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摘要
客观的食物的摄入通常会刺激饱腹感和刺激胰岛素的肠道激素的释放，如胰高血糖素样肽(GLP)-1。这种反应在肥胖的胰岛素抵抗者中减弱，但在Roux-en-Y胃旁路手术(RYGB)后迅速恢复。我们假设这是RYGB手术后小肠黏膜解剖重排后发生代谢变化的结果，并旨在确定这种机制。
设计从接受RYGB手术的患者中提取空肠黏膜活检在极低卡路里饮食前后，手术时和术后6个月。用蛋白表达分析和蛋白印迹法对样品进行分析。在小鼠和肠内分泌细胞(EECs)原代小鼠空肠细胞培养物中研究了这些发现的生物学功能。
结果RYGB后发现的最显著变化是空肠中限速生酮酶线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶(mmgc)的表达下降，酮体水平下降证实了这一点。在小鼠中，长时间高脂喂养可诱导空肠mmhgcs的表达和功能性酮生成。酮体对EECs肠道肽分泌的影响显示，与基线相比，对GLP-1释放有~ 40%的抑制作用。
结论高脂饮食诱导肠酮生成，RYGB手术抑制肠酮生成。在细胞培养中，酮体抑制了eec中GLP-1的释放。因此，我们认为这可能是一种机制，通过RYGB可以消除酮体对EECs的抑制作用，从而恢复EECs的反应性，导致术后餐后GLP-1水平增加。
- 肥胖手术
- glucagen-like肽
- 小肠
- 糖尿病
- 肠上皮细胞生物学
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
Roux-en-Y胃旁路手术治疗肥胖对糖代谢有快速、非体重依赖性的影响，不能仅用围手术期饥饿来解释。
新的发现是什么?
长时间高脂喂养诱导的肠酮生成可能是肥胖受试者术前GLP-1反应减弱的机制。胃旁路手术后，这一机制可能通过抑制肠酮生成而缓解，促进术后GLP-1反应的快速改善。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这可能是药物靶向肠酮生成，从而抵消肥胖的糖尿病效应，而不需要胃旁路手术。
介绍
Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)长期治疗病态肥胖和2型糖尿病有效。1体重减轻本身是改善代谢状态背后的一个重要因素，但RYGB也激活术后早期体重独立机制，例如，进餐诱导的肠肽释放。2 3这种RYGB相关效应突出了消化道在全身代谢中解剖重构的作用。因此，我们使用RYGB作为模型，试图在小肠近端发现新的肠道相关机制，以改善葡萄糖代谢。
在RYGB之后，前中肠空肠变成在食道-胃交界处与30毫升胃袋相吻合的消化肢。食物必须通过1.5米在消化肢体空肠-空肠吻合开始酶消化。消化肢空肠黏膜的形态出现了令人惊讶的小变化。4个5然而，功能研究表明，消化障碍的消化肢体不能吸收腔内葡萄糖。6 - 8显然，它经历了从血液循环吸收葡萄糖的诱导，可能具有降低血糖的效果。8 9很可能是胆汁、胃和胰腺脂肪酶对甘油三酯的预处理不足。因此，食物的消化和营养的吸收主要局限于空肠和回肠的远端。未消化的食物对远端小肠内肠内分泌细胞(EECs)的刺激增加被认为是导致肠内分泌肠肽(如胃抑制肽、YY肽和胰高血糖素样肽-1 (GLP-1))释放增加的主要机制。作为另一种理论，有人认为，防止近端胃肠道接触食物可以抑制迄今未知的“抗肠促胰岛素”因子的释放，这种因子会减少胰岛素释放或降低胰岛素敏感性，它的消失可以解释RYGB手术后肠道肽释放和葡萄糖代谢的迅速改善。9日10本研究旨在寻找RYGB后这种新的降血糖机制。
材料和方法
手术和病人
患者试点研究队列的人体测量学特征显示在表1．蛋白质组学队列中的患者要么接受了初级RYGB(4例)，要么从垂直带状胃成形术转换为RYGB(3例)。在确认队列中，包括9例患者，其中8例接受了初级RYGB, 1例接受了垂直带状胃成形术到RYGB的转换。在饮食队列中，招募了12名患者，在RYGB手术前开始2周极低热量饮食(VLCD)前进行粘膜采样。如前所述，提取样本。5简而言之，在RYGB手术中，为了研究目的，在胃-肠造口和空肠-空肠造口之间的-环被分割，形成最终的Roux-en-Y结构(在Treitz韧带远端50-60 cm处的空肠被取出几厘米(在线补充图1A左面板)。用锋利的剥离术将粘膜/粘膜下层与肌肉组织分离。在饮食队列的术前和所有队列的术后6-8个月，患者接受了空肠/Roux肢体的内窥镜检查，以提取粘膜样本(在线补充图1A右面板)。所有的内窥镜检查都是为了研究目的进行的。粘膜组织标本在液氮中速冻，并在- 70°C冷冻。在这些试点研究中，纳入的患者数量是基于对全球蛋白质组学分析中样本量可行性的估计。确认性样本来自所有术前、围手术期和术后样本都可获得的队列。
人空肠黏膜整体蛋白表达分析
该技术已在前面介绍过。11只有在所有患者中发生持续变化且与基线相比至少发生50%变化的蛋白质才被纳入进一步分析。
动物研究
4 ~ 5周龄雄性C57BL/6J小鼠购自Harlan (Horst, The Netherlands)。动物在控制温度(23℃)和光照(06:30-18:30小时开灯)下饲养，自由获得水和颗粒状食物(R34 Lactamin, Kimstad, Sweden)，营养含量为g%:脂肪4%，蛋白质16.5%，碳水化合物58.0%;总发热量:3千卡/克。从6 ~ 8周龄开始，小鼠分别饲喂高脂饮食或低脂饮食(LFD) 3周或3个月。HFD包括颗粒状食物(Surwit糖尿病致鼠饮食，D12309;研究饮食，New Brunswick, New Jersey, USA)，其营养含量为g%:脂肪35.9%，蛋白质23%，碳水化合物35.5%;总热值:5.6千卡/克。LFD组继续接受正常饮食(R34)。
在第一组实验中，小鼠分别在LFD或HFD和小肠不同部位喂养3周后被处死;取十二指肠(近端3厘米)、空肠(中端3厘米)和回肠(远端3厘米)以及肝脏。肠壁和一个肝叶的全层样本在液氮中速冻(−70°C)，以便稍后通过Western blotting分析蛋白表达(见下文)。
在第二组实验中，小鼠分别饲喂LFD或HFD 3个月。在研究当天，实验前将食物移出45分钟，以同步喂食状态。实验开始时，灌胃以250 μ L的内脂质(大豆油200 mg/mL，纯化的蛋磷脂，甘油，氢氧化钠，水;给予Fresenius Kabi，瑞典)，其中包含两种载体(20µL乙酸乙酯)，2.5 mg线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶(mmgc)抑制剂hymeglusin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA;溶解在载具中)或25毫克β-羟基丁酸盐(βHB，西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州;溶解在车辆)。在15,30或120分钟，从尾部提取静脉血样本，并使用GlucoMen LX β-酮传感器(a . Menarini Diagnostics, florence, IT)分析βHB。
在第三组实验中，小鼠在实验开始前禁食6小时，并保持低脂或高脂饮食3周。然后灌胃500µL的脂内(Fresenius Kabi)， 90 min后用异氟醚麻醉小鼠。进行剖腹手术，确定门静脉，用细针穿刺并采集血液。同时从眼睛抽取外周血样本。血液样本离心制备血清。使用酶铬酮体检测试剂盒(BioAssay Systems, Hayward, California, USA)分析血清中的βHB。
活检均质，Western blotting和βHB定量
对于所有人类队列和所有小鼠冷冻空肠粘膜标本，组织样本的制备如前所述。11对于每个检测到的波段，密度被量化，并表示为同一薄膜上特定大小的所有波段的总密度的百分比。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为加载对照。抗体看到在线补充表1．
为了进行βHB定量，使用βHB比色测定试剂盒(开曼化学公司，美国密歇根州安娜堡)对“饮食队列”中rygb前后的组织匀浆进行分析，并将结果归一化为匀浆蛋白含量。
人空肠黏膜组织学
从rygb前后患者(n=5，从确认队列中随机选择)中提取空肠粘膜标本，按照组织学标本制备的标准程序进行处理。简单地说，活检组织被固定在4%的磷酸盐缓冲甲醛中，脱水并嵌入石蜡中。包埋活检切片取5个µm切片。对于免疫荧光，切片再水化，提取抗原，切片在5%正常山羊血清中阻塞(31872,ThermoFisher Scientific, Rockford, Illinois, USA)，然后在4°C与一抗孵育过夜。洗净载玻片，室温下与二抗孵育2小时，用Hoechst染色(H6024, Sigma-Aldrich)反染色。抗体看到在线补充表1．以阻断缓冲液代替一抗的切片作为阴性对照。一般组织学按照标准程序进行H&E染色。
小鼠空肠原代培养及GLP-1分泌的定量研究
如前所述，空肠原代培养物来自C57BL6背景的小鼠。12简单地说，分离小肠中间10-15 cm区域，消化并分离隐窝。隐窝在matrigel包被的24孔板上，高糖DMEM添加10% FBS, 2 mM l-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素，10µM Y-27632。电镀后第二天，用生理盐水分泌缓冲液(138 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 4.2 mM NaHCO)冲洗细胞3.， 1.2 mM NaH2阿宝4， 2.6 mM CaCl2， 1.2 mM MgCl2， 10 mM HEPES和0.1% BSA, pH 7.4)与1 mM葡萄糖30分钟。第一个小时在含有1mm葡萄糖的分泌缓冲液中孵育，收集上清，第二个小时用含有不同添加剂的分泌缓冲液替换:10mm葡萄糖+0.1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)， 10mm葡萄糖+0.1 mM IBMX +10 mM βHB, 10mm葡萄糖+0.1 mM IBMX +0.1µM生长抑素。上清在4℃下离心5分钟，1000 g，以去除任何细胞碎片，并直接速冻，直到分析。分析样本的GLP-1总量(美国马里兰州罗克维尔中尺度发现)，数据归一化到同一井第一个小时的分泌。使用百日咳毒素(PTX, 500 ng/mL)时，在细胞电镀后4-5小时添加到细胞中，在开始分泌实验前允许16小时预孵育，并在分泌实验中纳入。
患者和公众的参与
公众和患者均未参与本研究的设计、招募或实施。
统计分析
学生t检验用于分析蛋白质组学分析二维凝胶电泳斑点强度中蛋白质水平的统计变化。采用双向方差分析(ANOVA)和Tukey诚实显著差异(HSD)检验对GLP-1分泌数据进行分析。配对的人类数据采用非参数Wilcoxon符号秩检验，未配对的小鼠数据采用非参数Mann-Whitney U检验。所有统计均使用Prism 7和8 (GraphPad, La Jolla, California, USA)进行。如无特别说明，则以图表示平均值和SEM。
结果
RYGB降低空肠mmhgcs蛋白表达
进行个体内整体蛋白表达分析，以确定术中和术后6-8个月提取的人空肠黏膜活检的蛋白质组的变化。总共有27个蛋白质点对应12个独特的蛋白质通过了选择标准(单向的，在RYGB之后比基线至少受50%的调节)。下调最强的4个蛋白点(平均减少−3.8倍;p<0.001)后的RYGB经串联质谱鉴定为mhmgc。二维凝胶电泳的代表性图像如图所示在线补充图1B．用这种蛋白质组学方法鉴定的其他蛋白质以前也发表过。11日13所有调控蛋白的列表显示在在线补充表2．
证实手术相关的粘膜mmhgcs和酮体水平降低
使用与全球蛋白质组学分析相同的样本，Western blotting证实mhmscs的减少(图1一个；由于剩余体积不足，蛋白质组学分析中的一个样品不得不被省略)。对证实性患者队列进行了blotting分析，显示RYGB (图1 b)．所有队列的特征显示在表1．在术前进行了2周VLCD的禁食患者和RYGB后6-8个月的相同患者的围手术期样本中测量空肠黏膜酮体βHB水平。术后水平明显降低(图1 c；peri-RYGB vs post-RYGB;意味着±扫描电镜;70.5±4.7 vs 39.3±2.2 μ M/µg蛋白，n=11;p < 0.001;由于技术上的困难，一个样品不得不被省略)。
Western blot分析rygb前后空肠mmhgcs蛋白的表达。(A)上图显示的是来自患者蛋白质组学队列(n=6)的空肠样本中mhmscs的Western印迹。相邻的样本代表来自同一患者的围手术期(上面的白色条)和术后(上面的灰色条)样本对。GAPDH作为加载控制，如下图所示为每个对应的mhmgc波段。下面板显示mmhgcs归一化后的GAPDH在rygb前后的密度测量。(B)上图显示RYGB患者RYGB前后确诊队列空肠样本中mhmscs的Western blot (n=9)。来自多个Western blots的组对被合并以呈现所有对。下面板显示mmhgcs归一化后的GAPDH在rygb前后的密度测量。(C)同一患者(n=11)在术前2周VLCD和术后6-8个月RYGB手术后测定人空肠黏膜样品中的酮体βHB。(D) 1例患者围手术期的mhgcs免疫荧光(E) RYGB术后6个月的mhgcs免疫荧光。 (F) and (G) show corresponding H&E stainings to panels (D) and (E), respectively. Statistical analyses were performed using Wilcoxon signed-rank test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. +ve, positive control. ADU, arbitrary densitometric units; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; mHMGCS, mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase; RYGB, Roux-en-Y gastric bypass.
mhmgc定位于人空肠表面上皮层
为了研究mmhgcs的表达形态，我们对RYGB术后围术期和术后样本进行了免疫染色(n=5个样本对，从确认队列中随机选择)。mmhgcs免疫染色定位于上皮细胞，表明主要表达于肠细胞。RYGB 6个月后，所有调查标本对mhmgc的免疫反应性较低或无，从而支持蛋白质组学和印迹分析的半定量结果。图1 d示1例患者围术期和术后mmhgcs染色的代表性图像。
粘膜mmhgcs的减少是手术特有的，并没有因术前VLCD而减少
对VLCD术前、术中和术后饮食队列中提取的黏膜样本进行印迹分析，证实mhmscs的减少与手术有关(图2一个；pre-VLCD vs后vlcd /peri-RYGB vs后rygb;意味着±扫描电镜;1.53±0.18 vs 1.32±0.19 vs 0.31±0.06;n = 12)。脂质代谢标志物CPT1A (图2 b；意味着±扫描电镜;0.91±0.11 vs 1.49±0.15 vs 0.83±0.09;n = 12), FATP4 (图2 c；意味着±扫描电镜;0.82±0.11 vs 1.38±0.16 vs 1.00±0.10;n=12)和DGAT1 (图2 d；意味着±扫描电镜;0.67±0.15 vs 2.24±0.33 vs 0.51±0.09;n=12)显示，饮食前和手术后提取的样本没有变化，但VLCD后表达增加。酮体利用酶琥珀酰辅酶a -3-草酸辅酶a转移酶(SCOT)在VLCD后增加，但术后与基线相比无变化(图2 e；基线vs VLCD vs RYGB;意味着±扫描电镜;0.93±0.08 vs 1.49±0.19 vs 0.77±0.08;n = 12)。
Western blot分析空肠mmhgcs和一些脂肪代谢相关蛋白的vlcd前，vlcd后/ rygb周围和rygb后的饮食队列患者(n=12)。上图显示(A) mhmgc， (B) CPT1A， (C) FATP4， (D) DGAT1和(E)酮体分解酶SCOT的Western印迹。在每个面板中，有代表性的蛋白带来自三个患者的感兴趣的蛋白质和相应的负荷控制GAPDH显示。相邻样本分别代表同一患者的vlcd前(Western blots上方的白色条)、vlcd后/ perio - rygb后(灰色条)和rygb后(黑色条)样本。在下方的面板中，每个感兴趣的蛋白的表达已经归一化到加载控制GAPDH中，并在柱状图中显示。统计分析采用Wilcoxon符号秩检验。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。ADU;任意密度测量单位。GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶; mHMGCS, mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase; CPT1A, carnitin-palmitoyl-transferase-1A; DGAT1, diacylglycerol O-acyltransferase 1; FATP4, long-chain fatty acid transport protein 4; SCOT, succinyl-CoA-3-oxaloacid CoA transferase; RYGB, Roux-en-Y gastric bypass; VLCD, very-low-calorie diet.
小鼠肠道mhmgc的表达是脂肪敏感的，最明显的在空肠
为了证实其诱导作用并进一步研究小肠粘膜mhmgc蛋白的潜在功能，我们采用动物实验。C57bl/6J小鼠分别饲喂LFD或HFD 3周。HFD小鼠的体重增加明显高于LFD小鼠(体重增加LFD vs HFD;意味着±扫描电镜;0.94±0.23 vs 5.84±0.53 g, n=8, p<0.001)。对十二指肠、空肠、回肠和肝脏的粘膜标本进行mmhgcs的Western blotting。LFD组和HFD组小鼠十二指肠中mhmscs的表达无差异(图3一；最晚完成日期和HFD;意味着±扫描电镜;1.10±0.23 vs 1.35±0.18,n=6, p=NS)。然而，在空肠观察到mhmgc蛋白的表达(图3 b；最晚完成日期和HFD;意味着±扫描电镜;0.59±0.03 vs 1.43±0.20,n=5, p<0.01)和回肠(图3 c；最晚完成日期和HFD;意味着±扫描电镜;HFD术后0.84±0.06 vs 1.18±0.09,n=6, p<0.05)显著高于LFD。空肠和回肠之间mhmscs表达的比较显示，HFD后空肠中mhmscs的表达水平显著升高(图3 d；空肠和回肠;意味着±扫描电镜;1.39±0.13 vs 0.70±0.06,n=5/6, p<0.01)。肝脏中mhmscs表达有所增加(图3 e；最晚完成日期和HFD;意味着±扫描电镜;0.87±0.04 vs 1.15±0.07,n=6, p<0.01)。
Western blot分析低脂饮食(LFD;与高脂饮食(HFD;上面的灰色条形图)对mhmgc蛋白表达的影响。上图显示LFD或HFD时C57BL/6J小鼠(A)十二指肠、(B)空肠、(C)回肠、(D)空肠与回肠和(E)肝脏中mhmscs的表达。GAPDH作为加载控制，如下图所示为每个对应的mhmgc波段。下方的面板显示了mhmgc与GAPDH对应的密度量化结果。注意(D)显示HFD喂养的小鼠空肠(浅灰色BAR)和回肠(深灰色BAR)中mhmscs的比较，以说明空肠和回肠之间表达水平的差异。(F)测定LFD或HFD喂养3个月的小鼠静脉血中0、15、30和120 min时βHB的变化。在实验之前，小鼠被给予口腔脂肪负荷(250 L的脂内)，以提供酮生成的底物。在一些小鼠的口腔脂肪负荷混合了βHB，或mmhgcs抑制剂胶凝素，如所示。 (G) shows the measurements from (F) at 120 min in a scatter plot (n=7–8). βHB levels in venous blood were significantly higher in the HFD mice 120 min after oral gavage compared with LFD mice. Notably, the βHB levels in HFD mice pretreated with the mHMGCS-inhibitor hymeglusin did not increase. (H) Mice fed HFD for 3 weeks had significantly higher levels of ketone bodies in portal vein blood normalised to ketone bodies in peripheral blood, in contrast to mice fed LFD (n=9) after oral gavage with Intralipid (500 µL). (I) Absolute levels of ketone bodies (mM) in peripheral and portal blood in the same mice as in panel H (n=9). Statistical analyses were performed using Mann-Whitney U test. *p<0.05 and **p<0.01. +ve; positive control; ADU, arbitrary densitometric units; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; mHMGCS, mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase.
hfd喂养的小鼠脂内灌胃导致门脉血酮水平升高
为了检测HFD诱导小鼠空肠mmgcs表达的功能，我们评估了门静脉和外周静脉血βHB的水平。C57bl/6J小鼠分别饲喂HFD或LFD 3个月，以强烈诱导mhmscs表达。小鼠灌胃脂内脂后，于不同时间从尾(图3 f)．与LFD小鼠相比，HFD小鼠在120min后βHB水平升高(图3 g；最晚完成日期+ intralipid vs HFD + intralipid;意味着±扫描电镜;0.50±0.08 vs 0.87±0.10 mM, n=7, p<0.05)。在给予mmgcs抑制剂hymeglusin灌胃的HFD小鼠中没有这种增加(图3 g；HFD + intralipid vs HFD + intralipid + hymeglusin;意味着±扫描电镜;0.87±0.10 vs 0.46±0.06 mM, n=7, p<0.01)。饲喂LFD的小鼠在灌胃后120 min内未见βHB水平明显升高，即使在灌胃中添加外源性βHB也未见明显升高(图3 g；最晚完成日期+ intralipid +βHB vs HFD + intralipid;意味着±扫描电镜;0.36±0.08 vs 0.87±0.10 mM, n=8/7, p<0.01)。在另一项实验中，我们检测了喂食LFD或HFD 3周的小鼠门静脉和外周静脉血中的βHB水平。与LFD小鼠相比，HFD喂养的小鼠在恢复到外周血(门静脉/外周血)水平时门静脉βHB的基线水平显著高于LFD小鼠(图3 h；LFD门户/周边vs HFD门户/周边;意味着±扫描电镜;0.62±0.04 vs 1.02±0.10,n=9, p<0.01)，表明βHB的主要来源在LFD和HFD之间转移;大部分来自肠道而不是肝脏。HFD组门静脉血βHB的绝对水平也显著高于LFD组(图3我；LFD门户vs HFD门户;意味着±扫描电镜;1.35±0.14 mM vs 3.82±0.89 mM, n=9, p<0.05);而外周血水平无显著差异(图3我；LFD周边vs HFD周边;意味着±扫描电镜;2.20±0.22 vs 3.47±0.65 mM, n=9, p=NS)。在LFD动物中，门脉血βHB水平明显低于外周血(图3我；LFD外围设备vs LFD门户;意味着±扫描电镜;2.20±0.22 mM vs 1.35±0.14 mM, n=9, p<0.01)，而HFD动物则不同(图3我；HFD外围设备vs HFD门户;意味着±扫描电镜;3.47±0.65 mM vs 3.82±0.89 mM, n=9, p=NS)。这些数据表明，LFD和HFD饲喂的差异是增加了肠道βHB的产生，而不是减少肝脏βHB的产生。
酮体抑制小鼠小肠eec葡萄糖刺激的GLP-1释放
在小肠eec上有两种已知的脂肪酸/酮受体表达。FFAR3/GPR41优先表达于人和小鼠小肠EECs, GPR109a表达水平较低。14日15因此，我们测试了酮体是否会影响EECs的肠肽释放。用小鼠空肠原代培养物测定βHB对基础、葡萄糖刺激和ibmx刺激下肠肽GLP-1释放的影响。βHB水平的选择是基于人空肠黏膜中βHB的近似摩尔浓度(图1 c)．假设2 mm钳活检样品6µL圆柱形体积的三分之一为粘膜，在βHB试验中缓冲液稀释至30µL，因此总共稀释了15倍。空肠样品中测得的βHB平均水平为0.8 mM。在15倍稀释的情况下，这应该反映在体内的组织浓度约为12毫米。我们决定使用10 mM浓度的βHB，并发现它抑制葡萄糖/ ibmx刺激的GLP-1释放43% (图4一；IG+10 mM βHB与IG与基底比较)。生长抑素的抑制作用更强，完全阻断葡萄糖/IBMX (图4一)．因为FFAR3和GPR109a是Gα我我们检测了βHB的阻断作用是否通过Gα我用PTX处理细胞培养物的信号。PTX治疗消除了βHB对葡萄糖/ ibmx刺激对GLP-1释放的抑制作用(图4 b)．如预期的那样，PTX也阻断了生长抑素的作用(图4 b)．虽然这些数据没有明确证明FFAR3介导βHB的抑制作用，但它们确实表明了Gα我耦合的受体。
(A)用10 mM葡萄糖/0.1 mM IBMX (IG;或10 mM葡萄糖/0.1 mM IBMX和10 mM βHB的组合(左三)，或10 mM葡萄糖/0.1 mM IBMX和0.1µM生长抑素(SST)的组合(左四)。(B)与a组设置相同，但所有组均用500 ng/mL PTX处理，以阻断Gα我信号。不同的符号描述了空肠原代培养物的复制。统计分析采用双向方差分析，然后采用Tukey 's hsd检验。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。GLP-1, glucagon-like peptide-1;PTX、百日咳毒素。
提出了机械模型
图5显示了HFD剂量依赖性如何抑制葡萄糖刺激的肠肽释放的拟议机制模型，例如来自EECs的GLP-1。慢性脂肪暴露可诱导空肠上皮细胞mmhgcs表达增加和酮生成图3B, F-I和1C)．酮体(βHB)以细胞旁的方式通过绒毛微循环到达EECs，作用于FFAR3抑制GLP-1的释放(如图4)．RYGB手术可能通过立即去除FFA作为酮生成底物的可及性，以及下调空肠mmgc表达和βHB来抑制这一机制(如图1A至C)，从而减轻酮体对EEC肠泌素产生的抑制作用。
拟议的酮体作用于产生GLP-1的肠内分泌细胞(EECs)的机制示意图。长期接触游离脂肪酸(FFA)可诱导绒毛末端空肠上皮细胞mmgc表达和βHB产生增加。βHB通过绒毛静脉微循环到达EECs，通过FFAR3/GPR41起作用，抑制GLP-1的产生/释放。RYGB手术可能通过降低FFA可用性和mmhgcs表达来干扰这一机制。GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶;GLP-1, glucagon-like peptide-1;mhmgc，线粒体3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶;RYGB, Roux-en-Y胃旁路手术。
讨论
关于限速生酮酶mhmgc在人小肠黏膜中的表达的报道很少。16我们发现，RYGB手术本身，而不是热量摄入的减少，导致mhmgc表达和空肠酮体(βHB)水平的大幅下降。术后酮体表达和酮体产生减少可能有多种原因。例如，由于胆汁和胰腺脂肪酶偏离消化肢体而导致的脂解减少可能导致底物不可用。另一个原因可能是在RYGB后空肠消化肢发生肥厚后，用于合成代谢目的的脂质利用增加或用于能量需求的脂质氧化。5 17 18
已知在饥饿或高脂肪低碳水化合物生酮饮食时，肝脏会产生酮体，以便在葡萄糖水平低时为包括大脑在内的外周组织提供能量。酮发生与丁酸等短脂肪酸有关，它们通过PPARα诱导mmgcs的表达，也通过β-氧化作为前体底物。16在小肠中mmhgcs有一个食物摄入相关表达．它在哺乳鼠出生后早期被证明是高表达的，饥饿减少了它的表达，反对肝脏酮生成。19日20断奶至LFD后，该表达从肠道消失。20.可能是母乳的高脂肪含量诱发了mhmgc。在成年鼠体内，高脂饮食也能重新激活mhmscs的小肠表达。21日22因此，肠酮发生可能是小肠黏膜的一种脂肪感觉机制。与全身性酮生成相比，这似乎是一种完全不同的营养介导的信号，在全身性酮生成过程中，酮被认为是可能的全身性信号代谢物保护对抗胰岛素抵抗和2型糖尿病。23
在动物实验中，我们证实了hfd喂养后空肠中mhmscs的表达明显增加。这种表达导致小鼠门脉血中酮体βHB的水平升高。此外，用mmhgcs抑制剂hymeglusin经口服预处理可完全阻断βHB的产生。然而，在产生部位，即粘膜上皮细胞和绒毛微循环中，酮体的局部水平可能要高得多(我们的粘膜测量值约为10毫米)，因为门静脉血被空肠以外的肠区域的静脉回流“稀释”。本研究的一个潜在局限性是无法获得rygb手术患者餐后酮体测量样本。最近的研究表明，rygb操作的大鼠餐后脂肪酸摄取和氧化增加(而不是减少)。18这是否反映了肠道其他部位的代偿性增加，仍有待研究。
EECs上抑制性酮体的停止可能有助于RYGB手术后肠肽反应性的增加。在原代EECs细胞培养中，酮体βHB抑制葡萄糖刺激的GLP-1释放比基线水平低40%。这种抑制作用是由G介导的α我因为它完全被G逆转了α我耦合的受体抑制剂PTX。Gα我偶联酮体/脂肪酸受体FFAR3/GPR41在小肠上皮中表达，在EECs中高度富集。14日15它早前已被证实参与调节能量稳态，例如，通过PYY和GLP-1。24我们的数据表明了一种新的机制，即Gα我耦合受体-抑制剂PTX阻断了βHB和生长抑素对EECs释放GLP-1的抑制作用。然而，我们不能确定βHB诱导的GLP-1分泌抑制是由FFAR3介导的，还是一种替代Gα我偶联受体，如GPR109a。然而GPR109a在EECs中的表达水平要低得多。15
综上所述，我们建议通过诱导酮生成的底物缺乏对消化肢进行外科生理重建。这可能有助于解释RYGB术后肠促素激素分泌迅速改善的原因，正如我们最近显示的，在术后2天就明显改善。3.这些发现与提出的“抗肠促胰岛素”和“前肠排斥”假说一致，这些假说可以解释RYGB手术对改善饱腹感和葡萄糖稳态的影响。10这可能为抗肥胖和抗糖尿病药物的开发开辟了新的途径，以mhmgc和肠黏膜酮生成为靶点，以增加EEC对营养刺激的反应性和肠肽释放。
致谢
作者要感谢Claes Ohlsson教授和Kristina Wallenius教授对手稿的批判性阅读。蛋白质组学分析在哥德堡大学Sahlgrenska学院蛋白质组学核心设施进行。哥德堡的动物实验是与哥德堡大学Sahlgrenska学院生理学和生物成像中心(CPI)合作进行的。tGLP1免疫分析在Addenbrooke医院核心生化分析实验室进行。
脚注
贡献者研究概念和设计:VW, LF, ES, AC, EElias。采集数据:VW, EElias, BH, AC, PL, FR, FMG。分析和解释数据:VW, EElias, EElebring, BH, PL, FR, CLR, ND, FMG, LF。起草稿件:VW, EElebring, LF。关键修订的手稿:AC, EElias, PL, FR, CLR, ND, FMG。统计分析:VW, EElias, EElebring, BH, PL, FR, FMG。
资金本研究得到瑞典西部地区的ALFGBG-673931、Erik和Lily Philipson纪念基金会、MRC [MRC_MC_UU_12012/3和MRC_MC_UU_12012/5]、Wellcome Trust [106262/Z/14/Z, 106263/Z/14/Z, 100574/Z/12/Z]资助。
相互竞争的利益大众报告了来自瑞典西部地区的赠款，来自埃里克和莉莉·菲利普森纪念基金会的赠款。FMG是纽约Kallyope的付费顾问。grible - reimann实验室的项目由Medimmune/AstraZeneca资助。CLR报告了爱尔兰科学基金会和爱尔兰健康研究委员会在研究期间提供的研究经费;其他来自诺和诺德，其他来自GI动力，来自礼来的个人费用，来自强生的拨款和个人费用，来自赛诺菲安万特的个人费用，来自阿斯利康的个人费用，来自杨森的个人费用，来自百时美施贵宝的个人费用，来自勃林格-殷格翰提交的作品之外的个人费用。
病人同意发表获得
伦理批准该研究由哥德堡区域伦理审查委员会批准，批准号为193-02、647-05和007-09，并根据《赫尔辛基宣言》进行。所有动物程序均经哥德堡大学动物伦理委员会批准，批准号为90-2007和246-2009，或根据tok Home Office项目许可70/7824和当地法规(动物(科学程序)法案1986年修订法规SI 2012/3039)。
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