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肝脏病学
原始研究
PBMC转录组学鉴定HBV-ACLF发展过程中的免疫代谢紊乱
  1. 江李1，
  2. 2，3.，
  3. 静江1，2，
  4. 玲玲杨1，
  5. 娇娇鑫1，2，
  6. 冬艳史1，2，
  7. Yingyan陆4，
  8. 小君李5，
  9. 科克任1，
  10. Hozeifa Mohamed Hassan1，
  11. 嘉宁张6，
  12. Pengcheng陈3.，
  13. 亨姚1，
  14. 李嘉1，
  15. Tianzhou吴2，
  16. Linfeng金1，
  17. 你们平1，
  18. 李棕褐色1，
  19. Huafen张1，
  20. Suwan太阳1，
  21. 贝贝郭1，
  22. Xingping周1，
  23. 群蔡1，
  24. 郏县陈1，
  25. 小徐1，
  26. 建黄1，
  27. Shaorui郝1，
  28. 金秋他7，
  29. Shaojie鑫8，
  30. 迪王9，
  31. Jonel Trebicka10，11，
  32. 新陈12，13，
  33. 小君李1，2
  34. 中国重型乙型肝炎研究小组(COSSH)
  1. 1传染病诊疗国家重点实验室，传染病诊疗协同创新中心，浙江大学医学院第一附属医院，杭州,中国
  2. 2精密医学中心，台州中心医院(台州大学医院)，台州,中国
  3. 3.制药生物技术研究所，浙江大学医学院，杭州,中国
  4. 4中西医结合防治癌症重点实验室，浙江省同德医院，杭州,中国
  5. 5病理学系，浙江大学医学院第一附属医院，杭州,中国
  6. 6眼科国家重点实验室，中山大学中山眼科中心，广州,中国
  7. 7肝病科，南昌市第九医院，南昌,中国
  8. 8肝脏和传染病科，解放军总医院第五医疗中心，北京,中国
  9. 9免疫学研究所，浙江大学医学院，杭州,中国
  10. 10翻译肝脏学，内科I，法兰克福大学诊所，法兰克福、德国
  11. 11EF克利夫，欧洲慢性肝衰竭研究基金会，巴塞罗那、西班牙
  12. 12医药生物技术研究所，第一附属医院放射肿瘤科，浙江大学医学院，杭州,310058,中国
  13. 13浙江大学与多伦多大学遗传学与基因组医学联合研究所，浙江大学，杭州,中国
  1. 对应到李军教授，浙江大学医学院第一附属医院传染病诊治国家重点实验室，传染病诊治协同创新中心，浙江杭州;lijun2009在}{zju.edu.cn；鑫陈教授;xinchen在}{zju.edu.cn；教授Jonel Trebicka;jonel.trebicka在}{efclif.com；迪王教授;帝王在}{zju.edu.cn

摘要

客观的乙型肝炎病毒相关的急性-慢性肝衰竭(HBV-ACLF)的病理生理尚不清楚。本研究旨在利用转录组学来描述HBV-ACLF的分子基础。

方法来自前瞻性多中心队列的400名HBV-ACLF、急性-慢性肝功能障碍(ACHD)、肝硬化(LC)或慢性乙型肝炎(CHB)和正常对照(NC)的受试者进行了研究，其中65名受试者(ACLF, 20;ACHD 10;LC, 10;慢性乙肝,10;对照组15例，采用外周血单个核细胞(PBMCs)进行mRNA测序。

结果聚焦于与PBMC反应相关的7个生物过程和前500个差异表达基因(DEGs)的功能协同分析表明，病毒过程与所有疾病阶段相关。免疫失调是HBV加重引起的最显著的变化和障碍，将CHB或LC转化为ACHD和ACLF。ACHD中代谢中断显著，ACLF中代谢中断严重。对62个重叠DEGs的分析进一步将基于hbv的免疫代谢紊乱与ACLF进展联系起来。与先天免疫反应相关的干扰素相关、中性粒细胞相关和单核细胞相关通路的信号明显上调。与适应性免疫反应相关的信号被下调。在ACLF发育过程中观察到脂质和脂肪酸代谢的中断。在患者和实验大鼠中对上述分子机制基础上的四种DEGs的外部验证证实了它们的特异性和作为HBV-ACLF发病的生物标志物的潜力。

结论这项研究强调了由HBV加重引发的免疫代谢紊乱是HBV- aclf的潜在机制，并可能为降低HBV- aclf相关死亡率提供一个新的诊断和治疗靶点。

  • 肝衰竭
  • 乙型肝炎
  • 肝硬化

数据可用性声明

数据，即从fastq文件中的RNA-seq实验中原始读取的数据，可以在一个公共、开放访问的存储库中获得，对数据的使用或分发没有限制。Sequence Read Archive数据库项目用于访问本研究产生的数据的登录编号为PRJNA548207 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA548207/)．

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是原创作品被正确引用，给予适当的荣誉，任何更改都被注明，且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323395

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 急性-慢性肝衰竭(ACLF)因其病因和发病事件而具有区域表型特异性。

    • 乙型肝炎病毒相关ACLF (HBV-ACLF)在西方人群中表现出不同于酒精性肝病相关ACLF的临床特征。

    • HBV-ACLF疾病发展的转录组学基础分子机制和预后尚不清楚。

    新的发现是什么?

    • HBV-ACLF的转录组特征是由HBV加重引发的过度免疫反应，从而驱动慢性乙型肝炎或肝硬化到急性-慢性肝功能障碍和ACLF。

    • 在HBV-ACLF患者中，免疫反应失调导致代谢紊乱和炎症，并诱导多器官衰竭。

    • 免疫代谢障碍是HBV-ACLF患者疾病发展和进展的核心轴。

    • 4个差异表达基因(PPAR γ， MER酪氨酸激酶，血栓反应蛋白1和信号量6B)被确定为潜在的生物标志物，反映ACLF患者中病毒免疫代谢障碍的调节异常通路。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 新的发现可能指导针对免疫调节和代谢平衡的有效早期诊断和治疗策略的发展，以降低HBV-ACLF患者的高死亡率。

    简介

    急性-慢性肝衰竭(ACLF)在慢性肝病患者中发生，无论是否存在肝硬化，它是导致死亡的常见最终途径。1了解ACLF发病的分子机制对于制定有效的早期诊断和治疗策略至关重要。慢性肝衰竭(CLIF)协会肝硬化急性对慢性肝衰竭(CANONIC)研究首次制定了急性失代偿性酒精性肝病或丙型肝炎病毒相关肝硬化患者ACLF的定义和诊断标准。2这一广为接受的定义承认ACLF是一种基于存在器官衰竭和高死亡率的独特综合征。我们最近的大型前瞻性多中心研究(中国重型乙型肝炎研究小组，COSSH)发现乙肝病毒相关ACLF (HBV-ACLF)在西方人群中具有不同于酒精性肝病相关ACLF的临床特征，我们提出了hbv阳性人群中ACLF的COSSH-ACLF标准，因为这些标准具有更高的诊断敏感性和预后准确性。3.

    已知肝细胞损伤和死亡可引发ACLF;然而，肝细胞损伤的原因和参与ACLF进展的途径尚不清楚。4CANONIC研究表明，强烈的全身炎症反应是酒精性肝病相关和丙型肝炎病毒相关ACLF患者急性恶化的主要原因。5个6如前所述，迄今为止两个最大的ACLF前瞻性多中心研究，CANONIC和COSSH，揭示了ACLF的疾病病因和诱发事件的区域表型特异性差异。7然而，免疫细胞似乎在ACLF中起着至关重要的作用;然而，这些细胞中正在进行的过程可能是不同的，到目前为止还没有进行深入的研究。在目前的研究中，我们旨在提供一个基于转录组学的数据集，这些数据来自HBV-ACLF患者在疾病发展的不同阶段收集的循环免疫细胞(外周血单个核细胞，PBMCs)，以阐明疾病发展的详细分子机制及其对HBV-ACLF患者肝组织和预后的影响，并开发和验证潜在的生物标志物，以改善HBV-ACLF的诊断和预后。

    材料和方法

    研究设计

    为了阐明HBV-ACLF发展和进展的详细的基于转录组学的分子机制，我们从COSSH研究开放队列中前瞻性和随机选择了340例HBV病因患者，以评估和描述疾病的演变过程，从慢性乙型肝炎(CHB, n=70)或肝硬化(LC, n=70)开始，通过急性-慢性肝功能障碍(ACHD, n=70)进展到ACLF (n=130)。从电子数据采集系统和病例报告表格中收集相关临床和随访数据。正常、健康志愿者作为正常对照组(NC, n=60)。根据亚太肝脏研究协会(2009)的共识建议，如果ACLF或ACHD患者中检测到HBV DNA，应立即给予抗病毒核苷类似物。8患者和对照组随机分为测序组和验证组(图1一个)．在测序组中，根据COSSH研究中ACLF分级的患病率，采用分层随机抽样的方法从COSSH队列中选取20例HBV-ACLF患者(ACLF-1, 60.6%;ACLF-2, 33.0%; ACLF-3, 6.4%)。3.来自65名受试者的pbmc (ACLF, 20;ACHD 10;测序组LC和CHB各10个，NC各15个)进行转录组测序。功能协同分析(图1 b)，以确定与HBV-ACLF临床病理生理学相关的基因变异和生物学过程。9通过定量反转录- pcr (qRT-PCR)在其余335名受试者的PBMCs中验证潜在的生物标志物，并分别在HBV-ACLF患者的肝组织和大鼠ACLF模型的肝组织中进行免疫组化(IHC)验证。

    Transcriptomic characteristics of patients with HBV-ACLF. (A) Study design and patient group allocation based on the COSSH-ACLF diagnostic criteria. (B) Flow chart of the functional synergy analysis strategy. (C) Principal component analysis of subjects in the ACLF, ACHD, LC, CHB and NC groups. (D) Number of DEGs analysed in pairwise comparisons among the five groups. (E) Venn diagram of the DEGs analysed in pairwise comparisons among subjects in the CHB, LC and NC groups. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; CHB, chronic hepatitis B; COSSH, Chinese Group on the Study of Severe Hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; PBMC, peripheral blood mononuclear cell.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    HBV-ACLF患者的转录组学特征。(A)基于COSSH-ACLF诊断标准的研究设计和患者组分配。(二)功能协同分析策略流程图。(C) ACLF组、ACHD组、LC组、CHB组、NC组受试者主成分分析。(D)在五组间两两比较中分析的差异基因数量。(E) CHB组、LC组和NC组患者deg两两比较的维恩图。mRNA测序数(n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC组)。ACHD，急慢性肝功能障碍;ACLF，急性-慢性肝衰竭;CHB，慢性乙型肝炎; COSSH, Chinese Group on the Study of Severe Hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; PBMC, peripheral blood mononuclear cell.

    定义

    COSSH-ACLF和ACHD

    HBV-ACLF的诊断基于COSSH-ACLF标准。3.该定义将HBV-ACLF确定为一种复杂的综合征，在hbv相关慢性肝病患者中，无论是否存在肝硬化，其短期死亡率都很高，其特征是肝功能急性恶化和肝和/或肝外器官衰竭。HBV-ACLF包括三个等级:ACLF-1、ACLF-2和ACLF-3。ACLF-1包括四种类型的患者:(1)仅表现为肝功能衰竭且国际标准化比值(INR)≥1.5和/或肾功能障碍和/或肝性脑病(HE) I级或II级的患者;(2)单纯肾衰竭患者;(3)凝血、循环或呼吸系统单一器官衰竭和/或肾功能不全和/或HE I、II级患者;(4)脑衰竭合并肾功能不全患者。ACLF-2包括两个器官系统故障的患者，而ACLF-3包括三个或更多器官系统故障的患者。ACHD被定义为不符合ACLF诊断标准的ACLF前期患者。ACHD由两组患者组成:(1)严重肝损伤(总胆红素，TB≥5mg /dL)且之前诊断为CHB的患者;(2)之前诊断为肝硬化的患者，出现以下五种诱发事件之一:腹水、上消化道出血、HE、细菌感染和高水平黄疸(TB≥5mg /dL)。

    LC, CHB和NC

    在本研究中，LC被定义为稳定代偿性肝硬化患者。肝硬化的诊断基于既往肝活检结果、既往失代偿的临床证据和实验室检查、内窥镜检查(食管和胃静脉曲张)和门脉高压和/或肝结节的影像学检查。排除有失代偿史(腹水/HE/上消化道出血/细菌感染)的患者。关于肝硬化诊断标准的详细信息载于在线补充材料和方法．CHB患者的入选标准符合2009年美国肝病研究协会(AASLD)指南。10正常健康志愿者(18-80岁)是体检正常的参与者。排除有糖尿病、高血压等基础常见病的受试者。

    方法:mRNA测序、qRT-PCR和组织学染色

    使用TruSeq RNA LT Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, California, USA)进行mRNA测序。本研究使用的qRT-PCR、H&E/马松三色染色和免疫组化的材料、试剂、引物和抗体及方案见在线补充方法，在线补充表1(引物)和在线补充表2(抗体)。

    功能协同分析

    通过基于网络的功能协同分析(基因集连锁分析，GSLA)，识别显著差异表达基因(DEGs)并将其聚类到生物过程中。11生物过程使用公开的基因集(基因本体，GO;京都基因和基因组百科全书;Reactome,等等)。分析相关生物学过程之间的相互作用，以阐明HBV-ACLF的分子机制。详细描述了DEG的识别、主成分分析、基因表达的层次聚类、DEG函数的滑动窗口分析和基因表达途径分析在线补充材料和方法．

    免疫概要分析

    利用血液转录模块(BTMs)进一步定义不同疾病分期患者免疫谱的差异。BTMs是Li开发的PBMC转录组学在不同免疫刺激下构建的分子特征等，12用来降低转录组数据的维数。每个BTM作为一个基因集进行频率分析，基因集富集分析(GSEA)，13配对t检验和均值分析。以上分析用于测定BTM活性。

    统计分析

    除非另有说明，测量结果以平均值±SD或中位数(p25, p75)表示。如果每个比较组通过Shapiro-Wilk检验(p>0.05)，则使用学生t检验比较两个连续变量。配对t检验仅用于比较不同疾病分期和NC患者BTMs的成员基因。Mann-Whitney U检验在其他情况下用于比较变量。的χ2分类变量比较采用检验。使用Benjamini-Hochberg程序进行多次比较校正，以控制I型错误。显著性定义为p<0.05。

    结果

    患者及临床特征

    所有400名受试者的临床特征见表1．ACLF组HBV DNA水平明显高于LC组和CHB组(p<0.001)。ACLF组的实验室指标，包括TB和INR水平明显高于其他四组。肝功能衰竭和凝血功能衰竭是ACLF患者最常见的器官功能衰竭类型，与我们之前的研究观察一致。3.ACLF患者的短期死亡率(28/90 d)为33.0/46.0%，高于ACHD患者的2.9/2.9%。在测序组的65名受试者中(图1一个，在线补充表3)，来自LC患者和NC患者的一个样本没有达到最小测序reads (>20 M)质量检查标准，因此被排除在本研究之外。序列读取可在序列读取档案数据库(登录号:PRJNA548207，在线补充表4)．

    把这个表:
    表1

    患者临床特征

    HBV-ACLF患者PBMCs的转录组学特征

    PBMCs中基因表达的主成分和核密度估计分析显示ACLF患者聚集在一起，并与其他患者明显分离(图1 c而且在线补充图1)．NC/CHB/LC组、ACHD组、ACLF组沿一个方向逐步分布(图1 c红线)。

    两两差异表达分析显示ACLF组和ACHD组的DEGs较少(13个)，因此与其他组(>297个)差异显著(图1 d而且在线补充表5-14)．虽然ACHD没有表现出ACLF的临床特征，但在转录上被认为是ACLF的前驱期。我们还进行了多组比较，并在至少一个组中确定了1078个表达水平有明显差异的deg。基于多组DEGs的层次聚类分析得到相同的结果(在线补充图2)．LC、CHB和NC组的分析表明，LC和CHB是ACLF的不同的疾病基础，两者的DEGs没有重叠。图1 e)．因此，我们将这两组分别作为进一步分析的对照。

    ACLF患者的HBV急性加重和免疫代谢紊乱

    通过在ACLF/ACHD/LC/CHB组和NC组之间进行四次配对比较，确定了前500个deg，并对它们与生物学过程的联系进行了功能协同分析，以确定ACLF进展基础上的显著病理生理变化。由此产生的1014个生物学过程术语被总结为与PBMC反应相关的7个一般生物学过程(病毒、免疫、损伤、代谢、凝血、炎症和凋亡过程)。这些生物过程的分配图载于在线补充图3而且在线补充表15．

    如滑动窗口DEG函数图所示(图2一个)，病毒过程与所有疾病阶段相关(CHB, 3/17;LC, 4/35;ACHD, 5/39和ACLF, 5/35 GO条款/DEGs)。免疫过程(27/115 GO项/DEGs)在ACHD患者中表现出最显著的紊乱，这在所有7个功能过程中以及在所有疾病阶段中都是最显著的变化。炎症过程也与所有分期相关(CHB, 3/57;LC, 1/23;ACHD, 20/70和ACLF, 7/35 GO terms/DEGs)。然而，CHB和ACHD患者的炎症过程失调水平相似，ACLF患者的炎症过程失调水平略有改善。与ACHD (1/7 GO项/DEGs)和ACLF (4/17 GO项/DEGs)相比，CHB患者的凋亡过程(7/35 GO项/DEGs)表现出更明显的失调。在所有疾病阶段均观察到代谢过程的失调，并从CHB到ACLF逐步增加(CHB, 4/38; LC, 8/41; ACHD, 22/59 and ACLF, 17/69 GO terms/DEGs). Coagulation and wounding processes are closely related to coagulation failure and liver damage, respectively, which represent the known clinical manifestations of ACLF. These three processes were dysregulated in patients with ACHD and ACLF, suggesting consistency between our transcriptomic observations and known pathophysiological variations. Based on these observations, viral, immune and metabolic processes participated in the development and progression of HBV-ACLF.

    Hepatitis B virus exacerbation and immune-metabolism disorder during ACLF aggravation. (A) Functional synergy analysis of the functional implications of the top 500 DEGs in pairwise comparisons between the ACLF/ACHD/LC/CHB and NC groups. (B) Network of the biological processes identified in the functional synergy analysis of 100 DEGs between the ACHD and NC groups. (C) Network of the biological processes identified in the functional synergy analysis of 100 DEGs between the ACLF and NC groups. (D) Network of the biological processes identified based on overlapping DEGs. Top panel, number of DEGs analysed in pairwise comparisons among the ACLF, ACHD, LC and CHB groups. Bottom panel, network of the biological processes identified in a functional synergy analysis of 62 overlapping DEGs. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; IL, interleukin; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NK, natural killer.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    ACLF加重期间乙型肝炎病毒加重和免疫代谢紊乱。(A) ACLF/ACHD/LC/CHB组与NC组两两比较前500名deg的功能协同分析。(B)在ACHD组和NC组之间的100个deg的功能协同分析中确定的生物过程网络。(C)在ACLF和NC组之间的100个deg的功能协同分析中确定的生物过程网络。(D)基于重叠deg识别的生物过程网络。上面板，ACLF组、ACHD组、LC组和CHB组间deg数量两两比较分析。底部面板，62个重叠的deg的功能协同分析中确定的生物过程网络。mRNA测序数(n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC组)。ACHD，急慢性肝功能障碍;ACLF，急性-慢性肝衰竭; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; IL, interleukin; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NK, natural killer.

    通过比较ACLF/ACHD组和NC组识别出的前100个deg进行GSLA，以了解从ACHD到ACLF变化最显著的生物过程。所示图2 b, C在ACHD和ACLF患者中发生改变的最显著的生物过程中，病毒、免疫和代谢过程在生物过程网络中发挥了核心作用。在ACHD到ACLF的进展过程中，与病毒激活相关的生物学过程(例如，病毒复制和转录的调节)发生改变，并与ACLF患者中HBV DNA水平升高或HBV加重相关(表1)．ACHD和ACLF患者的免疫过程(如先天免疫激活细胞表面受体、先天免疫激活信号转导和先天免疫反应激活)均受到显著调控。对促炎因子(如白介素(IL)-6, IL-1和IL-2)的反应激活的炎症过程在ACHD患者中出现失调，而在ACLF患者中这种失调大多得到改善(仅观察到IL-8和抗原刺激)。在ACHD向ACLF过渡的过程中，糖原、胆固醇外排和高密度脂蛋白代谢明显失调。当ACLF组和ACHD组与LC组和CHB组比较时，一致识别出62个deg (图2而且在线补充表16)．这些deg与ACLF发展的核心机制相关。GSLA确定了27个GO术语，其中14个与病毒、免疫和代谢过程有关，表明ACLF的发生与病毒免疫代谢障碍密切相关。

    在ACLF发育过程中，先天免疫反应上调而适应性免疫反应下调

    免疫相关BTMs的分析显示，与先天免疫反应相关的基因大幅上调，而与适应性免疫反应相关的基因表达下调。与先天免疫反应相关的deg在五个模块(干扰素、单核细胞、中性粒细胞、炎症和树突状细胞)中最为明显(图3一)．在干扰素模块中，与NC组相比，CHB组和ACHD组基因簇中的大部分基因，包括抗病毒干扰素信号、先天抗病毒反应和I型干扰素反应均明显上调。GSEA结果显示，上述基因簇在CHB组和ACHD组中富集得分较高。模块的平均表达量显示，这些DEGs在ACHD组中表达量最高，在ACLF组中表达量显著下调，提示干扰素模块可能是ACLF发生的初始因素。

    Spectra of immune responses defined by BTMs across ACLF development. (A) Innate immune response-related BTMs were activated in patients with ACLF. (B) Adaptive immune response-related BTMs were exhausted in patients with ACLF. The first column shows the frequency analysis of significant DEGs in each module. Coloured spots represent the percentage of significantly upregulated (red) or downregulated (blue) genes. The second column shows the results of the GSEA using BTMs as gene sets. The heatmap represents the Normalised Enrichment Score (NES) calculated by the GSEA for these modules. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. The third column shows the results of the paired t-test comparing member genes between patients with different disease stages and NC. The transcriptomics data were summarised into module level scores by calculating the mean values of member genes. The colour intensity and size of nodes represents the degree of perturbation. In the fourth column, line charts represent the mean expression of each module across disease stages. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; BTM, blood transcriptional module; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; GSEA, gene set enrichment analysis; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NK, natural killer.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    ACLF发育过程中由BTMs定义的免疫反应谱。(A)先天免疫反应相关的BTMs在ACLF患者中被激活。(B) ACLF患者中与适应性免疫反应相关的BTMs已耗尽。第一列显示了每个模块中显著差异的频率分析。彩色斑点代表显著上调(红色)或显著下调(蓝色)基因的百分比。第二列显示了使用BTMs作为基因集的GSEA结果。热图表示GSEA为这些模块计算的归一化浓缩分数(NES)。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。第三列为配对t检验结果，比较不同疾病分期和NC患者的成员基因。通过计算成员基因的平均值，转录组学数据被总结为模块水平分数。 The colour intensity and size of nodes represents the degree of perturbation. In the fourth column, line charts represent the mean expression of each module across disease stages. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; BTM, blood transcriptional module; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; GSEA, gene set enrichment analysis; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NK, natural killer.

    与NC组相比，ACHD组和ACLF组单核细胞富集模块(I/II/III/IV/表面)、活化树突状细胞/单核细胞、单核细胞表面特征和髓样细胞/单核细胞中的基因均明显上调。GSEA显示ACHD和ACLF组中deg有很强的聚类。成员基因的配对t检验显示，6种BTMs的变化最为显著，模块的平均表达图在ACHD组和ACLF组均有上调。基于这些结果，单核细胞功能的激活在ACLF患者的免疫反应中起着至关重要的作用。同样，与中性粒细胞、炎症、树突状细胞和抗原呈递相关的BTMs在ACHD组和ACLF组中表现出一致的变化。综上所述，先天免疫系统的激活可能是ACLF进展的关键机制。

    与适应性免疫反应相关的BTMs表现出截然不同的变化，并且基因簇中的大多数DEGs下调(图3 b)．GSEA、配对T检验和平均表达图也显示，ACLF组与T细胞、B细胞和NK细胞相关的BTMs明显被抑制。因此，ACLF患者的适应性免疫可能已经耗尽。

    转录组揭示ACLF患者的代谢改变

    基于GSEA结果，使用KEGG数据库中的代谢途径进行功能注释，以进一步研究ACLF发育过程中的代谢变化。途径富集分析发现在ACLF发育过程中富集了53个途径(p<0.05) (图4一)．其中有30条通路在ACLF组上调，包括过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、胆固醇代谢、缺氧诱导因子1信号通路、雷帕霉素机制靶点(mTOR)信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、自噬、amp激活蛋白激酶信号通路、神经磷脂代谢和糖胺聚糖生物合成。这些途径在脂质代谢、脂肪酸代谢、氧稳态和自噬中发挥作用。

    Regulation of metabolism across ACLF development. (A) Metabolic pathways that were significantly altered across disease stages based on enriched KEGG pathways with only p value <0.05 are depicted here. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Lipid handing-related and usage-related pathways are highlighted in red. Pathways in which gene expression was increased or decreased are shown in red and blue in the heatmap, respectively. The colour intensity is proportional to the NES calculated using the GSEA. (B) Heatmap of genes from selected KEGG-derived metabolic pathways. For each pathway, the top 30 DEGs are shown (adjusted p value <0.05). (All DEGs are shown if the number of detected genes is <30.) Genes with higher (red) or lower (blue) expression are proportionally displayed. Significantly differentially expressed genes (|log2-fold change|>1.5) are shown in bold. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; AMPK, AMP-activated protein kinase; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; GSEA, gene set enrichment analysis; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NES, Normalised Enrichment Score; KEGG, Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    ACLF发育过程中的代谢调节。(A)基于丰富的KEGG通路，代谢通路在不同疾病阶段发生显著改变，此处仅p值<0.05。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。与脂质传递和使用相关的通路用红色标出。在热图中，基因表达增加或减少的途径分别用红色和蓝色表示。颜色强度与使用GSEA计算的NES成正比。(B)来自选定的kegg衍生代谢途径的基因热图。对于每个通路，显示了前30个deg(调整后的p值<0.05)。(如果检测到的基因数量<30，则显示所有的deg。)表达量高(红色)或低(蓝色)的基因按比例显示。 Significantly differentially expressed genes (|log2-fold change|>1.5) are shown in bold. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; AMPK, AMP-activated protein kinase; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; GSEA, gene set enrichment analysis; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls; NES, Normalised Enrichment Score; KEGG, Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor.

    然后，我们比较了CHB、LC、ACHD和ACLF组与NC组各代谢途径中个体基因的表达水平，并观察到ACLF发展过程中基因表达的稳健变化(图4 b)．与其他疾病阶段相比，我们观察到代谢基因的表达增加，最显著的是PPAR和mTOR信号通路中的基因，这进一步表明脂质代谢紊乱可能在ACLF的发展中发挥关键作用。此外，“补体和凝血级联”和“糖鞘脂生物合成”在凝血失败患者的代谢通路中显著上调(在线补充图4)．脑功能障碍患者表现为“松弛素信号通路”、“肌醇磷酸盐代谢”紊乱(在线补充图5)．

    与ACLF发育相关的免疫代谢特征

    我们对疾病分期(从NC、CHB和LC到ACHD和ACLF)进行了四种成对比较，以确定与ACLF病理生理相关的差异表达的关键分子。统计四次比较中排名前50位的deg的出现频率(图5一个)．前两个DEGs(血栓反应蛋白1,THBS1;MER酪氨酸激酶(MERTK)的表达，表明它们在大多数组间比较中存在显著差异。此外，在ACLF组和NC组比较中，信号量6B (SEMA6B)的表达变化最大log2倍，PPAR γ (PPARG)的p值调整最小(图5 b)．基于相互作用网络的功能富集分析显示，这4个基因参与先天免疫反应、适应性免疫反应、补体激活、脂肪酸氧化和活性氧种代谢，提示这些分子反映了ACLF整体发展过程中病毒免疫代谢障碍的基础上的失调通路(图5 c, D)．

    Immune-metabolism signatures associated with ACLF development. (A) The frequencies of the top 10 genes appearing in the top 50 DEGs of the four comparisons (ranked by adjusted p value). (B) The top 10 genes are shown in the volcano plot of the ACLF versus NC groups. Significantly differentially expressed genes (|log2-fold change|>1.5; adjusted p value <0.05) are shown in red or blue. The node size represents the frequency of key genes. (C) String network showing genes interacting with the top four genes (MER tyrosine kinase, MERTK; semaphorin 6B, SEMA6B; thrombospondin 1, THBS1 and PPAR gamma, PPARG). The colour represents the log2-fold change in the ACLF group compared with the NC group. (D) Significantly enriched pathways for the genes interacting with the top four genes (MERTK, SEMA6B, THBS1, PPARG, p<0.05). (E) Expression of four key genes in the sequencing group. Box plot, medians with (p25, p75). The false discovery rate was calculated using the Benjamini-Hochberg procedure. #No Significance, *adjusted p value <0.05, **adjusted p value <0.01, ***adjusted p value <0.001. The number of mRNA sequencing (n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). (F) The qRT-PCR validation of four key genes (n=110/60/60/60/45, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC groups, respectively). Plot, medians with (p25, p75). Mann-Whitney U test, #No Significance, *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001. (G) Immunohistochemistry staining for four key proteins involved in ACLF development in patients from the HBV-ACLF, LC and NC groups. ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; CHB, chronic hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    与ACLF发育相关的免疫代谢特征(A) 4次比较中前50个deg中出现前10个基因的频率(按调整后的p值排序)。(B) ACLF组与NC组的火山图显示前10个基因。显著差异表达基因(|log2倍改变|>1.5;调整后的p值<0.05)以红色或蓝色表示。节点大小代表关键基因出现的频率。(C)显示与前四个基因(MER酪氨酸激酶、MERTK)相互作用的基因串网络;semaphorin 6 b, SEMA6B;血栓反应蛋白1,THBS1和PPAR γ， PPARG)。颜色代表ACLF组与NC组相比变化的log2倍。 (D) Significantly enriched pathways for the genes interacting with the top four genes (MERTK, SEMA6B, THBS1, PPARG, p<0.05). (E) Expression of four key genes in the sequencing group. Box plot, medians with (p25, p75). The false discovery rate was calculated using the Benjamini-Hochberg procedure.＃无显著性，*调整后p值<0.05，**调整后p值<0.01，***调整后p值<0.001。mRNA测序数(n=20/10/10/10/15, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC组)。(F) 4个关键基因(n=110/60/60/60/45, ACLF/ACHD/LC/CHB/NC组)的qRT-PCR验证。图，中位数为(p25, p75)。Mann-Whitney U测试,＃*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001，差异无统计学意义。(G) HBV-ACLF组、LC组和NC组患者中参与ACLF发育的4个关键蛋白的免疫组化染色。ACHD，急慢性肝功能障碍;ACLF，急性-慢性肝衰竭;CHB，慢性乙型肝炎;差异表达基因DEGs;乙型肝炎病毒;LC,肝硬化;数控,正常对照组。

    在外部验证组中验证了与ACLF进展相关的免疫代谢紊乱相关的4个关键分子。外部验证组患者的临床特征与测序组患者相似(在线补充表17)．qRT-PCR结果显示，在CHB/LC向ACHD和ACLF进展过程中，4个发育相关基因表达增加，与测序样本中检测到的基因表达一致(图5 e, F)．在NC和LC和ACLF患者的肝组织中进行免疫组化验证表明，在从NC和LC到ACLF的疾病进展过程中，这些疾病发展相关基因编码的4个蛋白的表达增加(图5克)．这些数据证实了我们的转录组学分析结果，提示上述基因应进一步探索作为ACLF潜在的诊断和预后生物标志物。

    大鼠ACLF模型中4种潜在生物标志物的验证

    我们还在ACLF大鼠肝脏组织中使用qRT-PCR和IHC对这4个潜在的生物标志物进行了验证，进一步确认了它们在ACLF患者中的特异性和潜在的研究价值。在猪血清处理大鼠体内注射d -半乳糖胺和脂多糖诱导大鼠ACLF模型(图6上面板)。肝功能分析显示，ACLF大鼠的丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆汁酸、TB和γ-谷氨酰转肽酶水平显著升高(图6，左下方面板)。H&E和Masson三色染色显示肝硬化肝衰竭的典型组织学特征，包括广泛的肝细胞坏死、肝小叶结构异常、胶原积累、纤维增生和结节形成(图6，右下面板)。

    Validation of potential immune-metabolism biomarkers of ACLF development in a rat ACLF model. (A) ACLF was induced in porcine serum-treated rats through the injection of D-galactosamine and lipopolysaccharides. Top panel, schematic showing the design of the ACLF rat model. Bottom left panel, changes in six typical biochemical markers of liver function observed among the groups. Bottom right panel, pathological staining (H&E and Masson’s trichrome) of liver tissues (bar=250 µm). (B) The quantitative reverse transcription-PCR measurement of the expression of four key molecules in liver tissues (n=8/8/16, NC/LC/ACLF, respectively). (C) Images of IHC staining for four key molecules in rat liver tissues (bar=50 µm). Plot, means with SD. Kruskal-Wallis test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.001. ACHD, acute-on-chronic hepatic dysfunction; ACLF, acute-on-chronic liver failure; CHB, chronic hepatitis B; COSSH, Chinese Group on the Study of Severe Hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    在大鼠ACLF模型中验证ACLF发展的潜在免疫代谢生物标志物。(A)通过注射d -半乳糖胺和脂多糖在猪血清处理大鼠中诱导ACLF。上图，ACLF大鼠模型设计示意图。左下图:各组间肝功能6种典型生化指标的变化。右下方，肝组织病理染色(H&E和马松三色)(bar=250µm)。(B)肝组织中4个关键分子表达的逆转录- pcr定量测定(n=8/8/16, NC/LC/ACLF)。(C)大鼠肝组织四种关键分子免疫组化染色图像(bar=50µm)。Plot表示SD。克鲁斯卡尔-沃利斯检验,* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.001。ACHD，急慢性肝功能障碍; ACLF, acute-on-chronic liver failure; CHB, chronic hepatitis B; COSSH, Chinese Group on the Study of Severe Hepatitis B; DEGs, differentially expressed genes; HBV, hepatitis B virus; LC, liver cirrhosis; NC, normal controls.

    在ACLF大鼠肝脏组织中，通过qRT-PCR验证了与ACLF发育相关的免疫代谢障碍相关的4个潜在生物标志物，结果显示，从NC和LC到ACLF大鼠，MERTK、SEMA6B和THBS1的表达逐渐增加，除PPARG (图6 b)．免疫组化染色显示NC和LC向ACLF大鼠的MERTK、SEMA6B、THBS1和PPARG蛋白表达逐渐增加(图6 c)．这些结果进一步证实了这些标志物在HBV-ACLF患者中的特异性。

    讨论

    在病理生理学中，病毒加重、免疫过程和炎症过程之间的相互作用形成了一个复杂的网络，其中许多方面尚不清楚。一些回顾性研究和小队列研究报告的证据共同表明，HBV加重可能诱导慢性肝炎和/或LC患者的过度免疫反应。14本研究发现ACHD患者中干扰素相关模块、单核细胞相关模块、中性粒细胞相关模块、炎症相关模块和树突状细胞相关模块表达明显升高，T细胞相关模块、B细胞相关模块和NK细胞相关模块表达明显降低。提示在从CHB或LC到ACLF的疾病发展过程中，固有免疫系统被激活，适应性免疫系统被耗尽。许多病毒过程参与了所有疾病阶段的进展，这表明在ACHD患者中，急性HBV加重可能引发过度的免疫反应。HBV-ACLF患者的免疫过程失调比炎症过程失调更为明显，而酒精性肝病相关ACLF患者的主要致病途径涉及全身炎症反应。5

    在这项研究中，我们还观察到ACLF发育的所有阶段显著的代谢改变(包括脂质代谢、脂肪酸代谢、自噬和氧稳态)。最近的一项研究进一步证实，代谢失调与患者死亡率和疾病严重程度的增加有关，并与肝外器官衰竭有关，15表明病毒、免疫和代谢过程驱动HBV-ACLF的发展和进展(图7)．

    Proposed mechanism of HBV-ACLF development and progression. HBV-ACLF may be aggravated by an excessive immune response triggered by HBV exacerbation during the initial stage. Subsequent inflammatory responses and metabolic disorders result in multiorgan failure. The immune-metabolism disorder triggered by HBV exacerbation may be an important mechanism that aggravates HBV-ACLF. ACLF, acute-on-chronic liver failure; HBV, hepatitis B virus; IL, interleukin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    提出HBV-ACLF发生进展的机制。HBV- aclf可能在初始阶段由HBV加重引发的过度免疫反应而加重。随后的炎症反应和代谢紊乱导致多器官功能衰竭。HBV加重引起的免疫代谢紊乱可能是加重HBV- aclf的重要机制。ACLF，急性-慢性肝衰竭;乙型肝炎病毒;IL,白介素。

    本研究强调了免疫代谢紊乱在HBV-ACLF发病机制中的重要性。一些研究表明，旨在改善免疫功能障碍的方法可能是治疗HBV-ACLF的一种可行策略。16干细胞移植通过发挥对免疫反应调节的旁分泌作用，显著提高HBV-ACLF患者的生存率。17正如我们之前的研究显示，干细胞的旁分泌效应通过免疫调节改善猪的代谢和促进再生。9总之，以免疫调节和代谢平衡为目标的治疗是HBV-ACLF管理的一种潜在策略，与本研究中观察到的免疫代谢紊乱的关键作用一致。然而，要了解免疫-代谢轴在ACLF发育和进展中的确切作用，需要更多的蛋白质组学和代谢组学证据。

    此外，识别ACLF的免疫代谢生物标志物不仅可以改善临床实践，还可以为该疾病的病理生理基础提供分子方面的见解。尽管我们和其他研究人员已经报道了血清巨噬细胞炎症蛋白3α、K18和cK18水平可以预测ACLF的严重程度，18 19这些生物标志物的发现是基于常见的实验室指标或低通量技术，并不能反映HBV-ACLF发生、进展和结局的复杂分子发病机制。6相比之下，我们的研究基于大型前瞻性COSSH-ACLF队列，涵盖了从CHB到LC、ACHD和ACLF的四个演变的疾病阶段。我们对功能协同的临床表现导向分析还发现了四个潜在的生物标志物(MERTK、PPARG、SEMA6B和THBS1)，反映ACLF患者中基于病毒的免疫代谢障碍。MERTK已被证明可以抑制ACLF患者对微生物的先天免疫反应。20.据报道，PPARG与脂肪变性和纤维化显著相关，提示PPARG可能是肝硬化和脂质代谢的靶点。21已有文献证明THBS1是转化生长因子β (TGF-β)介导的肝再生抑制的调节因子。22在HBV-ACLF患者的PBMCs和肝组织以及ACLF大鼠的肝组织中进行qRT-PCR和IHC验证，进一步证实了它们的重要作用，表明它们有可能作为HBV-ACLF发病的生物标志物。我们的分层随机抽样和更大的测序深度策略也减少了选择偏差，确保了高质量的数据。具体的机制需要在未来的研究中阐明，特别是在非hbv ACLF人群和ACLF动物模型中。23

    总之，HBV-ACLF具有典型的转录组学特征，即由HBV加重引发的过度免疫反应驱动CHB和/或LC进展为ACLF。随后的免疫失调，包括先天免疫激活和适应性免疫抑制，可诱导代谢中断。这些发现强调了免疫代谢障碍作为HBV- aclf中疾病发展和进展的核心轴的重要性，这可能指导针对HBV和免疫代谢障碍的新治疗策略的开发，以降低HBV- aclf的高死亡率。

    数据可用性声明

    数据，即从fastq文件中的RNA-seq实验中原始读取的数据，可以在一个公共、开放访问的存储库中获得，对数据的使用或分发没有限制。Sequence Read Archive数据库项目用于访问本研究产生的数据的登录编号为PRJNA548207 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA548207/)．

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    本研究方案通过浙江大学医学院第一附属医院临床研究伦理委员会(2011-13号)批准。所有患者和志愿者都得到了充分的信息，并在入组前获得了研究对象或患者的法定代理人的书面同意。

    致谢

    作者们感谢Vicente Arroyo医生(西班牙巴塞罗那大学医院诊所肝脏部)为编写手稿提供了有益的意见。

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    脚注

    • 推特@lijun2009

    • 调整通知这篇文章在Online First发布后进行了修改。出处和同行评审声明已经包括在内。

    • 贡献者JL(第一作者)、XL、JJ和LY均有贡献。本研究由JL(最后一位作者)和XC设计。手稿由JL(最后作者)、XC、JT、JL(第一作者)、XL和DW撰写。实验和数据分析由JL(第一作者)、XL、JJ、LY、JX、DS、YL、JL (8th作者)，KR, HH, JZ, PC, HY, JL (14th作者)，TW, LJ, PY, TL, HZ, SS, BG, XZ, QC, JC, XX, JH (26th(作者)，张建平，张建辉(28)th作者)、SX、DW、JT、XC和JL(最后一位作者)。JL(最后一位作者)支持并监督该项目。所有作者都参与了对手稿的批判性修改。

    • 资金本研究得到国家自然科学基金项目(81830073)、国家科技重大专项项目(2017ZX10203201)、浙江省和国家重点研发计划项目(2016YFC1101303/4和2017C01026)、国家和浙江省高层次人才引进专项支持计划(“万人计划”)资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。