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内窥镜检查的消息
在1期概念验证研究中，使用靶向荧光七肽对Barrett瘤的多内镜成像
  1. 陈京1，
  2. 杨江2，
  3. Tse-Shao常3.，
  4. 学者Joshi1，
  5. 胡安周1，
  6. 乔尔·H·鲁宾斯坦1，
  7. Erik J Wamsteker1，
  8. 理查德·S·权1，
  9. 亨利Appelman4，
  10. 大卫·G·比尔5，
  11. 丹尼尔·K·特金1，
  12. Eric J Seibel6，
  13. 托马斯·王1，3.，7
  1. 1内科医学，密歇根大学，安阿伯，密歇根美国
  2. 2生物医学工程，华盛顿大学，西雅图，佤邦美国
  3. 3.机械工程，密歇根大学，安阿伯，密歇根美国
  4. 4病理，密歇根大学，安阿伯，密歇根美国
  5. 5胸外科，密歇根大学，安阿伯，密歇根美国
  6. 6机械工程，华盛顿大学，西雅图，佤邦美国
  7. 7生物医学工程，密歇根大学，安阿伯，心肌梗死美国
  1. 对应到Thomas D Wang博士，密歇根大学内科，美国密歇根州安娜堡48109;thomaswa在}{umich.edu

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-322945

数据来自Altmetric.com

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    消息

    巴雷特食道(BE)引起的早期癌症检测方法仍然需要改进。BE患者的成像分子表达模式可以靶向瘤变。我们展示了一种多重荧光成像方法，用两种EGFR和ErbB2特异性荧光标记七肽检测癌前病变。22例BE患者采用多模态扫描纤维内窥镜(mmSFE)进行内窥镜成像。在这项初步研究中，92%的肿瘤病变可以通过病理对比成像，只有11%的假阳性。这项首次在人体中进行的研究证明了同时检测体内多个靶点的可行性，以及早期检测分子异质性癌症的潜力。

    Iniedmore细节

    背景

    食道腺癌(EAC)是一种致命的疾病，在过去的几十年里发病率急剧上升。1 2用白光照明和随机活检的内镜筛查受到抽样误差的限制。3.发育不良常表现为扁平结构和斑块状分布。4EGFR和ErbB2是跨膜酪氨酸激酶受体，刺激上皮细胞的生长、增殖和分化。5这些靶点的过度表达反映了癌症进展的更高风险。6 - 8多重成像方法利用了可见光和近红外(NIR)方案的广谱光。我们的目的是证明在体内同时观察EGFR和ErbB2表达以检测Barrett瘤变的临床可行性。

    方法

    本研究招募了接受Barrett瘤变评估或治疗的连续患者(NCT03589443)。设计了一种可同时采集多路荧光图像的mmSFE。计算每个荧光图像的目标/背景(T/B)比。有关方法和多路复用成像技术的更多细节，请参阅在线补充文件。

    结果

    EGFR特异性的QRHKPRE肽通过GGGSK连接子用Cy5标记，(图1一个)。9ErbB2特异性的KSPNPRF通过GGGSC连接子用irdy800标记(图1 b)。10选择这些荧光团是为了尽量减少吸收光谱和发射光谱之间的重叠(图1 c)。荧光标记肽的特性和稳定性显示在在线补充表S1-S4。药理学/毒理学研究显示动物没有急性不良反应(在线补充表S5和S6)。在n=25人中进行了一期安全性研究，两种肽的实验室结果、尿液分析和心电图均未发现异常，且未发现不良事件。

    Fluorescently labelled peptides for multiplexed imaging. Biochemical structures are shown for (A) QRH*-Cy5 and (B) KSP*-IRDye800. (C) Peak absorbance of QRH*-Cy5 and KSP*-IRDye800 occurs at abs=648 and 776 nm, respectively. Peak fluorescence emits at em=675 and 812 nm, respectively. (D) Schematic diagram for the multimodal scanning fibre endoscope (mmSFE) is shown. Excitation at ex=638 and 785 nm is delivered through a single-mode fibre (SMF) that is scanned in a spiral pattern by a piezo tube actuator. The beam is focused onto the tissue surface (illumination plane) by a lens assembly. (E) Fluorescence is collected by a ring of large core multi-mode fibres (MMF) mounted around the instrument periphery. (F) The dimensions of the rigid tip are 9 mm in length and 2.4 mm in diameter. (G) This instrument passes forward through the 2.7 mm working channel of a standard medical endoscope (Olympus #GIF-HQ190). (H) The system is contained within a portable cart.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    用于多重成像的荧光标记多肽。(A) QRH*-Cy5和(B) KSP*- irdy800的生化结构。(C) QRH*-Cy5和KSP*- irdy800的吸光峰分别出现在abs=648和776 nm处。峰值荧光分别在em=675和812 nm处发射。(D)多模态扫描纤维内窥镜(mmSFE)示意图。ex=638和785 nm的激发通过单模光纤(SMF)传递，该光纤由压电管驱动器以螺旋模式扫描。光束通过透镜组件聚焦到组织表面(照明平面)。(E)荧光由安装在仪器外围的大芯多模光纤(MMF)环收集。(F)刚性尖端的尺寸为长9毫米，直径2.4毫米。(G)该仪器通过标准医用内窥镜(Olympus #GIF-HQ190)的2.7毫米工作通道向前传递。 (H) The system is contained within a portable cart.

    mmSFE设计用于收集多路荧光图像(图1 d - h)。使用造影剂，从n=22名受试者中收集实时图像，表1（在线补充视频S1-S23)。有代表性的白光图像显示鳞状(SQ)和非发育不良BE (NDBE) (图2 a, B)。在给肽后，很少看到背景。在不同的通道中采集荧光图像，共配准反射率为图像解译提供解剖学标志。一组具有代表性的HGD和EAC体内图像显示(图2 c, D)。HGD和EAC区域可见荧光强度增高，病理证实。采用免疫组化(IHC)检测EGFR和ErbB2在切除标本上的表达(在线补充图S1)。

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    查看该表:
    表1

    病人的人口统计

    Barrett’s oesophagus. Representative in vivo images collected endoscopically are shown from patients with (A) squamous (SQ), (B) non-dysplastic Barrett’s oesophagus (NDBE), (C) high-grade dysplasia (HGD) and (D) oesophageal adenocarcinoma (EAC). The presence of NDBE is identified by the salmon red patches (arrows) in the white light images. Fluorescence images are collected after separate topical administration of QRH*-Cy5 and KSP*-IRDye800. The merged images show high contrast regions-of interest (ROI) where EGFR and ErbB2 (orange) are coexpressed. Coregistered reflectance images provide anatomical landmarks to interpret the location of the ROI’s.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    巴雷特食管。内窥镜收集的代表性体内图像显示来自(A)鳞状(SQ)， (B)非发育不良的巴雷特食管(NDBE)， (C)高度发育不良(HGD)和(D)食管腺癌(EAC)患者。白光图像中橙红色斑块(箭头)可识别出NDBE的存在。分别局部给药QRH*-Cy5和KSP*-IRDye800后采集荧光图像。合并图像显示高对比度感兴趣区域(ROI)，其中EGFR和ErbB2(橙色)共表达。共配反射图像提供解剖标志来解释ROI的位置。

    采用QRH*-Cy5和KSP*- irdy800检测单个患者的T/B比值(图3 a, B)。对于SQ (n=2)和NDBE (n=3)， QRH*-Cy5和KSP*- irdy800的平均(±SD) T/B比分别为1.28±0.07和1.33±0.15。(n=4) LGD的T/B分别为1.23±0.05和1.18±0.10。HGD (n=7)和EAC (n=6)的平均(±SD) T/B比值分别为1.61±0.21和1.68±0.24。采用留一交叉验证(LOOCV)对结果进行分类(在线补充表S7)。支持向量机(SVM)和逻辑回归(LR)的分类准确率最高，达到91%。成像结果显示n=12, 1, 8, 1真阳性，假阳性，真阴性，假阴性，敏感度92%，特异性89%。给出了使用支持向量机和LR的决策边界。使用这些方法和LOOCV的ROC曲线显示如下(图3 c)。与单独从bootstrap()获得的任一目标相比，多路复用检测获得了更高的AUC()。图3 d)。

    In vivo imaging performance. Scatter plot shows target/background (T/B) ratios measured for EGFR and ErbB2 expression in the fluorescence images collected in vivo from the distal oesophagus of n=22 patients. Decision boundaries show regions classified as either negative (blue) or positive (brown) for neoplasia using (A) support vector machine (SVM) and (B) logistic regression (LR) trained on all data. (C) ROC curves for classifying HGD/EAC from SQ/NDBE/LGD are shown using SVM and LR algorithms with leave-one-out cross-validation (LOOCV). (D) Average ROC curves from bootstrap using SVM (AUC=0.97) model trained on all data show that multiplexed detection provides improved performance than using either EGFR (AUC=0.95) or ErbB2 alone (AUC=0.94). AUC, area under curve; EGFR. epithelial growth factor receptor; ErbB2. epithelial growth factor receptor2; ROC, receiver-operator characteristic.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    体内成像性能。散点图显示22例患者食管远端荧光图像中EGFR和ErbB2表达的目标/背景(T/B)比。决策边界显示使用(A)支持向量机(SVM)和(B)逻辑回归(LR)对所有数据进行训练，将肿瘤分类为阴性(蓝色)或阳性(棕色)的区域。(C)将HGD/EAC与SQ/NDBE/LGD分类的ROC曲线显示为使用保留一次交叉验证(LOOCV)的SVM和LR算法。(D)使用支持向量机(AUC=0.97)模型对所有数据进行训练的bootstrap的平均ROC曲线表明，多路复用检测比单独使用EGFR (AUC=0.95)或ErbB2 (AUC=0.94)提供了更好的性能。AUC，曲线下面积;表皮生长因子受体。上皮生长因子受体;ErbB2。上皮生长因子受体2; ROC, receiver-operator characteristic.

    评论

    在这里，我们证明了通过在体内同时成像两个靶点在内窥镜下检测巴雷特瘤变的可行性。在22例BE患者的食管远端局部注射了特异性的上皮生长因子受体(EGFR)和上皮生长因子受体2 (ErbB2)荧光标记肽。在常规白光照射下，与巴雷特瘤相关的结构异常表现不明显。通过比较，目标表达的空间模式使用荧光高对比度可视化。两种激光激发波长同时通过单一的柔性光纤，使用原型宽视场内窥镜附件。采用大芯、高数值孔径光纤采集了足够的信号。将成像区域与内镜粘膜切除或活检切除标本的组织病理学进行比较。这些标本的免疫组化证实了EGFR和ErbB2的异质性表达。

    据我们所知，本研究首次展示了多重荧光成像在内镜检查中的临床应用。包括EAC在内的许多癌症都具有分子异质性，因此可能需要检测多个靶点来进行准确的临床诊断。具有非特异性特征的粘膜异常，如结节、溃疡和不规则，可能不能准确定位Barrett瘤变。一些医学协会推荐随机四象限活组织检查用于EAC监测，但这种抽样方法效率低，社区医生很少采用。11分子生物标记物对疾病具有高度特异性，在肿瘤病变变得非常明显之前就已表达。在体内检测这些目标的内镜成像策略可用于指导和优先切除高风险区域，减少监测频率，并最大限度地减少过度诊断。

    最近，使用血管内皮生长因子a特异性抗体证实了BE患者中异常增生和早期EAC的检测。贝伐单抗最初用于癌症治疗，并通过IRDye800标记重新用于诊断成像。12与抗体相比，多肽的尺寸更小，具有更快的结合动力学，并且可以以更低的成本大规模制造。13 - 15通过局部给药将肽传递到食管远端粘膜表面。该方法对BE肿瘤受累区染色有效。16与全身给药相比，这种方法只将外源性显像剂分布在目标组织，最小化背景和最大化图像对比度。选择这种策略是因为所使用的多肽具有相似的结合动力学。9日10凝集素已被用于体外巴雷特瘤变的检测，17但还没有临床证明。荧光标记多肽靶向检测结肠癌前病变也已在临床上得到证实。18 19叶酸已被开发用于卵巢癌的靶向成像，20.然而，小分子荧光标记的灵活性有限，很难用于多路成像。

    在这项工作中，使用柔性纤维内窥镜附件收集了宽光谱的光，并将其分离成荧光和反射通道。21多像素光子计数器的灵敏度比视频内窥镜中发现的电荷耦合设备高得多。通过在吸收和发射波段之间重叠最小的波长处激发Cy5和irdy800实现了多路检测。通过将这一策略扩展到全可见和近红外光谱，可以检测到更多的目标。22近红外方案中的荧光发射减轻了血红蛋白吸收和组织散射的影响，并最大限度地减少了组织自身荧光背景。23所使用的远端光学和扫描策略提供了比光纤束更大的空间分辨率。

    这项技术的临床用途可以通过解决几个研究的局限性来提高。肽是分开给药的，以尽量减少潜在的结合相互作用，但可以组合在一起，以减少重组和准备肽交付所需的时间。通过工作通道插入成像附件后，荧光和HD-WLE图像不定向。准确的对准将使荧光图像更有效地指导组织切除。这项研究是在一个专门治疗晚期BE患者的三级转诊中心进行的，因此研究了一个高度富集瘤变的队列。纳入更多的非肿瘤受试者将更好地反映社区中疾病的患病率。总之，我们展示了一项概念验证研究，可同时检测巴雷特瘤变患者的多个靶点，该策略有望用于其他中空器官癌症的早期检测。

    致谢

    我们感谢E Brady, D Chandhrasekhar和A Cawthon的临床支持，以及BR Reisdorph的监管支持。

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    补充材料

    脚注

    • 贡献者JC、BJ、JZ、DGB、DKT、EJS和TDW构思并设计了实验。JC、T-SC、JHR、EJW和RSK进行实验。JHR, YJ和EJS对图像和数据分析做出了贡献。医管局检查了病理。JC, YJ, EJS和TDW撰写了手稿。

    • 资金本研究得到了美国国立卫生研究院U54 CA163059 (DGB, JHR, EJS, TDW)， U01 CA189291 (TDW)和R01 CA200007 (EJS, TDW)的部分支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。