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摘要
客观的全身炎症易使急性失代偿(AD)肝硬化发展为急性-慢性肝衰竭(ACLF)。支持治疗可以改善AD患者，使其得到补偿。对于AD后患者的治疗结果知之甚少。我们假设不同的炎症小体激活参与了补偿和补偿患者的ACLF发展。
设计249例肝硬化患者，分为代偿性和代偿性(既往AD)，前瞻性随访致命性ACLF发展。包括两个外部队列(n=327)(补偿、AD和ACLF)。测量了炎症小体驱动白介素(ILs)、IL-1α (caspase-4/11依赖)和IL-1β (caspase-1依赖)。在大鼠中，胆管结扎诱导的肝硬化和脂多糖暴露用于诱导AD和随后的补偿。检测IL-1α、IL-1β水平及上下游基因表达。
结果发生ACLF的患者表现出较高的ILs基线水平。补偿患者和检测到il的患者ACLF的发生率高于补偿患者。基线cliff - c(欧洲慢性肝衰竭研究基金会联盟)AD、白蛋白和IL-1α是补偿患者ACLF发展的独立预测因子，而在补偿患者中cliff - c AD和IL-1β是ACLF发展的独立预测因子。代偿大鼠IL-1α基因表达升高，代偿大鼠IL-1β水平升高，肝脏基因表达升高。在两个外部队列中证实，发生ACLF的补偿患者中IL-1β检出率较高，而ACLF患者中IL-1α和IL-1β检出率较高。
结论既往AD是致死性ACLF发展的重要危险因素，可能与炎性小体激活有关。动物模型证实了ACLF的发展与代偿性肝硬化的IL-1α和代偿性肝硬化的IL-1β之间的联系。
- 肝硬化
- 炎症
- 门脉高压
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
急性-慢性肝衰竭(ACLF)是一种短期死亡率高的综合征。
其发展与全身炎症有关。
新的发现是什么?
这项研究表明，白介素(IL)-1α是代偿性ACLF致命发展的独立预测因子，IL-1β是代偿性实验和人类肝硬化的独立预测因子，这表明不同的炎症小体激活似乎影响致命的ACLF发展。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些结果有助于理解致死性ACLF中的炎症小体激活，并可能为开发预防致死性ACLF的治疗靶点铺平道路。
简介
在肝硬化中，急性-慢性肝衰竭(ACLF)是一种最近被描述的以急性失代偿(AD)、器官衰竭和高短期死亡率为特征的综合征。1 - 4导致这种综合症的途径还不完全清楚。全身性炎症(SI)的发生可归因于促炎信号从肠腔转位到体循环和/或损伤相关分子模式的释放。5 - 7大量的促炎介质。这些促炎介质对器官微循环和细胞生理止血的直接有害作用可导致器官衰竭。1 8在肝硬化的任何阶段，患者都可能发展为AD，1 9但只有当SI被广泛激活时，患者才会出现ACLF。1 9在规范的AD药物治疗下，部分患者病情可好转，临床稳定并得到补偿。最近的数据表明，ACLF在门诊患者中的患病率很高。10此外，几乎一半的CANONIC队列患者在没有突发性事件的情况下发生了ACLF，1强调要么诱因不完全清楚，要么在某些情况下SI可能很高，以至于ACLF可以在没有外部诱因的情况下发生。
被代偿和被代偿(即有代偿失代偿史)门诊患者在现实临床实践中出现相似的临床情况。然而，补偿和补偿患者之间ACLF发展风险的差异尚未被研究。10尽管人们一致认为SI是ACLF的标志，但成功治疗AD(补偿)后SI的动态尚未被描述，其在ACLF发展中的作用仍不清楚。
炎症小体激活是先天免疫系统炎症反应的标志，导致白介素(IL)-1α和IL-1β的释放。11炎症小体通过典型途径的激活涉及到触发因子的感知，如危险相关分子模式或病原体相关分子模式，炎症小体的细胞质组装，以及因此caspase-1依赖于生物非活性的IL-1β前体裂解为其活性形式IL-1β。随后，通过IL-6和C反应蛋白的全身炎症反应开始启动。12日13值得注意的是，胞质脂多糖(LPS)是已知的涉及caspase-11/4/5的非典型炎症小体信号的触发因素，随后导致焦亡和IL-1α中的警报释放。因此，IL-1α有助于局部炎症反应。14
因此，本研究的目的是通过促炎细胞因子IL-1α和IL-1β评估补偿和补偿患者的炎症小体激活及其在致命性ACLF发展中的作用。我们假设SI是补偿和补偿状态下ACLF发展的前提和指示。
患者与方法
患者和数据收集
在这项前瞻性的单中心研究中，根据研究方案，2002年至2016年间，249名肝硬化患者被选择性转介到丹麦Hvidovre医院临床生理和胃肠科进行肝静脉压力梯度(HVPG)测量。纳入标准为年龄> ~ 18岁，根据临床特征结合HVPG和组织学、生化、超声或内镜检查结果诊断肝硬化。排除标准为年龄<18岁、入组时患有AD、恶性肿瘤和急性细菌感染。一般临床特征表现在在线补充表1．
根据失代偿史将患者分为两组。15补偿患者定义为从未发生失代偿事件。补偿患者定义为失代偿患者(先前有腹水发作)，临床不明显，无腹水或在纳入时使用药物治疗有控制腹水。
主要终点为致命性ACLF，定义为ACLF发展导致死亡。
在登记时收集了血液样本，并对患者进行了随访，直到2017年10月。欧洲慢性肝衰竭研究基金会(European Foundation for study of chronic liver failure consortium, cliff - c)于2013年建立了ACLF的定义，因此对ACLF的诊断进行了回顾性的确定。１ ２无非致死性ACLF的记录。使用标准试验进行血液生化分析。经纳入患者书面知情同意。
来自先前研究的48例患者的子队列被纳入外部队列(EC1)，以确认补偿组的结果。16这些患者在德国波恩大学医院内科I部接受AD治疗。血液样本被用来测量循环中的IL-1β水平。随访患者ACLF的发生情况。
另一项来自前瞻性多中心研究的279例AD肝硬化患者的外部队列(EC2)1分析血清IL-1α和IL-1β水平以及ACLF的存在，以评估ACLF中的炎症小体激活。EC2患者未进行随访。
由于没有为患者或公众参与分配资金或时间，因此我们无法邀请患者对研究设计、患者相关结果的发展或结果的解释进行评论。为了可读性和准确性，我们不邀请患者参与本文档的写作或编辑。
评估血液循环中白细胞介素水平
在初步评估时，采集了本研究中所有患者的外周血。采集后，血液样本在4°C下离心，血清样本在- 80°C保存。使用DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, USA)根据制造商说明书(在线补充表2)在德国波恩的内科I部。在未稀释的血清样本中定量IL水平;两名患者的血清作为对照，在每个ELISA板中获取变异。
IL-1α和IL-1β的检测范围分别为7.81 ~ 500 pg/mL和3.91 ~ 250 pg/mL。无法检测的水平被赋予了一个等于检测下限的值。17 18对于高于检测上限的值，使用GraphPad Prism V.5.00 (GraphPad Prism Software, La Jolla, USA)计算浓度。
在EC1中，根据制造商的说明，使用高灵敏度的Luminex MAGPIX系统(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)和ProcartaPlex Mix&Match Human 15-Plex (eBiosciences, Carlsbad, California)测量IL-1β。16在EC2中，IL-1α和IL-1β在Luminex 100系统(Luminex, Austin, Texas)中使用定制的MILLIPLEX MAP人类细胞因子/趋化因子磁珠板(Merck Millipore, Billerica, Massachusetts)进行评估。简单地说，在加入预混的微珠(25µL)之前，每个孔中加入25µL稀释剂和25µL血浆或白细胞上清液。4℃摇晃孵育过夜，清洗后用25µL检测抗体孵育1小时。再次清洗平板，并与25µL链霉亲和素‐藻红菊酯孵育30分钟。最后将平板冲洗两次，用100 μ L鞘液重新悬浮，并在Luminex 100系统中进行分析。仪器检测读出的读数为平均荧光强度，随后通过在检测中同时运行的一组标准进行外推，将值转换为pg/mL。分析内和分析间变异系数分别为1.6 ~ 3.3和6.7 ~ 16.8。19
动物实验
根据负责北莱茵-威斯特法伦州动物研究的委员会LANUV批准的指导方针和规定，我们在实验中使用了雄性野生型(WT) Sprague Dawley大鼠。所有的动物都得到了水和食物。Sprague Dawley大鼠被安置在受控环境中(标准IVC笼，12小时光照/黑暗，温度22°C - 24°C)，并喂食标准鼠粮(snif, Soest, Germany)。实验是在光周期中进行的。
纤维化的胆汁淤积模型
初始体重180 ~ 200 g的WT大鼠行胆管结扎(BDL)。20 21AD模型大鼠腹腔注射单剂量LPS肺炎克雷伯菌(Sigma L4268，圣路易斯，美国)，0.03 mg/kg体重，BDL后28天。注射LPS后0、4、24、72 h处死大鼠。AD模型的实验在英国伦敦大学学院肝脏和消化健康研究所进行。
对于补偿模型，实验在BDL后3周进行。补偿组接受单剂量的LPS静脉注射大肠杆菌O111:B4 (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)， 6.25 mg/kg BW诱发AD。第4周(第28天)大鼠进行补偿后处死。
LPS剂量设计的基本原理描述于在线补充资料1．
补偿组在4周(第28天)后不接受LPS，并由无腹水的大鼠组成。肝脏和血清样本被快速冷冻并保存在−80°C。补偿和补偿模型的实验在德国波恩大学医院内科一科进行。
外周血单个核细胞
如前所述，使用Pancoll梯度离心(PAN-Biotech, Aidenbach, Germany)从代偿和代偿大鼠的EDTA血液中分离出外周血单个核细胞(pmcs)。22细胞悬浮于Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 16/40培养基+ 10%胎儿犊牛血清+二甲基亚砜(Gibco, Life Technologies, Carlsbad, USA)，并保存于−80°C。
鼠类循环白介素水平评估
对于AD动物模型，使用Abcam试剂盒(ab113350;Abcam Cambridge, UK)(阵列灵敏度<15 pg/mL)，根据制造商的说明。
在补偿和补偿模型的啮齿动物中循环IL-1α和IL-1β水平在25µL血浆中使用多重珠基免疫分析法(MILLIPLEX MAP细胞因子/趋化因子磁珠板;Merck Millipore, Darmstadt, Germany)的Luminex 100生物分析仪(Luminex, Austin, Texas)。23使用MILLIPLEX Analyst软件(Merck Millipore)分析读数，并使用五参数逻辑回归模型计算每个样品的浓度(pg/mL)。
cRNA微阵列
从大鼠肝脏和PBMC样品中进行RNA分离，如前所述。21互补RNA (cRNA)微阵列由OakLabs(全基因组基因表达服务，Hennigsdorf，德国)使用OakLab的microarray XS Agilent微阵列(Agilent Technologies, Santa Clara，美国)完成。综上所述，低输入快速Amp标记试剂盒(Agilent)用于创建荧光cRNA，基因表达杂交试剂盒(Agilent)用于微阵列上的杂交。荧光信号检测采用SureScan Microarray Scanner(安捷伦)。统计参数计算组之间，结果显示为折叠变化和可视化的热图。P值采用配对t检验计算，并根据自适应Benjamini-Hochberg程序进行校正。计算错误发现率，并用q值表示。仅使用q值较低(<0.05)的基因进行进一步分析。
信使RNA表达分析
使用标准技术从快速冷冻的小鼠肝脏和细胞样本中提取AD模型中的总RNA。随后，根据制造商的方案，使用TaqMan探针分析IL-1α (Rn.PT.58.35304224)和Rplp0(管家- rn . pt .39a.22214840) (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA)的基因表达。
统计分析
如果没有特别说明，数据以中值和范围或绝对频率和百分比表示。采用Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验进行非配对比较。采用受试者工作特征分析计算截止值。采用Kaplan-Meier曲线分析ACLF发育速率，并采用log-rank检验进行比较。单因素Cox回归用于鉴定致命性ACLF的预测因子。用多变量Cox回归评估单变量Cox回归中的显著预测因子，以确定独立预测因子。为避免多元Cox回归的多重共线性，本研究未同时纳入终末期肝病模型(Model for End-Stage Liver Disease, MELD)和cliff - c AD评分及其纳入参数。
与以前的研究不同，我们选择将所有患者纳入我们的分析，而不管基线IL浓度如何。为了评估ILs作为致命ACLF临床可行的生物标志物，我们因此选择将患者分为可检测到和不可检测到的il水平。
所有试验的显著性水平设置为p<0.05。采用SPSS V.25进行统计学分析。
结果
患者一般特征
纳入249例患者(73%为男性，74%为酒精性肝硬化，中位年龄60岁;在线补充表1)．Child-Pugh、MELD和cliff - c AD评分中位数分别为7(5-12)、10(6-25)和49(33-67)分。在入选时，根据国家酒精滥用和酒精中毒研究所(NIAAA)的标准，没有一名酒精性肝硬化患者发生急性酒精性肝损伤(至少有以下三种:6个月的主动酒精性酒精中毒，女性为>40 g/天，男性为>60 g/天，胆红素>3 mg/dL，天门冬氨酸转氨酶(AST) >50有意单位(IU)， AST/谷丙转氨酶(ALT) >1.4, AST或ALT >400 IE)。有病毒性肝炎的患者入组时未经治疗。
IL-1α和IL-1β分别在62例(25%)和78例(31%)患者中检测到(表1)．在检测水平的患者中，IL-1α的中位浓度为45.6 pg/mL(9.5-1573.8)和89.2 pg/mL(8.5-768.2)。在IL-1β可检测的人群中，其数量分别为73.8 pg/mL(4.1-622.9)和70.4 pg/mL (4.3-1180.5) (表1)．MELD分层的时间时代(2002-2011 vs 2012-2016)之间IL水平无显著差异(≤11 vs >11)，这表明在研究期间储存的血液样本中测量的细胞因子具有稳定性(在线补充表3)．
共有88例(35%)患者死亡。52例(58.5%)患者最常见的死亡原因为ACLF。其他较为常见的死亡原因是恶性肿瘤(11.2%)和心血管事件(14.6%)(在线补充表4)．在63.5%的病例中，ACLF的诱因是未知的。已知致死性ACLF最常见的诱因是感染，68.4%的患者(25%包括所有病例)(在线补充表5)．致死性ACLF的中位时间为17个月(0-137)。
补偿和补偿患者的特点
患者分为代偿(既往无AD)和代偿(既往有腹水)。51% (n=128)有肝硬化代偿，49% (n=121)有肝硬化代偿。
与补偿患者相比，补偿患者的中位MELD和cliff - c AD(包括其成分的差异)显著升高，血红蛋白、白蛋白和碱性磷酸酶(表1)．此外，大食管静脉曲张患者中代偿性肝硬化(14%，n=19)的比例(49%，n=59)高于代偿性肝硬化(14%，n=19)。
与补偿患者相比，补偿患者的ACLF致命率(31%，n=38 vs 11%， n=14)和总死亡率(51%，n=62 vs 23%， n=29)显著升高(表1)．在代偿性肝硬化患者中检测到IL-1α的比例为24%，在代偿性肝硬化患者中为26%。两组IL-1β检出比例分别为26%和37% (表1)．
致命性ACLF发展的预测因子
基于单变量和多变量Cox回归分析(表2和表3)，在补偿队列中，基线cliff - c AD (HR 1.106, p=0.052)、白蛋白(HR 0.872, p=0.010)和IL-1α (HR 1.248, p=0.013)是致命性ACLF的独立预测因子。在代偿性肝硬化中，IL-1β (HR 1.184, p=0.011)和cliff - c AD (HR 1.079, p=0.006)是致死性ACLF的唯一独立预测因子。
补偿和补偿患者血清IL水平与致命性ACLF发展的关系
与补偿患者相比，补偿患者表现出明显更高的ACLF致命率(图1一个)．发生致死性ACLF患者的促炎IL基线检出率明显较高(在线补充表6)．
致命ACLF发展的Kaplan-Meier曲线分层为(A)补偿和补偿患者;(B) cliff - c AD评分<50 vs≥50的患者;(C) IL-1α不可检测水平和cliff -C AD评分<50的代偿患者与IL-1α可检测水平和cliff -C AD评分≥50的代偿患者;(D) IL-1β不可检测水平和/或cliff - c AD评分<50的补偿患者与IL-1β可检测水平和cliff - c AD评分≥50的补偿患者。ACLF，急性-慢性肝衰竭;AD，急性失代偿;欧洲慢性肝衰竭研究基金会联合cliff - c;IL,白介素。
Kaplan-Meier曲线显示，在补偿患者中IL-1α和IL-1β检测到的患者中，致命性ACLF的发生率更高(在线补充图1A,B)．同样，cliff - c AD评分高(≥50分)的患者有更高的致命性ACLF (图1 b)．
在代偿患者中，IL-1α和IL-1β可检测和不可检测患者的致命性ACLF发展相似(网上补充图1A及B)．因此，为了对补偿组中风险最高的患者进行分层，我们将IL-1α检测与cliff - c AD评分相结合。数据显示，IL-1α检测水平和cliff - c AD≥50的患者死亡率明显较高(图1 c)．
同样，我们对修复患者的IL-1β和cliff - c AD评分进行了分层。Kaplan-Meier分析清楚地显示，IL-1β水平检测不到且cliff - c AD <50的患者有最好的结果(图1 d)．
致命性ACLF发展的受试者工作特征下面积(AUROC)分析显示，Child-Pugh评分、MELD、MELD- na和cliff - c AD评分的曲线下面积(AUC)高于单独的IL-1α和IL-1β。在补偿患者中，联合使用cliff - c AD和IL-1α，而在补偿患者中，联合使用cliff - c AD和IL-1β与单独使用cliff - c AD相比，AUC略高，因此分别为最高AUC (在线补充图2和3)．
外部军团
外部队列1
共纳入48例AD患者。中位年龄为59岁(18-80岁)，其中27例(56%)男性患者。肝硬化的主要病因为酒精(56%)。中位MELD为9例(7-26例)，大多数患者(75%)被分为Child-Pugh b期。随访期间，16例患者(33%)发生ACLF。发生ACLF的患者cliff - c AD评分明显高于未发生ACLF的患者(50 vs 45, p<0.05)。其他一般特征无显著差异。重要的是，使用高灵敏度检测，与未发生ACLF发展的患者相比，发生ACLF发展的患者IL-1β水平明显更高，更频繁地被检测到(69% vs 34%， p<0.05) (在线补充表7)．反之亦然，检测到IL-1β的患者ACLF发育率明显更高，证实了IL-1β在补偿患者中的作用(在线补充图4)．
外部队列2
共纳入279例AD患者(172例(61%)男性，平均年龄58岁)。主要病因为酒精性肝硬化(n=140, 50%)和慢性病毒性肝硬化(n=82, 29%)。共有178例(64%)患者在入院时患有ACLF。ACLF患者Child-Pugh(9±7比11±2)和MELD(16±6比27±7)均高于无ACLF患者。重要的是，与没有ACLF的患者相比，ACLF患者的IL-1α (60% vs 33%)和IL-1β (16% vs 8%)检测率显著高于ACLF患者。然而，与研究队列相比，IL-1β的检出率较低，这可能是由于使用了不同的、灵敏度较低的检测方法(在线补充表8)．
IL-1α在实验性肝硬化早期AD中的表达
在AD动物模型中(图2一个)，我们发现了肝IL-1α基因表达的早期反应，随后在LPS刺激4小时后全身释放IL-1α。24小时和72小时后表达量下降(图2 b, C)．
(A)急性失代偿期、代偿期和代偿期肝硬化动物模型示意图。(B)急性失代偿模型中IL-1α的肝脏基因表达。(C)急性失代偿模型中IL-1α的循环水平。(D) IL-1α在肝脏和PBMC补偿和补偿模型中的基因表达。(E)补偿和补偿模型中IL-1α的循环水平。(F)代偿和补偿模型中IL-1β在肝脏和PBMC中的基因表达。(G)代偿和复偿模型中IL-1β的循环水平。(H)补偿和补偿模型中PBMC和肝脏中IL-1α和IL-1β上下游信号通路基因表达热图。*P<0.05 vs补偿组，**P<0.005 vs补偿组。AD，急性失代偿;BDL，胆管结扎; Comp, compensated; d21, day 21; d28, day 28; IL, interleukin; LPS, lipopolysaccharide; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; Recomp, recompensated.
IL-1α和IL-1β在补偿实验模型中的表达
在评估IL-1α基因表达时，我们发现在肝脏中代偿和代偿模型之间没有差异，但与代偿动物相比，代偿后PBMC中IL-1α基因表达显著降低(图2 d)．两组之间血清水平无显著差异，提示IL-1α是AD的早期反应(图2 e)．
与代偿大鼠相比，代偿大鼠肝组织中IL-1β基因表达明显升高(图2 f)．两组PBMC基因表达差异无统计学意义(图2 f)．与补偿大鼠相比，补偿大鼠的血清IL-1β水平显著升高，表明一旦AD发生，IL-1β驱动的激活途径不同(图2 g)．
IL-1α和IL-1β信号的上游和下游表达的详细热图如图所示图2 h．在补偿大鼠PBMC中，IL-1β下游信号(IL1r1, Irak4, Traf6, Ikbkb, Ccl4, Vcam1)明显下调。IL-1α和IL-1β的上游信号传导也降低了。在肝组织中，IL-1β上游(Casp1)和下游(Irak4, Ccl4, Vcam1)信号通路在被偿大鼠中表达高于代偿大鼠(图2 h)．
讨论
这是第一个描述SI在临床上稳定的肝硬化患者中预测并可能诱导致命性ACLF的差异机制的研究。肝硬化代偿和代偿患者之间存在显著差异。在CANONIC和其他队列中，IL-6和IL-8与AD中ACLF的频率和严重程度密切相关。17这项研究补充了先前的证据，并表明在补偿患者中IL-1α和在补偿患者中IL-1β是致命性ACLF发展的独立预测因子。重要的是，实验动物模型支持这些发现。
虽然IL-1α和IL-1β属于同一个炎性体驱动il家族，作用于同一个受体(IL-1R1)，但它们在SI中发挥不同的作用。24 - 26日IL-1α在多种细胞类型(不仅是造血细胞)和位置(细胞质、细胞核和质膜)中具有组成性和诱导性表达。-此外，与亲il -1β相反，亲il -1α已经具有完全的生物活性。29 30由于这些特性，IL-1α引发任何炎症。24 25 31 32重要的是，它也通过非规范途径在炎症小体激活中释放。33该途径涉及脂多糖诱导的caspase-4/11的激活和gasdermin的激活，导致焦亡。34相比之下，IL-1β在补偿患者中被确定为致死性ACLF的独立危险因素，而在补偿患者中则不是，这突出了肝硬化SI的另一个有趣方面。肝硬化是持续和进行性炎症状态的结果，随着疾病的进展炎症激活增加，这一假设与最近的研究结果一致。我们观察了稳定补偿和补偿患者不同的炎症表型。然而，那些发生ACLF的AD患者表现出最多的SI异常标志物，表明炎症小体激活的“全面”炎症状态。18 35
我们的研究表明，补偿和补偿患者有不同的炎症小体激活途径和SI。我们假设，主要表现出高度免疫功能不全并发展为AD的患者即使在临床上得到了补偿，也会增加ACLF发展的风险。这一假设得到了补偿患者中较高的IL-1β检测率的支持，并且我们的实验结果进一步强调了这一假设，这些实验结果清楚地证明了补偿动物中IL-1β循环水平的升高，表明SI处于高状态。肝组织中特异性IL-1β基因表达的增加提示肝脏炎症是补偿后炎症状态升高的主要原因。
第一个外部队列(EC1)证实并强调了IL-1β在补偿中的结果，如研究队列中分析的那样。在这些由AD补偿的患者中，IL-1β的检测水平与ACLF的发展密切相关。此外，EC1通过证明IL-1β和典型炎症小体激活与补偿患者中所有(致命和非致命)ACLF的关联，补充了研究队列的结果。
第二个外部队列(EC2)代表表现为ACLF的肝病自然进展较晚期的患者。这些伴有ACLF的患者IL-1α和IL-1β的检出率提高了一倍，这与先前报道ACLF中促炎细胞因子释放成熟的研究一致。17日23EC2和研究队列之间IL-1β检出率的差异是由于在不同的实验室使用了不同的、灵敏度较低的检测方法，因为在ACLF中“充分”释放细胞因子时，高灵敏度的测量被认为是不必要的。然而，超过570例患者的所有三个队列(研究队列，EC1, EC2)的结果强调了肝硬化不同阶段的病理生理学和不同炎症小体激活的参与，与所使用的检测方法无关。重要的是，本研究不是为了描述疾病的生物标志物，而是详细阐述导致预后较差的病理生理机制。
总的来说，我们的发现不仅得到了外部队列的强调，而且在动物模型中也得到了很好的平行和证实，通过分析动物模型中的第一例AD，然后显示在补偿和补偿动物中IL1信号通路被类似地激活，与在患者中发现的相似。实验数据中的这一证实使我们相信，根据临床情况，肝硬化炎症小体系统的差异激活存在因果效应。我们期望这些结果可能有助于指导新的预防措施和寻找ACLF的治疗靶点。
研究表明，炎性小体，特别是核苷酸结合域富含亮氨酸重复序列蛋白3 (NLRP3)，除了激活裂解和释放IL-1β外，还需要启动。34 36在我们的动物模型中，这可能是我们的患者既往AD的影响，并由LPS刺激诱导。与补偿模型相比，在我们的补偿模型中IL-1受体1 (IL1R1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)的表达增加支持了这一点。TRAF6已被证明介导IL-1R信号诱导的NLRP3炎性小体的非转录启动。37最近，有研究表明，在肝硬化伴既往AD患者中，循环细胞死亡标志物(cK18, K18)水平显著降低。这可能反映了在没有AD病史的个体中显性细胞死亡(IL-1α)反应，但如果有AD病史则反映NLRP3反应(IL-1β)。38
另一种可能的病理生理机制可能是炎症小体激活的替代途径，这与典型或非典型途径不同。它由LPS刺激启动，独立于炎症小体的其他激活物。39 40然而，这些假设需要进一步研究。
正如预期的那样，MELD和cliff - c AD与致命性ACLF的发生有关。2 41 42然而，IL-1α和IL-1β的重要作用被进一步强调，它们的预测价值独立于MELD和cliff - c AD评分。评估代偿期和代偿期肝硬化患者的细胞因子谱，可能有助于识别除MELD和cliff - c AD外，有发展致命ACLF风险的患者。
我们的研究描述了一个具有良好特征和独特的队列，但有一些局限性。首先，我们在随访期间没有获得戒酒和抗病毒治疗的数据，也没有获得AD发作的数据，因此我们无法研究IL-1α和IL-1β在代偿期向失代偿期过渡中的作用。在本研究中，致命性ACLF是回顾性诊断的，因为在研究开始时ACLF还没有定义。因此，目前还没有关于潜在可逆性ACLF的更详细的数据，应该在未来的研究中进行研究。此外，只在纳入时测量血浆细胞因子水平。先前有报道称，白细胞介素的分布不均匀，且未检测到的白细胞介素的比率很高。17 18据我们所知，没有来自相同条件下患者的数据可用，由于在临床实践中我们不能排除患者，因此我们没有将患者排除在IL分析之外的事实是本研究的优势。另一个优势是来自实验性肝硬化模型和外部队列的支持数据。在目前的文献中，这种关于补偿和补偿患者中ACLF发展的翻译一致性数据是独一无二的。
结论
这项研究表明，在临床稳定的肝硬化患者中，IL-1α和1β的检测水平与ACLF发展的高风险相关。IL-1α是补偿患者ACLF发展的独立预测因子，IL-1β是补偿患者的危险因素，提示在人类和实验性肝硬化的不同状态下，典型和非典型炎症小体活化。
致谢
我们感谢Gudrun Hack出色的技术支持和Sabine Dentler的批判性阅读。
参考文献
脚注
SM, JG和FEU是联合第一作者。
推特@UschnerFrank， @R_Schierwagen， @drgautammehta
贡献者SofM, JG, FEU:数据的获取，数据的分析和解释，文稿的起草，统计分析。NK、JLM、RS、SK、CW、LS、CJ、JC、JA-Q、VA、RM、JF、FB、GM:对重要智力内容进行批判性修改。LLG, SorM, MP, JT:研究概念和设计，数据获取，数据分析和解释，手稿起草，关于重要智力内容的手稿批判性修订，资金接受者，行政，技术和物质支持，研究监督。LLG,SorM,MP,JT:作为最后一位作者贡献相同
资金作者得到了来自Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TRR57 P18, CRC 1382 A09, SFB 815 A5, SFB 1177 C02)， Ernst-und-Berta-Grimmke基金会，欧盟地平线2020研究和创新计划的GALAXY研究(no 668031)， LIVERHOPE (no 731875)， MICROB-PREDICT (no 825694)和Cellex基金会(PREDICT)的资助。资助者对研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备没有影响。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
患者发表同意书不是必需的。
伦理批准该研究获得了当地伦理委员会和数据保护局(J-No 2008-41-2020和HVH-2011-02)的批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据可用性声明所有与研究相关的数据都包含在文章中，或作为补充信息上传，或联系通讯作者即可获得。