条文本
PDF
文摘
客观的器官捐献者短缺,一个关键的挑战治疗终末期器官衰竭,有动机选择的发展策略来生成器官体外。在这里,我们的目标是描述hepatorganoids,肝组织模型生成的三维(3 d)生物打印HepaRG细胞和调查其肝脏功能在体外和体内。
设计3 d打印hepatorganoids (3 dp-hos)是利用HepaRG细胞构造和bioink,根据特定的3 d打印程序。肝脏功能3 dp-hos 7天的体外分化,后被发现,后来被移植到Fah-deficient老鼠。3 dp-hos的体内肝脏功能评估小鼠的生存时间和肝损伤,人体肝功能标记和人类debrisoquine代谢物生产。
结果3 dp-hos广泛获得肝脏功能,如白蛋白分泌,药物代谢和糖原存储经过7天的分化。移植后的腹腔华氏温标- / -Rag2- / -肝损伤小鼠模型,3 dp-hos进一步成熟和显示增加肝脏特异性蛋白质的合成。特别是,老鼠获得人类药物代谢活动。功能也形成于移植3 dp-hos血管系统,进一步提高3 dp-hos材料运输和肝脏功能。最重要的是,移植3 dp-hos显著提高小鼠的生存。
结论我们的研究结果表明综合原理的证明,表明3 dp-ho模型肝组织拥有体内肝移植后功能和减轻肝衰竭,这表明3 d生物打印可以用来生成人类肝脏组织的替代移植捐赠者治疗肝脏疾病。
- 肝衰竭
- 肝移植
- 肝功能检查
- 肝脏代谢
- 肝再生
这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和许可他们的衍生产品在不同的协议,提供了最初的工作是正确地引用,给出合适的信用,任何更改表示,非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
器官捐献者短缺是一个重要的挑战对治疗终末期器官衰竭。
三维(3 d) bioprinting-generated器官体外可能提供一种可能的解决方案。
然而,它仍然是一个挑战,成功地构建各种3 d bioprinting-generated功能器官,并将它们应用于再生医学。
有什么新发现吗?
3 d打印hepatorganoids (3 dp-hos)广泛获得肝脏功能,如白蛋白分泌,药物代谢和糖原存储后分化。
3 dp-hos延长小鼠的生存与肝衰竭和显示增加肝脏特异性蛋白质的合成。特别是,老鼠获得人类药物代谢活动。
功能性血管系统也在移植后3个月dp-hos形成,进一步加强材料运输的功能以及其他功能3 dp-hos。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究已阐明的潜在价值3 d生物打印技术在肝移植治疗。这种技术连同适当的细胞可以被用来制造人造器官,可以移植到体内,在体内发挥正常的生理功能,并提供新的解决方案来治疗某些疾病。
介绍
器官捐献者短缺,一个关键的挑战治疗终末期器官衰竭,有动机选择的发展策略,如三维(3 d)生物打印,生成器官体外。1 2尽管多年的生物打印技术的发展,它仍然是一个挑战,成功地构建各种3 d bioprinting-generated功能器官,并将它们应用于再生医学。3
有限的正交的肝移植,局部注射治疗体外肝支持和狭义的肝细胞不满足的医疗需求不断扩大的终末期肝病患者。4几十年来,许多一直努力为潜在生成功能细胞体外再生医学使用。5 - 9然而,这些细胞的功能空间组织组织或器官的结构仍然是一个主要障碍。10 - 13构建一个可靠的重要因素对移植肝瀑样体外包括:(1)足够的细胞在植入源与组织结构进行进一步的操作,(2)与高效传质三维微环境,保持肝脏特异性功能匹配那些体内,(3)易于处理和固定在移植。
在这项研究中,我们描述一个肝组织模型生成的3 d HepaRG细胞生物打印,14日15可移植体内功能。我们指定的这个模型作为“hepatorganoids”。HepaRG细胞,3 d打印的形式hepatorganoids (3 dp-hos)在体外分化成肝细胞;这些瀑样获得一些肝脏功能,如白蛋白分泌,药物代谢和糖原存储经过7天的分化。移植后3 dp-hos小鼠的腹腔内华氏温标- / -Rag2- / -(F / R)肝损伤小鼠模型;3 dp-hos进一步成熟,表现出增加肝脏特异性蛋白质的合成。特别是3 dp-hos获得特征与人类药物代谢在这些老鼠。功能性血管系统也形成于3 dp-hos在移植后14天,进一步支持材料运输的功能以及其他功能3 dp-hos。更重要的是,移植3 dp-hos显著提高治疗小鼠的生存。因此,我们的研究结果证明HepaRG细胞来源3 dp-hos,仿照肝组织,表现出成熟的肝移植后功能和减轻肝衰竭动物。这一发现表明,3 d打印的人类肝脏组织从正常肝细胞可以作为替代移植捐赠者治疗肝脏疾病。
材料和方法
3 d生物打印和3 dp-hos文化
提供的3 d细胞打印机(SPP1603) SUNP来制造体外肝脏结构之后,先前建立的方法。16简而言之,HepaRG细胞收获和准备悬浮在培养基中。细胞悬液和4%的海藻酸钠溶液混合的比例2:1 (v / v)。混合物在37℃培养5分钟,然后在适当的体积比20%的明胶溶液混合,导致最后1×10的细胞密度6/毫升。一毫升细胞/生物材料混合了无菌注射器23 G针和设置成3 d打印机控制温度。喷嘴和成形室的温度进行调整,以确定最优条件保持最高的细胞生存能力在印刷。培养皿直径35毫米的预镀0.0125‰(w / v) poly-L-Lysine (P8920;Sigma-Aldrich)收集印刷结构。每个3 dp-ho然后捏造了强迫挤压在一个150毫米3/分钟挤压速度分层技术的方式。3 dp-hos后来在100毫米氯化钙溶液浸泡3分钟交联的海藻酸钠溶液,然后转移到3毫升的充分补充高葡萄糖鹰杜尔贝科的修改中。3 dp-hos评估细胞存活,印刷后立即评估生产过程对细胞活力的影响。最初的文化是保持,直到第三天,后来改变了媒介二甲亚砜(DMSO)含有介质的蹩脚HepaRG分化的细胞。分化诱导了7天的变迁中每2天,紧随其后的是生化分析。提出了过程图1 a, B。(细节所示在线补充材料和方法)。
制造3 d HepaRG /水凝胶质量。(一)示意图说明3 d细胞的打印机。(B)插图3 d cell-printing过程的示意图。(C)细胞生存能力与各种明胶水凝胶成分和藻酸盐。(D) 3 D HepaRG /水凝胶结构的俯视图0(感应)和天10天(诱导DMSO溶液的浓度表示)。比例尺:1毫米。表达肝细胞标志蛋白,白蛋白(铝青铜,红色)和cholangiocyte标记蛋白质,CK19(绿色),通过免疫荧光染色法测定。酒吧规模:100µm。3 d三维;CK19,细胞角蛋白19; DMSO, dimethyl sulfoxide.
体外肝脏功能分析
体外肝脏功能通过以下方法:3 dp-hos评估水平的白蛋白,alpha -抗胰蛋白酶,第七因子和因子IX分泌物通过ELISA测定;蛋白质和mRNA的表达肝脏功能标记被免疫荧光检测和reverse-transcription-PCR (rt - PCR)和实时定量PCR (qPCR),分别;CYP1A2和CYP3A4活动3 dp-hos P450-Glo化验进行评估;和肝糖原储存和吸收功能由周期性acid-Schiff (PAS)染色,DiI-labelled乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)染色和吲哚菁绿(ICG)吸收和释放试验。(细节所示在线补充材料和方法)。
F / R老鼠和3 dp-hos移植
所有动物程序进行根据守则由国家卫生研究院和被委员会批准,我们医院的机构审查委员会。
F / R老鼠保持特定的无菌条件下。他们是美联储包含7.5×10的饮用水32 - (2-nitro-4-trifluoro-methylbenzoyl)−1毫克/毫升,3-cyclo-hexanedione (NTBCσ)。F / R小鼠的遗传背景是C57Bl6 / J * 129 sv。麻醉后,3 dp-hos被移植到腹腔的窝肠系膜覆盖着。他克莫司,而不是NTBC添加到饮用水(7.5×103毫克/毫升)术后。体重监测post-transplantation每周都去。幸存的接受者老鼠牺牲收集血液,3 dp-hos和肝移植后样品在3 - 4周。
体内肝脏功能分析
肝功能参数估计使用一个非盟5800自动分析器(贝克曼)在医院临床实验室。水平的氨基酸和人类药物代谢体内肝脏功能进行评估。(细节所示在线补充材料和方法)。
统计数据
所有数据都显示为均值±SD。对于大多数统计分析,未配对的学生的学习任务是用于这项研究。为生存的Mantel-Cox生存率较应用分析。统计分析采用SPSS 23.0软件(IBM)。被认为具有统计显著性差异p值低于0.05。对于所有的测试,数据从至少三个独立样本或实验重复三次。
结果
建设3 dp-hos
创建一个人类hepatorganoid显示肝脏功能,我们采用3 d生物打印的方法因为它的优势迅速产生一种微妙的结构在高分辨率、合并多种生物材料来模拟一个体内微环境(图1一个)。由于经验通过一个长期的技术发展与细胞外基质、氧气和营养支持3 d文化,各种细胞成功地应用在3 d生物打印形成特定功能的组织或器官组成的组件也很高的细胞群。17日至19日
cholangiocytes肝脏的肝细胞,间质细胞、免疫细胞、血管细胞和其他一些罕见的细胞类型。肝细胞和cholangiocytes导致大部分的肝脏功能。因此,我们选择HepaRG细胞能分化成功能性肝细胞和cholangiocytes。以前,成功3 d生物打印HepaRG细胞的报道,他们可以用来生成肝模型与体外感染病毒的能力。20.根据我们之前的工作、明胶和海藻酸被用来生成一个bioink由于其生物相容性,thermosensitivity与氯化钙和交联能力治疗后21日22维持结构的稳定性。为3 d生物打印hepatorganoids优化条件,我们首先测试了bioink各种比例的明胶、海藻酸以及打印温度。bioink明胶在低浓度(3%和5%)没有显示显著差异在印刷在细胞生存能力。然而,细胞生存能力下降时,bioink包含7%的明胶。此外,只有一半的细胞存活明胶的比例增加到10%时bioink (图1 c,在线补充图1和2)。HepaRG细胞连续扩散的三维打印的构造在体外的文化。我们指出,低比例的明胶bioink导致更高的细胞增殖(在线辅助图3)。考虑结构的形成,细胞生存能力,以及细胞增殖在长期的文化中,我们使用5%明胶和1%海藻酸bioink组成。
喷嘴温度的增加,形成空间的3 d细胞打印机导致细胞生存能力略高,但差异不显著。然而,增加喷嘴温度可以降低印刷三维构造的稳定性,因为thermosensitivity凝胶(在线补充图4和图5)。因此,在后续的实验中,我们打印3 dp-hos通过维持温度20℃的喷嘴和10℃形成空间。每个3 dp-ho形式的总统夫人刚性长方体结构10×10×3毫米3互联通道的直径约500µm促进充分的营养和氧气的传质,和清除代谢废物(在线辅助图6)。
模拟生理条件下,3 dp-hos培养3天,然后诱导分化的刺激下DMSO溶液的各种成分。14日23如数据所示,DMSO浓度的增加导致增加cholangiocytic谱系分化与增加细胞角蛋白19 (CK19) +细胞和CK19 mRNA表达(图1 d,在线辅助图7)。铝青铜+细胞在诱导条件下最丰富的有0.5% DMSO溶液;细胞的数量逐渐减少,DMSO浓度的增加。铝青铜mRNA表达诱导时最高1% DMSO但感应2% DMSO后大大降低。浓度的肝function-related蛋白质,如白蛋白、alpha -抗胰蛋白酶,文化因子七世和因子IX上层清液3 dp-hos各种诱导条件下,被ELISA检测评估。我们观察到,这些蛋白质的水平显著增加细胞中诱导0.5% DMSO相比与未分化HepaRG细胞(在线辅助图8)。值得注意的是,HepaRG 3 dp-hos细胞分化成铝青铜+肝细胞(82.5%±4.6%)后7天内的感应0.5% DMSO (图1 d)。此外,HepaRG诱导后细胞不断激增0.5% DMSO (在线辅助图9)。然而,长期的分化(21天)3 dp-hos减少细胞生存能力在线辅助图10)。因此,我们使用3 dp-hos分化在0.5% DMSO的7天(生物打印后10天)随后的体外和体内分析。
3 dp-hos体外肝脏功能
检测肝脏功能3 dp-hos肝特异性的瀑样进一步证实由qPCR评估肝脏特异性基因的表达分析。与未分化的细胞相比,二维(2 d)文化细胞和Matrigel-embedded 3 d细胞,3 dp-hos HepaRG细胞在体外分化为肝基因表达了最高水平(7天图2一个)。这种差异可能是由于更好的诱导肝脏特异性转录因子,包括FOXA2和HNF4A,在3 dp-hos (图2 b)。肝脏function-related 3 dp-hos和2 d之间的不同的文化表达蛋白质被免疫荧光检测。蛋白质的表达铝青铜,multidrug-resistance-associated蛋白质2,谷胱甘肽s-transferase和CYP3A4 HepaRG细胞3 dp-hos明显高于HepaRG细胞的2 d文化(在线辅助图11)。此外,3 dp-hos分泌白蛋白,alpha -抗胰蛋白酶,第七因子水平与主要的人类肝细胞(收购phh) (图2 c)。我们还观察到浓度的白蛋白的变化,alpha -抗胰蛋白酶,第七和第九因子在文化因素3 dp-hos的上层清液,不同时期体外培养(在线辅助图12)。肝脏的功能3 dp-hos培养2 - 3周后最高,然后逐渐下降。然而,收购phh 2 d文化细胞和Matrigel-embedded 3 d细胞培养时没能活下来的同一时期。
3 dp-hos函数体外(A, B)的肝标记基因表达定量PCR分析3 dp-hos经过7天的分化。结果被表示为±SD, n = 6。(C)白蛋白、alpha -抗胰蛋白酶因子VII水平文化上层清液由ELISA测定(n = 6)。(D) P450-Glo测定细胞色素的活动(CYP1A2, CYP3A4) 3 dp-hos经过7天的分化。结果被表示为平均数±标准差(n = 5)。(E)显微细胞图像质量在一个3 dp-ho(明亮的字段)。3)染色的formalin-fixed石蜡包埋dp-ho部分。(F)糖原存储由PAS染色;3 dp-hos DiI-ac-LDL吸收(红色)。国际危机组织(G)吸收和释放3 dp-hos(绿色)。 Scale bar, 100 µm. *P<0.05; ***P<0.001. 3DP-HOs, three-dimensional bioprinted hepatorganoids; DiI-ac-LDL, DiI-labelled acetylated low-density lipoprotein; DMSO, dimethyl sulfoxide; ICG, indocyanine green; PAS, periodic acid-Schiff; PHH, primary human hepatocytes.
为了演示3 dp-hos的解毒功能,为广泛的体外分析实验CYP酶进行。我们的研究结果表明,3 dp-hos收购CYP1A2和CYP3A4活动水平,同那些生活在收购phh (图2 d)。值得注意的是,3 dp-hos回应一些已知的诱导物,如苯巴比妥钠或利福平、增加CYP1A2和CYP3A4的活动。结果表明,几种CYP450基因的表达,包括CYP1A2,2 a6,2 b6,2C8,它们2制备过程,2 d6, 3 a4和3 a11增强与3-methylcholanthrene治疗后,苯巴比妥钠或利福平(在线辅助图13)。因此,我们证明3 dp-hos表达各种CYP450基因,而这种基因表达式可以进一步诱导高水平治疗后诱发。
形态学、细胞3 dp-hos增长以块的形式(图2 e)。如图所示细胞hepatorganoid糖原累积总量PAS染色(图2 f)。协调小组吸收和释放(图2 g)和DiI-ac-LDL进口还发现在3 dp-hos (图2 f)。这些结果表明3 dp-hos获得足够水平的体外DMSO-induced分化后肝脏功能。
3 dp-hos移植拯救Fah-deficient老鼠
分析3 dp-hos体内的功能,我们将3 dp-hos移植到腹腔内F / R的老鼠。的华氏温标- / -酪氨酸血症小鼠模型是一种行之有效的模型类型,酪氨酸metabolism-deficient疾病造成的损失函数fumaroylacetic酸水解酶。华氏温标- / -老鼠服用NTBC饮用水中抑制酪氨酸在肝细胞的有毒代谢产物的积累。24日25日可以看出NTBC撤军(NTBC-off)后,华氏温标- / -老鼠接受肝功能衰竭和死亡。为了避免免疫排斥,我们使用F / R小鼠,建立和用于我们的以前的工作。263 dp-hos移植后,NTBC政府立即停止诱发慢性肝损伤在F / R老鼠。25他克莫司(7.5×103毫克/毫升)口头管理日常进一步抑制免疫反应。F / R老鼠收到3 dp-hos明显延长生存和减少体重损失(图3 a, B)。在移植后4周,血清丙氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素、gamma-glutamyl转肽酶和碱性磷酸酶显著降低,表明3 dp-hos移植减轻肝脏损伤(图3 c)。组织学分析进一步证实小鼠肝脏与减少necrotic-like保持完整的肝脏结构损伤后3 dp-hos移植(在线辅助图14)。此外,3 dp-hos移植改善肝脏功能所观察到的血清水平的增加鼠标白蛋白、总蛋白、前白蛋白(图3 c)。调查机制,延长F / R老鼠的生存,我们检查了小鼠血清中氨基酸的水平。水平的谷氨酸、瓜氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和羟脯氨酸在F / R明显减少小鼠接受3 dp-hos移植与sham-operated老鼠相比(图3 d)。
移植与3 dp-hos救援华氏温标- / -Rag2- / -(F / R)不足的老鼠。(A) kaplan meier存活曲线3 dp-hos-transplanted老鼠(n = 13), sham-operated F / R (n = 7)老鼠,老鼠和控制F / R (n = 9)后NTBC撤军。(B) NTBC撤军后每周体重测量。数据提出了如平均数±标准差、t检验。(C)血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、铝青铜、直接胆红素(DBIL)、乳酸脱氢酶(LD)、gamma-glutamyl转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(稍后通知),白蛋白/球蛋白配给(A / G)和前白蛋白(PA)野生型(n = 6),小鼠sham-operated F / R (n = 6)和3 dp-hos-transplanted老鼠F / R (n = 5,血清收集在移植后4周)。数据提出了如平均数±标准差、t检验。(D)的血清水平表示氨基酸在野生型(n = 3),老鼠sham-operated F / R (n = 3)和3 dp-hos-transplanted老鼠F / R (n = 3,血清收集在移植后4周),t检验。* P < 0.05;* * P < 0.01;* * * P < 0.001。 ALB, albumin; 3DP-HOs, three-dimensional bioprinted hepatorganoids.
血液血管系统是一个关键系统,为组织提供营养和氧气。尽管血管是不包括在3 d生物打印,我们指出,3 dp-hos移植开始neovascularised移植后14天(数据没有显示)。通过注入fluorescein-conjugated右旋糖酐,新生血管性系统显然是视觉效果在3 dp-hos移植移植后4周(图4 a, B,在线辅助数据15 - 17日)。组织学分析还显示微血管3 dp-hos移植(在线辅助图15)。免疫荧光染色进一步证实了鼠标的表达CD31在3 dp-hos移植,这表明血管系统鼠标派生(在线辅助图16)。因此,3 dp-hos移植功能以及neovascularised体内,这确保了长期的功能3 dp-hos (在线辅助数据17 - 18)。
人类的肝脏3 dp-hos的函数华氏温标- / -Rag2- / -(F / R)老鼠。(一)宏观观察移植3 dp-hos(上半部分)。右旋糖酐灌注后显示了血管系统。µm酒吧,规模500人。图描绘了右旋糖酐(B)灌注显示功能血管形成和红色荧光显示人类铝青铜表达式4周。µm酒吧,规模200人。(C)血清白蛋白水平,alpha -抗胰蛋白酶,第七因子和因子IX的ELISA测定野生型(n = 6), sham-operated F / R (n = 6)的老鼠,老鼠3 dp-hos-transplanted F / R (n = 5,血清收集在移植后4周),t检验。(D)人类debrisoquine代谢物生产(平均数±标准差,n = 6, t检验)。* P < 0.05;* * P < 0.01。 3DP-HOs, three-dimensional bioprinted hepatorganoids.
接下来,我们牺牲了3 dp-hos移植F / R老鼠在移植后4周分析3 dp-hos移植的功能。分化HepaRG 3 dp-hos移植细胞表达白蛋白(图4 b)。重要的是,大量的白蛋白,alpha -抗胰蛋白酶因子七世和IX因子也发现小鼠的血清中移植3 dp-hos 4周(图4 c)。分析药物的代谢活动,F / R小鼠移植3 dp-hos debrisoquine挑战,这是容易在人类新陈代谢而不是老鼠。药物治疗后,生产人类代谢物4-hydroxydebrisoquine (4-OH-DEB)明显高于血清样本收集从小鼠移植3 dp-hos (图4 d)。
讨论
作为一个有吸引力的和有前途的技术,3 d生物打印逐渐被应用于生理组织/器官功能的发展近年来,包括骨骼、心脏、肾脏、血管等。27 28基于先前的报道,15 29我们使用HepaRG,常用的肝祖细胞,构建一个由3 d生物打印和人类肝脏组织首先应用它来延长小鼠肝衰竭的生存。我们的研究结果表明,移植3 dp-hos可以有效地进行体内肝分化从早期到成熟阶段的肝脏器官发生和减轻肝衰竭动物移植后受者。这些研究结果还指出,3 d bioprinting-generated肝组织从正常的人类肝细胞可能发挥重要作用在晚期肝脏疾病的治疗。
的过程中不断优化印刷过程中,我们发现bioink的浓度、温度的喷嘴,形成空间有重要影响细胞的存活率和耐用性的三维结构。尝试几种不同的条件后,现有的印刷工艺参数测定。肝脏体外模型制成一个刚性的长方体结构10×10×3毫米3(12层)的大小,相互联系的直径约500µm渠道,考虑到这一事实细胞居住少于200µm离最近的血管,体内,由于氧气扩散的限制。30.
根据我们的初步研究,HepaRG细胞选择从几个细胞候选人在考虑为3 d生物打印细胞生物打印后生存能力的过程。最近,据报道,HepaRG细胞可用于3 d生物打印生成肝感染病毒的体外模型。20.在本研究中,我们显示3 d生物打印的显著改善肝组织。在我们的过程中,HepaRG细胞3 d打印的构造,证明了稳定的增长,逐渐形成球状体文化(7天期间在线辅助图19)。值得注意的是,白蛋白表达式和CYP3A4的活动3 dp-hos与收购phh的水平。我们的结果证明,3 d生物打印过程和bioink用于当前的研究是优化和选择执行几个pre-experiments后,获得更高的增长,生存能力和功能的细胞。
在这项研究中,HepaRG细胞迅速扩散和转化成球状体和3 d打印模型中提出了一个克隆细胞生长潜力比单层生长。此外,更高级的球状体保持在3 d打印模型(图1)由于传质通过互联电网结构,那里有一个充分的和连续的氧气供应细胞嵌入到打印从不同方向构造。然而,HepaRG三明治文化表现出非均匀3 d细胞集群的形成和分布,因为氧只能提供从顶部和代谢废物容易积累在水凝胶内部,导致文化条件不足的传质(在线辅助图19)。3 d细胞的增长集群文化系统以不同的方式构造和矩阵进一步检查。发现细胞集群的直径在3 dp-hos组明显大于bioink的3 d三明治文化矩阵组和基底膜基质的3 d三明治文化矩阵组7天后文化在体外(在线辅助图19)。这一结果表明,细胞培养环境由3 d生物打印更有利于HepaRG细胞增殖和分化,进而对肝细胞功能的进一步发展奠定了基础。这一发现进一步证实了体外肝脏功能3 dp-hos。当HepaRG细胞来源3 dp-hos与2 d组织结构文化相比,所有的肝基因的表达水平和肝脏特异性转录因子3 dp-hos高于二维结构,和蛋白质分泌和解毒功能的水平也更高。
维护良好的生长和功能后3 dp-hos证明在体外实验中,他们被移植入小鼠;小鼠的存活时间显著延长,特别是显示3 dp-hos血管的存在。每个收件人是移植3 dp-ho含有大约5×105肝细胞腹腔。通过这些移植的肝细胞活跃的肝脏功能减轻肝损伤在F / R老鼠和长期生存。众所周知,肝细胞是非常健壮的,和一个有限数量的细胞能够执行生物功能的整个身体。肝脏在人类占体重的3% - -5%。成年人体重60公斤,肝脏重量大约是1.5 - 2公斤,其中肝细胞的数量约为3.57×1011,占总数的1%的人体细胞。31日成年小鼠的肝脏重量约为5.2 g,占总数的26.0%体重约7×108肝细胞。32延长liver-deficient老鼠的寿命需要一定数量的对正常肝细胞分解代谢。5×105人类肝细胞中包含3 dp-hos足以扮演这一角色,从而证明这些人类肝细胞合适liver-related功能。大量的细胞操作和积累会导致细胞死亡的细胞如果没有充足氧气和营养血管转移。然而,在3 dp-hos,细胞被嵌入在一个富氧水凝胶与相互联系的晶格结构,促进传质维持细胞生存能力和功能。因此,即使有相对较少的细胞和细胞密度低,3 d打印的构造功能很好。
生成一个可移植的3 d bioprinting-generated肝脏器官为临床治疗仍是一个长期目标。然而,我们成功完成了一个重要的一步̵̵第一步证明3 dp-hos体内肝脏功能和移植3 dp-hos也可以拯救肝脏衰竭小鼠模型。应该提到,我们的研究是有限的,我们只使用一种类型的肝细胞,HepaRG细胞系,为建设3 dp-hos,展示我们的概念证明。总的来说,先进的3 d生物打印技术仍处于研究和发展的早期阶段。在初始阶段,我们的研究中,我们测试了数个肝细胞为3 d生物打印,包括收购phh,胎儿肝细胞,修改后的肝癌细胞株HepG2-GS-CYP3A4和HepaRG细胞。然而,他们中的大多数人没有必要的特征用于这个相对复杂的过程。尤其是收购phh印刷后的存活率太低(小于10%),和胎儿肝细胞的体外肝脏功能和HepG2细胞行也不令人满意。在所有这些测试主要细胞细胞系,HepaRG细胞系是收购phh最合适的选择,因为它具有类似的代谢和形态属性。因此,它经常利用代谢或细胞生物学研究。14日15在我们的后续研究中,因此,HepaRG细胞主要是选择生物打印,尽管其他细胞部分用于这个研究进一步支持我们的概念证明。我们意识到HepaRG细胞不能直接使用在人类身上,但我们的数据证实了我们的方法的优越性在建立3 d bioprinting-generated肝组织或器官及其临床潜力。相信在医学和生物学领域的发展在未来,更合适的细胞可以作为生物工程组织供体细胞或种子细胞,如各种诱导多功能干细胞细胞组织细胞。具体地说,我们研究相关技术的发展在人类肝细胞体外培养的操纵将大大帮助我们创造改善临床移植3 d打印的肝组织或器官,这反过来将有助于开发新的临床治疗肝脏疾病的方法。
总之,我们明显修改3 d生物打印过程和成功打印一个稳定的3 d体外肝脏瀑样,进行系统化的肝脏功能在体外和体内。采用移植化验,我们表现出的证明原理对应用3 d打印的人类肝脏组织的移植捐赠者。除了使用在临床移植,他们可能也适用于作为救援桥过渡肝衰竭肝再生或作为补充对广泛肝切除术切除和临时维护肝脏移植的等待期期间。
引用
脚注
HY, LS, YP和DH同样起到了推波助澜的作用。
贡献者YM, WS和PH值构思这个项目。HY, LS, YP和DH执行大部分的实验。YP和SM优化3 dp-hos的印刷过程。YW, y, YZ和SD 3 dp-hos的体外功能分析。HZhao和3 dp-hos TC基因表达分析。XL, x,深圳,XW HZhang设计实验描述3 dp-hos体内功能。衔接、LS、HX和WP进行体内实验。HY, LS, YM WS和PH值分析了数据。HY, PH值、HZhang和YP写的手稿。
资金这项工作是由国家支持的高科技研究与开发项目(863)(no.2015AA020303),中国国家基础研究计划973项目资助(2015 cb553802)和凸轮医学科学创新基金(CIFMS) (no.2016 - i2m - 1 - 001)。这项工作也支持由战略重点项目(SPP)空间科学(没有。项目(没有XDA15014300), 111。B17026),中国科技部(最多;2019 yfa0801501 2016 yfa0100500),中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委;31970687,31970687,31522038,51805294,81730078),ShanghaiTech启动格兰特Pengyu黄和国际科技项目(2016 yfe0107100)。
相互竞争的利益3 d生物是由健康生物医学公司提供。
病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。
病人同意出版不是必需的。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
数据可用性声明所有数据都包含在相关研究文章或上传在线补充信息。其他数据都可以在合理的请求。