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附言
信
在5例康复患者的胃肠道和肝脏组织中检测到SARS-CoV-2病毒抗原残留
免费的
  1. 春洲劳伦斯张1，2，
  2. 丹尼斯吴3.，
  3. Xinru Lim3.，
  4. 崔西·田志军3.，
  5. Jeffrey Chun Tatt Lim3.，
  6. 贾斯汀娜·纳迪亚·李3.，
  7. 本尼迪克特谭3.，
  8. 智恩阿莫斯泰1，
  9. 魏仪婉4，
  10. 陈雪芹1，
  11. Sanjna Nilesh Nerurkar5，
  12. Shihleone龙1，
  13. 彭涌周6，
  14. 钟业陈6，
  15. 叶欣高6，
  16. 宣统潭7，
  17. Shirin Kalimuddin2，7，
  18. 大卫·泰8，
  19. 吴佳琳2，9，
  20. Jenny Guek-Hong Low2，7，
  21. 乔Yeong1，3.，
  22. 林家宏1，2
  1. 1解剖病理学系，新加坡总医院、新加坡
  2. 2杜克-新加坡国立大学医学院、新加坡
  3. 3.分子与细胞生物学研究所“，，科学技术与研究局、新加坡
  4. 4微生物学系，新加坡总医院、新加坡
  5. 5永禄麟医学院，新加坡国立大学、新加坡
  6. 6肝胆胰移植外科，新加坡总医院、新加坡
  7. 7传染病科，新加坡总医院、新加坡
  8. 8新加坡国立癌症中心、新加坡
  9. 9结直肠外科，新加坡总医院、新加坡
  1. 对应到新加坡总医院解剖病理科，新加坡169608;yeongps在{}imcb.a-star.edu.sg；Kiat Hon Lim医生，新加坡总医院解剖病理科，新加坡169856新加坡诊断塔10层，学院路20号;lim.kiat.hon在{}singhealth.com.sg

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324280

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    我们怀着极大的兴趣阅读了左先生发表的文章等该研究强调了在COVID-19感染活动性和恢复期的粪便样本中存在SARS-CoV-2 RNA。1然而，没有研究报告在恢复期胃肠道和肝器官内存在病毒抗原。

    采用常规免疫组化方法，在结肠、阑尾、回肠、痔疮、肝脏、胆囊和淋巴结中检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)。图1 a - k)来自5名从COVID-19中康复的患者，时间跨度为在SARS-CoV-2检测呈阴性后9天至180天(在线补充表1)．值得注意的是，当从一个患者(患者1和患者4)获得多个组织时，所有组织都显示出病毒抗原的存在，表明病毒感染广泛涉及多器官。有趣的是，对于结肠，病毒抗原只存在于正常的结肠隐窝和息肉中，而不在肿瘤组织中(图1问)．在肝细胞癌肿瘤区域也观察到类似的阴性染色(图1 r)尽管在一些分散的免疫细胞中阳性染色(图1 d)．为了验证我们的发现，我们检测到了SARS-CoV-2刺突蛋白(图1帮)和RNA (图2 b-f)分别用常规免疫组化和RNAscope在上述组织中进行检测。然而，我们无法在一些患者的组织中检测到病毒RNA (在线补充表1)，可能是因为RNA降解率高于蛋白质，以及其他患者依赖的因素，如疾病严重程度、康复时间和基础代谢率。

    Immunohistochemical staining of the SARS-CoV-2 nucleocapsid and spike proteins in intestinal and hepatic tissues. (A and B) Positive SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (NP) staining in colonic crypts (A) and appendix (B), both with a granular supranuclear cytoplasmic pattern. (C) positive SARS-CoV-2 NP staining in scattered immune cells in haemorrhoid tissue (red arrows). (D) positive SARS-CoV-2 NP staining in sinusoidal Kupffer cells in the liver (red arrows). (E–H) Representative images of negative SARS-CoV-2 NP staining in colon, appendix, haemorrhoid and liver tissues taken from individuals with no history of COVID-19. (I) Positive SARS-CoV-2 NP staining in scattered immune cells within the lymph node. (J and K) Positive SARS-CoV-2 NP staining in ileum (J) and gallbladder (K), both with a granular supranuclear cytoplasmic pattern. (L) Positive SARS-CoV-2 spike protein staining in scattered immune cells within the lymph node. (M–P) Positive SARS-CoV-2 spike protein staining in the ileum (M), liver (N), colon (O) and appendix (P). (Q) Positive SARS-CoV-2 NP staining in normal colonic crypts (top right) but negative staining in the adjacent neoplastic glands (bottom left, red box). (R) Scattered SARS-CoV-2 NP-positive immune cells were seen along the invasive margin of hepatocellular carcinoma, as indicated by the red arrows. Hepatocellular carcinoma tumour region, as demarcated by the red box, was negative for SARS-CoV-2 NP. (A–R) Scale bar: 50 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    肠和肝组织中SARS-CoV-2核衣壳和刺突蛋白的免疫组化染色。(A和B)结肠隐窝(A)和阑尾(B)中SARS-CoV-2核衣壳蛋白(NP)染色阳性，均呈颗粒状核上细胞质模式。(C)痔疮组织散在免疫细胞中SARS-CoV-2 NP染色阳性(红色箭头)。(D)肝脏正弦Kupffer细胞中SARS-CoV-2 NP染色阳性(红色箭头)。(E-H)取自无COVID-19病史的个体的结肠、阑尾、痔疮和肝脏组织中SARS-CoV-2 NP染色阴性的代表性图像。(一)淋巴结内分散免疫细胞SARS-CoV-2 NP染色阳性。(J和K)回肠(J)和胆囊(K) SARS-CoV-2 NP染色阳性，均呈颗粒状核上细胞质模式。(L)淋巴结内分散免疫细胞中SARS-CoV-2刺突蛋白染色阳性。(M - P)回肠(M)、肝脏(N)、结肠(O)和阑尾(P) SARS-CoV-2刺突蛋白染色阳性。(Q)正常结肠隐窝(右上)SARS-CoV-2 NP染色阳性，而相邻肿瘤腺体(左下红框)的SARS-CoV-2 NP染色阴性。(R)在肝细胞癌浸润边缘可见散在的SARS-CoV-2 np阳性免疫细胞，如红色箭头所示。 Hepatocellular carcinoma tumour region, as demarcated by the red box, was negative for SARS-CoV-2 NP. (A–R) Scale bar: 50 µm.

    Multiplex immunohistochemistry, RNAscope and flow cytometry analysis of tissues obtained from five patients with COVID-19. (A) Representative images of liver tissue stained using multiplex immunohistochemistry for DAPI (blue), SARS-CoV2 NP (red), ACE2 (green) and CD68 (magenta). #DP1: double positive cell 1; #TP1 and #TP2: triple positive cell 1 and 2, respectively. (B) Representative images of colon tissue stained using RNAscope for DAPI (blue), SARS-CoV-2 S gene (red), ACE2 (green) and CD68 (magenta) RNA. (C–F) Representative RNAscope images of haemorrhoid (C and D) and ileum (E and F) stained for DAPI (blue), SARS-CoV-2 S gene (red) and CD68 (green). Some SARS-CoV-2-positive cells were stained positive for CD68, as indicated by the white arrows (D and F). (G) SARS-CoV-2-specific CD4+ T cells were identified from the CD45+CD3+CD4+CD39+CD103+CD38+Granzyme B+ population, where CD39, CD103 and CD38 select for immune cells with a memory phenotype,8 9and granzyme B selects for immune cells with a functional phenotype.10Representative pseudo-colour plots of CD38+Granzyme B+CD4+ T cells following stimulation with SARS-CoV-2 peptides in tissue and blood samples of patient 1 against healthy donor blood. Similar results were obtained from patient 2. The numbers indicate the percentages in the drawn gates. The plots shown are representative of at least two independent experiments. (A–F) Scale bar: 100 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    5例COVID-19患者组织的多重免疫组化、RNAscope和流式细胞术分析。(A) DAPI(蓝色)、SARS-CoV2 NP(红色)、ACE2(绿色)和CD68(品红)多重免疫组化染色的肝组织代表性图像。#DP1:双阳性细胞1;#TP1和#TP2:分别为三阳性细胞1和2。(B) SARS-CoV-2用RNAscope染色的结肠组织代表性图像(蓝色)年代基因(红色)、ACE2(绿色)和CD68(品红)RNA。(C - F)代表RNAscope图像的痔疮(C和D)和回肠(E和F)染色的DAPI(蓝色)，SARS-CoV-2年代基因(红色)和CD68(绿色)。部分sars - cov -2阳性细胞CD68染色呈阳性，如白色箭头(D和F)所示。(G) sars - cov -2特异性CD4+从CD45中鉴定出T细胞+CD3+CD4+CD39+CD103+CD38+Granzyme B+其中CD39、CD103和CD38选择具有记忆表型的免疫细胞，8 9颗粒酶B选择具有功能表型的免疫细胞。10CD38的代表性伪彩色图+Granzyme B+CD4+患者1的组织和血液样本中使用SARS-CoV-2多肽刺激后的T细胞与健康供体血液。患者2也有类似的结果。数字表示所绘制的门的百分比。所示的图至少代表了两个独立的实验。(A-F)比例尺:100 μ m。

    此外，多重免疫组化和RNAscope染色显示，部分sars - cov -2阳性细胞在结肠和肝脏中与ACE2受体和CD68共定位(图2 a, B)．这些细胞很可能是单核细胞谱系和肝脏驻留的正弦Kupffer细胞，因此证实了我们早期基于细胞形态的推测。这表明，正如之前报道的那样，SARS-CoV-2可能确实会直接感染这些免疫细胞。2 3最后，在检测和验证组织中的病毒抗原时，我们询问组织中是否存在对病毒的免疫反应。我们进行了体外肽刺激试验，将血液和组织与病毒核衣壳、刺突蛋白和膜蛋白的混合物孵育，然后进行流式细胞术分析。特别是sars - cov -2特异性CD38+Granzyme B+CD4+T细胞以类似的方式从组织中分离出来，与匹配的血液样本(图2 g)，这表明在一段时间内，sars - cov -2特异性记忆T细胞可能存在于血液和组织中。然而，有必要进一步研究比较感染前后的组织免疫微环境，确认病毒抗原附近的免疫细胞是否确实针对SARS-CoV-2。

    几个小组报告了这样一种现象:从轻度或中度COVID-19中康复的患者后来在鼻咽拭子或痰样本中检测出阳性，4个5提高对残余病毒宿主和在康复个体中的潜在传播能力的关注。尽管呼吸道传播是大多数COVID-19感染的原因，但越来越多的证据表明，COVID-19会导致胃肠道和肝脏表现，因为研究报告称，在肛门拭子和粪便样本中存在SARS-CoV-2 RNA阳性，尽管鼻咽或痰标本的病毒检测为阴性。1 4 - 6这些报告与我们对鼻咽拭子检测阴性患者肠道组织的发现一致。此外，尽管鼻咽拭子检测呈阴性，但在死亡患者的肺组织中检测到SARS-CoV-2病毒抗原，7我们的发现构成了非死后环境下恢复期肺外组织残留病毒的第一个证据，康复后长达6个月。似乎阴性拭子结果不一定表明病毒从体内完全清除。然而不幸的是，我们无法确定从组织中分离出的病毒抗原是否具有传染性，因为病毒在组织固定过程中不可避免地会被摧毁。我们也无法获得肛门拭子、粪便样本和病毒分离设备，而这些本可以进一步了解粪口传播的可能性。尽管如此，基于这些初步发现，我们认为有必要在更大的队列中进行进一步研究，以探索病毒在组织标本中的复制和传染性，并了解COVID-19在胃肠道和肝脏的参与。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    该研究获得了SingHealth中央机构审查委员会(参考编号:2018/3045和2019/2653)的批准。

    参考文献

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

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    脚注

    • CCLC, DG和XL贡献相当。

    • 发表于部分工作已在预印本服务器MedRxiv上发表。DOI: 10.1101 / 2020.10.28.20219014

    • 调整通知这篇文章在Online First发布后进行了修改。已添加通讯作者。

    • 贡献者构思、设计、监理:JY、KHL。撰写文章:CCLC, DG, XL, JY。提供患者:ZEAT, WYW, PCC, CYC, YXK, TTT, SK, WMDT, JG-HL。辅助组织相关技术:TZT, JCTL, JNL, BT, RT-PCR实验:EXC，流式细胞术实验:XL。生成图形:CCLC, DG, XL和SNN。从病理学角度提供科学输入:SL。所有作者已阅读并同意手稿的出版版本。

    • 资金作者获得了新加坡总医院中心赠款(赠款号为。NMRC/CG/M011/2017_SGH)和A*STAR职业发展奖(202D8226)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。

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