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客观的解痉药polypeptide-expressing化生(SPEM)是一种再生损伤胃粘膜和肠上皮化生是一个潜在的前体/胃腺癌的一种慢性炎症。这些研究的目的是定义相关的转录变化SPEM在单个细胞水平应对急性药物损伤和慢性炎性损伤胃粘膜。
设计从胃上皮细胞分离的健康的胃和肚子和药物引起inflammation-induced SPEM病变。单个细胞RNA序列(scRNA-seq)组织样本上执行这些设置。个别上皮细胞的转录组从健康,严重受损,慢性炎症的胃进行了分析和比较。
结果scRNA-seq揭示人口粘蛋白6 (Muc6)+胃内因子(Gif)+在正常组织细胞,但这些细胞不表达与SPEM相关记录。此外,分析SPEM细胞药物受伤和慢性发炎语料库产生了两个主要发现:(1)SPEM和颈部细胞增生/肥大是几乎相同的表达式的SPEM-associated成绩单和(2)SPEM项目由drug-mediated壁细胞消融和慢性炎症几乎是相同的,尽管成绩单参与免疫调节的感应是SPEM慢性炎性细胞所特有的设置。
结论这些数据需要SPEM的定义包括的扩张Tff2 + Muc6 +细胞不表达成熟细胞记录等Gif。我们的数据表明,SPEM产生一个高度保守的细胞项目独立的病因学和发展慢性炎症的免疫调节功能的设置。
- 胃化生
- 胃癌
- 胃炎
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
解痉药polypeptide-expressing化生(SPEM),确定了三叶草的coexpression因子2 (TFF2),粘蛋白6 (MUC6)和胃内在因素(GIF),被认为是一个前体病变肠上皮化生和胃腺癌。
SPEM被认为发展新创的首席细胞终末分化再生后的胃粘膜语料库受伤但可以持续长期如果煽动侮辱没有解决。
在慢性设置,TFF2 + MUC6 +病变出现除了SPEM但缺乏成熟的主细胞签名蛋白质(如GIF小鼠胃里)。是否这些增生的粘膜脖子细胞,而不是真正的化生是不清楚。
有什么新发现吗?
单个细胞RNA序列数据的30 000个细胞健康受损的小鼠胃语料库组织确定了主要语料库血统以及SPEM粘液颈细胞增生肥大。
Muc6 + Gif +上皮细胞在健康的胃语料库但不表达SPEM成绩单等Tff2,Cd44和雌性生殖道。
Tff2 + Muc6 + Gif−增生的细胞不是一个独特的血统/肥厚性颈细胞,有几乎相同的转录计划Gif Tff2 + Muc6 + +细胞,证明SPEM的病态定义包括细胞不表达成熟首席细胞记录(例如,Gif在小鼠胃)。
虽然许多规范化SPEM-associated基因表达在药物和inflammation-induced SPEM细胞,许多免疫调节基因被诱导慢性inflammation-induced SPEM。
本研究的意义
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
SPEM的扩张包括细胞不表达成熟首席细胞记录是至关重要的,因为这些细胞可能赋予相同的规范SPEM最终intestinalisation和致癌的风险。此外,免疫调节表型在慢性炎性环境开发的风险分层和治疗干预提供了潜在的机会。
介绍
语料库粘膜的上皮细胞胃应对损失的变化基因转录、细胞表型和组织架构通常称为化生。1 2胃癌胃化生是一个关键的因素,它具有显著的全球疾病负担和死亡率。2 - 4更好地了解胃化生的响应是至关重要的在胃癌的诊断和治疗。
损伤胃粘膜语料库与cytokine-producing免疫细胞的渗透,顶叶和首席细胞增生/ mucous-producing脖子肥大细胞和修复化生细胞谱系的出现病态定义的coexpression脖子细胞和细胞lineage-specific genes-Mucin 6 (Muc6)和胃内因子(Gif)(胃蛋白酶原/PGA分别在人类)。5这化生的血统最初的特点是蛋白质的异位表达三叶草因子2 (TFF2),也称为解痉的多肽,通常表达的胃窦和小肠上皮细胞,但未找到底部的腺胃语料库。这化生的病变是因此命名为解痉药polypeptide-expressing化生(SPEM)。6在人类患者,SPEM周围几乎所有切除胃肿瘤和存在于大多数监测活检残胃癌症。7SPEM也流行病学与胃癌患者群体,并有证据表明,肠上皮化生可能来自SPEM。8 - 10根据这些事实,SPEM被认为是一个关键的前兆肠上皮化生,最终胃腺癌的发展,尤其是在慢性炎症和壁细胞损失(慢性萎缩性胃炎)。2 11这导致了临床指南推荐的发展表现出癌前病变的内镜监测的患者,如SPEM、肠上皮化生(IM)和发育不良。12虽然初步研究SPEM关注其肿瘤出现前的特性在长期情况下,底层细胞的过程是一个关键的急性期计划,使组织损伤后调整。这个过程只会致癌煽动受伤无法解决时,如在慢性幽门螺杆菌感染或自身免疫性胃炎。13 - 15决议的重要性证明了临床治疗的共识幽门螺杆菌感染可以解决癌前病变肠上皮化生。16
基础研究大大增加SPEM的理解很大程度上依赖于病理和immunofluorescent分析。若干关键问题的本质SPEM依然存在。例如,SPEM被认为是来源于胃首席成熟细胞的去分化,17但是microscopy-based分析可能不具备执行organ-wide调查必要排除这种可能性,一个小化生细胞存在人口在稳定状态和必要时扩大到修复胃粘膜。此外,它已经被很好的描述两种不同的病理病变发展针对慢性胃损伤:Gif Tff2 + Muc6 + +SPEM和Muc6 + Tff2 + Gif−粘液颈细胞增生肥大。人们认为SPEM胃腺癌发展是一个至关重要的前兆,但细胞增生的计划/肥厚性颈细胞和癌症的风险构成发展并不好理解。18 19最后,结合药物引起急性和慢性inflammation-induced胃损伤的小鼠模型和SPEM证明了细胞化生的计划是由壁细胞结合附加信号的损失,例如,通过免疫细胞分泌的细胞因子。1 20-26然而,它已被提出,由于病因学的显著差异(药物、感染、自身免疫)和慢性(天、月/年)这些模型系统之间,化生的计划可能显著差异和复杂的解释这些重要的研究。27到目前为止,尚未有可能专门隔离并比较数百个人SPEM的转录组之间细胞化生的药物损伤和慢性炎症模型。这些研究的目的是确定SPEM转录项目并定义单个细胞水平解决这些重要问题。
在这里,我们使用单细胞RNA-sequencing (scRNA-seq)来识别和比较000 ~ 30个人上皮细胞的转录组孤立语料库的三个不同的组老鼠:(1)健康控制老鼠,(2)老鼠经历壁细胞消融使用大剂量服用它莫西芬治疗(热变形)在三天时间内(称为“药物”在这些研究)和(3)小鼠模型的自身免疫性胃化生(TxA23),发展了一个受测者(表示“inflammation-induced”)。TxA23老鼠使用,因为他们是一个很好的描述小鼠模型inflammation-induced萎缩和化生密切概括人类患者的疾病进展包括:胃壁细胞萎缩,SPEM发展,慢性STAT3磷酸化和胃上皮内肿瘤的发展。24 - 30使用无监督聚类的共享近邻modularity-based优化算法和降维t-Distributed随机邻居嵌入(t-SNE),我们区分正常和SPEM (Tff2 + Muc6 + Gif + Muc5ac−)胃上皮细胞数量在这些单个细胞的准备。健康的胃语料库图书馆寻找存在的细胞病理SPEM标准会议(Muc6 + Gif +),但其他metaplasia-associated基因转录分析确定这些细胞缺乏与SPEM相关基因表达异常的项目。的子集SPEM细胞(Gif Tff2 + Muc6 + +)和潜在的增生性/化生细胞没有首席细胞转录表达(Tff2 + Muc6 + Gif−)被确定和比较交头接耳地识别显著差异在细胞编程,格兰特SPEM肿瘤出现前的属性。然而,这些分析揭示转录相似性Gif +和Gif-Tff2 -粘液细胞表达,表明共享本体而不是分离成独特的子集和扩大“SPEM”的定义。最后,比较药物引起的胃SPEM细胞识别和inflammation-induced SPEM透露,虽然炎症SPEM发展一个免疫调节表型,化生的计划是这两种不同的煽动之间高度保守的刺激。这些分析决定扩大SPEM的定义包括细胞没有主细胞基因表达和细胞计划推动这种病变是高度保守的,不管煽动病因学。
方法
老鼠
健康背景BALB / c小鼠购自杰克逊实验室。TxA23表达转基因小鼠T细胞受体的具体从H + / K + atp酶α肽链在BALB / c背景和曾被描述。28 29日31日32所有老鼠都保持在我们的设施和照顾动物按照机构的指导方针。研究进行一个男女混合组雄性和雌性小鼠cohoused同窝出生仔畜控制。高剂量的使用它莫西芬诱导壁细胞萎缩和SPEM发展之前。20 21 33简而言之,它莫西芬(5毫克/ 20克体重,T006000,多伦多研究化学物质)是腹腔内注入6 - 12周大BALB / c小鼠为3天每天一次。他莫昔芬是溶解在一辆汽车的10%的乙醇和90%葵花籽油(S5007,微孔σ)。
隔离的胃上皮细胞悬浊液
牺牲后,胃是收获从每组两只老鼠,排水胃淋巴结被移除。前胃腔被移除,语料库是减少内在曲率和打开。语料库在洗澡洗的磷酸缓冲盐去除食物,然后立即洗二次浴先进修改鹰的介质(MEM)。切割主体之一被放置在一个50毫升锥形管10毫升prewarmed消化腺媒体(高级MEM + 20毫米玫瑰+ 0.2%牛血清白蛋白(BSA) + 1×青霉素和链霉素+ 50µg /毫升庆大霉素)和1毫克/毫升胶原酶1 (C9891,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。胃在37°C激动了30分钟。结缔组织被留下胃腺体,然后转移到15毫升锥形管使用腺冲洗媒体(DMEM / F12火腿+ 1%青霉素和链霉素+ 50µg /毫升庆大霉素+ 0.5毫米二硫苏糖醇)。腺体在prewarmed resuspended Trypsin-EDTA (T3924 Millipore-Sigma)和孵化10分钟37°C。每10分钟,腺体激动用1毫升吸管来帮助消化。搅拌后,整除,和消化进度测量使用血细胞计数器和台盼蓝染色。消化时停止锥虫蓝染色显示完整的消化腺成单个细胞。 Cells were then washed twice in phosphate-buffered saline (PBS)+0.1% BSA to quench enzyme activity. Single cells were then resuspended in DMEM+10% FBS for final cell count and loading on the Chromium Single Cell Controller.
铬单细胞5 '图书馆建设
铬单细胞控制器仪表根据建议制造商在这些研究中使用协议和前面描述的。34-37短暂,胃语料库上皮单一细胞悬浊液被装载在一个铬单细胞控制器仪表(10倍基因组学,,而加利福尼亚,美国)生成单细胞凝胶珠在乳液(宝石)。单细胞RNA-Seq图书馆准备使用铬单细胞5′库&凝胶珠工具包(P / N 1000006, 10 x基因组学)。执行GEM-RT Veriti 96 -热循环(应用生物系统公司,4375786):53°C 45分钟,85°C 5分钟;在4°C和储存在−20°C。宝石被打破,单根cDNA清理了DynaBeads MyOne硅烷珠子(热费希尔科学;P / N 37002 d)。条形码,全长cDNA放大使用Veriti 96 -热周期计:98°C 45 s;骑车13×:20年代98°C, 67°C 30年代和72°C 1分钟;1分钟72°C;在4°C。 Amplified cDNA product was cleaned up with the SPRIselect Reagent Kit (0.6× SPRI; Beckman Coulter; P/N B23318). 5′ gene expression libraries were constructed using the reagents in the Chromium Single Cell 3′/5′ Library Construction kit (P/N 1000020). For 5′ gene expression library construction, these steps were followed: (1) fragmentation, end repair and A-tailing; (2) postfragmentation, end repair and A-tailing cleanup with SPRIselect; (3) adaptor ligation; (4) postligation cleanup with SPRIselect; and (5) sample index PCR and cleanup. Final quality control (QC) and Illumina sequencing of the prepared libraries was performed by the Washington University in St. Louis Genome Technology Access Center or McDonnell Genome Institute.
原始数据处理通过CellRanger 3.0管道(10 x基因组学)和二级集群和微分表达式分析进行修/ R。38
在聚类之前,库和子集都是加工,以确保质量。基因与mitochondria-localised蛋白质是破碎或低质量的标记细胞。39因此,低质量的细胞表达高水平的线粒体标记大多数阈值以上独特的每个库/子集下游分析之前被过滤掉。每个库当时全球规模和正常化1×10的比例因子4和日志转换。此外,多余的变化归因于生物噪声的来源和批处理效果被确定和退化,改善下游分析和降维。40
组件集群生成了典型相关分析。高信号规范相关解释最方差比较身份类被动态时间扭曲对齐,及其维度用于后续共享近邻t-SNE集群和可视化。41全球区分每个集群和比较身份类基因被确定通过计算平均单个细胞的正常基因的表达。重要基因至少有一个双重的改变和纠正p值小于0.01被确定通过Wilcoxon rank-sum测试Bonferroni调整为多个比较。
免疫荧光
胃是准备,彩色,从拉姆齐成像使用修改后的方法等。42简而言之,石蜡包埋标本切成5µm部分,deparaffinised和水化。抗原检索后10毫米柠檬酸钠(pH值6.0),部分被洗PBS和屏蔽1% BSA和0.3% Triton x - 100一夜之间在PBS孵化主要抗体。主要的抗体用于免疫染色鼠anti-CD44v (1:10 000 Cosmo生物LKGM002)和山羊anti-GIF (David Alpers博士的礼物,1:10,000圣路易斯华盛顿大学)。洗后,部分与二次抗体和孵化GS-II凝集素(1:50 0,L21415 ThermoFisher)。部分被洗,沾着赫斯特(62249年,ThermoFisher) 1:20 000在PBS和安装在延长黄金不变色mountant (P36934 ThermoFisher)。
多色−RNA原位杂交(RNAscope)
组织固定和RNAscope化验(先进细胞诊断,海沃德,加州)执行根据制造商的建议。短暂,胃组织从BALB / c和TxA23老鼠和4%多聚甲醛固定24小时在4°c。胃组织然后搬到10%蔗糖在PBS直到组织沉入底部,大约18个小时。组织后来搬到30%的蔗糖溶液PBS直到沉管的底部,大约18个小时。部分是利用蛋白酶预处理和孵化与探测目标Tff2(Cy3.5),Gif(FITC)和Muc6(Cy5)。幻灯片使用清洗彻底清洗缓冲(先进细胞诊断)后在室温下每个杂交步骤。定量是由计数细胞从三个胃语料库中的高功率字段在每个鼠标每组五到六老鼠。
结果
scRNA-Seq小鼠胃语料库的上皮细胞识别健康和化生的细胞谱系
这些实验的总体目标是定义单个细胞的转录SPEM的水平。为了做到这一点,胃上皮的方法隔离最初开发流仪分析适用于10倍基因组铬控制器平台。43为研究在这个手稿,单独的上皮细胞从语料库孤立地区健康小鼠的胃和药物引起的小鼠胃inflammation-induced SPEM。模型药物SPEM的反应,一个完善的药物引起的胃损伤模型高剂量服用它莫西芬(热变形)注射导致严重萎缩和化生在使用3天。20 21 33对于inflammation-induced SPEM的研究中,细胞被孤立于TxA23小鼠模型的自身免疫性胃炎发展壁细胞萎缩和SPEM SPEM开发受测者。18 24 - 30条形码的成千上万的单个细胞的互补脱氧核糖核酸数据库使用10倍基因组学从每个条件生成铬控制器平台。44被处理的数据使用CellRanger(10倍基因组学)和老鼠基因组保持一致。合并后图书馆健康严重受损,慢性炎症的胃包含29 351个体细胞平均1923个基因和11 431独特的分子标识符(umi)检测到每个细胞。每个记录包含UMI和特异性条形码识别个人成绩单和细胞。
一旦单个细胞的捕获记录每组测序,每个组的数据相结合,受到一个无偏t-SNE降维。我们提出这个公正的方法将确定集群的已知最大量的胃上皮细胞谱系在正常库以及SPEM产生病变的细胞库。共享近邻聚类算法,它定义了一组细胞基于相似和差异基因表达,确定15集群的细胞(图1一个)。这些组织的细胞类型可以确定基于记录的存在和没有已知的上皮细胞和SPEM细胞记录。例如,基因转录用于识别集群包括:Atp4a(壁细胞),Muc6(脖子粘液细胞),Muc5ac(小凹的或坑细胞),胃内因子(Gif;首席细胞)和老鼠Tff2(SPEM细胞)(图1 b)。以下确定集群:集群0:孔穴的细胞1;集群1:粘液颈细胞1;集群2:孔穴的细胞2;集群3:化生细胞;集群4:壁细胞2;集群5:粘液颈细胞2;首席细胞集群6:1;首席细胞集群7:2;集群8:增殖TFF2 +细胞; cluster 9: smooth muscle cells; cluster 10: endothelial cells; cluster 11: T/B cells 1; cluster 12: macrophages; cluster 13: neuroendocrine cells (G cells/D cells/ECL cells); and cluster 14: T/B Cells 2 (图1 c)。更完整的列表cluster-defining基因在网上提供补充图1。这些数据建立的能力对胃细胞执行scRNA-seq语料库和使用无监督聚类算法组不同类型的细胞健康与药物和炎症受损胃。
识别胃上皮细胞谱系使用scRNA-seq和公正的集群。(A) t-Stochastic邻居嵌入(t-SNE)无偏集群的胃上皮细胞悬浮液BALB / c(红色)隔绝,TxA23(蓝色)和热变形(绿色)老鼠。(B)功能点阴谋Tff2,Muc6,Muc5ac,Gif和Atp4a。细胞相对表达式表示目标记录用高强度的紫色色素。(C) t-SNE情节的胃上皮细胞从BALB / C, TxA23和小鼠热变形算法定义集群根据颜色识别。热变形、高剂量服用它莫西芬。
Muc6 + Gif +细胞在正常胃粘膜不是化生的血统
而无偏算法分析验证隔离方法和分析方法,我们使用这个数据集来解决特定的、有针对性的关于SPEM的本质问题。Muc6和Gif与语料库颈细胞和细胞(小鼠),分别。Coexpression这些蛋白质编码的记录与TFF2 /解痉的多肽表达有关immunofluorescent染色,因此用作SPEM的诊断标准。然而,在正常胃上皮分化,细胞被认为是来源于细胞谱系的颈部,表明Muc6 + Gif +“过渡”正常粘膜的细胞可能是一个特征。罕见的过渡细胞做出了深入分析与传统的组织病理学方法困难。使用我们scRNA-seq库,我们发现1635孔穴的细胞(Muc5ac +),400个颈部细胞(Muc6 + Gif−),2032首席细胞(Gif + Muc6−)和231过渡细胞(Muc6 + Gif +)在正常胃粘膜的BALB / c小鼠,和感兴趣的基因的umi被量化。Muc6脖子和过渡细胞中表达最高,表示只有在低水平在小数量的孔穴的兼细胞(孔穴的:0±0.02;颈部:28±1.8;首席:0±0.01;过渡:54±4.5)。Gif记录最多的主要细胞和过渡细胞与非常低的检测孔穴的和颈部细胞(孔穴的:1±0.1;颈部:1±0.1;首席:250±4.8;过渡:92±7.2)(图2 a, D)。关键问题在于过渡细胞,表达的满足SPEM标准Muc6和Gif同时,代表正常胃粘膜组织转化的细胞谱系。如果这是真的,这将意味着这些“化生的细胞是胃上皮细胞的正常功能,这也表明,细胞定位可以简单地扩展而不是派生通过分化期间应对急性和慢性的侮辱。TFF2 MUC6 + GIF +细胞表达的规范化病理SPEM的定义。来确定Muc6 + Gif +细胞中标识scRNA-seq库化生的表型,Tff2成绩单是量化的。每个细胞Tff2表达式是平均高出10倍的孔穴的细胞与其他细胞类型分析,只是在一小部分细胞分析,发现无论血统(孔穴的:2±0.1;颈部:29±4;首席:2±0.3;过渡:3±1.4)(图2 b, D)。除了Tff2表达、伤口愈合和肠道等记录Cd44,Dmbt1,雌性生殖道,Gkn3和Sox9与SPEM有关这些细胞发展异位表达由于细胞的改变计划,支持黏膜重建。13日22 45 46除了可以忽略不计Tff2表达式,分析确定的表达Cd44,Dmbt1, Gkn3和雌性生殖道在几乎所有的健康细胞分析检测不到,包括过渡细胞。这进一步支持了假设过渡细胞不正常胃粘膜化生的血统(图2 c, D)。有趣的是,虽然Sox9通常与伤口愈合和化生,umi这个记录被发现在低水平在所有细胞的一小部分测量子集。这些数据表明,Muc6 + Gif +过渡细胞存在于正常上皮不像由化生的基因表达,支持真正SPEM的想法需要异常基因表达计划中没有稳定状态,而不是简单的罕见的既存的细胞领域扩张。这些分析也强调这一点,虽然Muc6和Gif单独使用这一标准是SPEM表达的细胞,对于识别的损伤可能是有问题的,因为coexpression血统基因发生在正常粘膜的一个小子集化生的编程的细胞没有表现出其他转录功能。
Muc6 + Gif +细胞在正常胃粘膜不是化生的血统。1635年Muc5ac +孔穴的细胞,400Muc6 + Gif颈细胞,2032Gif + Muc6−首席细胞和231Muc6 + Gif +过渡细胞中确定单个细胞库BALB / c产生正常的胃黏膜。(一)细胞UMI项Muc6和Gif记录在Muc5ac +,Muc6 +,Gif +和Muc6 + Gif +人群。每细胞UMI (B)项spasmolytic-polypeptide /Tff2记录。每个细胞UMI (C)项SPEM-associated记录Dmbt1,Cd44,雌性生殖道,Sox9和Gkn3。(D)平均UMI表项表示基因在正常胃上皮细胞的数量。红色栏表示平均UMI计数细胞在每个细胞子集。意义确定未配对的学生的学习任务。Gif胃内因子;民大6,粘蛋白6;SPEM,解痉药polypeptide-expressing化生;Tff22,三叶草的因素;UMI,独特的分子标识符。
SPEM脖子和增生性/肥厚性粘液细胞培养在慢性炎症在转录难以区分
至此,SPEM细胞的研究一直主要使用细胞学执行标准包括immunofluorescent分析。它已经被描述,在慢性胃炎,观察到两个不同的蛋白表达模式:TFF2 + MUC6 + GIF +正则解痉的多肽(TFF2)表达化生(SPEM)和TFF2 + MUC6 + GIF−粘液细胞,缺乏成熟的首席细胞基因表达。除了不同的蛋白质表达模式,这些病变也由亮视场显微镜定性不同。18 27 47这个病态的区别是至关重要的,因为它已经提出,SPEM是一个潜在的前体的肠上皮化生和最终肿瘤变换,而增生/肥厚性颈细胞构成的风险尚不清楚。18然而,解决这些问题深入研究的两个细胞群一直使用传统的方法。对MUC6使用免疫荧光(GSII;绿色),GIF(黄色)和CD44v(红色),我们确定了增生性/肥厚性颈细胞(黄色箭头)和规范SPEM(红色箭头)的小鼠慢性胃炎胃语料库(n = 3每组的老鼠,图3一)。确定细胞的差异项目SPEM和增生性/肥厚性颈细胞之间,我们确认Gif Tff2 + Muc6 + +SPEM细胞和Tff2 + Muc6 + Gif颈细胞库细胞的慢性炎症的胃(在线补充图2一个)。然后生成新库包含转录数据只有这些细胞。
Gif +SPEM和Gif−颈细胞增生或肥大有类似化生的表型和转录概况。(A)代表亮视场和immunofluorescent显微照片的胃的健康BALB / c和慢性发炎TxA23老鼠在4个月大的时候。黄色箭头表示GIF−颈细胞增生肥大,红色箭头显示GIF + SPEM。n = 3老鼠每组。每细胞UMI (B)项metaplasia-associated记录Muc6,Gif,Tff2,Cd44,Dmbt1和Gkn3。红色栏表示的意思是UMI每细胞计数。意义决定使用Wilcoxon ranked-sum测试。(C)代表多色RNA原位杂交的荧光图像Tff2成绩单(黄色),Gif成绩单(青色)Muc6成绩单(红色)。高放大倍数的insets的白色箭头指示位置Gif +,Muc6 +和Tff2 +细胞。绿色框表示Gif-Muc6 + Tff2 +细胞,紫色的框表示Gif Tff2 + Muc6 + +规范SPEM与相应的高放大倍数的嵌入图像。(D)的平均数量的定量Muc6 + Tff2 + Gif -和Gif Muc6 + Tff2 + +细胞/高通滤波器。每个点代表细胞的平均数量,从三个HPFs分区计算一个鼠标的胃语料库。n = 5 - 6小鼠每组。决定使用一个未配对t测试学生的意义。(E)点的所有检测到的相对表达记录计算的每个细胞平均相对表达式从scRNA-seq数据集Gif +SPEM和Gif−颈部慢性化生细胞增生和肥大。Gif,胃内因子;高通滤波器,大功率领域;Muc6,粘蛋白6;SPEM,解痉药polypeptide-expressing化生;Tff2,胃内因子。
我们获得了每个细胞UMI SPEM-associated记录的记录数Muc6,Gif,Tff2,Cd44,Dmbt1和Gkn3在Gif +和Gif−化生细胞,与规范的期望Gif +SPEM细胞会为所有这些记录相对于更高的表达式Gif−颈细胞增生肥大。令人惊讶的是,这个初始的假设被拒绝的原因是,除了典型的成熟的主细胞转录的分离准则Gif表达式,这些细胞子集有相似的表达与化生的编程相关的记录,包括Muc6,Tff2,Cd44和Gkn3(图3 b)。有趣的是Dmbt1肠道成绩单,曾被用来表示先进SPEM导致肠上皮化生,22表达的是一个更高比例的吗Tff2 + Muc6 + Gif细胞相比,Gif +规范SPEM细胞。雌性生殖道和Sox9表达式也化验,但无显著差异雌性生殖道之间的表达式Gif +和Gif−观察子集。此外,没有协会Sox9SPEM细胞与正常细胞相比,在健康的图书馆,表明Sox9可能不是一个可靠的记录指定胃化生(数据没有显示)。这个目标已知SPEM-associated基因的分析表明,增生性/和SPEM发达肥厚性颈细胞异位基因表达规划与伤口愈合和肠相关特征。
大部分的开创性工作识别SPEM及其与组织修复和胃癌生成使用immunofluorescent染色。我们使用获得的信息从scRNA-seq测试新方法,RNAscope技术,识别Tff2 +SPEM的慢性炎症的胃。短暂,多路复用原位杂交进行使用荧光标记的互补的探针来检测Tff2(黄色),Muc6(红色)和Gif(青色)记录在健康(左)和慢性发炎(右)胃组织(图3 c)。正如所料,在健康胃语料库组织Tff2成绩单是局部的脖子以上地区,Muc6颈部区域Gif首席细胞腺底部,白色箭头所示。在健康的组织。这些记录没有重叠的染色。这支持使用Tff2记录检测颈细胞作为异常疾病过程的一个标志。然而,在胃慢性自身免疫性胃化生,腺体包含Gif Tff2 + Muc6 + +规范SPEM细胞包含矩形(紫色)和腺Tff2 + Muc6 + Gif -细胞(绿色矩形)被发现在距离彼此在胃粘膜。此外,许多腺体包含的混合物Gif +SPEM的腺和本地化的基地Tff2 + Muc6 + Gif−化生细胞isthmal /颈部区域。我们量化的平均数量Tff2 + Muc6 + Gif -和Gif Tff2 + Muc6 + +细胞在三个大功率领域(从五到六HPFs分区)健康和慢性炎症小鼠观察到,虽然没有colocalisation这些记录在健康小鼠胃,胃从慢性炎症小鼠显著增加这些细胞的平均数量/高通滤波器(Tff2 + Muc6 + Gif−:0±0 vs 111±29;Gif Tff2 + Muc6 + +:0±0 vs 12±4) (图3 d)。这些数据表明RNA-based RNAscope等技术可以用来识别SPEM原位表达的基础上Tff2记录。
最后,整个转录的相似性Gif +和Gif−Tff2 + Muc6 +化生是评估通过比较平均每个细胞表达水平的成绩单中发现Gif Tff2 + Muc6 + +单一的细胞库Tff2 + Muc6 + Gif−单个细胞库。除了Gif用作标准的子集的人群,几乎所有记录都是在相似的水平只有8个基因表达显著相关Gif +或Gif−化生(图3 e,在线补充图2 b)。虽然有一些潜在的重要的成绩单等Spp1(骨桥蛋白)和Gkn3(gastrokine-3)表达水平更高Gif +细胞,这种压倒性的转录重叠度显示Gif Tff2 + Muc6 + +SPEM和Tff2 + Muc6 + Gif−化生细胞最有可能代表一个人口的细胞操作同一个化生的计划Gif从细胞到细胞表达变化。这个结果表明SPEM的定义应该包括细胞不表达成熟细胞记录(如Gif在小鼠胃)。
化生的反应是守恒的,产生一种免疫调节表型在慢性炎症
SPEM已被证明开发针对急性损伤和慢性炎症。急性药物引起SPEM模型如热变形、l - 635和dmp - 777的理解对胃损伤的关键。17 18 21 22 33由于病因学和时间尺度的显著差异相比,药物引起的SPEM SPEM期间发生慢性炎症幽门螺杆菌感染和自身免疫,提出SPEM细胞出现在药物引起的损伤会明显的区别于那些在慢性炎症引起。27如果这是真的,它将对结果的解释和应用有着重要的意义来自急性药物引起SPEM模型。Immunofluorescent分析确定GS2 + / MUC6 +(绿色)和GIF +(黄色)SPEM细胞在两种药物(热变形)和inflammation-induced(自身免疫性)模型的胃损伤和SPEM用于生成scRNA-seq库(n = 3每组的老鼠,图4一)。确定药物引起SPEM显著不同从inflammation-induced SPEM,新库包含成绩单Tff2 + Muc6 + Muc5ac−SPEM细胞产生的热变形和慢性炎症的数据集。在这些分析中,Gif +和Gif−SPEM细胞结合成一个单一的图书馆,与前面的数据表明,除了Gif表达式,这些Tff2表达细胞没有明显的细胞谱系和所有满足扩大转录SPEM的定义(图3)。
化生的反应是守恒的,产生一种免疫调节表型在慢性炎症。Muc6 + Tff2 +化生细胞被确认在库生成的小鼠急性胃的高剂量tamoxifen-induced化生和小鼠慢性炎性化生。(A)代表亮视场和immunofluorescent inflammation-induced和药物引起的SPEM的图像。n = 3老鼠每组。每个细胞(B)项记录SPEM-associated记录Muc6,Gif,Tff2,Cd44,Dmbt1和Gkn3。(C)每个细胞记录计数与炎症相关的基因明显SPEM:H2-K1,H2-Eb1,Cd74,Reg3g和Chil4。每个点代表一个细胞。红色条指示的意思是UMI每细胞计数。(D)点的所有检测到的相对表达记录计算的每个细胞平均相对表达式从scRNA-seq数据集在药物和inflammation-induced SPEM细胞。Gif,胃内因子;Muc6,粘蛋白6;SPEM,解痉药polypeptide-expressing化生;2 Tff2,三叶草的因素;UMI,独特的分子标识符。
上述SPEM-associated成绩单的慢性和急性化生图书馆是量化。UMI记录项Muc6,Gif,Tff2,Cd44,Dmbt1和Gkn3表明,药物和inflammation-induced SPEM有类似的这些基因的表达水平(图4 b)。这表明,即使是在慢性炎症环境中时间尺度,化生的基因表达计划这些截然不同的有害刺激之间是高度保守的。然而,基因,使上皮细胞参与免疫反应等H2-k1,H2-eb1,H2-Ab1,Cd74,Bpifb1和B2m被上级表达炎性SPEM细胞(图4 c)。最后,每个细胞的平均表达之间的所有检测记录药物和inflammation-induced SPEM细胞相比,单个细胞库是为了确定转录的相似项目。这些分析显示一个高度相似的表达模式在几乎所有检测到的基因保存了40成绩单中确定差异表达的数据集在很大程度上如此。几乎所有的相关差异表达成绩单是inflammation-induced SPEM图书馆,赋予细胞调节的能力和参与免疫反应(图4 d, E;在线补充图3)。这些数据表明SPEM计划是守恒的,即便煽动损伤显著变化(即三天热变形处理和3月胃炎)但这inflammation-induced SPEM发展除了SPEM基因表达的免疫调节功能。
讨论
胃语料库的细胞成分包括几个不同的上皮细胞谱系;每个有助于整个胃的功能单位。这种细胞的异质性使得胃语料库研究细胞生物学在后勤方面的困难,影响一个细胞类型可以很容易地使用器官时错过了溶解产物方法结合免疫印迹技术,存在和批量RNA-seq。随着scRNA-seq,现在可以隔离,识别和研究,成千上万的人胃上皮细胞,一个重要的发展技术,如激光捕获显微解剖。在这里,我们开发了适应方法最初分析蛋白表达胃上皮细胞的流式细胞仪,43我们成功地孤立RNA从单一细胞悬浊液使用铬单一细胞平台。最初的无监督分析证明了这种技术在识别成熟和化生的(SPEM)胃上皮细胞谱系。这个手稿SPEM的焦点时,我们观察到subclusters在正常上皮细胞组织,特别是在壁细胞集群的一群细胞放置一些距离剩下的集群。这表明多个壁细胞表型的可能性,或许表明一个独特的转录的激活项目相比,这组与主集群。作为进一步的点,我们使用这种技术来调查整个健康语料库图书馆的存在Muc6 + Gif +细胞可能代表一个化生的利基,可以扩大而不是分化期间受伤。虽然我们确实发现一小部分细胞满足这些标准,他们显示没有SPEM的其他特性项目。目前还不清楚这些“过渡”细胞是否可以开发一个SPEM表型,但这无疑需要重组的稳态条件受伤害的存在和/或炎症。
这项研究集中在SPEM应对药物引起的热变形造成的损害和慢性炎症的胃的主体区域。人们普遍认为SPEM的发展是至关重要的修复胃粘膜溃疡等急性损伤的事件。这些增殖细胞重建受伤的组织,在切除侮辱,恢复到完全分化上皮血统。13 48然而,在发生慢性non-resolving胃损伤,如自身免疫引起的炎症或感染,这些SPEM细胞没有恢复和增生性炎症环境中自然会增加突变的风险负担和最终肿瘤转变。11 49鉴于这些细胞的潜在关键关系胃癌风险,各种急性和慢性模型系统开发研究老鼠SPEM反应增加了这种细胞的集体理解项目,但一直存在争议的解释结果。在这些研究中,我们使用scRNA-seq分析工具来解决涉及SPEM的重大问题。
我们解决一个主要问题是如何规范SPEM的手机计划(Gif Tff2 + Muc6 + +SPEM)不同于另一个出现在慢性炎性细胞谱系胃损伤(Tff2 + Muc6 + Gif -细胞)。这个问题尤为重要,因为关注规范SPEM的病变的关键推动组织修复和赋予转换最终癌变的风险更高。18 19然而,我们试图确定SPEM和之间的关键差异转录计划Tff2 + Muc6 + Gif -细胞表明Gif +和Gif - Tff2从转录的角度表达粘液性细胞都几乎无法分辨。这表明,Gif−颈细胞增生和肥大的运营基础转录计划一样Gif +SPEM,成熟的表达主要细胞记录(Gif在小鼠胃)建立原型并不表示重要的转录差异。
除了scRNA-seq分析,我们还发现了RNA转录原位使用多路复用荧光原位杂交本土化Tff2,Muc6和Gif记录胃粘膜的健康和长期发炎语料库。表达这些记录在胃的健康的胃是局限于区域单位,没有观察到重叠,支持使用Tff2记录异常的标记细胞的过程Muc6 +细胞。在病变胃,意义重大Tff2和Muc6costaining贴上整个腺,而只有微弱的Gif信号检测腺底部,表明一个非常低的水平Gif相对于健康的主要细胞表达。此外,规范Gif +SPEM和Tff2 + Muc6 + Gif -细胞被点缀在个人和腺体相邻的语料库。鉴于这一事实Gif +和Gif——化生细胞有一个压倒性的重叠基因转录谱和他们的物理位置在胃内单位,不太可能Gif描绘了一个独特的族群化生细胞表达。可想而知,也许Gif表达逐渐失去了在SPEM的发展Gif +细胞是简单的一个子集Tff2 + Muc6 +SPEM的细胞没有减少主细胞基因表达水平以下的检测。已经有相当多的争议是否SPEM源自首席或isthmal祖细胞终末分化。19日27日50 51在这里详细研究不能确定SPEM的细胞起源,它们显示生成的细胞表型上不能轻易分离成独特的团体基于主细胞基因表达。相反,SPEM的定义应该扩展到包括细胞缺乏成熟的主细胞记录。这个发现可能产生至关重要的影响考虑到许多immunofluorescent SPEM的定义会忽视“颈细胞增生或肥大”作为一个重要的危险因素细胞必须评估前进。最后,这些数据表明识别Tff2转录表达是至关重要的胃化生的身份在将来的研究中。
解决最终的问题是SPEM因急性药物引起萎缩模型如热变形超过几天确实是由相同的项目SPEM开发炎症环境中在过去的几个月是鼠幽门螺杆菌感染模型和TxA23老鼠。17 20 27 29 30 33 52这个问题特别重要,因为大多数人类SPEM的上下文中出现慢性炎症,而机械的数据在小鼠模型依赖于急性和慢性的组合模型。我们解决这个通过识别SPEM细胞(Tff2 + Muc6 + Muc5ac−)出现在单个细胞库生成的药物(热变形)和inflammation-induced SPEM的(TxA23)模型和比较他们的转录计划。重要的是,SPEM基因表达之间几乎相同的药物和inflammation-induced SPEM细胞。这种不寻常的相似度表明,尽管药物SPEM出现在三天时间内,inflammation-induced SPEM / 4个月在炎症环境中,细胞在两种设置操作基于SPEM计划,几乎是无法区分的。最重要的是,这意味着一般细胞过程参与生成SPEM细胞是守恒的药物和炎症之间的上下文,允许一个更自信的解释研究涉及这些研究SPEM的关键工具。这也提供了额外的支持SPEM的观念是一个损伤急性期反应,维持在慢性异常的场景。类似于之前的研究,使用laser-capture SPEM的慢性炎症和药物损伤模型之间的显微解剖,53我们发现了一些这两个目的基因表达差异。然而,尽管这些研究发现了一个更“intestinalised”在慢性发炎SPEM病变表型,调节基因的确定在我们scRNA-seq实验参与抗原处理和表示细胞的适应性免疫反应。这不同的结果可能是由于我们观察到的重要的细胞间变异性肠道scRNA-seq转录表达,这将使显微解剖数据基于病变。此外,慢性发炎胃组织中使用的研究进展为12个月,而不是4个月TxA23老鼠用在这里。无论如何,这里的基因表达模式识别表明能力参与和潜在的直接免疫反应,观察SPEM至关重要,因为最常见的原因在人类患者慢性感染和自身免疫。支持这个假说是最近发现的免疫调节蛋白的表达是一种炎症性上皮反应幽门螺旋杆菌感染,它可以保护这些细胞的免疫反应。54了解转录的inflammation-induced SPEM为正在进行的努力提供燃料的机械化理解细胞损伤和修复的复杂系统,发生在人体组织。
总体而言,这些数据支持这样的结论,SPEM是一个高度保守的转录计划中没有正常稳态粘膜。结果表明,应扩大到包括SPEM的定义Tff2transcript-expressing细胞缺乏成熟的首席细胞基因表达在慢性炎症。此外,化生的反应药物损伤和炎症是高度相似,发展一个并发炎症SPEM转录概况,使参与免疫反应可能发挥作用在调节下游事件如intestinalisation、发育不良和致癌作用。
确认
作者要感谢约瑟夫Burclaff和杰森钢厂寻求帮助和建议在大剂量服用它莫西芬治疗的老鼠。我们还要感谢圣路易斯华盛顿大学基因组技术访问中心和麦克唐奈基因组研究所援助10 x基因铬单一细胞RNA隔离和Illumina公司测序。此外,我们要感谢Kolar格兰特:博士,芭芭拉·内格尔和卡洛琳墨菲圣路易斯大学研究显微镜和组织学的核心寻求帮助与荧光显微镜分析和乔尔·C Eissenberg博士的批判阅读手稿。
脚注
出租车和萨尔同样起到了推波助澜的作用。
贡献者出租车是负责研究概念和设计,采集的数据,分析和解释数据,起草的手稿和修订手稿。萨尔负责分析和解释scRNA-seq数据集,起草的手稿和修订手稿。金知云尽情负责解释和修订的数据的手稿。CNN和NMJ协助数据采集、解释和修订手稿。精灵获得数据和提供技术支持。梁柱节点参与研究的概念和设计,分析和解释数据和修改最后的手稿。RJD获得资金,参与研究的概念和设计,数据的解释和修订手稿。
资金出租车是由国立卫生研究院(NIH) /趋势NRSA博士前的奖学金(+ 30 DK118873)。RJD支持由美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(R01 DK110406)。RJD以前由美国癌症协会(显示- 12 - 171 - 01 - lib)和美国胃肠病协会Funderburg奖。
相互竞争的利益没有宣布。
病人同意出版不是必需的。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
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作者注文本分析:数据库链接将提供验收。