免疫原性、治疗效果和作用机制。
结果在本研究评估的含有hbsag -aa119-125的多肽中，HBsAg-aa113-135 (SEQ13)表现出最显著的治疗效果。从圆叶蝙蝠HBV核心抗原(RBHBcAg)中获得了一种新的免疫增强病毒样颗粒载体(CR-T3)，并用于展示SEQ13，形成候选分子CR-T3-SEQ13。该颗粒抗原表面显示的多个SEQ13副本促进了小鼠、兔子和食蟹猴抗hbs抗体反应的诱导。免疫动物血清和纯化的多克隆IgG在体外中和了HBV感染，并在小鼠中介导了HBV/乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的高效清除。基于cr - t3 - seq13的疫苗接种在HBV转基因小鼠中诱导了HBV sag和HBV DNA的长期抑制，并在基于水动力学的HBV携带者小鼠中完全根除了病毒。对HBsAg的抑制作用与接种后的抗- hbs水平密切相关，提示CR-T3-SEQ13疫苗治疗的主要机制是诱导seq13特异性抗体反应，介导HBV/HBsAg清除。
结论新型颗粒蛋白CR-T3-SEQ13通过诱导hbv耐受小鼠的体液免疫反应有效抑制HBsAg。这种基于B细胞表位的治疗性疫苗可能为人类慢性HBV感染提供一种新的免疫治疗剂。
- 乙型肝炎
- 药物开发
- 免疫疗法
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
实现乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)丢失是慢性乙型肝炎(CHB)治疗的理想终点，目前已批准的抗hbv药物很少能达到这一目标。
高负荷的HBsAg直接抑制适应性和先天免疫功能，最终导致特异性耐受，阻止宿主根除HBV感染。长期抑制HBsAg有望恢复抗- hbs B细胞反应和HBV特异性T细胞功能。
大多数基于原生HBsAg和HBcAg的HBV治疗性疫苗可以诱导HBV携带者小鼠特异性T细胞，甚至在CHB患者中也能诱导特异性T细胞，但没有明显的有效抗体反应介导病毒清除，因此对HBsAg水平的抑制作用有限。
抗体识别sA表位(HBsAg-aa119-125)，并表现出比我们前面描述的结合其他表位的抗体更显著和更持久的HBsAg抑制作用。
本研究的意义
新的发现是什么?
在本研究评估的含有hbsag -aa119-125的多肽中，HBsAg-aa113-135 (SEQ13)表现出最显著的治疗效果。从圆叶蝙蝠HBV核心抗原(RBHBcAg)中提取的新型免疫增强病毒样颗粒载体(CR-T3)被创建并用于显示SEQ13，形成新型颗粒蛋白CR-T3-SEQ13。
该颗粒抗原表面显示的多个SEQ13副本促进在小鼠、兔子和食蟹猴中诱导强有力的抗体反应，显性抗体识别HBsAg-aa119-125，其表现出广泛的活性，在体内介导HBsAg清除，并在体外中和HBV感染。
基于cr - t3 - seq13的疫苗接种在HBV转基因小鼠中显示出长期抑制HBsAg和HBV DNA，并通过诱导seq13特异性抗体应答介导HBV/HBsAg清除，在基于水动力学的HBV携带者小鼠中完全根除病毒。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
CR-T3-SEQ13是一种基于独特B细胞表位的用于开发HBV治疗性疫苗的优秀候选药物，该疫苗将单独在临床进行测试，或与目前可用的抗HBV药物联合用于治疗CHB患者，旨在提高HBsAg的损失率。
如果成功，基于cr - t3 - seq13的免疫治疗将提供一种新的抗hbv策略，以实现对HBsAg水平的长期抑制，并改善CHB的临床管理。
简介
目前，约有2.5 - 3.4亿人慢性感染乙肝病毒，这是全球最普遍的慢性病毒感染之一，死于HBV相关疾病的风险为15%-25%。1 - 3目前批准的抗hbv药物，包括核苷/核苷酸类似物和PEG干扰素，可以抑制病毒复制和限制乙型肝炎，但不能有效降低病毒抗原载量。通过抗- hbs血清转化(目前治疗的最佳终点)或不通过抗- hbs血清转化实现乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的丢失是罕见的。4 - 6因此，迫切需要新的抗病毒策略来对抗慢性HBV感染。为什么慢性乙型肝炎(CHB)如此难以治愈?一般来说，有两个主要障碍需要克服。第一个障碍是共价闭合环状DNA (cccDNA)的稳定存在，它是HBV生产的模板，并在肝细胞核中形成一个小染色体。7然而，cccDNA的维持和降解机制尚不完全清楚，也没有令人信服的理论指导针对cccDNA的药物的发现。7第二个主要障碍是高HBsAg负荷，它被提出直接抑制适应性和先天免疫功能，并最终导致特异性耐受，阻止宿主根除HBV感染。8 9一些研究表明，对慢性病毒感染的免疫耐受的出现与病毒抗原负荷高度相关。10 11具有高病毒载量的病毒，如HBV、HIV、HCV和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎哺乳病毒(LCMV)会导致T细胞数量和/或功能的严重丧失。11此外，抗原与抗原特异性B细胞的高比率可导致B细胞的终末分化，并最终失去有效的IgG反应。12一致地，长期抑制HBsAg水平可以促进逆转B细胞耐受产生抗- hbs抗体反应。13日14在乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性患者中，较低的HBsAg水平预示着较高的HBsAg丢失概率。15治疗后HBsAg血清清除率与肝细胞癌发病率或死亡率显著降低相关。16这些研究表明HBsAg水平与肝脏疾病的进展相关。因此，开发能够有效降低HBsAg水平的新药，有可能恢复特异性免疫反应，实现更高的功能性治愈率。
治疗性疫苗是治疗慢性病毒感染最有前途的生物制剂之一。然而，大多数设计用于诱导T细胞反应或基于原生HBsAg的治疗性候选疫苗在临床试验中错过了它们的主要终点。17-22在HBV携带者中存在高HBsAg水平的情况下，靶向HBsAg显性表位的T细胞被认为是耗尽的，这对于在不去除丰富的HBsAg的情况下刺激有效的细胞免疫应答是一个巨大的挑战。诱导抗- hbs抗体反应可能是降低循环HBsAg水平的一种有前途的方法。23因此，我们建议必须找到一个源自HBsAg的功能B细胞表位，并且必须设计一个免疫原性病毒样颗粒(VLP)来显示该表位的数百个副本。显示多个表位的嵌合VLP将刺激更强的表位特异性抗体反应，从而介导体内HBsAg清除。在我们之前的研究中，我们发现并不是所有抗HBsAg的抗体在体内都具有相同的清除HBV的能力;只有识别独特sA表位的e6f6样抗体(HBsAg-aa119-125作为核心基序)可以有效地介导HBsAg清除。24 - 26日先前的研究结果表明，表位是决定抗hbsag抗体疗效的关键因素，sA表位有可能成为治疗CHB的靶点。一方面，基于单克隆抗体(mAb)的免疫治疗是治疗慢性乙型肝炎的一种有前景的途径;另一方面，sA表位可用于开发一种新型治疗性疫苗，预计主要诱导体液免疫反应。
在本研究中，基于sA表位的优化肽(SEQ13, HBsAg-aa113-135)被设计用于显示从圆叶蝙蝠乙型肝炎病毒核心抗原(RBHBcAg)获得的新型免疫增强VLP载体(CR-T3)的刺突上;候选分子被命名为CR-T3-SEQ13。该颗粒抗原表面的多个表位副本促进产生强大的sA表位特异性抗体反应，然后介导HBV转基因(HBV- tg)小鼠和基于水动力学的HBV (HDI-HBV)携带者小鼠的长期HBsAg清除和抑制病毒载量。我们还发现CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内具有良好的安全性和免疫原性。在慢性乙型肝炎患者中诱导类似的免疫反应将是实现长期抑制HBsAg水平和更高功能治愈率的一种有前途的方法。
材料与方法
动物
HBV-Tg小鼠由陈培杰(台湾南大)提供，在厦门大学实验动物中心繁殖27；本研究使用8-10周龄HBV-Tg小鼠。以水动力注射(HDI)为基础的HBV载体模型，如前所述，使用' B6-Tg(AAVS1)A1Xob/J '菌株和pAAV-HBV1.2质粒建立。28 29BALB/c小鼠(6 ~ 8周龄)购自上海菱昌生物科技有限公司。用于免疫的新西兰大白兔购自上海斯拉克实验动物有限公司。所有小鼠在厦门大学实验动物中心特定的无病原体条件下饲养。在小鼠和兔子身上进行的实验是在厦门大学动物护理和使用委员会的批准下进行的《实验动物护理和使用指南》．
免疫原性研究使用了4只雄性食蟹猴和3只雌性食蟹猴，该研究由药明康德(苏州)有限公司进行。本研究中的所有实验都完全符合协议，并符合以下关于动物护理和福利的法规和准则:国际实验动物护理评估和认可协会(AAALAC)和国际卫生研究院在“实验动物护理和使用指南”和国家研究委员会- ILAR, 2011年修订版中报告的准则。在任何涉及动物的活动之前，该研究已由药明康德机构动物护理和使用委员会审查和批准。
来自慢性乙型肝炎患者的血液
本研究使用了住院CHB患者的25份血液样本。所有患者均获得书面知情同意。
疫苗制备、抗体表位定位、HBV标记物检测、低温电子显微镜(cryo- em)和CR-T3-SEQ13的三维重建、联合治疗实验、抗CR-T3-SEQ13血清或纯化多克隆IgG的体内效力和体外中和试验的更多细节在网上提供补充材料、方法和表格．
结果
基于B细胞表位的VLP疫苗CR-T3-SEQ13的构建
对于设计用于诱导表位特异性B细胞应答的重组蛋白治疗性疫苗，与疗效相关的关键因素包括功能表位、免疫原载体和佐剂。本研究通过实验系统地优化表位和载体。根据我们之前的研究，我们提出HBsAg-aa119-125作为初始靶点。24
为了获得一个优化的表位，我们从包含HBsAg-aa119-125的HBsAg中选择了5种不同长度的多肽;将多肽的编码序列插入截断的HBcAg载体(HBC149)中，在an中表达大肠杆菌系统(在线补充图1A)．所有5个嵌合蛋白和载体蛋白自发组装成直径约30 nm的球形颗粒，我们获得了高纯度的颗粒，在表面显示这些肽(在线)补充图1B)．然后，我们在无hbv的BALB/c小鼠中评估这些抗原的免疫原性。数据显示，所有5种含有HBsAg-aa119-125的颗粒抗原都能诱导强烈的抗hbs和抗载体抗体反应(在线)补充图2A,B)， hbc149 - s113 -135免疫小鼠的抗hbs抗体水平略高于其他组(在线补充图2A)．此外，我们在HBV-Tg小鼠中评估了这些抗原的免疫原性和疗效。结果表明，这些抗原可以诱导与无hbv小鼠相当的强抗携带者抗体反应(在线补充图2D)，但如预期，抗- hbs抗体反应明显较弱(在线补充图2C)．HBC149-S113-135处理后小鼠抗hbs抗体水平最高;与其他小鼠组相比，这组小鼠的HBsAg和HBV DNA水平明显下降(在线补充图2E,F)．因此，我们选择了一种23氨基酸的多肽HBsAg-aa113-135作为进一步研究的最佳候选，并将其命名为SEQ13。
为了获得优化的载体，我们对一系列基于病毒衣壳的VLP载体进行了评估，包括不同突变的HBcAg携带者、土鼠乙型肝炎病毒核心抗原(WHBcAg)携带者、人乳头瘤病毒L1携带者和蝙蝠肝病毒衣壳携带者。最后是中间圆叶蝙蝠的衣壳蛋白RBHBcAg (Hipposideros larvatus乙型肝炎病毒(RBHBV, NCBI GenBank登录号:KC790373.1)，被选为主要候选人。30.全长RBHBcAg由189个氨基酸组成，具有与HBcAg相似的拓扑结构域，在c端含有富含精氨酸的结构域。精氨酸丰富的区域非特异性地与宿主核酸结合;因此，RBHBcAg-aa150-189被截断以防止其干扰蛋白质纯化。这种被截断的载体被命名为RBHBcAg149，它可以自发地组装成vlp大肠杆菌系统。除了颗粒形状对免疫原性的重要性外，辅助T细胞反应对有效的B细胞反应也非常重要，CD8+ T细胞反应有利于清除细胞内病毒。因此，我们试图将研究充分的CD4+ T细胞表位和CD8+ T细胞表位整合到RBHBcAg149载体中。我们认为含有人T细胞表位的修饰分子可以作为候选分子，满足以下三点:(1)它仍然具有自发组装成VLPs的特性;(2)对HBV携带者小鼠的治疗效果与CR-SEQ13相当或优于CR-SEQ13，说明免疫原性未受损;(3)所选择的表位可以与尽可能多的HLA等位基因结合，覆盖更大的人群。31修饰后的分子可以增强CHB患者抗原刺激全血培养系统中干扰素γ (IFNγ)的释放。针对这三点进行了实验。最后，通过同源置换将一个来源于HBcAg的CD8+ T细胞表位和两个辅助性CD4+ T细胞表位引入RBHBcAg149 (图1一个)，包括CD8+ T细胞表位HBcAg-aa18-27 (FLPSDFFPSV)31日32CD4+ T细胞表位HBcAg-aa50-69 (PHHTALRQAILCWGELMTLA)31日33和HBcAg-aa120-140 (VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL)。31日34将SEQ13多肽和连接子序列通过替换RBHBcAg-aa79-81插入修饰载体(CR-T3)中，形成一个长度为193个氨基酸的嵌合分子，命名为CR-T3-SEQ13。经柱层析纯化得到纯度大于95%，分子量为20.4 kDa的候选治疗蛋白(图1 b)．该蛋白仍可自发组装成VLPs (图1 c,在线补充图3A)．我们进一步利用低温电镜和三维图像重建方法研究了CR-T3-SEQ13 VLPs的结构。6.3 Å分辨率的cryo-EM图显示T=3的二十面体衣壳结构，直径约36 nm，与HBV核心颗粒高度相似35（图1 d)．SEQ13多肽位于每个突起的顶部(图1 d)，因此被认为有可能引发强烈的免疫反应。在雄性和雌性HBV-TG小鼠中评估了CR-T3-SEQ13和CR-SEQ13降低HBsAg水平的功效。数据显示，cr - t3 - seq13处理小鼠的HBsAg下降与CR-SEQ13处理小鼠的HBsAg下降相当(在线)补充图3B)．此外，我们使用IFNγ释放试验检测CHB患者全血中T细胞对抗原的反应性;数据显示，CR-T3-SEQ13刺激的血液样本中IFNγ水平明显高于CR-SEQ13和阴性对照组(在线)补充图3C)．这些结果表明，CR-T3-SEQ13可以作为进一步研究的候选分子。
一种独特的基于B细胞表位的病毒样颗粒抗原:CR-T3-SEQ13的构建(A) RBHBcAg到CR-T3-SEQ13的设计示意图;截断RBHBcAg-aa150-189，通过同源置换将HBcAg-aa18-27、hbbcag -aa50-69和HBcAg-aa120-140导入RBHBcAg149，通过替换RBHBcAg-aa79-81插入SEQ13多肽和连接子序列，形成一个长度为193个氨基酸的嵌合分子，命名为CR-T3-SEQ13。(B)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)考马斯蓝染色和(C)重组CR-T3-SEQ13蛋白的电子显微镜(EM)图。(D) CR-T3-SEQ13颗粒的Cryo-EM结构，SEQ13表位显示在颗粒的尖刺上。低温电子显微镜。
CR-T3-SEQ13诱导具有广谱活性的sA表位特异性抗体介导HBsAg清除
为了评估CR-T3-SEQ13是否能诱导抗HBsAg特异性抗体，采用BALB/c小鼠评估剂量-反应关系。7组BALB/c小鼠分别用含有固定剂量铝佐剂(126µg/剂)和变剂量CR-T3-SEQ13(0µg, 0.6µg, 3µg, 6µg, 12µg, 30µg和60µg)的疫苗经肌注免疫。数据显示CR-T3-SEQ13诱导了强有力的hbsag特异性抗体反应。在助剂免疫后，抗体滴度逐渐增加，而在辅助剂对照组中没有观察到特异性抗体反应(图2一个)．血清抗hbs抗体滴度在第2、3、4周呈剂量-反应关系。60µg组的抗体水平与30µg组相当，而其他剂量组的剂量和抗体滴度较低。结果表明，较高的抗原剂量可以在早期诱导更强、更快的抗体反应。
CR-T3-SEQ13诱导具有广谱活性的sA表位特异性抗体介导HBsAg清除。(A)用固定明矾佐剂剂量(840µg/mL)和不同抗原剂量(分别为60µg、30µg、12µg、6µg、3µg、0.6µg和0µg)免疫BALB/c小鼠抗hbs抗体反应水平的动力学。(B)丙氨酸扫描表位定位策略用于识别多克隆抗血清或单克隆抗体结合活性的关键残基，这些多克隆抗血清或单克隆抗体来源于CR-T3-SEQ13免疫的小鼠、兔子和食蟹猴。该值表示各氨基酸突变引起的结合活性的倍数变化。(C)用CR-T3-SEQ13免疫BALB/ C小鼠的多克隆抗血清治疗HBV携带小鼠后，四种基因型HBV携带小鼠HBsAg水平的动态变化。数据表示均值±SEM, n=4。组间显著差异显示在顶部。* * * * P < 0.0001;双尾未配对t检验。HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
为了鉴定CR-T3-SEQ13疫苗接种诱导的抗体的表位，我们分析了来自血清的多克隆抗体和来自小鼠杂交瘤的单克隆抗体。采用CR-T3-SEQ13免疫小鼠、兔和食蟹猴血清，共获得11个识别SEQ13的小鼠单抗。使用SEQ13的丙氨酸扫描突变来识别抗体结合活性的关键残基。结果表明，三种植物的多克隆抗体均对HBsAg-aa119-125位点的突变敏感，尤其是C121和C124，这两个位点是E6F6识别的sA表位的关键氨基酸(图2 b)．在这些单克隆抗体中，11个单克隆抗体中有10个识别HBsAg-aa119-125区域，只有一个抗体识别HBsAg-aa113-135的c端，它对HBsAg-aa126-132的氨基酸突变更敏感(图2 b)．结果表明，CR-T3-SEQ13诱导的显性抗体与E6F6诱导的显性抗体相似，提示该抗体可在体内功能性介导HBsAg清除。
目前全球共鉴定出10种HBV基因型，其中以A、B、C、D基因型最为普遍。为了评价CR-T3-SEQ13诱导的多克隆抗体的广谱抗HBV作用，从CR-T3-SEQ13免疫的BALB/c小鼠采集血清，转移到HBV基因型A、B、c和d小鼠，在预处理(0)、治疗后2和12小时采集小鼠血液，并监测HBsAg水平的短期动态变化。结果显示，四种HBV基因型携带者小鼠的HBsAg水平在2小时内迅速显著降低至极低水平(图2 c)．这一结果表明，cr - t3 - seq13诱导的抗体可以有效抑制全球优势的HBV基因型。
CR-T3-SEQ13在HBV- tg小鼠中以剂量依赖的方式显著抑制HBsAg和HBV DNA
采用HBV-Tg小鼠评价CR-T3-SEQ13疫苗的抗hbv效果。为了评估疗效与抗原剂量之间的关系，用30µg、12µg和3µg CR-T3-SEQ13制备了三种不同抗原剂量的配方。对照组为相同剂量的不含抗原的明矾佐剂。四组HBV-Tg小鼠(每组4只雌性和4只雄性小鼠)分别于0、2、3、4、5和6周肌内注射150µL疫苗制剂。与仅接受佐剂治疗的对照组小鼠相比，cr - t3 - seq13治疗小鼠的血清HBsAg和HBV DNA抑制作用明显呈剂量依赖性(图3模拟)．当抗原剂量为30µg时，雌性小鼠的平均HBsAg水平从约4600 IU/mL下降到300 IU/mL (图3一)，并在雄性小鼠中增加约14000 IU/mL至2500 IU/mL (图3 b)，抑制率大于90%。平均HBV DNA水平从6.44×10开始下降6IU/mL至7.60×104雌性小鼠的IU/mL (图3 c)和1.10×108IU/mL至8.00×105雄性小鼠的IU/mL (图3 d)，抑制率为99%。因此，本研究中描述的治疗性疫苗的疗效与CR-T3-SEQ13抗原剂量相关，且抗原剂量越高，对HBV的抑制效果越好。此外，为了验证不同的免疫程序是否会影响疫苗的效力，测试了两种不同的治疗计划(0、2、3、4、5和6周以及0、2、4、6、8和10周)。在雄性和雌性小鼠中，免疫程序均可显著抑制HBsAg水平，但无显著差异(图3 e, F)．我们监测HBsAg水平直到19周，发现抑制作用持续，没有明显的病毒反弹(图3 e, F)．结果表明，基于cr - t3 - seq13的治疗性疫苗可以诱导特异性免疫应答，并介导HBV- tg小鼠中HBsAg和HBV DNA的有效减少，HBV- tg小鼠对HBV具有高度耐受性。我们还在HBV-Tg小鼠中评估了由重组天然HBsAg + HBcAg组成的疫苗的抗hbv效果，其配方包括每剂量12µg HBsAg和12µg HBcAg，与CR-T3-SEQ13疫苗相同的明矾佐剂(840µg/mL铝)。数据显示，在接受HBsAg + HBcAg疫苗治疗的小鼠中，没有观察到HBsAg和HBV DNA水平的显著降低;相比之下，cr - t3 - seq13治疗小鼠的病毒载量受到抑制，并且在治疗终点时显著降低(在线补充图4)．
CR-T3-SEQ13可显著抑制HBV转基因小鼠的HBsAg和HBV DNA，并呈剂量依赖性，且抑制作用持续时间较长。(A-D) HBV转基因小鼠肌内注射含有固定矾佐剂剂量(840µg/mL)和不同抗原剂量(分别为30µg、12µg、3µg和0µg)的疫苗配方。在0、2、3、4、5和6周共注射6剂。(A)雌性HBV-Tg小鼠HBsAg水平的动态变化;(B)雄性HBV-Tg小鼠HBsAg水平的动态变化;(C)雌性HBV- tg小鼠HBV DNA水平的动态变化;(D)雄性HBV- tg小鼠HBV DNA水平的动态变化。(E-F) HBV-Tg小鼠分别在0、2、3、4、5、6周和0、2、4、6、8、10周注射含有840µg/mL明矾佐剂和12µg CR-T3-SEQ13的疫苗配方。(E)不同接种方案接种雌性HBV-Tg小鼠HBsAg水平的动态变化;(B)不同接种时间接种雄性HBV-Tg小鼠HBsAg水平的动态变化。 The data represent mean±SEM, n=4. HBsAg, hepatitis B virus surface antigen.
治疗后第8周，用免疫组织化学方法分析肝内HBsAg和HBcAg水平。数据显示，cr - t3 - seq13处理小鼠的肝细胞胞浆HBsAg水平远低于铝处理小鼠(图4一)且两组间肝内HBcAg水平相当(图4 b)．我们还定量测定了这些小鼠肝裂解液中的HBsAg和HBcAg。数据与免疫组化观察结果一致。CR-T3-SEQ13治疗组HBsAg明显低于对照组，约为对照组的30%，两组HBcAg水平无明显差异(在线补充图5)．这一观察结果与我们之前报道的E6F6的肝内抗hbv作用类似。24
CR-T3-SEQ13处理HBV-Tg小鼠(n=4)肝脏中HBsAg和HBcAg的免疫组化染色。治疗后第8周进行检测。比例尺为20µm。HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
CR-T3-SEQ13疫苗能根除以水动力注射为基础的HBV携带者小鼠的HBsAg和HBV DNA
为了进一步评估CR-T3-SEQ13诱导抗- hbs抗体反应和消除HBsAg的强大能力，使用HDI-HBV携带者小鼠模型。HDI-HBV小鼠已被证明对HBV具有获得性免疫耐受，这与大多数CHB患者所经历的情况类似，这些患者由于早期接触HBV而产生了免疫耐受。如前所述，我们基于' B6-Tg(AAVS1)A1Xob/J '菌株开发了HDI-HBV小鼠。29根据水动力注射pAAV-HBV1.2质粒后6周的HBsAg水平筛选小鼠。本研究选取HBsAg水平高于2000iu /mL的小鼠。选取10只HBsAg水平相近的小鼠，分为两组，分别接种CR-T3-SEQ13疫苗和明矾佐剂对照。在第0、2、3、4和5周共注射5剂。数据显示，接种CR-T3-SEQ13疫苗可诱导抗hbs抗体应答(图5 b)，同时HBsAg下降到检测下限，在药物治疗停止后40周以上仍维持在无法检测到的水平。相比之下，对照组小鼠仍然携带HBsAg，平均水平高于100 IU/mL (图5一个)．结果表明，CR-T3-SEQ13可以有效刺激seq13特异性抗体反应，进而介导HBsAg清除，这与定义为HBsAg丢失和/或抗- hbs血清转化的“功能性治愈”情况类似。
接种CR-T3-SEQ13疫苗可根除以水动力注射为基础的HBV携带者小鼠的HBsAg和HBV DNA。分别于第0、2、3、4、5周注射CR-T3-SEQ13共5剂。(A) HDI-HBV携带者小鼠(基因型A, n=5) HBsAg水平的动态变化和(B)抗- hbs抗体水平的动力学变化。数据代表平均值±SEM。HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
CR-T3-SEQ13加核苷类似物的联合治疗
核苷/核苷酸类似物和干扰素是目前批准的抗hbv药物。恩替卡韦(ETV)和富马酸替诺福韦(TDF)是一线口服抗hbv药物。研究了CR-T3-SEQ13与ETV或TDF联合使用的效果。设计5组(ETV单独组、TDF单独组、RHBPI单独组、ETV + RHBPI组和TDF + RHBPI组)。在联合治疗组，接种疫苗后口服类似物2周。CR-T3-SEQ13 + ETV、CR-T3-SEQ13 + TDF或CR-T3-SEQ13单独治疗小鼠血清HBsAg水平显著降低(图6模拟)．CR-T3-SEQ13联合TDF治疗对雄性小鼠血清HBsAg水平的抑制作用略好于CR-T3-SEQ13联合ETV或CR-T3-SEQ13单独治疗(图6 b）;相比之下，仅接受ETV或TDF治疗的小鼠未观察到明显的HBsAg变化(图6 a, B)．数据表明，一线抗hbv核苷类似物与CR-T3-SEQ13之间没有干扰。在该模型中，TDF可能有改善CR-T3-SEQ13治疗效果的潜力。
CR-T3-SEQ13加核苷类似物的联合治疗。HBV转基因小鼠分别用TDF、ETV、CR-T3-SEQ13、CR-T3-SEQ13 + ETV和CR-T3-SEQ13 + TDF治疗。在联合治疗组，口服类似物2周后，在第0、2、3、4、5、6周注射CR-T3-SEQ13。(A)雄性和(B)雌性HBV- tg小鼠血清HBsAg水平及(C)雄性和(D)雌性HBV- tg小鼠HBV DNA水平的动态变化(E)雌性小鼠经CR-T3-SEQ13、TDF + CR-T3-SEQ13和ETV + CR-T3-SEQ13处理后HBsAg下降与抗seq13抗体滴度的相关性。(F)雌性小鼠经CR-T3-SEQ13、TDF + CR-T3-SEQ13和ETV + CR-T3-SEQ13处理后，HBsAg下降与Anti-SEQ13抗体滴度的相关性。数据以均值±SEM表示，n=4。箭头为注射CR-T3-SEQ13，绿色带为核苷酸类似物。ETV,恩替卡韦;HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原; TDF, tenofovir disoproxil fumarate.
为分析抗seq13抗体滴度与HBsAg下降的相关性，采用间接ELISA法检测所有小鼠血清抗seq13抗体。抗seq13抗体滴度的动力学表明，雌性小鼠比雄性小鼠有更强的抗体反应(在线补充图6)．数据显示HBsAg下降(0-7周)与抗seq13抗体滴度在第7周(R2=0.7898, p<0.0001) (图6 e)．同时，HBsAg水平与第7周抗seq13抗体滴度呈强负相关(R2=0.7427, p<0.0001) (图6 f)．强相关性表明，CR-T3-SEQ13疫苗的抗hbv作用高度依赖于抗seq13抗体反应的诱导，这与我们的假设一致。
CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内的免疫原性
在食蟹猴身上评价铝佐剂CR-T3-SEQ13的免疫原性和免疫应答的时间过程。在这项研究中使用了7只食蟹猴。免疫接种计划是在0、2、6、10、14和18周的时间内注射6次。静脉血每2周采集一次，至26周，监测抗体反应动态。hbsag特异性抗体滴度显著增加，并在三次注射后6周达到平稳期(图7)．反应高峰出现在第8周，抗hbs抗体滴度约为14 800 mIU/mL;以人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)为有效标准(图7)．结果表明，CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内具有良好的免疫原性。
CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内的免疫原性及抗血清的效力。(A) CR-T3-SEQ13疫苗和明矾对照免疫猴子的抗hbs抗体滴度动力学。两只公猴和两只母猴在上臂三角肌肌内注射含有CR-T3-SEQ13(20µg/剂量)和明矾佐剂(420µg/mL)的制剂1ml /剂量。对照组(两只公猴和一只母猴)只注射明矾佐剂。免疫接种计划是在0、2、6、10、14和18周的时间内注射6次。(B)以CR-T3-SEQ13接种猴子血清的体外中和活性，HBIG (1 IU/mL)作为对照组。(C)注射多克隆抗体(pAb)后HBV-Tg小鼠血清HBsAg动态变化。CR-T3-SEQ13 pAb和HBIG以相同剂量(10 IU/剂)注射HBV-Tg小鼠(n=4)。未处理的小鼠作为对照。数据以均数±标准差表示。 HBIG, human hepatitis B immunoglobulin; HBsAg, hepatitis B virus surface antigen.
CR-T3-SEQ13诱导的抗hbv多克隆抗体的效力
为了评估CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内诱导的抗hbs抗体的体外中和活性，使用稳定表达人Na+-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)的HepG2细胞(命名为HepG2- hntcp - 2b1细胞系)。以接种疫苗的猴子12周时采集的食蟹猴血清为检测样本，以HBIG (1 IU/mL)作为对照。配制从1/10到1/10240的两倍血清稀释系列。经CR-T3-SEQ13免疫的多克隆抗体表现出与1 IU/mL HBIG相当的中和活性(图7 b)．一般情况下，anti-HBs滴度在10 mIU/mL以上即可达到较好的保护作用，提示CR-T3-SEQ13产生的抗体具有保护作用，可能起到保护无HBV肝细胞免受HBV感染或阻断HBV在肝脏内传播的作用。
为了进一步评价CR-T3-SEQ13诱导的抗体在食蟹猴体内抗hbv的效果，从免疫猴血清中纯化了多克隆抗体。测定纯化多克隆抗体的抗hbs滴度，稀释至10 IU/mL，与HBIG滴度相当。同样数量的抗cr - t3 - seq13多克隆抗体和HBIG (10 IU/mL, 1 mL)注射到HBV-Tg小鼠体内。抗cr - t3 - seq13多克隆抗体和HBIG均可显著降低小鼠血清HBsAg水平(图7 c)．与HBIG组相比，anti-CR-T3-SEQ13治疗组小鼠血清HBsAg明显降低，且抑制时间更长。结果表明，CR-T3-SEQ13在食蟹猴体内诱导的抗体能有效介导HBsAg的清除，这也说明CR-T3-SEQ13治疗的主要机制是诱导抗HBsAg特异性抗体反应，介导HBsAg的清除。
讨论
几十项临床前和临床研究都未能研制出针对慢性乙型肝炎的有效治疗疫苗，20.这表明CHB患者确实难以克服免疫耐受，尤其难以产生能够介导HBsAg清除的抗- hbs抗体反应。在这项研究中，我们基于B细胞表位(HBsAg-aa119-125)构建了一个显示候选表位的VLP，该表位被我们之前研究中描述的优秀候选治疗抗体E6F6识别。24首先，我们用HBC149作为表位表达载体，用HBV-Tg小鼠筛选候选分子。共制备了23个HBsAg亲水区表位肽段，并进行了评价，最终获得了优化的表位SEQ13。虽然HBC-SEQ13在雌性HBV-Tg小鼠中可以诱导抗hbs反应并显著抑制HBsAg，但在雄性HBV-Tg小鼠中没有有效作用。作为基于B细胞表位的疫苗，载体蛋白应该是实现强烈免疫反应的另一个关键因素。因此，我们测试了几十个载体。最后，在这项研究中，我们使用了一种来自蝙蝠乙型肝炎病毒衣壳的载体。SEQ13显示的分子对圆叶蝙蝠HBV核心的治疗作用(RBHBcAg149)大大提高，并有效抑制雄性HBV- tg小鼠的HBsAg水平。为了进一步优化RBHBcAg149载体，通过置换引入一个人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位和两个辅助T细胞表位，得到候选分子CR-T3-SEQ13 (图1)．
CR-T3-SEQ13在HBV携带者小鼠中诱导对SEQ13表位的特异性抗体反应，并以剂量依赖的方式显著抑制HBV- tg小鼠中的HBsAg和HBV DNA (图3)．相比之下，基于HBsAg + HBcAg的疫苗对病毒抗原没有表现出明显的抑制作用(在线)补充图3)．评估疫苗单独使用或与一线抗hbv药物联合使用的疗效。CR-T3-SEQ13+TDF对HBsAg的抑制效果稍好(图6模拟)或CR-T3-SEQ13+干扰素a(在线补充图7)治疗方案，尽管差异无统计学意义。在获得性免疫耐受的HDI-HBV模型中，CR-T3-SEQ13疫苗将HBsAg抑制到低于检测限的水平超过40周(图5)．血清学标记与功能性治愈相似。在非人灵长类动物模型中，我们证明CR-T3-SEQ13具有优异的免疫原性，可以诱导食蟹猴产生高滴度的sA表位抗体，在体外HepG2-NTCP细胞模型中可以中和HBV感染，并通过被动转移到HBV- tg小鼠中有效消除HBsAg (图7)．BALB/c小鼠抗seq13多克隆抗体在体内抑制HBsAg，具有广谱活性(图2 c)．同样，CR-T3-SEQ13的抗hbv作用与抗seq13抗体滴度呈正相关(图5 e, F)．这些数据表明，CR-T3-SEQ13治疗的主要机制依赖于诱导抗seq13抗体，这种抗体介导了含有hbsag的病毒颗粒的清除。
佐剂和给药途径的比较对于治疗性疫苗的开发很重要，因此我们进行了实验来寻找潜在的佐剂和更好的途径。各种佐剂，包括AddaVax, Quil-A，壳聚糖，ODN 1585, ODN 1826和传统的明矾佐剂(在线补充图8A在野生型C57BL/6小鼠和HBV-TG小鼠中进行了评估，数据显示，用Addavax配制的疫苗的免疫原性和有效性与明矾佐剂相当，两者都优于其他佐剂(在线补充图8B,C)．我们还比较了肌内注射(IM)、静脉注射和皮下注射三种不同的给药途径，数据显示IM和皮下注射的疗效具有可比性，均优于静脉注射(在线)补充图9)，我们认为这是由于经静脉注射注射的抗原可在外周血中迅速清除。
虽然CR-T3-SEQ13可诱导抗体有效介导HBV携带者小鼠HBsAg清除，从而抑制HBsAg水平并长期维持，具有恢复HBV特异性免疫应答的潜力，但小鼠模型并不等同于CHB患者，它们对HBV的免疫状态不同，对疫苗免疫应答的敏感性也不同。因此，我们无法根据在小鼠模型中获得的结果准确预测患者将会发生什么。此外，由于SEQ13仅包含HBsAg B细胞表位的一部分，诱导的抗体多样性可能相对有限，可能面临病毒逃逸突变或抗体应答弱等问题。所有这些挑战都必须在临床试验中得到验证。
大量证据表明，T细胞衰竭的出现与宿主的病原体负担高度相关。11 36用抗- hbs抗体去除HBV携带者小鼠循环中的HBsAg可逐渐降低耐受性并增强随后的治疗性疫苗接种。13此外，CBH患者治疗队列的数据也显示hbv特异性T细胞反应与HBsAg水平呈负相关。37REP-2139的临床试验数据始终支持长期抑制HBsAg可以促进HBsAg特异性B细胞反应的假设。14 38
因此，抑制高水平的循环HBsAg应该是免疫治疗CHB的关键因素。23显示有效降低HBsAg的方法组合有机会恢复对HBV的有效免疫反应。减少病毒抗原的处理，如治疗性抗体、siRNA或核酸聚合物(nap)，可能有利于治疗性疫苗诱导体液反应。这一策略有望克服CHB患者的免疫耐受，并使治疗性疫苗的临床疗效能够治愈HBV感染。
综上所述，我们的数据表明，CR-T3-SEQ13是进一步发展为治疗CHB的治疗性疫苗的最佳候选疫苗。我们的发现为理解基于B细胞表位的治疗性疫苗对抗持续性病毒感染的方法提供了新的见解。考虑到CR-T3-SEQ13与明矾/另一种新型佐剂治疗性疫苗单独或与干扰素或核苷类似物联合提供的独特抗HBV作用，其他正在开发的抗HBV候选药物可能提供促进HBV治愈的有前途的策略。
参考文献
脚注
T-YZ, X-RG和Y-TW贡献相同。
贡献者TZ, QY, JZ和N-X对研究中的所有数据都有完全的访问权，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。研究概念与设计:TZ, QY, N-X。数据采集:TZ、XG、Y-TW、X-ZK、Q-BZ、R-YQ、B-BC、YL、SW。数据分析与解释:TZ, XG, Y-TW, QY, JZ, N-X。稿件起草:TZ, QY, JZ。重要知识内容的手稿批判性修订:Q-JZ, S-WL, S-XG, P-JC和N-X。统计分析:TZ和QY。技术或材料支持:MW, H-LX, JC, B-HZ, X-YQ, X-FH, YZ, TC, YC, Y-BW和M-JF。研究指导:JZ, QY和N-X。审定最终稿:JZ, QY, N-X。
资金国家科技重大专项(2017ZX10202203-001/009)、国家自然科学基金(31730029、81672023、81871316、81702006)、厦门大学校长基金项目(20720160063)资助。
相互竞争的利益我们已经阅读并理解BMJ关于利益申报的政策，并声明我们没有竞争利益。
伦理批准本研究获厦门大学公共卫生学院医学伦理委员会批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
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