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文摘
客观的ATM丝氨酸/苏氨酸激酶(ATM)是最常见的突变基因DNA损伤反应,参与同源重组(人力资源),在胰腺导管腺癌(PDAC)。
设计组合协同筛选了奋进号genotype-tailored靶向治疗。
结果协同抑制PARP被发现,ATR和DNA-PKcs (PAD)导致小鼠和人PDAC ATM-deficient合成杀伤力。机械化、PAD-induced PARP捕获复制叉停滞和有丝分裂缺陷导致P53-mediated细胞凋亡。最重要的是,化学抑制ATM tslp人类PDAC细胞向垫与长期肿瘤控制体内。最后,我们预期和阐明PARP抑制剂阻力通过全外显子组测序在ATM-null背景。引起细胞非整倍体,进行了epithelial-mesenchymal-transition和收购了多药耐药性(MDR)由于upregulation药物转运蛋白在DNA修复机制和旁路。这些功能观察镜像拷贝数变化影响一个地区的5号染色体组成的几个调节MDR基因。使用这些结果,我们最终提出替代策略来克服阻力。
结论分析分子脆弱的感情由ATM缺乏PDAC允许高效突变特异组合治疗方法的精化genotype-independent的方式也可以实现ATM抑制。
- 胰腺肿瘤
- DNA损伤
- 耐药性
- 胰腺癌
- 胰腺
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
ATM丝氨酸/苏氨酸激酶(自动取款机)是著名的DNA损伤反应的同源重组(人力资源)。
ATM (EMT)缺乏促进epithelial-mesenchymal过渡,基因组不稳定和惨淡的胰腺导管腺癌的预后(PDAC)。
PARP抑制是有效的在ATM-deficient PDAC但引起早期药物抗性。
有什么新发现吗?
PARP ATM不足引发巨大的敏感性,ATR和DNA-PKcs (PAD)抑制疗法在老鼠和人类的模型系统。
垫了药物的协同作用使最优化的治疗剂量。
ATM抑制将HR-defectiveness (HRDness)PDAC。
化学抗性的PARP抑制ATM-deficient PDAC upregulation时产生的多药耐药性转运蛋白和EMT。
PARP抑制药物抗性可以针对ATM-deficient PDAC。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
三重垫抑制是一种很有前途的新治疗方案的接受治疗的临床评价ATM-mutant PDAC。
介绍
胰腺导管腺癌预后(PDAC)令人沮丧的现在,几十年来,尽管一些治疗的进步。不存在有效的筛选方法,早期的罕见肿瘤检测和阻止许多病人潜在的治疗手术。1因此,PDAC死亡率呈上升趋势,而其他恶性肿瘤的死亡率正在下降。2 3这发生在一种改进的理解的PDAC生物学,尚未被翻译成一个真正的临床益处。4intertumourous和intratumourous异质性的PDAC代表的一个主要障碍的有效治疗这种疾病。司机突变致癌等喀斯特似乎并不是目前制药和剂量依赖性启动旅客突变,这进一步促进与亚种群有明显的mutagenomes异质性。5因此,迫切需要新的治疗概念消除不同积累genotype-independent的方式。这种方法可能是选择性干扰DNA损伤反应(DDR)机械。
基于转录组学技术的进步使得集群和基因组的改变,但全谱的PDAC尚未完全捕获。6一个特别积极的PDAC形式,称为不稳定的亚型,应该是敏感的对铂治疗,并且经常港口等DDR基因的突变BRCA1/2和自动取款机(ATM丝氨酸/苏氨酸激酶)。7这样有害突变频繁发生遗传突变体细胞也8虽然对治疗的影响尚不清楚。因此,针对DDR基因和最终渲染肿瘤分子肿瘤学的DDR缺陷是一个客观证明的数十名正在进行的DDR抑制剂试验,虽然主要是处理non-pancreatic癌症。9日10PDAC,目前的标准治疗方案FOLFIRINOX(叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康和铂)窝藏DDR似乎特别有效的肿瘤基因突变。11日12最近,第一tangible-targeted治疗PDAC报道作为生殖系的维持治疗BRCA1/2突变PDAC。PARP抑制剂治疗olaparib在维护环境导致无进展生存(PFS)的两倍。然而,这种效应是与不良事件率与剂量限制进一步升级。12符合观察铂敏感,总生存期(OS)与FOLFIRINOX自己到目前为止是最好的临床试验报告。12然而,乳腺癌易感基因1或BRCA2不是最常见的突变DDR基因在零星的PDAC一般西方人口。自动取款机多达5%的零星的PDAC突变13和运营的关键酶同源重组(人力资源)修理、安装善意的HR-defective (HRDness)14PDAC模型。15我们组之前表明ATM不足,即使在杂合的删除,导致转移性和侵略性的PDAC接受epithelial-mesenchymal过渡(EMT),负面影响预后在人类和老鼠。10 16然而,这样的攻击性会与受损的DNA修复能力造成脆弱性对,例如,PARP抑制。10日17同样,PARP, MEK和DNA拓扑异构酶抑制剂表现出ATM-deficient具体功效non-pancreatic癌症。18 - 20获得性耐PARP抑制,导致无情地药物失败,似乎是一个常见的长期治疗的限制。21此外,在马球试验,PARP抑制剂只有长期PFS迄今为止没有任何操作系统改善。因此,临床仍需要更高效的组合作为PARP抑制剂与化疗引起显著的毒性。17因此,在治疗上利用新方法是必要的HRDness对病人没有升级的毒性。当前的研究识别和剖析制药漏洞与协同操作信号通路HR-defective PDAC模仿通过ATM不足。此外,我们将提出一个概念HRDness任何人类PDAC ATM抑制,分子解剖PARP抑制耐药性并提出替代的治疗策略,可以考虑。
材料和方法
CRISPR / Cas9
生成自动取款机不足米娅PaCa-2 PANC-1细胞系,pCas9_GFP质粒和两个gRNA-harbouring表达质粒。pCas9_GFP质粒是礼物Kiran Musunuru (Addgene质粒# 44719)。导游RNA (gRNA)窝藏质粒是由插入特定gRNA目标序列(gRNA1: 5“-GATTTGACACTTCCCGGAAG-3”;gRNA2: 5“-CTCTGAGATGCGAGTTCGTG-3”)到一个空gRNA表达载体,这是一个礼物从乔治教堂(Addgene质粒# 41824)。转染进行200年000个细胞(6-well格式,猎鹰)使用15µg质粒DNA(即5µg的质粒)和7.5µL Lipofectamine 2000转染试剂(热费希尔科学)反应根据制造商的协议。简而言之,200µL plasmid-containing DMEM和200µL Lipofectamine-containing DMEM和孵化在室温下10分钟。细胞转染通过添加plasmid-Lipofectamine混合物。24小时后,介质被完全培养基刷新。3天后,GFP-positive细胞被fluorescence-activated细胞分类排序(BD FACSAria三世,BD生物科学)和被播种在96孔板单个细胞。结果克隆细胞株筛选自动取款机删除由定性PCR与基因组DNA。两个独立的定性PCR反应进行放大或者内部碎片(Int-fw 5“-CCTCTCTACGTCCCTAGCCT-3”;Int-rev 5 -TCCCTGTAAGTAGAGGCCCA-3)表示自动取款机删除或外部碎片(Ext-fw 5“-TCGTCAATTCAGAGGCTCGT-3”;Ext-rev 5“-GCAAACTTTTCTGGTGGGCT-3”;寡核苷酸的侧面自动取款机外显子2到4)证明外显子2的删除,3和4 CRISPR / Cas9因此,指示自动取款机删除。存在两种扩增子的克隆细胞株为杂合的表示自动取款机删除(自动取款机+ /Δ),而外部带的存在只表示纯合子自动取款机删除(自动取款机Δ/Δ)。自动取款机+ / +克隆细胞系(即,只有内部碎片放大)被用作CRISPR / Cas9-control细胞系。自动取款机删除(自动取款机+ /Δ和自动取款机Δ/Δ进一步验证了测序(欧陆坊)外部的扩增子和对齐的自动取款机基因序列(基因库加入号码:U82828.1)导致6777年到6791年英国石油公司在不同的跨越鸿沟自动取款机+ /Δ或自动取款机Δ/Δ克隆细胞系。
指导rna(得分> 85%)使用的指导设计工具设计https://crispr.mit.edu(麻省理工学院)和从Synthego购买。
RNA干扰
Lig1降价是通过使用慢病毒RNA干扰基于矢量的策略。Lig1shRNA向量(TRCN0000071153)购买的shRNA Sigma-Aldrich使命。慢病毒是如前所述。22
细胞生存能力分析
细胞被播种在96 -孔板(2000或4000细胞)。细胞治疗3天,24小时后播种。细胞生存能力进行了分析与MTT试验(Sigma-Aldrich)根据制造商的协议。在590纳米波长吸光度测量使用分光光度计(Tecan无限M200 Pro)。生存能力的百分比被正常化vehicle-treated细胞生存能力。最大抑制浓度(IC的一半50)是由GraphPad棱镜软件(GraphPad软件公司)。细胞生存能力的热图生成使用R软件(统计计算的R项目)。黄色代表100%的细胞生存能力和午夜蓝色代表0%的细胞生存能力。数据被表示为意味着至少两个独立的实验在至少两个独立的KC细胞系,执行两个独立AKC细胞系,两个独立AKPC细胞系,两个独立KPC细胞系,两个独立的R-AKC细胞系,两个独立的自动取款机+ / +米娅PaCa-2细胞系,两个独立的自动取款机+ /Δ米娅PaCa-2细胞系,两个独立的自动取款机+ / +PANC-1细胞系或两个独立的自动取款机+ /ΔPANC-1细胞系。
潜在的药物协同作用决定了没有任何的互动能力(ZIP)分析SynergyFinder使用在线软件(https://synergyfinder.fimm.fi/)。23
协同建模
我们调查了所有有效的联合行动评估水平采用卢安克相加性标准,24零互动的定义是在哪里
(d一个dB结合剂D一个DB剂单独使用时产生同样的效果)。我们使用了median-effect方程
和获得的参数一个和米利用非线性回归的测量单一的代理。洛伊可加性零交互响应面25然后通过求解方程计算吗
为给定迭代剂量组合。我们开发了一个新的软件来扩展这种方法通过加入第三剂以组合在一个固定的剂量水平。单剂都配有median-effect剂量响应曲线的影响。二维零互动响应表面有无第三剂然后集成到一个单一的情节。最后,实验数据被覆盖,使直接比较两个和三个代理模型。此外,实验数据之间的差异和影响预期的零互动两个和三个代理模型计算和形象化。
发现新生的DNA合成
DNA纤维扩散试验进行了如前所述。26nucleotide-labelling之前,细胞要么使用dna - pk抑制剂cc - 115 (30 nM) 6小时或车辆的控制。之后,细胞被另外要么co-treated 1小时与ATR抑制剂ve - 821 (10 nM)或车辆的控制。然后,细胞被贴上了CldU(20µM 5-chloro-2-deoxyuridine, Sigma-Aldrich) 20分钟,洗两次与之前prewarmed PBS标签细胞诱导器(200µM 5-iodo-2-deoxyuridine, Sigma-Aldrich) 20分钟。相应的抑制剂治疗(阿,DNA-PKi或阿特+ DNA PKi)一直在整个实验。此外,在诱导器标签,细胞要么co-treated PARP抑制剂olaparib(300海里)或其控制的车辆。随后,细胞被洗,收获和resuspended冰冷PBS。二千零五细胞被转移到一个幻灯片,细胞溶解6µL 0.5% SDS, 200毫米Tris-HCl, pH值7.4,50 mM EDTA和孵化了6分钟。幻灯片在室温下倾斜大约30°允许DNA通过重力,传播风干7分钟,固定为5分钟3:1甲醇:乙酸、空气干7分钟并存储在一夜之间70%的乙醇在4°C。之后,幻灯片被处理为变性/ deproteination 2.5 N HCl 1小时,其次是免疫荧光染色。DNA纤维成像和DNA纤维跟踪长度与日本基恩士bz - 9000测量分析仪。
复制伸长速率测量进行叉(双色的,CldU-IdU)轨道长度分析(> 800纤维)。原因清晰,只有IdU-track长度显示。评估复制叉停滞,叉不对称决定。因此,更长时间的比值与较短的跟踪计算。增加的比率CldU / IdU或者IdU / CldU表明停滞在轨道长度的差异可能是由于停滞在较短的轨道。27
结果
自动取款机基因突变在人类PDAC
首先,我们评估cBioPortal可用的基因组数据集的体细胞DDR基因突变在人类零星PDAC。事实上,60(8.9%)的670个样本中至少有一个突变DDR基因(来自八个小组DDR基因7)。最常见的突变基因自动取款机38.3%的DDR突变(23/60)和总体变异率为3.4% (23/670)(图1一个)。相比之下,BRCA2和乳腺癌易感基因1突变分别排名第二和第四(1.5%和1.0%;图1一个),使自动取款机突变PDAC目标相关的子类型。从PanCancer胰腺癌突变的分析研究也证实自动取款机作为最常见的基因突变DDR (25 DDR肿大面板之间的基因;在线辅助图S1A)。我们也重新审视的一组研究调查PDAC遗传突变和再次发现自动取款机最常见的突变基因的DDR集团(24/1,441;在线补充表1)。8 28 2927不同自动取款机突变是PDAC数据库中描述。它们中的大多数都是删除突变局部的n端,而错义突变主要是集群内的功能域(脂肪、PI3K和FATC) (在线辅助图印地C)。此外,自动取款机是最常见的突变DDR基因在8个不同的癌症类型,率超过5%,因此呈现高度相关的基因型特定干预吗30.(在线辅助图S1D)。
定制筛选识别ATM-deficient漏洞
评估genotype-specific漏洞的决心(i)最优传统化疗诱导方案和(2)最好的靶向治疗,一个系统的药物屏幕进行几个ATM-deficient (一个tmfl / fl;LSL -K拉G12D / +;Ptf1aCre / +,AKC)与ATM-proficient (一个tm+ / +;LSL -K拉G12D / +;Ptf1aCre / +,KC)主要鼠PDAC细胞。10 1645临床化疗药物批准或小分子抑制剂,大多数都是无效的或non-genotype特定的方式操作。然而,一些药物显示更高的活动ATM-deficient细胞(图1 b)。验证了系统的一个子集IC的决心50浓度和克隆细胞集落形成试验。目前,联合治疗方案(i) nab-paclitaxel +吉西他滨和(2)FOLFIRINOX代表关心的标准治疗转移性PDAC患者。31日有趣的是,无论是白金代理和氟尿嘧啶(研究者用)和吉西他滨和紫杉醇genotype-specific的方式(图1 b;在线辅助图S2A-F;数据没有显示10)。有趣的是,屏幕和验证实验表明,ATM-deficient PDAC可以优先的目标DNA拓扑异构酶抑制剂伊立替康(TOP1抑制剂)和依托泊苷(TOP2抑制剂)在体外和体内,后者在裸小鼠皮下实验中实现以及凸轮(绒毛膜尿囊的膜)化验(在线辅助图S3A-I在淋巴瘤),之前报道。32同样,在使用的靶向治疗,一组有限的信号在AKC抑制剂表现出更高的细胞毒性细胞(在线辅助图S2G-L)。MEK抑制似乎目标基于clonogenicity化验结果在AKC细胞(在线辅助图S2H肺癌)指向数据报告。20.然而,其选择性靶向能力不是证实了IC50测定(在线辅助图S2G)。值得注意的是,代理可能增加DNA损伤在AKC明显多于KC细胞操作,支持我们先前的研究结果显示,ATR和PARP抑制与ATM-deficiency综合致命7 33(图1 c)。这些数据表明,药物干扰DDR机械如PARP抑制剂的设置是最有效的一个突变自动取款机基因预测治疗反应。
协同干扰DNA修复机制不稳定的PDAC专门目标
基于单DDR抑制治疗的成功率可能会受到阻力由于补偿途径,药物毒性和缺乏可靠的响应预测。21综合利用漏洞(我)寻找一个致命的交互在给定PDAC基因型和/或(ii)协同应用药物之间的相互作用可以提高疗效和耐受性(图1 d)。各种抑制剂或抑制方案被称为一个“我“最后有针对性的分子,例如,PARP我。为了确定药物的协同作用,我们使用SynergyFinder,这是基于没有任何的互动能力(ZIP)模型(图1 d-f)。在测试药物从我们定制屏幕,没有观察到AKC-specific PARP之间的合作我和CHEK1 / CHEK2我,PARP我和MEK我,PARP我和TOP1我和PARP我和TOP2我(在线辅助图S4A-H)。相比之下,以低剂量高合作特别是在AKC可以观察到抑制PARP (olaparib, PARP相结合我)和ATR (ve - 822, ATR我)(图1胃肠道;在线辅助图S4I)。ATR的抑制剂(ATR我)允许多达五次PARP进一步减少剂量我在AKC细胞(图1 h)。类似的协同交互结合PARP上被发现我和DNA-PKcs抑制(称为dna - pk我)(图1 j-l;在线辅助图S4J)。PARP的综合治疗我和dna - pk我允许大量减少5 - 10倍的每个代理与单一药物治疗(图1 k)。以类似的方式,获得协同效应也当结合ATR我和dna - pk我(图1 m-o;在线辅助图S4K)。最大利用药物的协同作用,以进一步降低单个药物的浓度,我们滴定ATR我和dna - pk我亚致死剂量的PARP我olaparib。达到同一水平的细胞毒性效应(> 70%),显著减少剂量是可能的100倍和5倍剂量减少ATR我和dna - pk我亚致死的PARP时分别我剂量增加了(图1 p-r)。three-agent模型扩展这一分析,我们开发了一个新的治疗算法结合第三剂以固定剂量水平(PARP组合我1µM)。我们观察到大量偏差(−0.15)没有任何的互动响应面PARP我,表明最优协同效应在低剂量范围内的三个专门当药物自动取款机删除(图1年代)。证实了这些发现,我们执行一个额外的使用MuSyC多维协同分析,一个软件工具,分别评估协同效力和效率。34虽然ATR我和dna - pk我表现出协同功效(β> 0)和协同效力(α> 0)只有在AKC细胞,最高的协同的PARP后观察疗效我在AKC细胞,降低成本,但仍然协同效力(图1 t)。每个药物(PARP的优化剂量我,ATR我和dna - pk我),然后测试clonogenicity化验,进一步确凿的每个协同组合(图1,L, O和R)。这些数据表明,ATM-deficient胰腺癌依赖DNA-PKcs和ATR PARP的设置我为了保护DNA恒定性。10 35同时PARP的低剂量三联疗法我,ATR我和dna - pk我将被称为垫。
确定垫方案会在体内设置有效,KC和AKC南卡罗来纳州建立同种异体体内和垫治疗的效果比较图2一个)。对KC移植相比,AKC垫治疗肿瘤生长明显受阻,导致较小的肿瘤时未经处理的小鼠的恶化导致实验终止(图2 b和C)。与此同时,有明显诱导的DNA损伤(H2AX p-S319)和细胞凋亡在AKC肿瘤垫治疗与KC同行相比图2 d-f)。
垫引起DNA损伤和非整倍性ATM-deficient PDAC细胞
我们接下来研究了体外的分子机制垫在AKC导致更有效的肿瘤抑制作用与KC肿瘤。实际上,双链断裂的数量(双边带)取决于数量的H2AX p-S139-positive细胞流式细胞术在KC细胞保持不变,而AKC细胞显示2.1倍(分别为71.5%vs34.4%;p = 0.0093)增加垫治疗(图3 a和B)。双边带和PARP主要积累我和dna - pk我治疗,但不是在ATR我,显示最高的协同增强垫三重抑制(在线辅助图S5A, B)。测试是否缺ATM生成一个HR-deficiency表型,我们调查的关键人力资源修复因子RAD51。在不的情况下,AKC RAD51-positive疫源地细胞显示显著少于KC细胞(图3 c和D)。相比之下,垫治疗后,AKC细胞显示RAD51疫源地的可比数字KC细胞(图3 c和D),但增加了H2AX p-S139水平(图3 a和B),这表明ATM不足可能产生选择性影响能力形成RAD51核蛋白质纤维在双边带网站。类似的结果在评估核RAD51疫源地CCNA-positive细胞(S / g2期细胞的替代标记;数据未显示),不包括一个简单的细胞周期变化。为了确定DNA修复能力通过替代HR-deficient AKC细胞DNA修复途径与KC细胞相比,我们测量双边带维修频率年底总异源加入(NHEJ)或长串退火(SSA) (图3 e)。虽然总NHEJ能力的测量显示基因型之间无显著差异,ATM显然缺乏导致不准确的de-repression SSA通路(图3 e)。总之,我们在PDAC确实将证明ATM删除HRDness导致DNA损伤累积对基因毒性治疗。
因此,中期利差表明更多的结构畸变等染色单体PAD-treated AKC的融合比KC细胞(在线辅助图S5C-E)。在低剂量治疗,这些畸变似乎PARP引起的我和协同ATR我加上dna - pk我在AKC细胞。未解决的DNA损伤等双边带和复制中间体可以传播到有丝分裂染色体隔离随后创建缺陷,然后触发传输到下一个有丝分裂后细胞凋亡。36的确,垫治疗导致大幅增加的有丝分裂畸变等落后染色体和后期缺陷(图3 f和G)。一致,AKC细胞微核、多核细胞表现出显著增加垫治疗与KC细胞(图3 h;在线辅助图S5F, G)。Micro-nucleation和multi-nucleation形态有丝分裂灾难的迹象,这一过程对有丝分裂异常导致细胞死亡的一个不可逆过程,可以通过复制驱动压力。37事实上,细胞表现出核酸变化视为有丝分裂灾难事件(如> 2微核或叶38)观察只有在PAD-treated AKC细胞(图3 j)。
DNA复制动力学及其分子在垫治疗的后果
Oncogene-induced复制应力一直被认为是一个潜在的致命弱点的癌细胞。39垫治疗效果的深入分析,我们分析了DNA复制动力学在KC和AKC化验使用DNA纤维细胞(图4一)。ATM缺乏PDAC细胞加速DNA复制(图4 b),如之前我们组报道。10长/短轨道计算的比率来衡量叉不对称,我们发现KC细胞比例> 1,最有可能反映oncogene-induced复制压力。27AKC细胞还显示跟踪比率> 1,但降低值与KC相比细胞(图4 c)。然后分析了DNA复制抑制剂干预后纤维。单身,结合dna - pk我和ATR我引起显著缩短DNA复制跟踪独立于ATM状态(图4 b)。无论ATR的严重我全身的复制表型,叉KC仍可检测放缓的影响与AKC细胞,表明不同的行动模式ATM和ATR叉速度。相反,ATM-dependent效应不再出现在dna - pk的存在我,这表明一个上位关系与DNA-PKcs ATM。两个dna - pk我和ATR我治疗加剧了叉不对称AKC细胞(图4 c),可能由于基因损伤增加一般为叉运动产生障碍。恶化的压力通过额外的治疗PARP DNA复制我几乎没有引发DNA复制动态的改变。然而,值得注意的是,PARP治疗我中和ATM的影响缺乏在ATR DNA复制的速度我- - - dna - pk我治疗细胞(图4 b)。Olaparib会导致PARP捕获染色质和复制叉崩溃,这可能会干扰DNA复制特别是过度起源由于ATR射击我。40 41事实上,垫治疗引起的最明显PARP捕获(图4 d)。同样有趣的是,任意组合的三种药物增加PARP绑定到DNA, DNA - pk我独自在AKC细胞也有极大的影响。正如所料,在KC细胞(PARP绑定不明显图4 d)。最后,我们评估了P53信号分子垫治疗的后果。AKC细胞显示增加磷酸化丝氨酸18 (P53 p-S18)和P53与PARP的稳定我和垫治疗。这表明P53仍由残余ATR和激活DNA-PKcs活动DDR的一部分,后基因毒性压力或独立于这些PI3K-related激酶32(图4 e和F)。我们还观察到规范化P53基因目标Mdm2和p21Cip1目标以及pro-apoptotic P53基因(即伯灵顿,Bak1和病因)在PAD-treated AKC显著调节与KC细胞以及P53基因等目标Trp53inp1,42进而可以使磷酸化P53在ATM / ATR / DNA-PKcs-independent方式43(图4 f)。地址如果P53调解至关重要的细胞毒性效应,我们生成的胰腺癌细胞株AKC老鼠的失活Trp53在AKC的老鼠(一个tmfl / fl;Trp53fl / fl;LSL -K拉G12D / +;Ptf1aCre / +,称为“AKPC”tumour-bearing老鼠(鼠标应变不同的研究的一部分))和各自孤立的胰腺肿瘤细胞系(图4 g和H)。事实上,AKPC细胞显示减毒细胞死亡反应(图4我)与P53-proficient AKC同行相比,表明P53参与PAD-induced凋亡(图4 e, F和J)。然而,有关比例ATM-deleted细胞似乎也执行P53-independent细胞死亡途径所显示micro-nucleated和multi-nucleated细胞的存在表明异常的有丝分裂后细胞有丝分裂灾难垫基因毒性引起的压力(图3 f j;在线辅助图S5F-G),这表明P53是一个重要的但不是唯一的检查点在调解治疗导致细胞死亡在DDR抑制ATM-deficient PDAC (图4 j)。
遗传和化学ATM失活利用HRDness在人类PDAC
来确定我们的发现是人类PDAC有关,一个或两个自动取款机米娅PaCa-2等位基因被删除,PANC-1胰腺癌细胞系使用CRISPR / Cas9方法(在线辅助图S6A-D)。删除自动取款机向PARP敏感我在这些人类PDAC细胞系(图5一个;在线辅助图S6E)。使用压缩模型,我们证实了协同对ATR的影响我和dna - pk我在自动取款机杂合子(自动取款机+ /Δ)PDAC细胞,尽管高olaparib剂量被要求与小鼠相比同行(图5 b和C;在线辅助图S6F)。垫治疗人类的PDAC南卡罗来纳州异种移植导致显著抑制肿瘤生长伴随着选择性诱导H2AX p-S139磷酸化和细胞死亡自动取款机+ /Δ肿瘤(图5 d)。相反,monoallelic biallelic截断的躯体自动取款机也敏感人类PDAC单一PARP细胞系我和垫治疗(图5 g;在线补充图S6E、F、H)。
根据我们的发现,我们想知道ATM抑制可能有效地呈现野生型PDAC细胞敏感垫治疗,从而延长PDAC的目标人群对这种治疗方法可能的候选人。为了验证这个假设,我们使用两个临床级ATM抑制剂(ATM我),要么PARP组合在一起我单独或与垫和检查治疗反应在ATM野生型PDAC细胞(图5 h-j;在线辅助图S6G-H)。自动取款机(ATM抑制我)+垫治疗更有效比垫monoallelic的上下文中自动取款机删除,比ATM更有效我显示没有功效作为单一疗法。这个方案很有效测试体内,导致弗兰克肿瘤回归与垫或自动取款机我在这个模型中(图5 km)。组织学分析显示治疗肿瘤积累巨大的双边带4个毒品治疗(图5 n和O)。值得注意的是,自动取款机我本身已经显著增加的基线水平H2AX p-S139-positive信号ATM-proficient MIA PaCa-2细胞(图5 n和O)。垫的毒性是通过监测评估在小鼠减肥治疗。至少在一些裸体Foxn1ν老鼠,负面影响达到20%的极限(定义为道德端点)指向潜在的相关毒性的方案,尽管其显著的功效(图5 p)。
诱导HRDness在相关的临床前模型系统
提供证据的临床相关的人体模型系统,自动取款机我加垫方案被验证在一组5 patient-derived瀑样(pdo)随机选择从22 pdo库孤立肝转移活检。pdo是派生的病人都是第四阶段PDAC首次治疗,不管他们的检查自动取款机的地位。随后他们接受FOLFIRINOX治疗临床性能(每图6)。ATM抑制敏感所有pdo垫所揭示的增加细胞死亡比例(CDR44;图6 c)和增加DNA损伤(H2AX p-S139),但较低的扩散(KI67) (图6 d)。有趣的是,PDO # 5是唯一样本对垫治疗没有ATM抑制(图6 c和E),尽管增加后者仍然显著增加细胞死亡率(图6 c)。面板序列这一特定瀑样线显示众多第三类基因突变(不清楚意义)在DDR(例如,乳腺癌易感基因1,MSH6,FANCE)以及四级/ V的突变喀斯特,FLT1和TP53(图6 f)。有缺陷的人力资源与小indels和基因组重组但现在还可以与碱基替换模式。45 46这些模式可以使用捕获相关(突变分析工具箱)分析。事实上,PDO # 5显示DDR签名的余弦相似性得分为0.391分。支持假设垫治疗是一种有效的治疗策略,DDR PDAC缺陷,我们使用PDO细胞系孤立的自动取款机突变PDAC (ATM p.R3008H;归类为四级)。正如预测的那样,独自垫导致大量细胞死亡(图6 g和H),这进一步增加了自动取款机(ATM抑制我)(图6克),这表明ATM的剩余活动R3008H蛋白质。免疫荧光分析H2AX p-S139水平证明重要的DNA损伤积累后治疗(图6 h)。瀑样隔绝patient-derived异种移植片整体确认垫+ ATM的效率我方案(在线辅助图7 a - c)。
最后,我们测试了体内垫+ ATM的响应能力我在一组10 patient-derived PDAC异种移植(pdx) (图7 a和B)。评价肿瘤反应根据显示稳定的疾病的患者的临床标准6 10 PDX和部分反应4 10 PDX,其中没有一个通过累进疾病根据RECIST标准阈值(图7 c)。相反,自动取款机我加垫导致全肿瘤控制甚至肿瘤收缩长期的时间(图7 d和H;在线辅助图S8)。与此同时,免疫染色显示高水平的双边带和增加细胞凋亡在肿瘤治疗与vehicle-treated控件(相比图7 eg和i (k)。根据不良事件造成的裸体Foxn1ν老鼠(图5 p),我们进一步探讨了ATM的毒性资料我加垫方案在免疫活性的C57BL / 6 j小鼠。有趣的是,两个星期的治疗导致显著的减肥和其他伦理研究的端点(例如,虚脱,呼吸困难,缺乏警觉)在治疗小鼠(图7 l和M)。因此,外周血(PB)测试显示只有轻微的贫血白细胞减少,但没有证据(图7 n)或修改造血的祖人口(在线辅助图S9A)。综合骨髓表现型显示减少B细胞计数和嗜中性都反映在PB (在线辅助图S9B)。有趣的是,没有双边带堆积在肠道和肝脏样本,表明健康细胞可以通过ATM妥善应对基因毒性应激诱导我加垫(在线辅助图S9C, D)。然而,由于较低的啮齿动物模型提供的预测价值,潜在的人类的毒性预测垫治疗和自动取款机我必须采取预防措施。此外,我们的评估不良事件主要强调在急性毒性和并未直接评估长期副作用。不过,这些结果表明,化学和遗传ATM抑制需要垫治疗敏感性解偶联效率从DDR缺乏背景副作用有限的免疫活性的老鼠。
多层次的机制保证PARP-inhibitor抵抗HR-deficient PDAC
长期维护与PARP单一疗法我已经被证明可以促进抵抗收购作为non-pancreatic肿瘤已经显示。10 47机制的阐明耐olaparib ATM-deficient PDAC, PARP我多重细胞(称为PARPi-res-AKC在文本中,缩写说明原因R-AKC在生成的(数据)图8)。电阻被确认可行性和clonogenicity化验,甚至持续olaparib删除后(图8 b和C)。PARP我-res-AKC细胞表现出受损的扩散与积累在G2 / M期细胞,非整倍性,增加了基因改变(图8 d)。这些观察与持久化PARP我阻力以外的药物释放建议永久性遗传而不是临时改变。因此,我们进行全外显子组测序(韦斯)一组父母和PARP我indels -res-AKC细胞暴露增加,但更加明显,更多的单核苷酸变异(SNV)以及拷贝数改变(CNA)耐药(图8 h)。有趣的是,我们观察到一个结构畸变模式与放大某一特定轨迹描述的一致Abcb1扩增子48在PARP我-res-AKC (图8 i和J)。许多基因是位于这个轨迹(5 A1;5 3.43厘米地区老鼠基因组;7 q21.12地区人类基因组),例如,Abcb1,Abcb4,斯里兰卡,Dbf4,所有先前与tumourigenesis和多药耐药性(MDR)在各种癌症。48RNA序列随后qPCR验证证实,PARP结构放大模式我-res-AKC细胞直接转化为转录upregulation MDR基因包括Abcb1(凋亡),Abcg2(Brcp)(图8 k和L;在线辅助图S10A-D)。此外,我们发现三个谷胱甘肽S-transferase酶(如问题,经常在PARP癌症)调节我多重细胞(图8米),这表明一个额外的安全由于解毒的增加最终应用化疗。49
耐药性可能另外伴随着epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)的收购计划16个50和自动取款机删除驱动EMT PDAC已被证明。10 16 51事实上,PARP我-res-AKC间充质细胞出现形态比父母同行(图9)。这个观察证实了转录分析(图9 b;在线辅助图S10A-C, E)、EMT概略介绍表现型(图9 c和D),和迁移分析(图9 e)。值得注意的是,复杂重排模式与有丝分裂错误会引发肿瘤的同时逃避积累导致高度侵略性的PDAC。52因此,韦斯上执行这些细胞的证据表明,可能表明克隆进化在获得性耐药(在线辅助图S11)。
功能调查这一假设,我们回头挑战PARP我-res-AKC细胞与药物从定制屏幕中描述图1 b。因此,我们证实了基因和转录特征(图8我)的PARP我-res-AKC细胞大部分的药物,虽然活跃在父母同行,没有发挥相关活动符合MDR (图9 f)。值得注意的是,各种药物基质的至少一个描述射流转运蛋白(种代号为ABCB1的如olaparib和伊立替康)。额外的证据是由化学抑制药物转运蛋白种代号为ABCB1的(和ABCG2抑制elacridar),部分恢复敏感性对垫治疗(图9克)。Lig1,PARP DNA连接酶,调节我-res-AKC细胞表明一个角色在抵抗过程中DNA连接酶(图9 h;在线辅助图S10A)。同样,建立了其他成员的DDR PARP调节我-res-AKC细胞Fancd2(FA / BRCA通路),管理(MGMT-mediated DNA修复)Paxip1(NHEJ) (在线辅助图S12A)表明一个upregulation替代DDR组件可能会抵消DNA损伤的高水平。然而,药物抵消这种剩余end-joining双边带修复途径(AKC alternative-end加入(A-EJ))细胞(图3 e),21如dna - pk我,DNA连接酶抑制剂(L67)或ATR 1/3我,是克服PARP无效我伽马辐射电阻,甚至与辐射剂量增加10 Gy(数据没有显示;在线辅助图S12B)。功能测试的角色LIG1调解治疗抵抗,shRNA击倒LIG1 PARP中执行我-res-AKC细胞(在线辅助图S12C)。有趣的是,LIG1击倒垫的效果增加了部分恢复响应(图9我)。观察到的MDR,垫在sh的功效Lig1parp我-res-AKC时显著提高细胞结合elacridar或克拉霉素(种代号为ABCB1的抑制剂的和CYP3A) (图9我)。这些数据表明,长期PARP我单一疗法在ATM-deficient PDAC会导致一个复杂的抗性机制,LIG1起着推波助澜的作用(图9 j)。
讨论
双边带需要快速和有效的对策如人力资源,避免致命性癌症细胞。这就解释了潜在的单在HRD PARP抑制剂治疗肿瘤的基本原理由突变引起的,例如,BRCA1/2或自动取款机。,PARP我(即olaparib)维持疗法最近报道作为生殖系第一个靶向治疗BRCA1/2变异转移性胰腺癌(马球试验)。12然而,BRCA1/2突变包括只有一个子集的所谓的基因组不稳定的PDAC亚型,7而突变自动取款机占了大约三分之一的DDR的突变基因。此外,在未经选择的群组,自动取款机突变发生一样频繁BRCA1/2在生殖系突变PDAC突变。事实上,最近的一项研究分析测序数据从生殖系17 152名癌症患者的血液和匹配肿瘤组织发现,PARP抑制剂的敏感性是由癌症类型决定的,而不是由体细胞或生殖系的起源BRCA1/2突变。53因此,乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌被列为BRCA-associated癌症类型显示HR-deficiency和随后的PARP抑制剂的响应能力。53最终,生殖系或体细胞自动取款机突变应该引起HR-deficiency PDAC和属性相同的漏洞。从力学上看,自动取款机删除在PDAC确实提升HRDness与肿瘤细胞依靠替代DDR SSA等途径。行,一个人力资源SSA转变的公分母BRCA1/2突变细胞,也是在lymphoblastoid细胞系中描述失调性毛细管扩张症患者窝藏biallelic自动取款机突变。54因此,靶向治疗ATM-deficient PDAC或感光策略导致具体漏洞non-DDR-gene-mutated PDAC可能相关的治疗模式。这里,我们筛选药物专门针对ATM-deficient PDAC (i)来确定候选后续协同交互和(2)降低药物毒性和提高效率的组合。设计了三重通路抑制剂疗法(PAD)是同样有效的一组小鼠和人PDAC临床前模型包括pdo和pdx。更准确地说,仅垫方案似乎是普遍有效的HR-deficient PDAC和杠杆BRCAness或更好的改进HRDness例如genotype-independent的方式响应率的化学ATM抑制。因此,我们证明复杂的筛选方法利用两种药物的协同作用和合成杀伤力DDR-targeting PDAC治疗疗法可能会打开一个新时代。最后,长期的后果PARP抑制阐述了在ATM-deficient PDAC连同各自的策略来解决这个问题。因此,我们的研究提供了一个潜在的路线图来延长治疗选择在不同的PDAC亚型。
在这项研究中,我们确定了一些药物,操作,作为单一代理商或组合,与ATM-deficiency综合致命的状态。有趣的是,在传统的化疗没有采取了genotype-specific除了TOP1抑制剂伊立替康。这是符合角色的ATM / TDP1-pathway TOP1乳沟复合物从DNA去除。32对比与乳腺癌易感基因1突变PDAC,7自动取款机突变不需要有更高的敏感性对任何以铂为基础的化疗。单个组件的FOLFIRINOX方案仍然有效,尽管不是ATM-deficiency-tailored,这应该考虑方案一线治疗的病人。我们测试了一组靶向治疗时,DNA修复抑制代理显然站在最有效的单药治疗。然而,在这种环境下,DDR抑制剂经常缺乏持续响应指向内在/获得性耐药或仍然足够DDR维护DNA完整性的能力。值得注意的是,MEK抑制剂,前所述ATM-deficient具体地在肺癌,没有有效的单独或结合DNA修复抑制剂,表明不同的通路PDAC上瘾。我们的工作,而旨在设计一个组合药物疗法为治疗效益提供保留耐受性,插图的毒性试验在野生型老鼠执行。事实上,使用自动取款机(ATM抑制剂进行治疗我)+垫引起白细胞减少,但没有贫血,证明这种方法可以被认为是未来的主要概念在人类PDAC治疗。55然而,目前尚不清楚什么是扩展我们的短期治疗试验能预测人类的毒性可能需要治疗几个月。最近的报告表明PARP抑制作为标准来维持治疗反应在突变基因不稳定的PDAC至少在gBRCA1/2和功能型也在自动取款机缺乏PDACs。10我们的屏幕上还发现了PARP抑制剂定制药物作为协同组合疗法最有效的骨干针对剩余的DNA修复途径ATM-deficient PDAC。努力开发更有效的PARP抑制剂或PARG / PARylation或者目标56将最有可能的扩展和加强PARP的潜力我。在DDR抑制剂,PARP最高我合作与dna - pk的观察我和ATR我。这个三角合作的识别是一个新开发的协助下,先进的计算工具允许不同的协同行动的评估在一个多维空间。始终,它曾表明,依靠DNA-PKcs ATM-deficient肿瘤57ATR不足,复制应激反应的一个关键球员,与增殖细胞的杀伤力。35唯一的ATR或DNA-PKcs抑制被报道是很强的,58然而常常伴随着严重的副作用,可以大大限制其使用。在这里,通过大幅降低用PARP抑制剂的用量和组合我、高效和可容忍的协同鸡尾酒对ATM-deficient PDAC阐述。我们的研究利用复制叉稳定性的概念作为一个主要和协同攻击的目标板。59这个效果可以解释为计划外起源的报道影响发射由于ATR抑制和双边带持久性停滞叉由于ATM和DNA - pk的抑制功能,这完全加剧复制的压力和DNA损伤最终导致基因组不稳定性和死亡。的连续PAD-induced凋亡ATM-deficient PDAC细胞至少部分由P53,尽管P53-independent机制可能导致肿瘤细胞有丝分裂灾难控制TP53突变PDX。然而,一些细胞可能逃脱PARP治疗,因此会产生耐药性我揭示了缓慢的细胞增殖、表型和非整倍性。后者最有可能的结果PARP1 / PARylation函数在有丝分裂检查点的监管。36 56到目前为止,PARP的机制我电阻在PDAC尚未研究。有丝分裂过程的PARP放缓我多重细胞(R-AKC) PARP较少有关我的细胞毒性,解释最初的收购一步阻力。36Olaparib电阻的差别往往会有对这些基因等53 bp160或与BRCA回复突变。61年然而,尽管在大多数BRCA只研究一个抵抗细胞死亡机制对策,PARP我治疗上几个潜在的阻力水平至少在ATM-deficient PDAC,其中LIG1发挥潜在的作用。有趣的是,我们还观察到增加EMT在AKC表型16在进化的PARP我阻力。然而,我们的工作提供了一个列表的路线图向PARP的另类消除策略我多重细胞(R-AKC)细胞通过抑制调节药物转运蛋白或针对alternative-end加入通路。分馏和交替治疗方案也可以纳入治疗的设置。62年因此,我们的数据表明,PARP我单一疗法需要监控的小心,因为它会引发普遍耐药不可避免地呈现后续策略效率低下。总之,我们提供一个新的治疗方案,数据,可以利用有效的目标自动取款机人类PDAC突变体,结合ATM抑制,可以延长垫的使用方案治疗non-HRD胰腺癌。
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我们非常感谢库恩Elektro-Technik GmbH支持我们的研究胰腺癌作斗争。作者感谢Alica K Beutel,丽莎哈曼,丽莎Hofbauer,凯特琳科恩,拉尔夫Kohntop,克劳迪娅Langle,迈克尔•K Melzer Aref Saed, Lakshmi Sarojam, Elena Tschistjakow桑德拉Widmann和Eleni齐默杰出的技术支持。他们也感谢教授托马斯·F E巴斯输入他的专业知识和对人类病理学。作者感谢克里斯蒂娜Diepold她体内绒毛膜尿囊的膜化验技术援助,莎拉Kostezka DNA纤维分析图像的量化,蒂姆博士会怎样帮助科学交流,凯瑟琳·林赛对她的帮助用英语编辑和科学讨论和莎拉博士带有愤怒的核心设施血细胞计数,乌尔姆大学医学中心为她在流式细胞仪技术援助。作者感谢动物设施平台Tierforschungszentrum,乌尔姆大学,其成员为动物保健。
引用
脚注
詹和LP同样起到了推波助澜的作用。
p(和AK同样起到了推波助澜的作用。
贡献者概念和设计:詹,LP,毫米,LW, p(和正义与发展党。开发方法:詹,LP,毫米,FA, MI,某人,SL, TE, SM和p (。收购数据(提供动物、收购和管理患者,提供设施,等等):詹,LP,毫米,FA, MI,某人,SL, KS,长官,AZ, TE,千瓦,攻读,BS, PCH,呃,SM, NA, AL, DS和p (。分析和解释数据(例如,统计分析、生物统计学、计算分析):詹,LP,毫米,FA, MI, SL,某人,SL,呃,JMK, TE, SM, MW,在野阵营,LW和p (。写作,审查和/或修订手稿:詹,LP,毫米,FA, MW, DS, TS, LW, RR, p(和正义与发展党。行政、技术或材料支持:詹,LP,毫米,FA, MI,某人,SL, TE, MMu, SM和p (。研究监督:p(和正义与发展党。
资金主要由德国癌症提供援助资金拨款AK (111879)。额外的资金来自德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)“Sachbeihilfe”(KL 2544/1-1、1 - 2、5 - 1、7 - 1)和“Heisenberg-Programm”(KL 2544/6-1)的Baden-Wurttemberg-Foundation ExPoChip和INDIMED-Verbund PancChip。正义与发展党、FA、MI,某人,LW和TS主要研究者或学生DFG GRK抢劫RTG优先资助的2254/1。正义与发展党Else-Kroner-Fresenius卓越的。乌尔姆大学的LP Bausteinprogramm收到资金的。PCH支持德国癌症的马克斯•埃德尔奖学金援助(111746),德国癌症援助重点项目“平移肿瘤学”70112505和格兰特合作研究中心(316249678 - 1279年SFB)的德国研究基金会。嗯收到了来自德国癌症的资金援助(PiPAC, 70112505)和Volkswagenstiftung /科学与文化在下萨克森州(ZN3222)。这项工作也支持的德意志Forschungsgemeinschaft NA (AZ.96/1-3),由德意志Krebshilfe(111264)德国癌症和艾尔援助优先项目转化LW肿瘤学(70112504)。
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