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客观的乙肝病毒DNA整合的参与促进hepatocarcinogenesis和肝内HBV水库的程度调节肝脏疾病进展仍然知之甚少。我们检查了肝内HBV水库,乙肝病毒DNA整合的发生及其影响在乙型肝炎肝细胞转录组“e”抗原(e抗原)-慢性乙型肝炎(慢乙肝)。
设计慢性乙肝患者肝组织从84年HBeAg-negative较低(n = 12),中等(n = 25)和高(n = 47)血清HBV DNA进行了分析。共价闭合环状DNA (cccDNA) pregenomic RNA定量PCR (pgRNA)进行评估,全外显子组和转录组测序是由Illumina公司,和乙肝病毒DNA整合的负担被数字液滴聚合酶链反应评估。
结果患者低,温和的血清HBV DNA显示类似肝内cccDNA pgRNA,明显低于高患者HBV DNA,而乙肝core-related强烈与肝内乙肝病毒抗原相关水库,反映cccDNA数量。全外显子组集成中检测出大量的患者(高55.6%、14.3%和25%,中度和低viraemic患者,分别),在一个频率范围从0.5到157集成/ 1000肝细胞。乙型肝炎表面抗原> 5000国际单位/毫升预测整合基因的外显子组和这些集成局部hepatocarcinogenesis,调节脂质/药物代谢和抗病毒/炎症反应。特定基因的转录水平,包括原癌基因的极品,高患者的乙肝病毒DNA整合,支持一个潜在的致癌风险患者低中度病毒血症。
结论乙型肝炎病毒DNA整合发生在所有HBeAg-negative慢性乙肝患者,包括那些拥有有限的HBV水库;本土化在致癌基因,改变肝细胞转录组。
- 慢性病毒性肝炎
- 乙型肝炎
- 肝活组织检查
- 肝细胞癌
数据可用性声明
合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有临床数据收集在一个匿名数据库可用Blizard研究所,英国巴兹和伦敦SMD, QMUL。负责:PTFK
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
乙肝“e”抗原(e抗原)-阶段的乙型肝炎病毒感染与多种疾病相关光谱,从静低viraemic疾病慢性HBeAg-negative肝炎、高进化肝硬化和肝细胞癌的风险。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎core-related抗原(HBcrAg)越来越多地作为代理人肝内乙肝病毒的宿主。
乙型肝炎病毒DNA整合被认为在hepatocarcinogenesis起到关键的作用。
有什么新发现吗?
检测到乙肝病毒DNA整合全外显子组HBeAg-negative很大比例的患者,包括低viraemic患者HBV水库有限。
乙型肝炎病毒DNA整合发生在地区人类基因表达和涉及的关键基因调节细胞增殖,致癌作用除了抗病毒免疫和肝细胞的新陈代谢。
高水平的HBsAg(> 5000国际单位/毫升)可以预测HBeAg-negative患者乙肝病毒DNA整合事件。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
演示在慢性乙型肝炎患者HBV DNA整合视为低风险要求重新评估治疗的候选资格。
未来的研究需要解剖hepatocarcinogenesis乙肝病毒DNA整合的作用,这可以减轻。
小说乙肝病毒疗法应该目标集成HBV DNA除了共价闭合环状DNA来提高治疗效果,减少肝癌的风险。
介绍
慢性乙型肝炎(慢乙肝)病毒感染是一个动态的疾病反映病毒本身之间的平衡和宿主的免疫反应。在慢性乙肝,乙肝“e”抗原(e抗原)负面阶段与光谱相关的临床结果从HBeAg-negative慢性感染(血清HBV DNA < 2000国际单位/毫升和正常的谷丙转氨酶(ALT)) HBeAg-negative慢性肝炎的特点是疾病进展的风险更高,肝硬化和肝细胞癌(HCC)的发展。1
仍缺乏数据的程度和生产力肝内HBV水库(的共价闭合环状DNA (cccDNA),肝内总乙肝病毒DNA (itHBV DNA)和pregenomic RNA (pgRNA))在慢性乙肝的HBeAg-negative阶段。解体以来这个问题是至关重要的肝内HBV水库在调节肝脏疾病进展中起着举足轻重的作用。2 3阐明小说非侵入性乙肝病毒标志物的准确性预测肝内HBV水库也仍然是一个未满足临床需要。4个5乙肝病毒复制可以促进乙肝病毒DNA融入人类肝细胞的基因组,考虑一个关键机械的步骤基本HBV-mediated致癌作用,即使没有坏死性炎症。6 - 8事实上,乙肝病毒DNA整合可以妥协细胞基因组稳定性和修改基因的表达调控细胞周期/扩散,诱发肝细胞之间的转换。7
发现乙肝病毒DNA整合在慢性乙肝病毒感染的早期阶段。9从我们组重要的是,最近的一项研究表明高乙肝病毒DNA整合以及克隆肝细胞扩张HBeAg-positive慢性感染患者,在这些患者的潜在carcinogenetic风险突显,通常被认为是一种良性疾病阶段,缺乏疾病进展。9较低的乙肝病毒DNA整合HBeAg-negative慢性乙肝患者中观察到。10虽然备受争议,但它已经提出,在免疫清除期和e抗原血清转化,发展一个强大的免疫反应可能有利于肝细胞的选择中,乙肝病毒DNA整合赋予一种生存优势,所以可能会导致肝癌的发展。8 11 12
HBV DNA的存在和本地化集成在后期阶段的慢性乙肝病毒感染,尤其是在那些被认为有静止的疾病,如HBeAg-negative低级病毒血症,患者仍然可以理解。更好地理解这种疾病阶段是至关重要的,以确定肝癌发展的风险。此外,需要定义集成的本地化HBV DNA基因调节肝细胞的功能除了扩散(如细胞代谢或认可由免疫反应)和乙型肝炎病毒DNA整合对干扰细胞基因表达的影响。
根据这个知识差距,我们研究了HBeAg-negative病人在疾病谱系,包括那些与低级中度病毒血症,为了提供一个全面的描述肝内乙肝病毒的水库和调查这如何确定的程度和本地化乙肝病毒DNA整合全外显子组。此外,我们首次报告乙肝病毒DNA整合的角色在改变人类肝细胞的转录组剖面在这些病人。这强调的重要性更谨慎的方法管理中度viraemic HBeAg-negative慢性乙肝,是否更应该考虑降低治疗这些患者的阈值。
材料和方法
研究人群
八十四年HBeAg-negative慢性乙肝患者招募从病毒性肝炎在伦敦皇家医院诊所(巴健康NHS信托)英国从2013年到2016年。所有患者接受了肝脏活检诊断和组织盈余是用于描述的实验分析。匹配也收集血清样本(在线补充图S1描述了病人队列和病毒学进行分析)。慢性乙肝患者首次治疗和监测≥2年与病毒学和生化参数前疾病分层组织抽样。患者HBV mono-infected;和丙肝病毒,艾滋病毒合并感染和δ型肝炎病毒被排除在外。患者根据血清HBV DNA水平分层(计算平均值获得的连续测量2年期间监测前接受肝脏活组织检查):
组1:患者血清HBV DNA持续< 2000国际单位/毫升;低的病毒血症(n = 12)。
组2:患者血清HBV DNA在2000和000国际单位/毫升;温和的病毒血症(n = 25)。
3:组患者血清HBV DNA持续> 20 000国际单位/毫升;高病毒血症(n = 47)。
DNA和RNA与肝活检组织
总肝内DNA和RNA分离得到病人的肝组织利用AllPrep DNA / RNA迷你包(试剂盒、希尔登,德国)(过程中描述在线补充材料(SM))。
肝内乙肝病毒标志物的量化:总HBV DNA, cccDNA pgRNA
肝内DNA用于执行itHBV DNA和cccDNA SM的量化描述。pgRNA水平确定为41/84肝脏活组织检查一个可用的RNA样本,运用内部数字滴(dd) pcr试验(SM)中描述。itHBV DNA, cccDNA和pgRNA值正常细胞数量,根据量化得到Albumin-based ddPCR拷贝数检测:铝青铜,人类(Bio-Rad,而往常,加州,美国),因此报告为itHBV DNA, cccDNA和pgRNA副本/ 1000个细胞。至少有三个负面的控制和一个积极的控制被包含在每个实时和ddPCR反应来验证放大效率和排除样品污染。
血清乙肝病毒标志物:量化的HBV DNA, HBsAg HBcrAg
血清HBV DNA定量是由一个实时PCR使用Cobas Ampliprep / Cobas TaqmanHBV化验(罗氏诊断,美瀚,德国;定量下限(LLOQ): 20个国际单位/毫升)。血清乙肝表面抗原(HBsAg)量化Elecsys HBsAg II设备/ Cobas(罗氏诊断;LLOQ: 0.05国际单位/毫升)。乙型肝炎core-related抗原(HBcrAg)是由化学发光分析量化,Lumipulse GHBcrAg化验(Fujirebio欧洲、绅士、比利时;LLOQ: 3 logU /毫升)。
评估肝纤维化
肝纤维化是由一个专家评估肝脏histopathologist使用申请评分系统。值从0到2只被视为缺乏或轻度纤维化,而值从3到6被认为是严重肝纤维化或肝硬化。
乙型肝炎病毒基因分型
对于每一个病人,HBsAg基于测序(226个氨基酸)进行DNA提取血清样本,后一个协议之前。13系统发育的方法被用来确定乙肝病毒基因型。
全外显子组测序
全外显子组测序(韦斯)进行了40/84肝活检提供足够的DNA,通过应用整合的不错下一代测序的方法,基于Illumina公司技术通常用于诊断目的欧陆坊Genoma集团在罗马,意大利在SM(详细描述)。这个过程包含了一个关键的一步捕捉exome-amplified片段,让一个深入分析人类基因组及其编码部分的侧翼intronic /基因间区域。14总体来说,中值(差)外显子组测序的报道是115×90×-140×)。严格的生物资讯管道,SM和系统化图1,应用于确定乙肝病毒整合网站。乙肝病毒整合基因的功能是通过查询检索三个不同的在线可用的数据库:基因卡片,蛋白质图谱和基因和基因组的京都百科全书(KEGG数据库()图1)。15 - 17日公开的病毒整合位点数据库(VISDB)被用来验证观察乙肝病毒DNA整合发生在HBV DNA的基因称为目标集成在先前的研究分析肝脏样本(肿瘤/ peritumour / non-tumour)。事实上,VISDB从文献收集信息高质量的病毒在人类基因组中整合网站和相关的恶性肿瘤(https://bioinfo.uth.edu/VISDB/index.php/homepage)。乙肝病毒,VISDB 558数据集成网站从45出版物。
生物识别工作流的嵌合乙肝病毒人类序列。质量控制(通过Trimmomatic)后,基因组测序读是一致的特异的洞穴Wheeler Aligner-Maximal Exaxt匹配(BWA-MEM)为了提取所有读取包含乙肝病毒片段。SAMtools软件应用于推断所有人类嵌合乙肝病毒序列,代表乙肝病毒集成到人类基因组。ANNOVAR软件被用来映射乙肝病毒整合在染色体和基因水平。在乙肝病毒基因的功能集成检索到基因卡片,蛋白质图谱和KEGG数据库。韦斯,全外显子组测序。
量化的乙肝病毒集成数字滴PCR方法
乙肝病毒DNA整合发生在intronic /其实人类基因组区域检测到韦斯,特设ddPCR化验被设计为了进一步确认他们的存在和量化的肝细胞总数窝藏乙肝病毒DNA整合事件(SM)中提供的详细描述。
全转录组分析
全转录组测序的一个子集上执行15患者可用材料:7证实患者乙肝病毒DNA整合全外显子组和8没有证实乙型肝炎病毒DNA整合全外显子组,以评估整体的微分表达式mrna在肝脏活检。核糖核酸库与Illumina公司测序Hiseq 2000(美国加州Illumina公司)。大约45 - 60百万paired-end 150碱基对读取得到样品。每个注释记录的相对丰度为每个样本单位报告的transcripts-per-million (TPM)在SM(详细描述)。
统计分析
为连续变量和χMann-Whitney测试2测试了离散变量应用于定义统计上显著的差异。接受者操作特征(AUROC)下的面积被用来定义边缘的阈值参数的最佳性能预测肝内水库(cccDNA < 1.5日志副本/ 1000细胞)和HBsAg的阈值水平的最佳性能预测的发生HBV融入人类基因组。
结果
描述的血清和肝内HBV标记
八十四年HBeAg-negative慢性乙肝首次治疗患者,根据病毒载量分层(参见“材料和方法”部分)包含在这项研究。没有明显差异在临床和病人之间的人口数据组(表1)。重要的是,无/轻度纤维化(F0-2)被发现在研究病人的83.3%。
HBsAg水平可比所有患者团体之间,然而,大多数患者在组1和2显示HBcrAg < 3 logU /毫升(显示阴性结果)(分别为66.7%和81.1%;p = 0.38)。相反,HBcrAg水平已经显著大于高viraemic患者,中值(差)HBcrAg 4.1 (3.3 - -4.8) logU /毫升为1组和3组(p = 0.03, p < 0.001为组2和组3)(表1)。类似的,低级和中度患者病毒血症证明可比itHBV DNA和cccDNA中等水平的图2 a, B)明显低于观察高病毒血症患者(p = 0.004 - 0.02) (图2 a, B)。同样,组间可比性pgRNA水平1和2,虽然pgRNA是窄的分布在组1 (图2 c)。类似于HBcrAg水平,病人在3组的特征是pgRNA水平显著高于其他两组(组3 vs组2,p = 0.002;组3 vs组1,p < 0.001) (图2 c)。AUROC,血清HBV DNA的结合< 20 000国际单位/毫升,HBcrAg < 3 logU /毫升,HBsAg < 1000国际单位/毫升确定有限HBV水库(定义为cccDNA < 1.5日志副本/ 1000细胞)诊断的准确性为84.3%,90%,阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(NPV) 83.3% (在线补充表S1)。
肝内乙肝病毒标志物分布在病人组。箱形图显示肝内HBV DNA总量的分布(itHBV DNA) (A),共价闭合环状DNA (cccDNA) (B)和pregenomic RNA (pgRNA) (C)在组1、组2和组3,分别。统计上显著的差异被Mann-Whitney U测试评估。重大改变标有星号,* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;ns,不重要。
肝内HBV水库也评估在HBV基因型。特别是,患者感染乙型肝炎病毒基因型D的特征是低cccDNA和肝内HBV DNA与基因型和E (cccDNA: 1.9(0.9 - -2.6)和2.7(2.0 - -3.2)和2.4(2.1 - -2.7)日志副本/ 1000细胞,p = 0.007, p = 0.004;肝内DNA: 3.2(2.9 - -3.7)和4.1(3.7 - -4.2)和3.9(3.5 - -4.0)日志副本/ 1000细胞,p = 0.005, p = 0.02)。同样,乙型肝炎病毒基因型的形象D与pgRNA低于相关基因型(3(1.4 -11)和19(7-32)副本/ 1000个细胞,p = 0.05)。相反,从基因型D患者数据显示类似肝内水库对HBV基因型B和C。
乙肝病毒整合事件发生在整个光谱的HBeAg-negative慢性乙肝
乙型肝炎病毒DNA整合调查在全外显子组(定义为外显子,exon-flanking intronic地区和基因间区域位于< 500对碱基配对从外显子)从40的84名患者,获得足够的DNA被用于韦斯分析。下一代测序技术使用韦斯和促成了揭幕遗传和表观遗传畸变的景观。18的子集40例中分析,准确地反映了整体研究人口疾病分层根据血清HBV DNA水平(在线补充表S2)。中值(差)序列覆盖深度是115×(90×-140×),与一个值(差)paired-end读取次数为70(54 - 84)数百万病人,符合韦斯的建议。19日20至少一个乙肝病毒DNA整合事件在整个外显子组中检测出所有病人组与组3中的患病率最高(55.6%,10/18)。值得注意的是,乙肝病毒DNA整合也明显在14.3%(2/14)和25%(2/8)的患者组2和1,分别,尽管降低病毒血症,肝内储层就更有限了。乙肝病毒DNA整合档案也在评估乙肝病毒基因型;更频繁地集成检测基因型D患者(38.9%),其次是基因型E(33.3%)和基因型C患者(22.2%)。对乙型肝炎病毒基因型A和B,乙肝病毒DNA整合分析了两个病人,在集成中检测到事件(2/2)患者感染的基因型,但在没有乙型肝炎病毒感染的基因型B。
微分本地化乙肝病毒DNA整合事件全外显子组
发现乙肝病毒DNA整合是映射对细胞染色体。集成事件被检测到在12染色体没有优惠染色体热点的证据(图3一)。总共16个乙肝病毒整合事件被检测到。大多数乙肝病毒DNA整合事件(68.7%,11/16)发生在exon-flanking内含子。其中,八乙肝病毒DNA整合或接近信号序列中检测到的所必需的RNA拼接,一个事件的关键信使RNA合成,反过来对蛋白质功能(表2)。此外,乙肝病毒DNA整合也发现外显子基因间的地区(6.3%,1/16)和(25%,4/16)。乙肝病毒DNA整合事件发生地区的关键信使RNA合成也由ddPCR量化(8或接近信号序列内所需的RNA拼接和外显子的单一事件)(表3)。这些乙肝病毒DNA整合事件的量化范围从0.5到157集成每1000人肝细胞(值= 5集成/ 1000肝细胞)(表3)。
乙型肝炎病毒DNA的可视化集成对人类染色体和病毒基因组。(一)每一行定义了乙肝病毒集成断点在人类基因组特定位点(hg19)。(B)的频率直方图报告集成为每个核苷酸乙肝病毒基因组的位置。位置的基因编码HBV聚合酶(绿色),核心(紫色),S(粉红色)和X(红色)的蛋白质。
通过基因本体,乙肝病毒DNA整合本土化在人类基因调节细胞增殖(NUP85、ANKRD52 ELAC2, COL18A1和AGBL5)在五个病人,包括那些低级和中度患者病毒血症(表2)。VISDB值得注意的是,通过使用公开可用的数据库,收集558乙肝病毒整合网站在肝脏肿瘤/ peritumour / non-tumour 45出版物样本;ANKRD52, COL18A1 AGBL基因参与了乙型肝炎病毒DNA整合以前检测到肿瘤或peritumour肝脏样本。集成HBV DNA被发现在基因调节药物或脂质代谢(CYP2UI LMF-1)和调制抗病毒或炎症反应(NR3C1 IFITM1) (表2)。根据VISDB LMF-1和NR3C1基因也参与了乙型肝炎病毒DNA整合事件。
病毒基因组区域集成在人类的全外显子组
乙型肝炎病毒DNA整合被映射到病毒基因组。大多数乙肝病毒DNA整合(62.5%,10/16)发生在1590年和1840年乙型肝炎病毒核苷酸位置对应病毒基因组区域生成的直接重复2 (DR2)和直接重复1(根据DR1) (图3 b)。这个区域包含增强剂二世,被移植病毒基因的表达21和对应于乙肝病毒X蛋白的糖基(HBx)的表达与肝癌的发病相关。22日23日乙肝病毒整合事件也观察到在开放阅读框preC /核心(ORF C) (3/16), ORF P(2/16)和ORF P基因组区域的重叠与ORF (1/16)。
两个截然不同的乙肝病毒DNA整合事件被检测到两个病人。在病人没有。40岁的病毒基因组区域包括核苷酸1665 - 1746和1951 - 2039都是集成的第1内含子中发现IFITM1基因频率的每1000个肝细胞(4和5的集成表3)。病毒基因组区域包括核苷酸1684 - 1775和2716 - 2769年都检测到集成ANKRD52基因的基因内区7,158年和157年的频率每1000肝细胞在患者没有集成。62 (表3)。本地化在相同的人类基因与重合负担支持的集成部分至少354和1085年的病毒基因组核苷酸。
乙型肝炎病毒DNA整合事件与血清HBsAg的水平
肝内乙肝病毒标志物与HBV DNA整合事件,并指出在患者或无可比性的证据乙肝病毒DNA整合全外显子组(表4)。相反,在血清乙肝病毒标志物、乙肝表面抗原在患者明显高于展示集成HBV DNA全外显子组(3.9 vs 3.2 (3.8 - -4.2) logIU /毫升(2.9 - -3.7)logIU / mL, p < 0.001) (表4)。此外,由AUROC HBsAg > 5000国际单位/毫升发现乙肝病毒整合的发生最好的全外显子组诊断准确性(86.5%),70.6%的PPV和94.7%的NPV (图4)。之间没有相关性,然而,发现乙肝病毒DNA整合和ALT的发生或者Ishak纤维化阶段。此外,没有观察到患者的年龄相关性[34(26 39年)对于乙肝病毒DNA整合vs 37(30-43)年病人没有集成,p = 0.16)。
接受者操作特征(AUROC)曲线下面积的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平和发生HBV整合。HBsAg水平> 5000国际单位/毫升能够识别患者乙肝病毒整合(n = 14)最好的诊断准确性(83.5%):阳性预测值= 70.6%;阴性预测价值= 94.7%;曲线下的面积(AUC) = 0.841 (0.768 - -0.974);敏感性= 92.3%;特异性= 78.3%。
乙型肝炎病毒DNA整合影响人类肝细胞的转录组的概要文件
细胞基因表达是评估的一个子集15韦斯40例的分析,在充分的组织。这些患者分层(n = 8)根据存在与否(n = 7)乙肝病毒DNA整合热图显示(图5)。数量值(差)的55(52 - 61)为每个病人获得百万双端读取并总共52 268表达基因进行分析。其中,极品(p21编码的癌蛋白)和HGB2胎儿血红蛋白(编码)是唯一的基因的转录水平明显高于患者乙肝病毒DNA整合患者比没有乙肝病毒要素(中位数(差):255(151 - 539)和32.1 (24.3 - -33.7)TPM, hra调整p = 0.00002, 37.5(20.1 -115)和2.5 (0.9 - -3.1)TPM,调整为HGB2 p = 0.00014,分别)。然后我们调查了量化细胞基因的表达在这些患者被韦斯乙肝病毒DNA整合的证据。在患者HBV DNA在细胞基因ELAC2集成,其转录水平低于观察患者无乙肝病毒DNA整合(92 vs(差)值中位数为217 (186 - 232)TPM在那些没有乙肝病毒DNA整合,调整p = 0.05)。
热图排名前十位的差异表达基因的存在与否,乙肝病毒DNA整合。颜色从红色到蓝色指的z分数计算出每个基因在每个病人按照下列公式:X−(平均X) / SD, X代表记录每百万。热图报告10个基因与微分表达式或没有患者HBV DNA的证据集成和各自的p值。
同样,在患者的乙肝病毒DNA整合ANKRD52,这种基因的转录水平低于观察患者无乙肝病毒DNA整合,虽然没有达到统计学意义(119 vs值(差)的价值220 (155 - 243)TPM在那些没有乙肝病毒DNA整合,p = 0.20)。相反,在患者乙肝病毒DNA整合细胞基因IFITM1,转录水平较高(111 vs值(差)值42 (36-50)TPM在那些没有乙肝病毒DNA整合,p = 0.02)。的确,没有进一步的差异转录水平观察其他基因的分析在转录组分析。
讨论
在这项研究中,我们提供了一个深入描述肝内HBV水库及其对乙肝病毒DNA整合影响HBeAg-negative慢性乙肝患者。我们的数据表明,低级和中度患者HBV DNA的特征是一个类似肝内HBV水库总肝内HBV DNA和cccDNA而言,这是远远低于观察患者更高的病毒血症。这一发现与之前是一致的临床研究显示,大多数病人在所谓的灰色地带(血清HBV DNA介于2000和20 000国际单位/毫升)往往有一个良性的临床结果的特点是肝脏疾病进展有限。24日25日有趣的是,尽管可比cccDNA的水平,pgRNA广泛分布在低和适度viraemic病人,表明一个更严格的表观遗传控制cccDNA的乙肝病毒基因的转录活动水平较低。这印证了之前的临床研究显示,许多患者血清HBV DNA从2000到000国际单位/毫升(13%在1年之内根据最近的一项研究24)进展HBeAg-negative慢性肝炎。此外,我们的数据表明,HBcrAg血清HBV DNA和HBsAg可以预测肝内HBV水库有限。这符合最近的数据显示,HBeAg-negative慢性乙肝患者,HBcrAg可以反映cccDNA转录活动的程度。5虽然强调的重要性将血清乙肝病毒标志物纳入临床实践的更精确的分层HBeAg-negative慢性乙肝患者,乙肝病毒的影响所知甚少水库乙肝病毒DNA整合,这也是需要考虑的一个重要因素在疾病进展,在肝癌的发展更具体地说图6。
信息图表总结强调数据的关键点。
使用韦斯加上ddPCR在这项研究中,我们提供了独特的机会在HBeAg-negative精细解开患者慢性乙肝,乙肝病毒DNA整合的发生和负担最相关地区的人类基因组。全外显子组代表了180 000个外显子组成的蛋白质编码区域大约有85%的基因改变与人类遗传疾病都是局部的。26日27日因此,乙肝病毒DNA整合全外显子组最高概率改变人类基因表达和,反过来,临床病理的意义。此外,最近的研究发现,肿瘤组织的特点是一个不规则的浓缩乙肝病毒DNA整合事件编码/人类基因组的功能区域,与non-tumour组织相比,这表明在这些地区乙肝病毒整合可能带来tumourigenesis期间选择优势。7 28
我们的数据表明,乙肝病毒整合在整个外显子组发生在一个显著的比例的患者HBV DNA高(55.6%),而在显著水平低的患者(25%)和温和的病毒血症(14.3%),尽管他们有限的HBV水库。ddPCR,我们发现乙肝病毒DNA整合发生流行率从0.5到158年每1000肝细胞事件,支持克隆抱有这些乙肝病毒DNA整合扩张的肝细胞。值得注意的是,乙肝病毒DNA整合中检测出人类基因,如NUP85 ANKRD52, ELAC2 AGBL5参与调节细胞增殖。可想而知,乙肝病毒DNA整合这些基因的富集可能增强肝细胞生存从而使持久性的肝内病毒传染性后代的水库和长期生产,正如前面所示的其他病毒感染。29 30同时,这可能会造成肝细胞的克隆选择的基础窝藏这些乙肝病毒DNA整合,导致肝癌的发展。符合这个概念,上述基因的表达改变与发病有关或更糟的是肝癌的预后。16 31-34值得注意的是,通过询问VISDB公开数据库,我们证实这些基因参与了乙型肝炎病毒DNA整合事件中发现肿瘤或peritumour肝脏样本在先前的研究中,在hepatocarcinogenesis支持他们的角色。
大多数乙肝病毒DNA整合中发现exon-flanking intronic地区RNA拼接的关键信号序列(如分支网站)是局部的。一个似是而非的概念是,乙肝病毒DNA整合在这些地区可以影响正确的信使rna合成,从而改变细胞的基因表达。符合这一假说,指出,在基因转录组分析显示显著降低表达式的ELAC2患者乙肝病毒DNA整合在这个基因。这个结果可以解释的乙肝病毒DNA整合驻留在所谓的分支网站,一个intronic地区重要的正确折叠RNA剪接过程中。通过应用“人类拼接仪”(一种巩固和强大的算法来预测分支网站在一个给定的基因内区),我们发现乙肝病毒DNA整合ELAC2决定3-nucleotide转变的分支网站所涉及的基因内区乙肝病毒整合,减少该域的稳定。
有趣的是,最近的研究表明,ELAC2的异常表达在肿瘤中扮演角色的变换不同的细胞类型,包括肝细胞。31日35
分析整个转录组的病人根据HBV DNA的存在与否集成、细胞基因的一个重要upregulation hra和HBG2(编码胎儿血红蛋白)中强调那些乙肝病毒DNA整合。这两个基因与细胞增殖,增加有关15日16此外,upregulation hra,原癌基因,与肿瘤有关转换在几个人类癌症。36 37此外,它已被证明的异常活化细胞如Ras /皇家空军/ MAPK信号流程。72年在肝癌发展中起着举足轻重的作用。38类似地,moderate-to-strong细胞质积极性胎儿血红蛋白(通常不是表现在成年人)中描述的肝癌患者。16这些基因的表达增加可能青睐的基因组不稳定,被乙肝病毒DNA整合。11 39这个概念符合最近的一项研究显示乙肝病毒DNA整合的能力作为染色体间的桥易位。40hra upregulation也可以与病毒蛋白的过度HBx,羊痘疮的集成在绝大多数患者被发现。的确,这符合之前的数据显示,高架HBx生产可以支持p21细胞质的积累(hra)编码,提供肿瘤肝细胞转化的基础。41值得注意的是,一个有趣的案例是病人40,特点是集成的co-localisation乙肝病毒DNA(在基因编码IFITM1)随着hra的差异表达基因,HBG2和MUC6染色体11。在这个病人,hra的表达水平的变化,HBG2 MUC6特别明显,进一步支持乙肝病毒DNA整合的角色改变转录组的概要文件。最后,转录组变化资料也观察到患者的乙肝病毒DNA整合基因间区域。这可能是由于潜在的乙肝病毒DNA整合修改的可访问性细胞染色质和/或改变的生产监管rna,通常由人类基因组的基因间区域编码。42总的来说,这些发现支持这一概念,HBeAg-negative慢性乙肝患者,即使HBV DNA水平较低,仍有肿瘤肝细胞转化的潜在风险。
值得注意的是乙肝病毒DNA整合中也检测到基因调节抗病毒免疫和肝细胞的新陈代谢。在这方面,转录组分析凸显了IFITM1 interferon-associated基因的高表达患者的乙肝病毒DNA整合涉及这个基因。值得注意的是,通过分析该地区乙肝病毒基因组整合IFITM1内,我们发现这个事件涉及HBV地区丰富的发起人(核苷酸:1665 - 1746),包括增强剂二世,被转录因子有利于基因表达的关键。一个似是而非的概念是,乙肝病毒DNA整合的第一内含子IFITM1(上游的基因)的表达水平可以提高IFITM1,负责记录的增加水平观察在我们的研究中。
这些发现揭示乙肝病毒DNA整合的潜在影响细胞功能。因此,尽管被乙肝病毒复制的复制的终端产品,8乙型肝炎病毒DNA整合可以有多个下游影响细胞内稳态,新陈代谢和先天抗病毒免疫反应。关于乙肝病毒基因组的集成部分,正如前面所讨论的那样,大多数乙肝病毒DNA整合涉及HBV基因组区域生成根据DR1 DR2;公认的复合精通地区乙肝病毒基因组。43这个地区还编码HBx糖基,过度的报道诱导干细胞的特性,44转换和抑制细胞凋亡。45这进一步支持肿瘤肝细胞转化的潜在风险甚至在低水平的患者HBV DNA。值得注意的是,很长一段的集成部分至少354和1085年的病毒基因组核苷酸中检测出两个病人。这符合最近的数据突出显示集成不限于局部地区,还包括完整的病毒基因组,进一步支持集成的HBV DNA的贡献人类的基因改变。40
结论,HBeAg-negative慢性乙肝,乙肝病毒DNA整合全外显子组经常发生在高度viraemic患者,并观察到相当比例的患者较低的病毒血症。本地化乙肝病毒整合的例子表明,这一事件并不局限于hepatocarcinogenesis和但也可以与抗病毒免疫的调节机制,炎症反应和肝细胞的新陈代谢(图6)。我们的研究结果强调HBeAg-negative慢乙肝的临床挑战与管理。特别是乙肝病毒整合的证据在低viraemic有限的患者HBV水库是一个及时的提醒,这些病人不符合治疗标准,保持疾病进展的风险和肝癌的发展。
数据可用性声明
合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有临床数据收集在一个匿名数据库可用Blizard研究所,英国巴兹和伦敦SMD, QMUL。负责:PTFK
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
这项研究是由当地研究伦理委员会批准(布伦特研究伦理委员会参考:09年/ H0717/32)和符合《赫尔辛基宣言》。所有参与者提供书面知情同意。
确认
作者感谢有益的讨论,建议和评论的手稿教授威廉·梅森(福克斯蔡斯癌症中心)和卡拉Usai博士(英国巴兹和伦敦SMD Blizard研究所QMUL)。作者还要感谢所有的病人,他们的家庭和在伦敦皇家医院工作人员支持这项工作。
引用
补充材料
脚注
推特@druppygill, @drpkennedy
VS和RS同样起到了推波助澜的作用。
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。图已被添加。
贡献者研究概念和设计:PTFK VS。采集的数据:对,RSa, LP, AB, LCo, RSc, USG。分析和解释数据:VS、RSa、LP, AB, LCo, RSc,正是PTFK。数学与统计分析:对,RSa, LCa。获得资助:VS, USG PTFK。管理/技术/材料/伦理支持:对,RSa, LCa, MS, VC、一个,NH, FC-S, CFP,正是PTFK。研究监督:PTFK VS。起草文稿:VS, RSa, USG, PTFK。关键的修订手稿:VS, RSa, LP, LCa, AB, LCo, RSc, MS, VC、一个,NH, FC-S, CFP,正是PTFK。
资金这项工作是支持资金来自意大利的指令,大学和研究(FIRB项目:RBAP11YS7K_001),国家研究委员会(Progetto班迪耶拉PB05) VS,威康信托基金会临床研究培训奖学金(107389 / Z / 15 / Z), NIHR学术临床讲师职务(018/064 / A)、医学科学院起动格兰特(SGL021/1030)和种子资金Rosetrees / Stoneygate信托(A2903)授予美国政府;巴慈善项目资助(723/1795和开战/ 0406)和一个NIHR研究患者受益奖(pb - pg - 0614 - 34087) PTFK。
相互竞争的利益PTFK从基列协作赠款资金,参与顾问委员会/基提供咨询,詹森和基列是一个积蓄的调查员试验,詹森,Alere,组装生物科学,葛兰素史克和罗氏。
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