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Neurogastroenterology
原始研究
微超表达慢传输性便秘会导致减少NaV1.5当前和平滑肌收缩性改变
  1. 阿米莉亚马佐尼1,
  2. Peter R Strege1,2,
  3. 西蒙J吉本斯1,2,
  4. 康斯坦萨Alcaino1,
  5. Vikram Joshi1,
  6. 安德鲁J哈克2,
  7. 丹尼尔·J Tschumperlin2,
  8. 谢丽尔·E·伯纳德1,
  9. 罗伯特·R Cima3,
  10. 大卫·W拉森3,
  11. 海蒂K蔡3,
  12. Rondell P格雷厄姆4,
  13. Mona El Refaey5,6,
  14. Peter J莫赫勒5,
  15. Yujiro Hayashi1,
  16. Tamas Ordog1,2,
  17. 斯特凡•考尔德7,
  18. 彭杜7,
  19. Gianrico Farrugia1,2,
  20. 亚瑟Beyder1,2
  1. 1肠神经科学项目(ENSP),胃肠病学和肝脏病学分工,医学系的,梅奥诊所,罗彻斯特,明尼苏达州美国
  2. 2生理学和生物医学工程系,梅奥诊所,罗彻斯特,明尼苏达州美国
  3. 3结肠和直肠手术,梅奥诊所,罗彻斯特,明尼苏达州美国
  4. 4病理学系,梅奥诊所,罗彻斯特,明尼苏达州美国
  5. 5部门的生理和细胞生物学,多萝西·m·戴维斯心肺研究所、美国俄亥俄州立大学瓦克斯纳医疗中心,哥伦布,俄亥俄州美国
  6. 6内科,多萝西·m·戴维斯心肺研究所、美国俄亥俄州立大学瓦克斯纳医疗中心,哥伦布,俄亥俄州美国
  7. 7奥克兰生物工程研究所,奥克兰大学,奥克兰、新西兰
  1. 对应到博士Gianrico Farrugia,肠神经科学计划,分工胃肠病学和肝脏病学,医学系,梅奥诊所,罗彻斯特55905 MN,美国;farrugia.gianrico在}{mayo.edu;亚瑟Beyder博士肠神经科学计划,分工胃肠病学和肝脏病学,医学系,梅奥诊所,罗彻斯特MN, 55905;beyder.arthur在}{mayo.edu

文摘

客观的本研究旨在评估小分子核糖核酸的角色(microrna)在慢传输型便秘(STC)。

设计所有的人类组织样本的肌层外结肠。372 microrna的表达中检查发现患者群四STC和三个年龄/ sex-matched控制定量PCR的数组。考察了调节microrna定量逆转录qPCR (RT-qPCR)验证患者群七STC和年龄/ sex-matched控制。高度的影响差异表达microrna在检查自定义人类平滑肌细胞系在体外RT-qPCR,电生理学、牵引力显微镜和体外鼠慢病毒转导肌层外organotypic文化。

结果13个microrna的表达增加在STC样本。microrna,四个预测目标SCN5A,基因编码Na+钠通道V1.5。的表达SCN5A信使rna是减少STC样本。Let-7f显著减少钠+电流密度在人类平滑肌细胞体外。在大鼠肌层外organotypic文化,let-7f导致的过度收缩的频率和振幅。

结论一小群microrna是调节在STC,和许多microrna目标SCN5A-encoded Na+钠通道V1.5。在这个组中,小说NaV1.5监管机构,let-7f,导致减少了NaV1.5表达、电流密度和降低胃肠道平滑肌的蠕动。这些结果表明钠V1.5和microrna在优质新颖的诊断和潜在的治疗靶点。

  • 运动性疾病
  • 肠道蠕动
  • 肠道离子传输
  • 遗传学
  • 便秘
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2019 - 318747

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 慢传输性便秘的定义是通过结肠延长运输时间没有阻塞或结构异常。慢传输性便秘病理生理学是知之甚少。

    • 电压门控的mechanosensitive Na+钠通道V1.5表达在人类和大鼠胃肠道平滑肌细胞和调节平滑肌的机电功能。

    • Na的失调V1.5由于改变了表达的小分子核糖核酸(microrna)在心脏病理的后果。

    有什么新发现吗?

    • 在慢传输性便秘,SCN5A编码NaV1.5表达减少,13和4中microrna是过表达的一个子集的预计目标SCN5A。

    • Let-7f是Na的小说microrna的监管机构V1.5。这是过表达microrna的慢传输性便秘;它减少了功能NaV1.5通道表达,NaV1.5电流在人类的平滑肌细胞和大鼠胃肠道平滑肌收缩性。

    • Let-7f Na的监管者V1.5函数是一个新奇的发现和广泛兴趣的生理角色NaV1.5心脏和肠道。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • microrna在慢传输性便秘不同监管,这可能是诊断的意义。

    • microrna的Na的监管V1.5电流密度慢传输性便秘可能是重要的病理生理学。

    • 因此,microrna和NaV1.5治疗慢传输性便秘的目标可能是小说。

    介绍

    胃肠道蠕动是至关重要的人类胃肠道的正常功能。打乱胃肠道蠕动与几个疾病或障碍不同于急性发作,例如,术后肠梗阻,阴险,如pseudo-obstruction。慢传输型便秘(STC)、慢性致残疾病在结肠运输品质的延迟没有出口梗阻,可能耐火材料药物,导致结肠切除术。1 2优质的病理生理学并不明确。先前的研究显示肠神经元的损失3和卡哈尔间质细胞(ICC)——肠道的心脏起搏器。4个5然而,在大多数情况下,不是诊断,组织学分析6这可能表明功能病理学在分子水平上。

    离子通道是不可或缺的胃肠道平滑肌的电兴奋性和机电耦合。7因此,严格监管的离子通道的表达和功能是至关重要的正常胃肠道蠕动。电压门控钠+渠道,特别是,对信号的生成和传播很重要,电激细胞如细胞、心肌细胞和神经元。8甚至在胃肠道平滑肌,Ca2 +信号是至关重要的兴奋性和运动性,Na+通道生物的方式有助于调节电和收缩功能。卖地一个电压门控钠+钠通道V1.5,编码的SCN5A基因,传统上被认为是“心脏”Na+频道,14但NaV1.5是表达人类胃肠道平滑肌和ICC在空肠和结肠,10 15电生理功能是很重要的在哪里11日16和收缩性。13这也是现在和功能相关的肠道平滑肌的老鼠11但不是平滑肌和肠肌层的神经元鼠标。12日17

    SCN5A突变导致心脏传导障碍,“channelopathies”,如长QT综合征和Brugada综合症,18和SCN5A是唯一的非结构性基因与扩张型心肌病,心脏收缩性障碍。月19 - 21日患者SCN5Achannelopathies和已知的心律失常发生率的增加功能性胃肠道疾病,22反之IBS患者更有可能SCN5Achannelopathies,更大比例的患者SCN5Achannelopathies constipation-predominant肠易激综合症。23此外,钠V1.5块ranolazine,食品和药品管理局批准了药物,强烈与便秘有关24由于抑制NaV1.5 mechanosensitivity和减少人类结肠平滑肌的收缩性。13

    然而,channelopathies比较少见。更加频繁,引起的疾病是改变离子通道表达,25特别是因为离子电流的变化只有1%会导致致命的疾病。26因此,离子通道的表达是由多个机制,严格监管包括表观遗传,信使rna和蛋白质的水平。小分子核糖核酸(microrna)是一类小型非编码rna调节基因表达在转录后水平,参与许多疾病的发病机制。27离子通道密度,包括NaV1.5,经常受microrna,这种机制是与心脏传导障碍有关。28在胃肠道,microrna调节离子通道密度和导致胃肠道功能紊乱。29 30因为钠V1.5电流密度涉及胃肠道平滑肌功能,NaV1.5抑制导致便秘和延迟运输,我们提出在这项研究中,microrna可能调节NaV1.5密度失学。

    方法

    人类结肠癌样本和RNA / microrna的提取

    梅奥诊所的机构审查委员会批准使用人类结肠组织获得手术浪费。结肠肌层外从人类从STC患者结肠组织解剖进行小计结肠切除术或控制结肠癌患者结肠切除术(表1)。组织在液氮瞬间冷冻和储存在−80°C到使用。提取总RNA,包括microrna的分数,使用miRNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。

    定量PCR (qPCR)数组

    逆转录准备cDNA成熟的microrna测定进行了使用miScript II RT工具包(试剂盒)和400 ng总RNA根据制造商的指示。qPCR数组使用是miScript microrna的PCR数组人类miFinder 384 hc (mih - 3001 z,试剂盒)。这些连续的数据分析使用试剂盒软件和意义被分配如果p < 0.05。

    中存在

    信使rna逆转录反应的兴趣进行了使用上标很互补脱氧核糖核酸合成工具(技术)。逆转录反应MicroRNA的感兴趣的是使用微RT工具包和特定的微rna引物(TaqMan ThermoFisher),根据规范。qPCR LightCycler 480对系统做了SYBRGreen我主人混合(罗氏应用科学)。结果计算表达式相对于管家(次黄嘌呤phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1))使用2ˆ(-ΔCT),在这些分类和统计数据是通过使用Mann-Whitney分配如果意义p < 0.05。

    把这个表:
    表1

    病人的人口统计信息

    细胞系

    主人体平滑肌细胞(HuSMCs)被分离从一个病人的空肠(女,52岁)进行转换roux - en - y胃旁路手术,并通过与SV40大T抗原转换中被永久地传颂。31日HuSMCs在完成培养Clonetics SmGM−2平滑肌增长Medium-2 (Lonza)含1% antimycotic-antibiotic (Gibco)。

    microrna的转染

    HuSMCs转染使用LIPOFECTAMINE RNAiMax试剂(表达载体)和50 nM的microrna的模仿(热费希尔)Opti-MEM根据制造商的指示。这些细胞被孵化前48小时RNA / microrna的提取和电生理学实验。

    microrna的调制的SCN5A表达式

    HEK293细胞被镀在six-well板块72小时最低基本培养基(MEM),补充10%胎牛血清和青霉素、链霉素),然后由Lipofectamine转染3000(表达载体)SCN5A完整的3′UTR(2259个基点)记者向量(HmiT016601-MT05 Genecopoeia)和/或50 nM let-7f microrna的模仿(hsa-let7f-5p,生活技术)的总量2.4毫升/。24小时后,Opti-MEM新鲜MEM所取代。在48小时内,条件MEM媒体收集到1.5毫升管,和Gaussia荧光素酶(GLuc)和分泌碱性磷酸酶(SEAP)活动是衡量Secrete-Pair双发光测定(Genecopoeia)。发光是阅读在盘子里读者在1 s集成时间在10分钟。正常发光单元(NLUs)计算的方程:NLU = (GLucX——GLuc- - - - - -UTR)/ (SEAPX——SEAP- - - - - -UTR),GLuc或SEAP活动(任意单位)的荧光素酶或SEAP的媒体,utr从细胞转染条件媒体没有SCN5A向量和3′UTR记者X从细胞转染条件媒体没有(控制)或microrna的模仿(let-7f)。

    蛋白质提取和免疫印迹

    HuSMC轻轻洗两次冰冷的磷酸盐和收集的刮板。在4°C细胞颗粒状5分钟,用于蛋白质的提取和免疫印迹(如前所述)32(见在线辅助方法)。

    电生理学

    数据被记录在一个Axopatch 200 b放大器pClampfit 10软件。全细胞钠+电流被从引起潜在控股120−−80 mV 30 ms测试脉冲通过+ 20 mV。Na峰值+电流在整个−20 mV一步是正常细胞的电容。介绍了用于解决方案在线辅助方法。

    牵引力显微镜

    牵引进行分析(如前所述)33(见在线辅助方法)。

    慢病毒转导

    肌层外是解剖空肠的6 - 8周大的雄性sd大鼠中如前所述。11组织与新转导或let-7f慢病毒颗粒的感染复数(Dharmacon) 5。在每天0和5,长约2分钟电影记录14帧/秒的速度使用DP22相机(奥林巴斯)连接到一个SZ61立体显微镜(奥林巴斯)和用于收缩性测量和时空映射。

    收缩性测量

    ImageJ软件导入和转换图像用于收缩性测量中描述在线辅助方法。

    时空映射

    个人提取帧在90年代从每个视频和灰度图像增强在MATLAB (2015 a, MathWorks)。位移、频率和协调测量详细在线辅助方法。

    结果

    多个microrna预测目标SCN5A是在标准电话

    我们检查了372最常见的microrna在miRBase数据库由qPCR microrna的数组来确定进一步的调查从四个microrna女性患者和三个年龄和sex-matched控制。我们发现372年13个microrna(3.5%)三倍的8倍调节(STC)组织图1一个;表2)。没有检查microrna在STC)大幅下调。基于无监督层次聚类分析确定的13个microrna的表达模式使用平均联系分隔成两个集群(图1 b)。有趣的是,两个集群包含microrna的监管机构SCN5A,34mechanosensitive离子通道Na基因编码V1.5,一个著名的运动员在多个胃肠道蠕动障碍。13日22日23日35 36第一个集群,以10的13个microrna标识,包括两个mir - 98家族成员(let-7e和let-7f),第二个包含两个mir - 200家族成员(mir - 200 - a - 3 - p和mir - 429)。之前那些microrna预计或调节NaV1.5表达式绑定的3′UTRSCN5A信使rna (图1 c)。这些结果表明,一组特定的microrna在优质丰富,和> 30%的可能目标SCN5A。

    Thirteen of 372 miRNA examined are differentially expressed in slow transit constipation. (A) Heatmap plotting negative Ct values from the miRNA qPCR array organised by increasing p values. The box indicates the ones with p<0.05. The expression level of miRNAs is colour-coded as indicated in the legend. (B) Blowup of highlighted group of miRNAs, with hierarchical clustering analysis on the left. (C) Map of SCN5A mRNA 3′-UTR with binding sites for miRNAs obtained from multiple prediction algorithms (online supplementary table 1) and literature. In the boxes are position and sequence of target region complementary to each miRNA seed. In red are miRNAs identified by qPCR array screening. (D) SCN5A mRNA expression is reduced in STC smooth muscle. Data are median±IQR. n=10–11. *p<0.05, Mann-Whitney test. CTRL, control; miRNA, microRNA; qPCR, quantitative PCR; STC, slow transit constipation.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    372年13个microrna的检查中差异表达慢传输性便秘。(A)的热图策划- Ct值microrna qPCR数组组织通过增加p值。这个盒子表明的p < 0.05。microrna的表达水平是颜色表示的传奇。(B)崩溃的突出群microrna与层次聚类分析在左边。(C)的地图SCN5A与结合位点mRNA 3′utr microrna获得来自多个预测算法(在线补充表1)和文学。盒子的位置和序列的目标区域相辅相成的microrna的种子。在红色的microrna被qPCR数组筛选。(D)SCN5A信使rna表达减少失学平滑肌。数据值±差。n = 10 - 11。* p < 0.05, Mann-Whitney测试。CTRL,控制;microRNA, microRNA;qPCR定量聚合酶链反应;优质,慢传输性便秘。

    把这个表:
    表2

    慢传输性便秘的microrna的差异表达列表与控制

    这些结果促使我们检查SCN5A表达式是STC)的改变。我们扩展我们的队列和收集组织从七个额外失学和七个年龄组的患者。我们发现一个健壮的减少SCN5A信使rna表达在STC) 35% (图1 d)。我们使用这个扩展群组验证数组结果定量逆转录聚合酶链反应个人的microrna。我们选择预测目标的差异表达micrornaSCN5A:mir - 429和mir - 200 - 3 - p从一个集群和let-7f。我们没有发现差异表达是STC和对照组之间mir - 200 - a - 3 - p,可能由于低的microrna的表达我们的样品(图2一个),但我们确认重要的微分表达式let-7f和mir - 429 (图2 b, C)。我们还测试了两个负面的表达控制。第一个是mir - 155,没有预测目标的microrna的3′utrSCN5A和不是数组筛选差异表达的,但报道mechanosensitivity的一些病态的影响。37 38第二个控制mir - 219,一种microrna的目标SCN5A,34但不是数组筛选差异表达的。无论是microrna是控制和STC样本之间的差异表达(图2 d, E)。

    The expression of let-7f miRNA is significantly increased in STC. (A) miR-200a is not differentially expressed between CTRL and STC. Expression of miR-429 (B) and Let-7f (C) is increased in STC. Expression of miR-155 (D) and miR-219 (E) is not altered in STC. Data are median±IQR. n=10–12, *p<0.05, Mann-Whitney test. CTRL,control; miRNA, microRNA; STC, slow transit constipation.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    的表达let-7f microrna是STC)显著增加。(一)mir - 200 - CTRL和STC之间没有差异表达。mir - 429 (B)的表达和Let-7f (C)是STC)增加。mir - 155的表达(D)和mir - 219 (E)不改变失学。数据值±差。n = 10 - 12, * p < 0.05, Mann-Whitney测试。CTRL,控制;microRNA, microRNA;优质,慢传输性便秘。

    HuSMC行保留电兴奋性和收缩表型

    平滑肌细胞(smc)经常和迅速失去表型主要文化,39他们很难使转染。因此,我们在家乡HuSMCs利用SV40大T抗原。我们使用一些技术来验证HuSMC保持平滑肌表型。首先,通过牵引力显微镜,我们量化刺激驱动的拉伸力在存在收缩刺激。生成的牵引力量HuSMCs明显高于在碳酰胆碱的存在,一个典型的SMC兴奋剂(图3一)。我们由PCR, HuSMCs高纯度有关平滑肌离子channels-Na mRNAV1.5编码SCN5A和l型钙通道α1C (CACNA1C),以及典型的SMC标记如平滑肌肌动蛋白(ACTA2)和myosin-11 (MYH11)和smoothelin (SMTN),而之后的段落(> 11),失去了平滑肌表型和NaV1.5电流(图3 b)。免疫印迹实验表明,HuSMCs也表达NaV1.5蛋白(图3 c)。我们使用全细胞电压钳测试HuSMC NaV1.5函数直接和健壮的NaV1.5电流密度和动态属性与新鲜HuSMCs分离的10 - 12 15(图3 d)。这些数据表明,HuSMC是一个合适的SMC模型检查microrna的影响对Na的监管V1.5和SMC函数。

    HuSMCs have characteristics similar to GI smooth muscle cells. (A) Representative images of cell tractions’ colour maps generated by the same HuSMC in basal conditions (left) and response to carbachol (right). The colours correspond to magnitudes of traction forces generated as indicated in the colour bar. The RMS traction forces generated are quantified in the graph. Data are median±IQR, n=7, *p<0.05, Mann-Whitney test. (B) HuSMCs (passage 6, P6) are highly enriched for mRNA for smooth muscle cell marker genes, including SCN5A and CACNA1C, compared with later passages (>10, P10), which lose smooth muscle phenotype (n=4). (C) HuSMCs express NaV1.5 protein by western blot. (D) Representative traces of Na+ currents recorded from HuSMCs. (E) I/V plot with Na+ currents recorded from HuSMCs. Time to peak (F) and time constants of inactivation (G) calculated from currents recorded at different voltages. ACTA2, smooth muscle actin; CACNA1C, L-type calcium channel α1C; CARB, carbachol; CTRL, control; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; HuSMC, human smooth muscle cells; MYH11, myosin-11; pA, peak Na+ currents; pF, whole cell capacitance; RMS, root mean square; SCN5A, sodium channel NaV1.5; SMTN, smoothelin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    HuSMCs特征类似于胃肠道平滑肌细胞。(一)代表细胞牵引的彩色地图图像生成的相同HuSMC基底条件(左)和应对碳酰胆碱(右)。颜色对应生成的牵引力量大小颜色栏显示。RMS牵引力量生成量化的图。数据值±差,n = 7, * p < 0.05, Mann-Whitney测试。(B) HuSMCs(通道6,P6)高纯度为平滑肌细胞标记基因mRNA,包括SCN5A和CACNA1C,相比之下,后来段落(> 10,P10),而失去平滑肌表型(n = 4)。(C) HuSMCs表达NaV1.5蛋白质免疫印迹。(D)代表Na的痕迹+电流从HuSMCs记录。(E) I / V情节和Na+电流从HuSMCs记录。时间达到峰值(F)和时间常数的失活(G)计算出在不同的电压电流记录。ACTA2平滑肌肌动蛋白;CACNA1C,l型钙通道α1C;碳水化合物,碳酰胆碱;CTRL,控制;GAPDH甘油醛3磷酸脱氢酶;HuSMC人类平滑肌细胞;MYH11myosin-11;pA, Na峰值+电流;pF,整个细胞电容;RMS,均方根;SCN5A,钠离子通道NaV1.5;SMTN,smoothelin。

    Let-7f过度HuSMCs显著降低SCN5A表情,NaV1.5电流密度和细胞收缩性

    我们第一次使用荧光素酶由记者SCN5A3′UTR确定let-7f抑制SCN5A表达式。我们发现转染后48小时,let-7f microrna的模仿降低正常化荧光素酶单位55.9%±8.2% (0.169±0.037 NLU)在HEK293细胞cotransfected let-7f microrna的模仿SCN5A3′UTR,而细胞转染3′UTR独自向量(0.406±0.058 NLU;n = 6;p = 0.013, let-7f模仿no-mimic控制小动物——一张长有配对t检验;图4 d)。自从let-7f目标SCN5A并富含优质,我们对HuSMCs下检查是否有功能的影响。我们与let-7f转染HuSMC模仿。积极的控制,我们转染mir - 200 a,消极控制我们使用mir - 155。与模拟瞬时转染后,我们发现在感兴趣的microrna的大幅增加(图4一)。然后我们评估的影响转染的microrna Na的功能V1.5蛋白质使用电生理学。全细胞电压钳位显示转染后48小时的let-7f模仿HuSMC NaV1.5电流显著降低而untransfected HuSMC,而转染一道(NT) microrna的没有影响(图4 c, D)。得到了类似的效果与转染的HuSMC积极控制mir - 200 a,而mir - 155并不影响HuSMC NaV1.5电流(图4 c, D)。这些数据表明,过度的let-7f导致减少NaV1.5电流密度。

    Overexpression of Let-7f significantly reduced Na+ current density in HuSMCs and resulted in changes in the cells’ properties. (A) RT-qPCR show efficient delivery of miRNA after transfection of mimics in HuSMCs (means±SDs, n=6). (B) Representative patch-clamp traces for HuSMC±miRNA mimics. (C) Peak Na+ current densities were reduced after transfection with let-7f (means±SEMs, n=5–17 cells, *p<0.05 by a one-way analysis of variance with Dunnett’s post-test). (D) NLUs of HEK-293 cells transfected with SCN5A 3′UTR vector alone (control) or cotransfected with the 3′UTR vector and miRNA mimic (let-7f) (means±SEMs, n=6 transfections, *p<0.05 to same-plate controls by a two-tailed paired t-test). GLuc, Gaussia luciferase; HuSMC, human smooth muscle cells; miRNA, microRNA; NLU, normalised luciferase unit; NT, non-targeted; pA, peak Na+ currents; pF, whole cell capacitance; SEAP, secreted alkaline phosphatase.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    过度的Let-7f显著降低Na+电流密度在HuSMCs和导致细胞的特性的变化。(一)RT-qPCR显示高效转染后交付microrna的模仿HuSMCs(意味着±SDs, n = 6)。(B)代表膜片箝痕迹HuSMC±microrna的模仿。(C)峰值Na+电流密度是降低转染后let-7f(意味着±sem, n = 5 ~ 17细胞,* p < 0.05通过单向方差分析Dunnett测试后)。(D) NLUs hek - 293细胞的转染SCN5A仅3′UTR向量(控制)或cotransfected 3′UTR向量和microrna的模仿(let-7f)(意味着±sem, n = 6转染,* p < 0.05同一个盘子控制双尾配对t检验)。GLuc,Gaussia荧光素酶;HuSMC人类平滑肌细胞;microRNA, microRNA;NLU正常化荧光素酶单位;NT,一道;pA, Na峰值+电流;pF,整个细胞电容;SEAP,分泌碱性磷酸酶。

    过度的let-7f鼠肠organotypic文化导致平滑肌收缩性改变

    我们先前建立的老鼠,11但不是鼠标,12胃肠道平滑肌表达SCN5A和功能性NaV1.5,这使得它的相关模型来研究角色NaV1.5在胃肠道生理和病理生理学。11堆积序列使用Clustalω软件显示的顺序let-7f microrna的守恒的老鼠和人类之间(98.9%在线补充图1)。TargetScan分析还表明,预测目标站点let-7f守恒的老鼠SCN5A3′UTR (在线补充图1 b)。因此,我们选择使用大鼠肠道organotypic文化我们之前开发的。11研究let-7f进行靶向治疗对胃肠道平滑肌收缩性的影响在此系统中,我们为慢病毒转导优化条件和长期收缩性测量。转导后五天,lentiviral-mediated let-7f导致的超表达丰富的表达绿色荧光蛋白(GFP)标记let-7f整个平滑肌层(图5一个),而没有观察到信号控制组织或组织处理的新粒子。我们还测量了有节奏的收缩大鼠肠道平滑肌条的存在与否lentiviral-mediated超表达的let-7f通过测量平滑肌条收缩的频率在每天0和5文化在同一组织(图5 b)。控制组织显示频率无显著差异的两个时间点之间的收缩性,组织一样对待非目标慢病毒颗粒。然而,组织处理let-7f慢病毒粒子表现出减少约30%的收缩后5天(图5 c)。我们使用记录电影的时空映射分析检测组织特性的位移在连续帧基于覆盖网格(图5 d)。宫缩的频率和位移检测所有字段的视图包含感兴趣的区域(图5 e)。收缩模式随时间减少约35%在组织转导let-7f慢病毒颗粒,没有观察到的差异在控制和组织处理的新粒子(图5 f;表3)。这些发现符合我们之前的分析,频率测量使用这两种方法之间没有显著的不同方法(使用双向方差分析与Sidak多重比较的测试)。我们也分析了收缩的幅度,作为像素位移测量。振幅没有显著不同的控制和NT组时下降了78%在0和5天的let-7f集团(图5克;表3)。我们也组织一个协调指数衡量,来衡量的比例向量指向同一个方向。有趣的是,协调显示,任何集团的检查(没有区别图5 h;表3),这表明收缩的总体方向不变,即使频率和振幅受let-7f超表达的影响。这些数据表明,国际刑事法庭的功能没有改变在某种程度上,协调的影响。40 41我们的研究结果表明,let-7f对调节平滑肌收缩性有直接的负面影响。

    Overexpression of Let-7f in rat small intestinal organotypic cultures results in altered smooth muscle contractility. (A) Representative images from transduced tissue showing expression of let-7f-GFP throughout its full depth. Scale bar sizes are indicated in the figure. (B) Representative contraction patterns using ImageJ. Horizontal scale bar=2.5 s, vertical scale bar=35 pixels. (C) Frequency of contraction from ImageJ analyses reported as cpm, *p<0.05, n=4, paired t-test. (D) Representative grid overlay with tracked ROIs and the centroid used for calculations. (E) Displacements in the horizontal (x, blue) and vertical (y, red) directions for each ROI in the representative tissue. (F) Frequency of contraction from spatial–temporal mapping reported as cpm. (G) Amplitude of contraction calculated as displacement of pixels. (H) Coordination metric measured as ratio of vectors pointing in the same direction. For F, G and H, data are median±IQR, *p<0.05, n=4, one-way analysis of variance with Dunn’s multiple comparison test. cpm, contraction per minute; CTRL, control; ROI, region of interest; NT, non-targeted.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    过度的Let-7f鼠小肠organotypic文化导致平滑肌收缩性改变。(一)代表图像从传导组织let-7f-GFP贯穿其全部深度的显示表达式。比例尺大小表示在图中。(B)使用ImageJ代表收缩模式。水平标尺栏= 2.5 s,垂直刻度栏= 35像素。(C)的收缩频率ImageJ分析报告为cpm, * p < 0.05, n = 4,配对t检验。(D)代表网格覆盖跟踪roi和用于计算的重心。(E)位移在水平(x,蓝色)和纵向(y,红色)为每个ROI代表组织的方向。(F)的收缩频率报告为cpm时空映射。(G)收缩幅度计算像素的位移。 (H) Coordination metric measured as ratio of vectors pointing in the same direction. For F, G and H, data are median±IQR, *p<0.05, n=4, one-way analysis of variance with Dunn’s multiple comparison test. cpm, contraction per minute; CTRL, control; ROI, region of interest; NT, non-targeted.

    把这个表:
    表3

    时空映射分析的总结

    讨论

    本研究的目的是提高我们对优质的理解。我们专注于microrna因为他们控制胃肠道和血管平滑肌表型和功能。42-44先前的研究在老鼠身上,完全移除smc的能力来生成microrna显示一个戏剧性的平滑肌功能障碍,通过减少血管平滑肌收缩性品质44和肠道运动不足和扩张。42然而,完整的microrna的淘汰赛做这些研究的临床意义不清楚。在这项研究中,我们发现在人类STC结肠平滑肌microrna特异表达的令人惊讶的小子集,提出功能角色的microrna在人类胃肠道平滑肌收缩、蠕动障碍。

    我们追求的microrna的调节平滑肌的功能机制。我们专注于microrna的角色为离子通道在调节mRNA的可用性,因为离子通道对SMC功能至关重要,microrna是高度有效的监管机构的电兴奋性和兴奋收缩偶联。45 46例如,microrna调节内脏感觉47和心脏运动性48通过控制离子通道mRNA密度。在我们的microrna的设置中,我们发现30%的microrna我们确定预测目标SCN5A编码一个mechanosensitive电压门控钠+钠通道V1.5与运动性疾病相关联的特点是受损平滑肌的收缩特性。13日22日23日35 36因为microrna数以百计的目标,49基因组分析本质上是有限的,50和功能评估是必需的。我们主要调查let-7f原因有三。首先,它是一个mir - 98家庭的一部分,这是最近在STC)是调节在一个单独的研究。51第二,它是大量表达在我们的样本。第三,有人建议,mir - 98家庭的其他成员管理SCN5A。34我们发现let-7f过度导致下降SCN5A表情,NaV1.5电流密度和人类SMC电兴奋性。

    考虑到减少钠V1.5与减少兴奋性和收缩性人类结肠13和大鼠模型,11我们使用老鼠organotypic文化let-7f慢病毒转导。我们发现let-7f减少平滑肌收缩性通过减少收缩的幅度和频率,使协调指数不变,类似于肌病过程的测压法。虽然let-7f可能有几个细胞的目标,我们的研究结果表明,let-7f可能调节平滑肌的作用可能通过调节NaV1.5在smc。除了let-7f之外,我们发现三个microrna的目标SCN5A信使rna通过种子序列通过3′UTR传播,这表明可能是添加剂的影响。小说在所有,我们发现在Na的其他的系统有广泛的影响V1.5扮演着重要的角色,如心脏,52血管平滑肌44和感觉神经元,17 53而且non-excitable细胞54甚至是癌症。55 56

    有有趣的关于如何降低Na机械的可能性V1.5密度降低胃肠道平滑肌收缩性,包括通过NaV1.5函数作为离子通道或通过NaV1.5作为大分子的中心组件复杂,参与肌细胞细胞结构。57有趣的是,SCN5A突变不仅与扩张型心肌病,疾病的特点是受损的心脏收缩性,但也SCN5A是只有少数离子通道基因之一。19 58SCN5Achannelopathies可能导致运动减弱光滑和心脏肌肉通过肌细胞兴奋性降低。59 60在胃肠道平滑肌,NaV1.5有助于初始,快速增长的慢波的两极化的SMC,以及重要的是监管的慢波的幅值和持续时间,10 11SMC l型钙激活的关键参数2 +频道。有可能降低let-7f-driven NaV1.5电流密度可能会导致降低SMC和心肌细胞收缩功能通过一个不平衡的Na+/ K+泵或Na+/ Ca2 +换热器,如在血管平滑肌,61年最终导致减少(Ca2 +]我。另一种可能性是通过NaV1.5核心作用的大分子结构复杂,导致肌细胞相互作用与结构基因,如syntrophin和telethonin,无论是在心脏62年和胃肠道平滑肌。59 60因此,减少了Na的表达式V1.5可能删除一个关键组件,支持心脏细胞的细胞骨架和插入的光盘63年或者在SMC细胞骨架和质膜,16导致细胞结构改变和受损的收缩性。在所有,而NaV1.5建立在蠕动障碍作用,未来的研究需要确定其在疾病中的作用。

    这项研究还提供了重要线索关于GI SMC生物学。Let-7f和其他STC-associated microrna目标除了胃肠道SMC基因SCN5A。即使完全成熟和分化,smc保持显著的可塑性。smc可以失去增殖能力的收缩功能支持在应对环境信号。64年两国之间的失衡会导致疾病。64年事实上,改变表达let-7g, mir - 98的另一个成员的家庭,从收缩中起着关键作用增生性血管SMC表型。65年在胃肠道平滑肌,microrna工作证明了结合血清反应因素,开一个开关在平滑肌收缩表型相反的方向从增殖。66年痛的慢性肠道pseudo-obstruction的的一个子集,胃肠道蠕动可能受损的结果失去收缩smc和回归更为成熟和增殖状态。67年我们STC患者群精心挑选,但我们无法精确控制组织的位置我们收到了进行分析。因此,我们组很可能的一个子集STC患者和组织。需要进一步调查概括我们的发现和建立胃肠道SMC增殖和分化途径之间的关系在健康和优质。这些问题可能会被人类进一步的工作,尤其是在对胃肠道蠕动障碍全层切片来的年龄。68年

    microrna的失调在STC的原因是未知的,我们只能推测。一个有趣的可能性是通过饮食,在改变中扮演着关键角色在胃肠道microrna的表达,与生理后果肠道转运。69年机制可能涉及microbial-derived代谢物如短链脂肪酸和胆汁酸,调节肠道蠕动70年和间接改变microrna的表达。也有可能微生物非独立或独立于饮食71年可以直接改变microrna表达最近提出了一些胃肠道疾病。72年

    总之,我们发现STC患者结肠平滑肌的一小部分microrna的表达增加。这些目标Na的子集V1.5,导致减少HuSMC NaV1.5电流密度,胃肠道平滑肌收缩性。因此,我们的观察表明角色microrna在SMC的监管功能和运动的发病机理和病理生理学。

    确认

    作者感谢克里斯蒂Zodrow行政援助和Denika年代Kerska帮助分析的收缩的频率。作者还感谢资助机构的支持完成这个研究。

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    脚注

    • 广发期货和AB联合高级作者。

    • 推特@beyderlab

    • 贡献者设计并进行实验,分析数据和写的手稿。PRS, VJ, YH MER, CA和AJH进行实验和分析数据;PJM, SC, DT, RG, SJG PD设计实验和分析数据;CEB协调手术组织识别和检索;RRC设计水线,惠科电子手术和提供组织执行;AB和GF设计研究,分析数据和写的手稿。所有作者批判性审查和批准了手稿。

    • 资金这项研究是由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所NIH R01 (DK52766) GF和NIH K08 (DK106456)、美国胃肠病协会研究学者奖(AGA RSA) AB和卢瑟福发现卢瑟福基金会奖学金的,新西兰皇家社会的PD。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人同意出版不是必需的。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 数据可用性声明所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。