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  • 第71卷第1期
  • 在上皮细胞中，谷蛋白诱导的RNA甲基化改变通过等位基因特异性XPO1转译调节肠道炎症

条文本

菜单条
腹腔疾病
原始研究
谷蛋白诱导的RNA甲基化改变通过等位基因特异性调节肠道炎症XPO1上皮细胞转译
  1. 一Olazagoitia-Garmendia1，2，
  2. 琳达张3.，
  3. Paula Mera4，5，
  4. 朱莉K Godbout6，
  5. Maialen Sebastian-DelaCruz1，2，
  6. Iraia Garcia-Santisteban1，
  7. 路易斯·曼努埃尔·门多萨1，
  8. 阿兰•韦尔塔7，
  9. 此Irastorza8，
  10. Govind巴9，
  11. 彼得H绿色9，
  12. 劳拉·埃雷罗4，5，
  13. 悲哀塞拉4，5，
  14. 何塞·安东尼奥·罗德里格斯1，
  15. 埃琳娜F一直对6，
  16. 传他3.，
  17. 何塞-拉蒙毕尔巴鄂1，2，10，
  18. Ainara Castellanos-Rubio1，2，10，11
  1. 1遗传、体质人类学和动物生理学学系，巴斯克大学(UPV-EHU)，Leioa、西班牙
  2. 2Biocruces Bizkaia健康研究所，Barakaldo、西班牙
  3. 3.霍华德休斯医学院化学系，生物化学和分子生物学系，芝加哥大学，芝加哥，伊利诺斯州美国
  4. 4药理与食品科学学院生物化学与生理学系，巴塞罗那大学生物医学研究所(IBUB)，巴塞罗那、西班牙
  5. 5Investigación Biomédica红色中心Fisiopatología la Obesidad y la Nutrición (CIBEROBN)，卡洛斯三世学院，马德里、西班牙
  6. 6法恩科姆家庭消化健康研究所，麦克马斯特大学，汉密尔顿，安大略、加拿大
  7. 7心血管助消化药，医院de Galdakao-Usansolo，Galdacano、西班牙
  8. 8儿科，巴斯克大学(UPV-EHU)，Leioa、西班牙
  9. 9医学院乳糜泻中心，哥伦比亚大学医学中心，纽约，纽约美国
  10. 10CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)，卡洛斯三世学院，马德里、西班牙
  11. 11巴斯克科学基金会，毕尔巴鄂、西班牙
  1. 对应到Ainara Castellanos-Rubio博士，遗传学、身体人类学和动物生理学，西班牙Pais Vasco大学，Leioa 48940;ainara.castellanos在{}ehu.eus

摘要

目标腹腔疾病(CD)是一种复杂的自身免疫疾病，发生在基因易感的个体中。饮食中的谷蛋白会引发免疫反应，目前唯一有效的治疗方法是严格的终生无谷蛋白饮食。人类白细胞抗原(HLA)基因和几个非HLA区域与乳糜泻的遗传易感性有关，但它们在疾病发病机制中的作用仍然基本未知，这使得开发迫切需要的非饮食治疗方法变得复杂。在这里，我们描述了位于5'UTR的cd相关单核苷酸多态性(SNP)的功能参与XPO1在炎症环境下腹腔肠上皮的特征。

设计研究人员利用肠内SNP杂合子n6 -甲基ladenosine (m6A)相关敲除和HLA-DQ2小鼠，以及乳糜泻患者的人类样本。

结果携带风险等位基因的个体有较高的m65'UTR的甲基化XPO1RNA，产生更大的XPO1蛋白量，导致下游核因子kappa B (NFkB)活性和随后的炎症。此外，面筋暴露增加了总体m6甲基化在人体以及体外和体内模型中。

结论我们鉴定出一本小说6A-XPO1-NFkB通路在乳糜泻患者中被激活。这些发现将促进针对m的新治疗方法的发展6A蛋白和XPO1，一个正在评估的治疗肠道疾病的靶点。

  • 乳糜泻
  • 甲基化
  • 谷蛋白
  • 肠道基因调控
  • 炎症

数据可用性声明

数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。本研究分析的在线可用数据为:miCLIP (GSE128699) miCLIP (GSE128699):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128699和RNAseq (GSE84745):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE84745．数据保存在GEO存储库中，可免费重用。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是原创作品被正确引用，给予适当的荣誉，任何更改都被注明，且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-322566

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • rs3087898单核苷酸多态性，在5'UTR的XPO1与乳糜泻(CD)易感性相关。

    • XPO1蛋白参与核因子kappa B (NFkB)通路的调控。

    • NFkB通路及其下游细胞因子(即IL-8)在腹腔肠黏膜中上调。

    • n6 -甲基腺嘌呤(m6A) RNA甲基化与不同的肠道状况相关。

    新的发现是什么?

    • 的XPO1含有cd相关等位基因的mRNA优先甲基化，翻译效率提高。

    • XPO1翻译是米6a依赖，由YTHDF1蛋白介导。

    • 麦胶蛋白诱导m6一种肠上皮细胞中导致XPO1水平升高的机制。

    • XPO1等位基因特异性增加激活nfkb介导的肠道炎症。

    • 乳糜泻患者XPO1蛋白水平出现等位基因特异性变化，m6一个,XPO1，METTL3而且YTHDF1，以及下游的炎症作用。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的发现将促进以m为中心的乳糜泻治疗新方法的发展6A机械蛋白和XPO1靶向。针对这些蛋白质的分子目前正在评估或用于治疗其他肠道疾病。

    简介

    腹腔疾病(CD)是一种慢性炎症和自身免疫疾病，主要影响小肠，并在基因易感的个体中发生在麸质摄入后。在乳糜泻患者中，麸质会引发促炎反应，导致先天和适应性免疫系统的激活。1 2这包括促炎面筋特异性T细胞产生干扰素-γ，上皮内淋巴细胞(IEL)的细胞毒性转化，上皮细胞应激和先天促炎细胞因子的释放。3 4

    迄今为止，乳糜泻患者唯一有效的治疗方法是终生严格的无谷蛋白饮食(GFD)。然而，饮食依从性有局限性，这可能导致并发症，突出了辅助治疗的需求未得到满足。大约30%的乳糜泻的遗传风险是由人类白细胞抗原(HLA)基因决定的，精细的绘图研究已经揭示了额外的非HLA区域，共占额外的6.5%的遗传力。5大约90%的乳糜泻患者携带HLA-DQ2和DQ8等位基因，然而，这些变异在普通人群中也很常见。因此，为了更好地理解乳糜泻的发病机制，需要对相关变异进行功能表征。cd相关的单核苷酸多态性(SNPs)的相当大的比例映射到非编码区域，使得确定它们的分子功能具有挑战性。6

    N6-methyladenosine (m6A)表示信使rna和非编码rna最丰富的内部化学修饰。米6A修饰涉及RNA代谢的多个方面，在许多细胞过程中起着至关重要的作用，因此，它们正在成为基因表达调控的一个新层面。7 - 10现在一些米6甲基化酶，如n6 -甲基转移酶蛋白复合体(METTL3/METTL14)和m6一种消除或去甲基化酶(脂肪和肥胖相关蛋白，FTO或AlkB同源物5 RNA去甲基化酶，ALKBH5)是已知的控制m6通过添加或删除m来增加或减少rna中的A水平6甲基化标记。此外，所谓的解读蛋白是YT521-B同源结构域包含RNA结合蛋白(rbp)11 - 13识别甲基化rna并调节其过程。此外,米6动态允许对与自身免疫和免疫耐受相关的几种途径中涉及的不同细胞应激信号的快速反应。14日15然而，与免疫和炎症疾病相关的snp对所谓的转录组的可变性的影响还没有得到系统的分析。最近的一项研究表明，m6a -定量性状位点(QTL)在自身免疫性疾病等复杂性状中丰富，突出了进行疾病特异性研究的重要性。16此外，最近发现T细胞中RNA甲基化的干扰与结肠炎的发生有关。17因此，更好地理解cd相关的SNPs如何改变m6A标记，进而调控由麸质摄入引起的炎症反应的分子机制，可以为这种疾病的发病机制提供一层全新的信息，为开发新的基本治疗策略打开大门。

    在本研究中，我们试图从功能上描述一个cd相关的非编码SNP, rs3087898，在出口蛋白1 (XPO1)基因。XPO1是一种核输出蛋白，被描述为靶向参与不同细胞过程的许多蛋白质和rna。18其中,XPO1与核因子κ B (NFkB)通路的调控有关，19反过来，在乳糜泻患者中，它又会上调。20 21此外，上调和突变XPO1已经涉及到不同的恶性肿瘤，发展成为各种类型癌症的有趣的治疗靶点。22日23日我们证明，一个cd相关的非编码和差分m6基因5'UTR(非翻译区)的甲基化SNPXPO1mRNA改变蛋白质的翻译，促进肠上皮细胞(IEC)的炎症环境，这是乳糜泻的特征6一个相关的机械。

    材料和方法

    人类的样本

    小肠活检样本根据招募时的有效标准从Biocruces Bizkaia健康研究所、de Galdakao-Usansolo医院和腹腔疾病中心(哥伦比亚大学)获得。

    细胞系

    使用人类肠道细胞系HCT116 (Sigma-Aldrich， #91091005)、小鼠肠道细胞系C26(由Beatriz Arteta博士提供)和人类Jurkat T细胞系(Sigma-Aldrich， #88042803)。

    动物

    特定的无菌Ythdf1KO小鼠由CH提供。C57BL/6 JRj购自法国Janvier实验室，作为野生型小鼠。带有小鼠CD4的HLA-DQ2基因转基因小鼠组织(人单倍型DR3-DQ2)+细胞，最初产生于墨尔本大学24从EFV(麦克马斯特大学)收到。

    总体设计

    胃蛋白酶胰蛋白酶消化麦胶蛋白(PTG)刺激在人类样本，人类细胞系和小鼠模型中进行进一步的m6甲基化、RNA和蛋白质表达分析。所有研究和小鼠治疗的详细方法载于在线补充材料和方法．

    患者和公众的参与

    通过向乳糜泻患者散发传单招募志愿者和向公众开放的外联活动，患者和公众都参与了进来。临床和基础研究人员定期参与地方和国家乳糜泻患者协会。研究结果将在这些协会组织的活动以及在国家和国际裁谈会上传播。

    结果

    的CD-associatedXPO1等位基因优先甲基化，翻译效率提高

    许多免疫和炎症疾病相关snp的分子功能仍然无法解释，这主要是由于它们位于非编码区。6我们观察到cd相关SNP rs3087898 (GRCh38:chr2:61538039)位于的5'UTRXPO1,接近3米6共识主题(GGACT)。MeT-DB V2.0 m的检验6一个数据库25揭示了米6A在的5'UTR处达到峰值XPO1在小鼠和人类信使rna(见在线补充图1A)．此外，维也纳套餐在线工具26根据SNP基因型预测了5'UTR二级结构的变化(见图1一个而且在线补充图1B)．由于不同类型的细胞参与了乳糜泻炎症反应的激活，我们首先量化了m65'UTR的A水平XPO1在乳糜泻发病机制中涉及的主要细胞类型(T细胞和IEC)中。我们用m证实了这个区域的甲基化6RNA免疫沉淀(meRIP)和qPCR在人的IEC系HCT116中显示出非常低的甲基化水平，而Jurkat T细胞系显示出一种特殊的功能6肠细胞上的A标记(见在线补充图1C)．我们进一步确认了6甲基化XPO15'UTR在人十二指肠全活检中，特别是在上皮部分(见在线补充图1D)．使用网上可用资料6来自HCT116细胞的单个核苷酸分辨交联和免疫沉淀27我们观察到三个m65'UTR中的一致基序被甲基化图1 b)并使用基于rt - qpcr的方法确认了这些结果(参见在线补充图1E)．28此外，利用cd相关SNP的HCT116细胞系的杂合性，我们观察到携带cd风险等位基因的mRNA转录本(XPO1*T)比它的另一种保护性形式(XPO1* C)(见图1 c)．作为米6甲基化参与了多种RNA代谢过程，我们想要阐明这种差异甲基化的影响XPO1信使rna。我们没有观察到任何mRNA细胞定位的差异在线补充图1F)或稳定性(见在线补充图1G)比较保护性的(XPO1*C)和风险(XPO1* T) mRNA形式。然而，使用荧光素酶报告基因的翻译效率分析先于5'UTRXPO1显示在T等位基因存在时荧光素酶活性更高图1 d)，这表明该SNP在翻译过程中有一定的影响。这些结果被克隆的上游的两个5'UTR形式所证实XPO1在编码序列中，我们观察到从风险等位基因形式中产生更高的XPO1蛋白图1 e)．

    The CD-associated XPO1 allele is preferentially methylated and has enhanced translation efficiency. (A) Zoomed secondary structure of each of the human 5’UTR XPO1 forms as predicted by Vienna package. rs307898 SNP (green arrows) and putative m6A methylated adenines (red arrows) are highlighted in yellow. (B) Quantitative representation of miCLIP reads (orange) and mutations (blue) in the 5’UTR of XPO1. miCLIP data from HCT116 cells (heterozygous for rs3087898) was downloaded from GEO repository (GSE128699). Grey squares represent GGACT motifs, red dots represent methylated As and the green triangle and bar correspond to the associated SNP. (C) Allele-specific m6A levels in the 5’UTR of XPO1 in HCT116 cells as assessed by meRIP-qPCR. RNAs were immunoprecipitated with an anti-m6A antibody (normal IgG as control) and enrichment of m6A was determined by qPCR, n=4. (**p<0.01 according to a two-way ANOVA test. Enrichment relative to control IgG #p<0.05, ####p<0.0001 according to a two-way ANOVA test). (D) A dual-luciferase reporter system was used to assess the translation efficiency of each allele of the 5’UTR of XPO1. HCT116 cells were cotransfected with a Renilla luciferase plasmid and a plasmid with the Firefly luciferase CDS preceded by the 5’ UTR of XPO1. Bioluminiscence was measured 48 hours post-transfection, n=6. (****p<0.0001 according to a two-tailed Student’s t-test). (E) Both forms of the 5’UTR were cloned upstream the XPO1 cDNA and constructs were transfected into HCT116 cells. XPO1 and GAPDH (load control) were detected by Western blotting 48 hours post-transfection. Left, representative immunoblot; right, quantitative summary data, n=4. (*p<0.05 according to a two-tailed Student’s t-test). All values are mean±SEM. 5’ UTR, 5′ untranslated region; ANOVA, analysis of variance; m6A, N6-methyladenosine; miCLIP, m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    的CD-associatedXPO1等位基因优先甲基化，翻译效率提高。(A)每个人5'UTR的放大二级结构XPO1维也纳一揽子计划预测的形式。rs307898 SNP(绿色箭头)和推定m6甲基化腺嘌呤(红色箭头)以黄色突出。(B)的5'UTR中miCLIP reads(橙色)和突变(蓝色)的定量表示XPO1．从GEO库(GSE128699)下载HCT116细胞(rs3087898杂合子)的miCLIP数据。灰色正方形代表GGACT基序，红点代表甲基化的As，绿色三角形和条形对应相关的SNP。(C) Allele-specific m65'UTR的A水平XPO1通过meRIP-qPCR对HCT116细胞进行检测。rna用抗m免疫沉淀6抗体(正常IgG为对照)和m6A用qPCR法测定，n=4。(**p<0.01经双向方差分析检验。相对对照IgG #p<0.05， ####p<0.0001(双向方差分析))。(D)双荧光素酶报告系统用于评估5'UTR的每个等位基因的翻译效率XPO1．用Renilla荧光素酶质粒和萤火虫荧光素酶CDS质粒共转染HCT116细胞XPO1．转染后48小时测定生物荧光，n=6。(根据双尾学生t检验，****p<0.0001)。(E)两种形式的5'UTR克隆上游XPO1cDNA和构建物转染HCT116细胞。转染48小时后Western blotting检测XPO1和GAPDH(负载对照)。离开,代表免疫印迹;对，定量汇总数据，n=4。(根据双尾Student 's t检验，*p<0.05)。所有值均为平均值±SEM。5 ' UTR, 5 '非翻译区;方差分析，方差分析;米6一个,N6-methyladenosine;miCLIP, m6A单核苷酸分辨交联和免疫沉淀。

    XPO1翻译是米6a依赖性，由YTHDF1介导在体外而且在活的有机体内

    评估升高的m6A水平出现在XPO1*T表格均负责增强XPO1翻译效率方面，我们分析了m6XPO1蛋白的甲基化量很大。为此，我们过表达METTL3 writer蛋白，增加整体m6甲基化(见在线补充图2A, B)，但我们没有观察到任何显著的差异XPO1mRNA或蛋白质水平(见图2一个)．自XPO1转译是等位基因特异性的，风险等位基因显示更高的甲基化6A-QTL研究证实YTHDF1在人细胞中翻译上调作用，16我们假设m6一个解读蛋白YTHDF1，可以区别地结合影响翻译的每个等位基因。8

    XPO1 translation is m6A-dependent and it is mediated by YTHDF1 in vitro and in vivo. (A) HCT116 cells were transfected with a METTL3 expression plasmid or an empty vector (EV) and effects were analysed 48 hours post-transfection. Overall RNA methylation was measured by dot blot using an anti-m6A antibody. XPO1 mRNA levels were quantified by RT-qPCR. (ns, non-significant according to a two-tailed Student’s t-test). XPO1 and METTL3 protein levels were measured by immunoblot with GAPDH as a loading control, n=3. Top right, representative dot blot; bottom right, representative immunoblot. (B) HCT116 cells were transduced with lentiviral particles of either an empty pLKO vector or constructs with shRNAs targeting METTL3 or YTHDF1, and cells were selected for puromycin resistance. Overall RNA methylation was measured by dot blot using an anti-m6A antibody. XPO1 mRNA levels were quantified by RT-qPCR. (*p<0.05; ****p<0.0001, according to a two-tailed Student’s t-test). XPO1, METTL3 and YTHDF1 protein levels were measured by immunoblot and actin was used as a loading control, n=4. Top right, representative dot blot; bottom right, representative immunoblot. (C) METTL3 was immunoprecipitated (IP) with an anti-METTL3 antibody, and allele-specific XPO1 levels were quantified by RT-qPCR, n=3. (ns, non-significant according to a two-way ANOVA test. Enrichment relative to control IgG (#p<0.05 according to a two-way ANOVA test). Right, representative immunoblot of the IP experiment with HSP90 as negative control for the IP. (D) YTHDF1 was immunoprecipitated (IP) with an anti-YTHDF1 antibody, and allele-specific XPO1 levels were quantified by RT-qPCR, n=4. (*p<0.05 according to a two-way ANOVA test. Enrichment relative to control IgG ##p<0.01, ####p<0.0001 according to a two-way ANOVA test). Right, representative immunoblot of the IP experiment with HSP90 as a negative control for the IP. (E) The duodenum was harvested from WT and Ythdf1 KO mice, and XPO1 and YTHDF1 protein levels were quantified by immunoblot, with tubulin as a loading control. Left, representative immunoblot; right, quantitative summary data (+/-: control mice; DF1 KO: Ythdf1 knockout mice), n=7. (*p<0.05, according to a two-tailed Mann-Whitney U test). All values are mean±SEM. ANOVA, analysis of variance; m6A, N6-methyladenosine; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    XPO1翻译是米6a依赖，YTHDF1在体内外均介导。(A) HCT116细胞转染AMETTL3转染48小时后分析表达质粒或空载体(EV)的影响。RNA甲基化总体采用抗-m斑点杂交法测定6一个抗体。XPO1RT-qPCR法定量mRNA水平。(ns，根据双尾学生t检验不显著)。用免疫印迹法测定XPO1和METTL3蛋白水平，GAPDH作为负载对照，n=3。右上，有代表性的点印迹;右下为代表性免疫印迹。(B)用空pLKO载体或shRNAs靶向结构的慢病毒颗粒转导HCT116细胞METTL3或YTHDF1，筛选嘌呤霉素耐药细胞。RNA甲基化总体采用抗-m斑点杂交法测定6一个抗体。XPO1RT-qPCR法定量mRNA水平。(* p < 0.05;****p<0.0001，根据双尾Student 's t检验)。采用免疫印迹法检测XPO1、METTL3和YTHDF1蛋白水平，以肌动蛋白作为加载对照，n=4。右上，有代表性的点印迹;右下为代表性免疫印迹。(C) METTL3与抗METTL3抗体免疫沉淀(IP)，等位基因特异性XPO1RT-qPCR法定量，n=3。(ns，根据双向方差分析检验不显著。相对于对照组IgG的富集(双向方差分析显示#p<0.05)。对，以HSP90为阴性对照的IP实验的代表性免疫印迹。(D) YTHDF1用抗YTHDF1抗体免疫沉淀(IP)，等位基因特异性XPO1RT-qPCR法定量，n=4。(*p<0.05根据双向方差分析检验。相对于对照IgG ##的富集p<0.01， ####p<0.0001(双向方差分析)。对，以HSP90为阴性对照的IP实验的代表性免疫印迹。(E)十二指肠采自WT和Ythdf1用免疫印迹法定量KO小鼠、XPO1和YTHDF1蛋白水平，微管蛋白为负载对照。离开,代表免疫印迹;对，定量总结数据(+/-:对照小鼠;DF1柯:Ythdf1基因敲除小鼠),n = 7。(*p<0.05，根据双尾Mann-Whitney U检验)。所有值均为平均值±SEM。方差分析，方差分析;米6一个,N6-methyladenosine;WT,野生型。

    为了得到m的稳定还原6一个机器,METTL3或YTHDF1在HCT116细胞中被敲掉(看到了吗在线补充图2C, D)．我们观察到m的总体下降6一个水平METTL3击倒(见图2 b而且在线补充图2E)，包括约简m65'UTR的A水平XPO1(见在线补充图2F)，结果较低XPO1mRNA和蛋白质的含量(见图2 b而且在线补充图2G)．XPO1mRNA和蛋白质水平都降低YTHDF1被击倒了(看到了吗图2 b而且在线补充图2G),尽管米6A水平没有变化(见图2 b，在线补充图2E和2F)．这些结果表明甲基化在5'UTR上是必要的XPO1这表明其翻译是通过YTHDF1对甲基化5’UTR mRNA的识别来介导的。

    为了阐明METTL3和YTHDF1蛋白是否与XPO15'UTR是等位基因特异性的，我们进行了RIP检测，并量化了免疫沉淀等位基因特异性的数量XPO1信使rna(见在线补充图2H)．而METTL3没有表现出与任何等位基因的优先结合(见图2 c)， YTHDF1优先与风险等位基因结合(XPO1* T)(见图2 d)，与该等位基因存在时观察到的更高的翻译效率相一致。小鼠肠道细胞系C26在5'UTR处也出现甲基化Xpo1(见在线补充图2J)，以及从WT和十二指肠分离的IEC中XPO1水平的量化Ythdf1KO小鼠证实了YTHDF1参与了体内XPO1蛋白量的调节。事实上,Ythdf1KO小鼠的十二指肠上皮细胞中XPO1蛋白水平明显低于WT小鼠图2 e而且在线补充图2K, L)．

    Gliadin induces the activation of the m6A machinery in intestinal epithelial cells leading to increased XPO1 in vitro and in vivo. HCT116 cells were treated with a low dose of 30 µg/mL pepsin-trypsin digested gliadin (PTG) for 48 hours and stimulated with 350 µg/mL PTG for 24 hours as shown in SF3.A. (A) Overall RNA methylation was measured by dot blot using an anti-m6A antibody. Top left, a representative dot blot of four independent experiments is shown. Bottom left, XPO1, METTL3 and YTHDF1 protein levels were measured by immunoblot in untreated (NT) and PTG-treated cells, with tubulin as a loading control. A representative immunoblot of 4 independent experiments is shown. Right, relative expression measured by RT-qPCR for XPO1, YTHDF1 and METTL3 in HCT116 cells, n=4. (*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, ns: non-significant according to a two-tailed Student’s t-test). (B) m6A levels in the 5’UTR of XPO1 were assessed by meRIP-qPCR. RNA from untreated (NT) and PTG-treated cells was immunoprecipitated using an anti-m6A antibody and normal IgG as a control. Enrichment in m6A was determined by qPCR, n=3. (***p<0.001 according to a two-way ANOVA test). Enrichment relative to the control IgG +p<0.1; ####p<0.0001 according to a two-way ANOVA test). (C) Two independent siRNAs targeting YTHDF1 were transfected 16 hours prior to PTG stimulation. XPO1 and YTHDF1 protein levels were measured by immunoblot in untreated (NT), PTG-treated (PTG) and PTG-treated and YTHDF1-silenced (PTG +siYTH) cells, with tubulin as a loading control. Representative immunoblot of three independent experiments. (D) C57BL/6 mice (WT) and (E) HLA-DQ2 mice. Mice were gavaged with PTG and CT (PTG) during 3 weeks, once a week. Control mice received only CT (NT). Top left, overall RNA methylation was measured by dot blot using an anti-m6A antibody. Bottom left, representative immunoblot for XPO1 and YTHDF1 protein levels in untreated (NT) and PTG-treated mice (PTG), GAPDH and tubulin were used as a loading control. Right, relative expression measured by RT-qPCR for Xpo1, Ythdf1 and Mettl3, n=5–7. (*p<0.05, ns, non-significant according to a one-tailed Mann-Whitney U test). (F) Epithelial cells derived from WT or Ythdf1 KO mice were stimulated with 250 µg/mL for 4 hours. Representative immunoblot of XPO1 and YTHDF1 protein levels in untreated (NT) and PTG-treated cells from WT or Ythdf1 KO (DF1 KO) mice, with actin as a loading control. All values are mean±SEM. ANOVA, analysis of variance; KO, knockout; m6A, N6-methyladenosine; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    麦胶蛋白诱导m的激活6在肠上皮细胞中导致XPO1体外和体内增加的一种机制。HCT116细胞用低剂量30µg/mL的胃蛋白酶-胰蛋白酶消化麦胶蛋白(PTG)处理48小时，用350µg/mL的PTG刺激24小时，如SF3.A所示。(A)总体RNA甲基化用抗-m斑点杂交法测定6一个抗体。左上角显示了四个独立实验的代表性点印迹。左下，用免疫印迹法测定未处理(NT)和ptg处理细胞中XPO1、METTL3和YTHDF1蛋白水平，微管蛋白作为负载对照。4个独立实验的代表性免疫印迹显示。对，RT-qPCR检测的相对表达XPO1，YTHDF1而且METTL3在HCT116细胞中，n=4。(*p<0.05， **p<0.01， ****p<0.0001, ns:根据双尾Student 's t检验不显著)。(B)米65'UTR的A水平XPO1采用meRIP-qPCR法进行评价。RNA来自未经处理(NT)和ptg处理的细胞，使用抗m6抗体和正常IgG作为对照。浓缩在米6A用qPCR法测定，n=3。(根据双向方差分析，***p<0.001)。相对对照IgG +p<0.1;####p<0.0001根据双向方差分析检验)。(C)两个独立的sirna靶向YTHDF1在PTG刺激前16小时转染。采用免疫印迹法检测未处理(NT)、PTG处理(PTG)和PTG处理(和)中XPO1和YTHDF1蛋白水平YTHDF1-沉默(PTG +siYTH)细胞，微管蛋白作为负载控制。三个独立实验的代表性免疫印迹。(D) C57BL/6小鼠(WT)和(E) HLA-DQ2小鼠。小鼠灌胃PTG和CT (PTG) 3周，每周1次。对照组小鼠仅行CT (NT)。左上，总体RNA甲基化是用抗-m斑点杂交法测定的6一个抗体。左下为未处理小鼠(NT)和PTG处理小鼠(PTG)中XPO1和YTHDF1蛋白水平的代表性免疫印迹，以GAPDH和微管蛋白作为负载对照。对，RT-qPCR检测的相对表达Xpo1，Ythdf1而且Mettl3, n = 5 - 7。(*p<0.05, ns，根据单尾Mann-Whitney U检验不显著)。(F)来自WT或Ythdf1以250 μ g/mL刺激KO小鼠4 h。代表免疫印迹XPO1和YTHDF1蛋白水平的未处理(NT)和ptg处理的WT或Ythdf1KO (DF1 KO)小鼠，肌动蛋白作为加载对照。所有值均为平均值±SEM。方差分析，方差分析;KO,淘汰赛;米6一个,N6-methyladenosine;WT,野生型。

    麦胶蛋白诱导m的激活6一种在体外和体内导致XPO1增加的IEC机制

    米6mrna的5 ' utr中的一个标记被认为是应激刺激下转译激活的关键因素。29为了确定麦胶蛋白刺激(乳糜泻的环境触发器)是否增强了乳糜泻6A标记并导致XPO1水平升高，我们用PTG刺激肠细胞。HCT116细胞用低剂量PTG浓度(30µg/mL)培养48小时，随后用高剂量PTG(350µg/mL)攻毒24小时(见在线补充图3A)．我们观察到总体m的增加6一个层次，一起更高METTL3，YTHDF1而且XPO1以及更高的蛋白质水平(参见图3一和(在线补充图3B)．正如预期的那样，我们还观察到m6在5'UTR的XPO1在PTG存在的情况下(看到了吗图3 b)，表明醇溶蛋白诱导的XPO1蛋白水平的升高是由m6依赖机制。进一步支持这一观点的是，当PTG刺激在YTHDF1-沉默细胞，XPO1水平没有变化(见图3 c而且在线补充图3C)．综上所述，我们的结果表明麦胶蛋白激活了m6一种机制，增加甲基化水平在5'UTRXPO1并导致依赖于ythdf1的XPO1蛋白数量的增加。

    分析麦胶蛋白是否也能增强小鼠的免疫功能6我们用PTG和CT治疗C57BL/6小鼠(之前为naïve的面筋暴露)，并促进体内XPO1的翻译在线补充图3A)．根据体外模型，我们观察到经PTG处理的小鼠组织m增加6甲基化和Ythdf1而且Xpo1在mRNA和蛋白质水平的诱导(见图3 d而且在线补充图3D)，证实了之前观察到的麦胶蛋白诱导m6A和XPO1在体内。有趣的是，当研究HLA-DQ2小鼠的小肠样本时，与无谷蛋白饮食的对照组相比，接受PTG+CT治疗的小鼠在RNA水平上对麦胶蛋白有更强的反应图3 e而且在线补充图3E)．此外，进一步证实YTHDF1参与醇溶蛋白介导的XPO1的诱导是上皮细胞Ythdf1与WT相比，KO小鼠的XPO1几乎没有增加图3 f而且在线补充图3F)．

    XPO1等位基因特异性增加可在体内外促进肠道炎症

    由于XPO1抑制剂能够下调NFkB活性，已被广泛作为抗癌药物进行测试。30.我们还知道，麦胶蛋白可诱导NFkB激活，并进一步释放人体免疫细胞因子20.和IEC。31然而，细胞类型的特异性和醇溶蛋白诱导炎症的机制还不完全清楚。因此，我们想确定是否激活m6PTG引起的一种机制以及随后XPO1的增加能够激活人类肠道细胞中的NFkB及其下游炎症通路。如上所述，m越高6风险等位基因形式的A水平(XPO1*T)导致更多的XPO1蛋白含量(见图1 e)．根据我们的假设，我们观察到细胞过度表达XPO1 * Tform显示NFkB亚基p50的诱导和激活显著增加(见图4 a, B而且在线补充图4A)．

    Allele-specific increase of XPO1 effectuates intestinal inflammation in vitro and in vivo. Expression plasmids with each form of the XPO1 5’UTR upstream the cDNA or the empty vector (EV) were transfected into HCT116 cells. (A) XPO1 and p50 protein levels were quantified by immunoblot, with GAPDH as a loading control. Left, representative immunoblot of 3 independent experiments; right, quantitative summary data of p50 relative to XPO1. (*p<0.05. according to a two-tailed Student’s t-test). (B) The cytoplasmic and nuclear fractions of cells overexpressing each 5’UTR form were separated and XPO1 and p50 protein levels were quantified by immunoblot, HSP90 was used as a cytoplasmic loading control and H3 as a nuclear loading control. (C) Nuclear extracts from HCT116 cells transfected with an EV or XPO1 expression plasmid (ovXPO1) were analysed by gel shift assay for their ability to bind to an oligonucleotide with the IL8 promoter NFkB consensus sequence, with 10X unlabeled probe as competitor. A representative gel of 2 independent experiments is shown. (D) IL8 expression was quantified by RT-qPCR in cells overexpressing both forms of XPO1; n=3. (+p<0.1, according to a one-tailed Student′s t-test). (E) Secreted IL8 was measured by ELISA in the medium of cells transfected with an EV or overexpressing XPO1*T in the absence (T) or presence of the NFkB inhibitor Bay 11–7082 (T+BAY), n=3. (+p<0.1, ns: non-significant according to a one-way ANOVA test). (F) XPO1, YTHDF1 and p50 protein levels were measured by immunoblot in untreated (NT), PTG-treated (PTG) and PTG-treated +YTHDF1-silenced (PTG +siYTH) cells, with tubulin as a loading control. A representative immunoblot of three independent experiments is shown. (G) Xpo1 and p50 protein levels were quantified by immunoblot in untreated (NT), PTG-treated (PTG) and cells treated with PTG + the XPO1 inhibitor leptomycin B (PTG +LMB), with GAPDH as a loading control. A representative immunoblot of 3 independent experiments is shown. (H, I) IL8 expression and secreted IL8 levels were quantified by RT-qPCR and ELISA, in untreated (NT), PTG-treated and PTG+LMB-treated cells, n=3–5 (*p<0.01; **p<0.01 according to a two-tailed Student′s t-test). (J) Left, representative immunoblot of p50 protein levels in untreated (NT) and PTG-treated WT mice, with GAPDH as a loading control. Right, expression of mouse IL8 functional homolog cytokine Cxcl1 quantified by RT-qPCR in untreated (NT) and PTG-treated WT mice, n=7. (*P<0.05, according to a one-tailed Mann-Whitney U test). (K) Left, representative immunoblot of p50 protein levels in untreated (NT) and PTG-treated humanised HLA-DQ2 mice, with tubulin as a loading control. Right, expression of mouse IL8 functional homolog cytokine Cxcl1 quantified by RT-qPCR in untreated (NT) and PTG-treated humanised HLA-DQ2 mice, n=2–3. (*P<0.05 according to a one-tailed Mann-Whitney U test). All values are mean±SEM. 5’UTR, 5′ untranslated region; ANOVA, analysis of variance; IL8, interleukin 8; LMB, leptomycin B; NFkB, nuclear factor kappa B; PTG, Pepsin Trypsin digested Gliadin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Allele-specific增加XPO1在体外和体内都能抑制肠道炎症。表达质粒的各种形式XPO15'UTR上游cDNA或空载体(EV)转染HCT116细胞。(一)XPO1用免疫印迹法定量p50蛋白水平，以GAPDH作为负荷对照。左为3个独立实验的代表性免疫印迹图;对，p50的定量总结数据相对于XPO1．(* p < 0.05。根据双尾学生t检验)。(B)分离过表达各5’utr形态的细胞的细胞质和核部分，用免疫印迹法定量XPO1和p50蛋白水平，以HSP90作为细胞质负荷对照，以H3作为核负荷对照。(C)转染EV或XPO1用凝胶移位法分析表达质粒(ovXPO1)与寡核苷酸结合的能力IL8启动子NFkB一致性序列，以10X未标记探针作为竞争对手。给出了2个独立实验的代表性凝胶。(D)IL8通过RT-qPCR在两种形式的过表达细胞中定量表达XPO1；n = 3。(+p<0.1，根据单尾Student 's t检验)。(E)在转染EV或过表达细胞的培养基中，用ELISA法测定分泌的IL8XPO1*T在无(T)或存在NFkB抑制剂Bay 11-7082 (T+ Bay)时，n=3。(+p<0.1, ns:根据单向方差分析检验不显著)。(F)用免疫印迹法检测未处理(NT)、PTG处理(PTG)和PTG处理+中XPO1、YTHDF1和p50蛋白水平YTHDF1-沉默(PTG +siYTH)细胞，微管蛋白作为负载控制。有代表性的免疫印迹三个独立的实验显示。(G)在未处理(NT)、PTG处理(PTG)和PTG + Xpo1抑制剂leptomycin B (PTG +LMB)处理的细胞中，以GAPDH作为负载对照，用免疫印迹法定量Xpo1和p50蛋白水平。3个独立实验的代表性免疫印迹显示。(H I)IL8RT-qPCR和ELISA检测未处理(NT)、PTG处理和PTG+ lmb处理细胞中IL8的表达和分泌水平，n=3 ~ 5 (*p<0.01;**p<0.01根据双尾Student 's t检验)。(J)左为未处理(NT)和ptg处理的WT小鼠p50蛋白水平的代表性免疫印迹，GAPDH作为负载对照。对，老鼠的表情IL8功能相同器官细胞因子处于受控RT-qPCR检测未处理(NT)和ptg处理的WT小鼠，n=7。(*P<0.05，根据单尾Mann-Whitney U检验)。(K)左，未处理(NT)和ptg处理的人源HLA-DQ2小鼠中p50蛋白水平的代表性免疫印迹，微管蛋白作为负载对照。对，老鼠的表情IL8功能相同器官细胞因子处于受控通过RT-qPCR在未处理(NT)和ptg处理的人源HLA-DQ2小鼠中定量，n= 2-3。(单尾Mann-Whitney U检验*P<0.05)。所有值均为平均值±SEM。5 ' utr, 5 '非翻译区;方差分析，方差分析;IL8白介素8;LMB, leptomycin B;NFkB，核因子kappa B;PTG，胃蛋白酶胰蛋白酶消化麦胶蛋白。

    NFkB的激活意味着增加与靶基因启动子的结合以诱导其转录。在NFkB的其他目标中，IL8被确认为一种由谷蛋白诱导的细胞因子，32所以我们测试了XPO1是否与nfkb介导有关IL8增加我们的模型。首先，电泳迁移率转移实验(EMSA)表明细胞的核提取物过表达XPO1与NFkB一致序列有较高的蛋白结合IL8启动子(见图4 c)．此外，正如p50蛋白激活的情况一样，我们观察到IL8过表达的细胞表达量更高XPO1，再一次，归纳进一步增加的存在XPO1 * T形式(见图4 d)．我们证实这是xpo1介导的IL8增加依赖于NFkB，因为BAY 11-7082(一种NFkB抑制剂)抵消了IL8增加XPO1overexpressing细胞(见图4 e而且在线补充图4B)．

    此外，PTG处理的细胞显示激活的m6机械和增加XPO1水平(见图3一)，也显示p50的数量增加(见在线补充图4C)．我们确认p50的PTG诱导为m6a依赖，因为PTG刺激不会增加ythdf1沉默细胞中的NFkB(见图4 f而且在线补充图4D)．此外，当ptg刺激细胞用XPO1我们观察到p50诱导的下降，证实了PTG诱导的炎症环境至少部分依赖于XPO1(见图4 g而且在线补充图4E)．此外，我们证实了PTG也以xpo1功能依赖的方式诱导IL8蛋白(见图4 h, 1而且在线补充图4F)．总之，这些结果表明，麦胶蛋白诱导的两种m6一个和XPO1在体外以等位基因特异性的方式激活IEC中NFkB通路。ptg处理的小鼠也表现出NFkB的诱导，以及的转录增加IL8鼠标功能相同器官处于受控(见图4 j, K而且在线补充图4G, H)，证明了麦胶蛋白在体内刺激的生理效应。此外，PTG处理在Ythdf1KO小鼠来源的上皮细胞在处于受控体外(见在线补充图4I)．

    腹腔病人XPO1蛋白水平有等位基因特异性变异，m6一个,XPO1，METTL3而且YTHDF1和下游炎症标志物

    腹腔病人和非腹腔对照的小肠活检被用于证实在细胞和小鼠模型中获得的结果。人类样本的基因分型显示，尽管XPO1没有根据SNP基因型发生显著变化(见在线补充图5A)，来自携带风险等位基因(rs3087898基因型CT和TT)的个体的活组织检查产生了更多的XPO1蛋白(见图5一个)．这一结果证实了cd相关SNP的基因型影响XPO1蛋白水平(蛋白数量性状位点，pQTL)，进而影响疾病的易感性[次要等位基因频率(MAF)]。控制= 0.41 /加CD= 0.44)。33我们量化了总体m6A水平显示活动性(新诊断)乳糜泻患者的活组织检查中甲基化水平高于对照组图5 b)．我们还观察到，与对照组相比，活跃乳糜泻组中所有基因的表达都更高图5 d)以及XPO1蛋白的含量，在儿科和成人患者中都是如此(见图5 e)．更有趣的是，当乳糜泻患者的饮食中去掉麸质(GFD)时，总m6水平(见图5 b)，所有基因的表达(见图5 d)以及XPO1蛋白的含量(参见图5 e)回归正常值，表明m6一个,XPO1，METTL3，YTHDF1而且IL8gluten-dependent。为了确认上皮细胞在该通路中的作用，我们进行了量化IL8在对照和活动性腹腔病人的完整活检和免疫和上皮细胞组分中的表达。我们观察到，尽管免疫细胞似乎是主要的生产者IL8，活动性乳糜泻和对照个体之间的差异主要来自上皮部分(见图5 c)．

    Coeliac patients have allele-specific variation of XPO1 protein levels, a gluten-dependent increase in m6A, XPO1, METTL3 and YTHDF1, and downstream inflammatory markers. (A) DNA and protein were extracted from intestinal biopsies of control (CTR) individuals, XPO1 levels were measured by ELISA and rs3087898 was genotyped using an IDT genotyping assay. XPO1 protein levels were compared between individuals with the protective genotype (CC) and individuals harbouring the risk allele (CT+TT), n=7–25. (*p<0.05 according to a two-tailed Mann Whitney test). (B) RNA was extracted from intestinal biopsies from CTR, active coeliac patients (CD) and coeliac patients on gluten free diet (GFD) and overall RNA methylation was measured. Left, representative m6A DotBlot, and right, quantitative summary of total m6A levels quantified by a commercial m6A ELISA kit, n=15–17. (*p<0.05, ***p<0.001 according to a one-way ANOVA test). (C) IL8 expression by RNAseq counts from a previous RNAseq study46 in complete biopsies, CD45+ immune cell fractions and CD326+ epithelial cell fractions from non-coeliac CTR and active coeliac disease individuals (CD), n=4–12. (*p<0.05, ns: non-significant according to a two-way ANOVA test). (D) The expression of XPO1, METTL3, YTHDF1 and IL8 was measured by RT-qPCR in RNA extracted from adult and paediatric individuals, n=6–16. Individual and mean values (last row of each group) of relative RNA expression represented in a heatmap (+p<0.1; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 according to a one-way ANOVA test). (E) XPO1 protein levels were measured by immunoblot in biopsies from paediatric and adult individuals, GAPDH was used as a loading control. Left, representative immunoblot of 5–10 samples per group; right, quantitative summary of immunoblot for XPO1 in both paediatric and adult biopsies from CTR, active CD patients and patients on GFD, n=14–16. (*p<0.05, ns: non-significant according to a one-way ANOVA test). (F, G) Biopsies from active patients were cut into two pieces and incubated with PTG for 4 hours. Representative immunoblot and XPO1 protein levels measured by ELISA in biopsies untreated (NT) and incubated with gliadin for 4 hours (PTG), GAPDH was used as a loading control, n=13. (+p< 0.1 according to a one-tailed Mann Whitney test). (H) IL8 expression was measured by RT-qPCR in untreated (NT) and PTG-incubated biopsies. (**p<0.01 according to a one-tailed Mann Whitney test). All values are mean±SEM. ANOVA, analysis of variance; IL8, interleukin 8; PTG, pepsin trypsin digested gliadin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    腹腔病人XPO1蛋白水平有等位基因特异性变异，m6一个,XPO1，METTL3而且YTHDF1和下游炎症标志物。(A)从对照(CTR)个体的肠道活检中提取DNA和蛋白质，ELISA法测定XPO1水平，IDT基因分型法测定rs3087898的基因型。比较保护基因型(CC)与危险等位基因(CT+TT)个体XPO1蛋白水平，n=7 ~ 25。(*p<0.05根据双尾Mann Whitney检验)。(B)从CTR、乳糜泻患者(CD)和无麸质饮食的乳糜泻患者(GFD)的肠道活检中提取RNA，并测量总体RNA甲基化。离开时,m代表6一个DotBlot，对总m的定量总结6用商业m量化的水平6ELISA试剂盒，n= 15-17。(*p<0.05， ***p<0.001根据单向方差分析检验)。(C)IL8RNAseq计数来自之前的RNAseq研究46在完全活检中，CD45+免疫细胞和CD326+上皮细胞部分来自非腹腔CTR和活动性腹腔疾病个体(CD)， n= 4-12。(*p<0.05, ns:根据双向方差分析检验不显著)。(D)表达XPO1, METTL3，YTHDF1而且IL8采用RT-qPCR法检测成人和儿童RNA, n= 6-16。相对RNA表达的个位数和平均值(每组最后一行)用热图表示(+p<0.1;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001(单因素方差分析检验)。(E)用免疫印迹法测定儿童和成人活检标本中的XPO1蛋白水平，以GAPDH作为负荷对照。左为每组5-10个样本的代表性免疫印迹;右，CTR、活动性乳糜泻患者和GFD患者的儿科和成人活检中XPO1的免疫印迹定量总结，n= 14-16。(*p<0.05, ns:单因素方差分析不显著)。(F, G)活动期患者的活组织切片切成两块，与PTG一起孵育4小时。在未处理(NT)和与麦胶蛋白孵育4h (PTG)的活检标本中，用ELISA法测定代表性免疫印迹和XPO1蛋白水平，以GAPDH作为负载对照，n=13。(根据单尾Mann Whitney检验+p< 0.1)。 (H)IL8RT-qPCR检测未处理(NT)和ptg培养活检组织中的表达。(**p<0.01根据单尾Mann Whitney检验)。所有值均为平均值±SEM。方差分析，方差分析;IL8白介素8;PTG，胃蛋白酶胰蛋白酶消化麦胶蛋白。

    为了进一步证实麸质在这个场景中的作用，活跃性乳糜泻患者的活组织切片被加入或不加入PTG孵育4小时。我们发现有增加的趋势METTL3，YTHDF1而且XPO1信使rna水平(见在线补充图5B)和增强的XPO1蛋白水平(见图5 f, G)在ptg挑战活检中。我们也可以证实过表达IL8在受刺激的活检样本中(见图5 h)，进一步暗示了麸质在这一过程中的作用。有趣的是，ptg诱导的YTHDF1在肠活检中显著相关XPO1(见在线补充图5C)，证实了这一点6阅读对于谷蛋白依赖者来说很重要XPO1组织刺激模型中的诱导。总之，这些结果证实了在人体样本体内外观察到的麦胶蛋白诱导效应，并强调了激活m的重要性6结果的机器XPO1增加和IL8乳糜泻患者活检的诱导。

    讨论

    我们的研究表明，与免疫和炎症疾病易感性相关的非编码snp可以改变m6A水平和功能有助于疾病的发病机制。这是通过炎症反应的细胞类型特异性激活发生的，证实了最近转录组范围的m6一个QTL分析。16先前有研究表明，位于5'UTR的snp可以破坏其二级结构，影响翻译效率。19此外,米6在5 ' utr的A标记对应激刺激的反应增加，加速转译是细胞快速反应的一种机制。8在这里，我们展示了位于编码基因5'UTR的cd相关SNP rs3087898的基因型XPO1，影响mRNA的甲基化和随后的翻译。我们发现SNP基因型影响RBP YTHDF1的结合以及预测的5'UTR的二级结构XPO1，什么会导致m6A水平和平移特征与最近m的结果一致6一个QTL研究。16在IEC中，甲基化的增加使携带风险等位基因的mRNA分子的翻译效率更高(XPO1 * T)，这是一种由m介导的效应6一个阅读器YTHDF1，正如我们在体外和体内所展示的。需要强调的是，与肠细胞相比，我们已经观察到T细胞的5'UTR上很少或没有甲基化标记XPO1，表示这个m6a介导机制是IEC特有的。此外，这是第一个研究链接面筋，乳糜泻的触发剂，改变m6甲基化。有趣的是，我们已经证明谷蛋白诱导的m6间接的增加了XPO1激活了NFkB通路，这是乳糜泻的一个标志，为乳糜泻患者打开了新的治疗方法的大门。

    已知m6甲基化使细胞能够对外界刺激做出快速反应，激活不同细胞类型的不同通路。13日15病毒感染或微生物组的组成被认为有助于乳糜泻的发展，而微生物组最近也参与了m6甲基化存在于肠道中的甲基化34然而，来自谷蛋白的麦胶蛋白肽是引发乳糜泻的主要抗原。1 2 34尽管麦胶蛋白被认为是先天免疫反应的激活剂，但很少有人知道导致谷蛋白耐受性分解的早期步骤。我们的体外和体内实验将麦胶蛋白暴露与m6A和YTHDF1，进而导致XPO1蛋白水平的增加。这是m6修饰和麦胶蛋白暴露为乳糜泻的复杂发病机制增加了一个全新的、未被探索的层面。此外，考虑到病毒感染和微生物组组成与乳糜泻和m6甲基化改变，进一步研究其他乳糜泻触发因子有助于更好地了解乳糜泻固有免疫激活的相关因素。

    XPO1是一种核输出受体，参与关键信号通路和细胞功能的改变XPO1与几种恶性肿瘤有关。IkBa通过XPO1核输出的适当穿梭与NFkB通路的激活和下游细胞因子的分泌有关。此外，已有研究表明，用XPO1抑制剂处理的细胞NFkB活性较低，因此细胞因子释放减少。35我们已经证明，XPO1蛋白水平的增加是m6A分XPO1 * T此外，我们还发现xpo1介导的NFkB的诱导依赖于ythdf1，支持m6乳糜泻患者IEC中谷蛋白诱导炎症反应的甲基化。

    乳糜泻的特征是小肠上皮屏障被破坏，导致小肠上皮细胞浸润和巨噬细胞和其他免疫细胞的激活加剧。最近一项使用转基因小鼠的研究突出了乳糜泻发病机制的复杂性，因为在乳糜泻样小鼠模型中，需要激活和调节IEC以及免疫细胞，才能形成典型的免疫反应和绒毛萎缩，这在人类乳糜泻患者中可见。据报道，由IECs分泌的不同细胞因子在乳糜泻免疫反应的激活和早期步骤中起着关键作用。4白细胞介素8是一种中性粒细胞引诱趋化因子，在组织损伤和激活先天免疫反应中起着关键作用。有人提出，在乳糜泻患者中，白细胞介素8是在摄入谷蛋白后特异性分泌的。36 37根据等位基因特异性NFkB激活，我们观察到更高IL8转录和分泌的存在XPO1风险等位基因。此外,处于受控的功能性小鼠同源物IL8，在麦胶蛋白刺激小鼠的肠道中也上调，证实了xpo1介导的肠道炎症在应激刺激下的激活。到目前为止，大多数研究都是在乳糜泻衍生的免疫细胞和外周血单个核细胞中进行的。38-40然而，这是第一个表明cd来源的上皮细胞也表达的研究IL8事实上，我们已经看到，即使它们不是活动乳糜泻患者的主要生产者，上皮细胞也显示增加IL8表达式。如IL15所述4那么，目前研究中发现的机制可能与麸质介导的上皮损伤的早期反应和免疫细胞的进一步激活有关。

    我们的结果具有临床意义，因为我们确定活动性乳糜泻患者(食用含谷蛋白的饮食)的m6一个和XPO1,在一起IL8细胞因子水平在GFD后逆转。此外，我们还观察到，携带风险等位基因的个体表达更高水平的XPO1蛋白，这解释了该SNP与疾病易感性的关系，因为风险等位基因(TT)纯合的个体预计有更高水平的基础炎症，这是由于XPO1蛋白的增加。

    总之，我们的数据强调了m的重要性6一种由谷蛋白介导的机械XPO1增加,增强NFkB表达并随后导致IL8乳糜泻患者肠细胞诱导。到目前为止，乳糜泻唯一可靠的治疗方法是终生严格从饮食中去除麸质，这扭转了大多数疾病症状，但对患者的生活质量和心理健康产生了负面影响。这影响了对GFD的坚持，并增加了并发症的风险，包括胃肠道癌症。41事实上,这两个XPO1而且IL8在结肠和结直肠腺癌的肿瘤组织中，YTHDF1的水平升高(使用TGCA数据观察到)，而YTHDF1已被描述为调节人类结直肠腺癌的致瘤性。42有趣的是，研究表明食用GFD的乳糜泻患者患结肠癌的风险较低。43靶向m的小分子6阅读器和橡皮擦已经被建议作为治疗不同类型癌症的潜在疗法44并成为乳糜泻患者抵御炎症的一种选择。此外,XPO1抑制剂已经在使用或在先进的临床试验中作为抗癌治疗药物，并已显示出由于IkBa核保留有能力降低NFkB活性。35 45因此，我们的研究提供了第一个有关麸质反应的m参与的实验证据6A-XPO1-NFkB通路在CD发病中的作用，为该病的治疗提出了新的潜在靶点。m的介入6一个,XPO1和NFkB在各种肠道恶性肿瘤中的表达支持m6a - xpo1 - nfkb轴可能在其他药物对小肠上皮损伤的反应中起作用，这可能对各种胃肠疾病的治疗有直接影响。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。本研究分析的在线可用数据为:miCLIP (GSE128699) miCLIP (GSE128699):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128699和RNAseq (GSE84745):https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE84745．数据保存在GEO存储库中，可免费重用。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    使用这些活检样本的实验得到了相应的伦理委员会的批准。

    致谢

    我们感谢Robert Anderson博士和墨尔本大学通过材料转让协议提供并促进HLA-DR3-DQ2小鼠模型的使用。

    参考文献

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    补充材料

    脚注

    • 调整通知这篇文章在Online First发布后进行了修改。作者的名字,

      Iraia Garcia-Santisteban被修改了。

    • 贡献者AC-R设计了这项研究。AO-G、LZ、PM、JKG、MS-D、LMM、IGS和JAR进行了实验。IR, AH, PHG和GB招募患者并收集人体样本。AO-G、GB、LH、DS、EFV、CH、JRB和AC-R对数据进行分析。AO-G和AC-R撰写了论文。所有作者都阅读并认可了最终版本的手稿。

    • 资金本研究得到了西班牙科学、大学和创新部(PGC2018-097573-A-I00)对AC-R的资助。JRB由ISCIII研究项目PI16/00258资助，该项目由西班牙经济和竞争力部和欧盟ERDF/ESF共同资助，名为“欧洲之路”。AO-G和MS-D分别由巴斯克政府和巴斯克国家大学的博士预科奖学金资助。DS和LH项目由西班牙卫生部(MINECO) (SAF2017-83813-C3-1-R)资助，并由ERDF、Investigación Biomédica en Red中心(Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición) (CIBEROBN) (CB06/03/0001授予DS)、加泰罗尼亚政府(2017SGR278授予DS)和Fundació la Marató de TV3(201627-30授予DS)共同资助。CH是霍华德休斯医学研究所的研究员，由美国国家卫生研究所HG008935资助。我们要感谢Xuechen Yu和Justin Vargas处理从哥伦比亚大学获得的成人乳糜泻活检样本。EFV由CIHR拨款168840支持，并担任加拿大研究主席。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。