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  • 自身免疫性易感性基因PTPN2需要清除adherent-invasive大肠杆菌通过整合细菌吸收和溶酶体防御

条文本

菜单条
肠道微生物群
原始研究
自身免疫易感基因PTPN2需要清除adherent-invasive吗大肠杆菌通过整合细菌吸收和溶酶体防御
  1. 玛丽安丽贝卡Spalinger1,2,
  2. 阿里Shawki1,
  3. Pritha Chatterjee1,
  4. 维尼Canale1,
  5. Alina桑托斯1,
  6. 安妮卡Sayoc-Becerra1,
  7. 迈克尔Scharl2,
  8. 米歇尔·L Tremblay3,4,
  9. 詹姆斯Borneman5,
  10. Declan F McCole1
  1. 1生物医学科学部门,加州大学河滨分校医学院的,河畔,加州美国
  2. 2胃肠病学和肝脏病学,苏黎世大学医院,苏黎世、瑞士
  3. 3生物化学系,麦吉尔大学,蒙特利尔,魁北克、加拿大
  4. 4古德曼癌症研究中心,罗莎琳德和莫里斯古德曼癌症研究中心,蒙特利尔,魁北克、加拿大
  5. 5植物病理学和微生物学,加州大学河滨分校,河畔,加州美国
  1. 对应到Declan F McCole教授,生物医学科学部门,加州大学河滨分校医学院的河畔,CA 92521年,美国;declan.mccole在}{ucr.edu

文摘

目标肠道菌群的变化与多种自身免疫和炎症条件,包括炎症性肠病(IBD), pathobionts穿透肠屏障,促进炎症反应。IBD患者肠巨噬细胞的能力,有效地清除入侵的病原体被破坏导致增加细菌易位和过度的免疫反应。在这里,我们调查了一个IBD-associated功能丧失的变体在蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型(PTPN2)基因,或者失去PTPN2表达影响巨噬细胞响应入侵的细菌的能力。

设计IBD patient-derived巨噬细胞与野生型(WT)PTPN2或携带IBD-associatedPTPN2SNP,腹膜巨噬细胞从WT和本构PTPN2-knockout老鼠,老鼠特别缺乏PTPN2与非侵入性K12的巨噬细胞被感染大肠杆菌,人类adherent-invasive大肠杆菌(AIEC)LF82小说,或者鼠标AIEC (米AIEC)压力。

结果PTPN2损失严重妥协巨噬细胞清除入侵的细菌的能力。具体来说,功能丧失PTPN2提升pathobiont入侵/吸收成巨噬细胞和细胞内生存/扩散通过三个不同的机制:增加细菌吸收被增强的癌胚抗原的表达介导的细胞粘附分子(CEACAM) 1和CEACAM6PTPN2缺乏细胞,减少细菌的间隙导致自噬缺陷加上破坏溶酶体酸化。体内,老鼠缺乏PTPN2在巨噬细胞更容易米AIEC感染和米AIEC-induced疾病。

结论我们的研究结果揭示了三方监管机制PTPN2保存巨噬细胞抗菌功能,因此重要的是导致宿主防御入侵的细菌。

  • 细菌感染
  • 细胞免疫
  • 大肠杆菌
  • 巨噬细胞
  • 粘膜免疫

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2020 - 323636

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 改变微生物组成与几个相关炎症性疾病,包括炎症性肠病(IBD)。

    • 增加adherent-invasive面前大肠杆菌(AIEC)发生在IBD患者。

    • 变异的蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型(PTPN2)与风险增加有关开发IBD和PTPN2损失影响免疫反应。

    有什么新发现吗?

    • PTPN2至关重要影响巨噬细胞清除入侵的细菌的能力。

    • 增加入侵AIEC发生在PTPN2-deficient巨噬细胞和细胞内的复制。

    • PTPN2限制细菌生长和入侵体内巨噬细胞的三个不同的机制:PTPN2限制癌胚抗原细胞粘附分子的表达的蛋白质,促进细菌入口;PTPN2维护自我吞噬入侵的细菌;PTPN2保存溶酶体酸化细菌所需的间隙。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 提供了一个机械的解释改变微生物组成i IBD患者携带PTPN2变体。

    • 我们的研究结果表明PTPN2作为抗菌防御的关键因素,因此,位置PTPN2作为一个潜在的治疗目标AIEC患者过度生长。

    介绍

    人类的肠道是填充超过1000不同种类的细菌,形成一个复杂的生态系统,显著影响健康。1绝大多数的这些细菌是无害甚至有益的共生的,不构成危险。2然而,某些细菌物种会导致疾病或导致慢性炎性疾病的出现,包括炎症性肠病(IBD),3包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。加州大学和CD与肠道失调有关3 4一词描述减少总体细菌多样性和繁茂的致病性菌株,包括adherent-invasive大肠杆菌(AIEC)物种。4 - 6相比之下他们无害,非侵入性,AIEC可以穿透黏液层,坚持肠道上皮细胞(IEC),并在肠巨噬细胞入侵和生存。7 8

    在健康个体,增生和入侵的病原微生物被一层厚厚的粘液限制,严格上皮细胞屏障,9免疫细胞在固有层,特别是巨噬细胞驻留IEC下直接有效地消除入侵的病原体。10 11这些巨噬细胞显示抗炎、高度吞噬表型12和删除细胞碎片,死细胞和无害的细菌以immune-silent的方式。13然而,为了应对障碍缺陷和/或渗透入侵的病原体,肠巨噬细胞获得炎性表型,分泌大量的炎性细胞因子和发起全面的免疫反应。11 - 13一旦清除感染,抗炎恢复设置。11日12然而,当清除入侵的病原体是干扰,由于病原菌的生长或遗传因素妥协回到免疫沉默状态,加剧了免疫反应导致慢性炎症,驱动IBD和其他肠道疾病的发展。14

    除了微生物/免疫学因素,在超过200个基因变异与开发风险增强IBD相关。15 - 17日其中,单核苷酸多态性(SNP) rs1893217基因位点编码蛋白酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型(PTPN2),不仅有助于增强炎症性肠病的风险,但也促进其他炎症性疾病,包括类风湿性关节炎,1型糖尿病和代谢syndrome-diseases与肠道菌群的变化相关联。18 19PTPN2(也称为T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶)损失,或存在SNP rs1893217,导致异常T细胞激活/分化,20.hyper-responsiveness干扰素(IFN) -γ和表皮生长因子,21对胞内细菌处理和缺陷autophagy-a过程重要。22在老鼠身上,全身Ptpn2敲除会导致严重系统性炎症和死亡在出生后3 - 5个星期。23T特异性删除促进对肠道炎症和改变肠道微生物组(损耗潜在的有益微生物,减少细菌丰富,减少水平的丁酸盐生产商,增加潜在的pathobionts20.)类似于观察IBD患者携带PTPN2SNP rs1893217。24这个演示的重要性PTPN2和它的潜在作用在控制细菌的入侵。然而,目前尚不清楚PTPN2损失如何影响巨噬细胞的能力,以防止细菌感染。

    我们之前发现全身Ptpn2基因敲除小鼠表现出小说的一个重要扩张鼠标AIEC (米AIEC)。25本研究的目的是确定损失PTPN2活动妥协macrophage-mediated宿主防御AIEC和评估机制的PTPN2损失,或存在SNP rs1893217 SNP,妥协巨噬细胞清除AIEC感染的能力。

    方法

    试剂

    来源的材料和试剂用于本研究中列出在线补充表S1。

    Patient-derived外周血单核细胞

    全血样品从之前获得基因分型、性别和年龄来自瑞士IBD的患者人群和健康志愿者。所有患者面对疾病静止时样本集合。病人的性格特征和药物在血液收集中可以找到在线补充表S2。所有患者和健康对照组签署知情同意前研究夹杂物和当地伦理委员会批准了这项研究(瑞士苏黎世州的伦理佣金;批准文号ek - 1755)。

    老鼠

    杂合的Ptpn2击倒(Ptpn2het)在Balb / c小鼠背景取自米歇尔·l·Tremblay麦吉尔大学。Ptpn2 -Het老鼠培育彼此获得野生型(WT),Ptpn2het,Ptpn2ko的同胞和细胞获得在一个3周的时代。老鼠loxP侧面Ptpn2基因表达Cre Lysozyme2启动子(下Ptpn2-LysMCre老鼠26)培育了Ptpn2fl / fl小鼠获得Ptpn2fl / fl和Ptpn2 -LysMCre同窝出生的。8到10周大的同胞。对于体内自噬激活,老鼠每天腹腔注射1毫克/公斤雷帕霉素在汽车(4%乙醇、5%聚乙二醇,5%渐变80)开始前1天第一个细菌填喂法。车辆治疗小鼠作为控制。体内的癌胚抗原细胞粘附分子1 (CEACAM)抑制小鼠腹腔注射每日10毫克/公斤anti-CEACAM1抗体(克隆CC1)开始前1天第一个细菌填喂法。

    菌株和感染

    实验、K12(写明ATCC) LF828和鼠标AIEC (米AIEC)27培养在Luria-Bertani(磅)中一夜之间从冻结的股票,亚文化到新鲜磅,收获指数期,在PBS洗,巨噬细胞感染的莫伊20。2小时后,巨噬细胞被洗两次与庆大霉素(100µg /毫升)含有培养基和孵化庆大霉素(20 ug /毫升)含有培养基。除非另有说明,孵化时间给出的时间孵化庆大霉素后洗涤。米AIEC表达包含mCherry荧光蛋白的质粒用于本地化研究。

    巨噬细胞

    从人类外周血单核细胞巨噬细胞生成,老鼠骨髓和THP-1单核细胞中详细说明在线补充方法。纯洁和分化是检查通过流式细胞术和> 96%的细胞被确认为巨噬细胞。THP-1细胞稳定PTPN2击倒使用成分与WT转染PTPN2,变体PTPN2或者一个空向量(EV)获得教授Scharl苏黎世大学医院,瑞士苏黎世,苏黎世大学。由于部分保留内生PTPN2表达式,变异表达细胞功能上类似于细胞从运营商杂合的变体。

    流式细胞术

    流式细胞术,骨髓中巨噬细胞(BMDM)或腹膜巨噬细胞被感染米AIEC表达mCherry表达质粒或pHRhodo-K12粒子,脱离文化板使用2毫米乙二胺四乙酸(EDTA)在PBS,洗两次,直接分析一个LSRII流式细胞分析仪。测量的活性氧(ROS),这些细胞被孵化与CellROX试剂(500 nM,热费希尔科学)30分钟在37°C,洗在PBS和分析立即LSRII流式细胞分析仪。测量溶酶体的酸化,这些细胞被孵化LysoTracker绿色(25 nM,热费希尔科学)为1小时,用PBS和分析立即LSRII流式细胞分析仪。

    Immunofluorescent成像,共焦显微镜

    免疫荧光成像,巨噬细胞被播种在封面幻灯片PMA脉冲和感染后24小时后米AIEC-mCherry或pHRhodo-K12粒子如上所述。染色lysosome-associated膜蛋白(灯)1和LC3B根据标准执行过程和详细在线补充方法。

    CEACAM1 CEACAM6抑制体外

    CEACAMs阻塞,细胞培养1小时10µg /毫升antimouse CEACAM1或反人类的CEACAM6抗体感染K12之前,LF82或米AIEC。

    核处理

    STAT1沉默在腹膜巨噬细胞使用预先设计的3携带rna (siRNA)从Dharmafect Lipofectamine转染试剂根据制造商的指示,媒介在转染后取代了16个小时。细菌感染是48小时后进行。

    蛋白质和RNA提取,免疫印迹和定量PCR进行根据标准程序和所述在线补充方法。

    PTPN2活动分析

    PTPN2磷酸酶活性评估如前所述28使用一个磷酸酶活性测定(热费希尔科学)。总之,PTPN2从溶解产物免疫沉淀反应和样品溶解在phosphatase-assay缓冲区,DiFMUP衬底补充道,和磷酸酶活性测量每10分钟120分钟可靠地确定磷酸酶活性。28

    体内AIEC感染

    小鼠年龄在8 - 10周大被感染与10连续四天9K12, LF82或米AIEC /天。疾病活动评估使用以下参数:减肥,减少梳理,活动减少,粪便一致性,整体外观。均化细菌负荷确定的粪便或组织在磅琼脂0.5毫升PBS和电镀。

    量化和统计分析

    数据被表示为n的意思是生物重复±SE的意思。数据是高斯分布和组间变异相似条件进行了分析。显著差异确定使用GraphPad棱镜V.9软件使用方差分析。P值低于0.05被认为是重要的。老鼠被随机分成实验组,每组在年龄和性别匹配。图中数字复制的传奇。调查人员也不清楚重量记录,评估疾病活动和样本收集。没有排除在统计分析数据点。

    结果

    失去PTPN2促进AIEC在巨噬细胞吸收和生存

    首先,我们如何评估损失PTPN2或存在的疾病相关变异基因的SNP rs1892317轨迹编码PTPN2影响细菌吸收在巨噬细胞和细胞内的复制。因此,我们使用PTPN2沉默THP-1单核细胞的稳定与慢病毒转染构造包含正常(WT)PTPN2,电动车或变异PTPN2变体(Var;在线补充图S1A)。29日这些细胞暴露在非侵入性大肠杆菌K12的,人类LF82 AIEC或小说米AIEC最近发现在我们的实验室。27EV-transfected (PTPN2-deficient)巨噬细胞LF82和高度敏感米AIEC吸收,反映在巨噬细胞表达产生影响PTPN2丧失变体(在线补充图1 a, B)。细菌复制是在增加PTPN2不足和PTPN2不同的巨噬细胞与巨噬细胞表达WT变体(相比在线补充图1 c)。确认的效果PTPN2SNP rs1893217,我们使用monocyte-derived巨噬细胞从瑞士IBD IBD患者队列之前这些WT (TT)或杂合的SNP rs1892317 (CT)。而在巨噬细胞吸收和复制PTPN2WT健康控制和IBD患者相似,有高度增加细菌吸收和增加细菌增殖的巨噬细胞PTPN2 -变异患者(图1 a, B)。与先前的报道一致,29日存在SNP rs1893217 PTPN2磷酸酶活性降低,而蛋白质表达水平没有影响(在线补充图1 d)。我们没有观察到巨噬细胞之间的差异从加州大学和CD患者(数据未显示)。

    Loss of PTPN2 promotes uptake and replication of AIEC in macrophages. (A, B) Macrophages from healthy controls (HC), or patients with IBD homozygous for the wild-type (=C allele; WT (CC), HC: n=5, IBD: n=9) or heterozygous for the disease-associated (=T allele) variant (Var (CT), HC: n=2, IBD: n=8) in PTPN2 SNP rs1893217 were infected with non-invasive K12 E. coli or the AIEC strain LF82 for 2 hour, washed with PBS and incubated with gentamycin and macrophage uptake after 1 hour (A) and intracellular replication over time (B) analysed. (C, D) Peritoneal macrophages were isolated from WT, Ptpn2-Het (HET) or Ptpn2-KO (KO) mice and infected with K12, LF82 or a mouse AIEC (mAIEC) strain as described in A, B and analysed for bacterial uptake (C) and replication (D). (E, F) Bone marrow-derived macrophages were generated from WT, HET and KO mice, infected with mCherry-tagged mAIEC as in B and mCherry fluorescence measured after 3 hours by flow cytometry (E) and fluorescent imaging (F). Scale bar: 50 µm. Asterisks denote statistical significances (*P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA with Bonferroni correction for multiple testing). See also online supplemental figure 1. AIEC, adherent-invasive Escherichia coli; ANOVA, analysis of variance; IBD, inflammatory bowel disease.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    损失AIEC PTPN2促进吸收和复制的巨噬细胞。从健康对照组(A, B)巨噬细胞(HC),或IBD患者为野生型纯合子(= C等位基因;WT (CC)、HC: n = 5,炎症性肠病:n = 9)或杂合的变异(= T等位基因)变体(Var (CT), HC: n = 2,炎症性肠病:n = 8)与非侵入性K12 PTPN2 SNP rs1893217被感染大肠杆菌或AIEC应变LF82 2小时,洗了PBS和孵化与庆大霉素和巨噬细胞吸收后1小时(A)和细胞内复制(B)分析。(C, D)腹膜巨噬细胞WT隔绝,Ptpn2 -Het (Het)或Ptpn2KO (KO)感染小鼠和K12 LF82或鼠标AIEC (米AIEC)应变中描述的A、B和分析细菌吸收(C)和复制(D)。(E, F)骨骨髓来源的巨噬细胞产生WT, HET, KO小鼠感染mCherry-tagged米AIEC B和mCherry荧光测量3小时后用流式细胞仪(E)和荧光成像(F)。酒吧规模:50µm。星号表示统计意义(* P < 0.05, * * * * * P < 0.01, P < 0.001,方差分析与Bonferroni调整多个测试)。另请参阅在线补充图1。AIEC, adherent-invasive大肠杆菌;方差分析,方差分析;炎症性肠病、炎症性肠病。

    在腹膜巨噬细胞Ptpn2het老鼠,LF82和吸收米AIEC明显增加,进一步提高纯合子Ptpn2ko巨噬细胞(图1 c)。此外,细菌复制升高Ptpn2ko巨噬细胞,也部分可见巨噬细胞产生影响Ptpn2het老鼠(图1 d)。增加细菌吸收损失Ptpn2证实了流式细胞术(图1 e)和immunofluorescent成像(图1 f)BMDM mCherry-tagged感染米AIEC。相反,K12的吸收很低(没有显示)。PTPN2-defective巨噬细胞清除细胞内细菌的能力并不仅限于AIEC,但也观察到当用鼠标enteropathogen巨噬细胞被感染c . rodentium(在线补充图2)。综上所述,这表明Ptpn2有缺陷的巨噬细胞的细菌比Ptpn2主管巨噬细胞,失去Ptpn2妥协胞内细菌处理和消除。

    增加细菌吸收是通过增强CEACAM6 / CEACAM1表达介导的PTPN2不足或有缺陷的巨噬细胞

    LF82使用CEACAM6坚持人类IEC和入侵。30.确定是否改变CEACAM表达有助于增加AIEC吸收/入侵PTPN2有缺陷的巨噬细胞,我们坚定的表达水平CEACAM6(人类细胞)和CEACAM1(老鼠细胞;CEACAM6不是老鼠表示)。31日PTPN2不足和PTPN2变异人类THP-1细胞表达基础水平升高CEACAM6和CEACAM1 AIEC进一步增加CEACAM1/6表达式(图2一个)。此外,我们观察到增强的信号转导和转录激活(STAT1)磷酸化,据报道,已促进CEACAM1,和一定程度上的CEACAM6,表达式32(图2一个)。在小鼠巨噬细胞,我们发现CEACAM1水平增加Ptpn2het,Ptpn2ko巨噬细胞和bacteria-induced STAT1磷酸化是增加(图2 b)。CEACAM1(老鼠)和CEACAM6(人类)与特定的抗体抑制减少细菌入侵(图2 c, D),这表明AIEC进入细胞至少部分通过附加CEACAM1 / CEACAM6。相比之下,CEACAM抑制并不影响细胞内细菌复制,甚至CEACAM1 / CEACAM6抑制后,PTPN2不足和PTPN2击倒/变体THP-1巨噬细胞表现出更快的增加细胞内细菌负荷(图2 e, F),表明增加复制并不是由于细菌吸收增加。

    Loss of PTPN2 promotes CEACAM1 and CEACAM6 expression in macrophages. (A) PTPN2 was silenced in THP-1 macrophages prior to transfection with the major (WT) allele in SNP rs1893217, an empty vector (EV), or the minor (Var) allele in PTPN2. After selection of stable clones, cells were infected with K12, LF82 or mAIEC for 1 hour. Depicted are representative Western blot images of the indicated proteins. (B) Peritoneal macrophages were isolated from WT, Ptpn2-Het (HET) or Ptpn2-KO (KO) mice and infected with K12, LF82 or mAIEC for 1 hour. Depicted are representative Western blot images of the indicated proteins. (C–F) WT, EV and Var THP-1 cells (C, E) and peritoneal macrophages from WT, Het and KO mice (D, F) were infected with K12, LF82 or mAIEC for 2 hours, incubated with gentamycin and bacterial load (C, D) and replication (E, F) determined at the indicated time points. Asterisks denote statistical significances (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA with Bonferroni correction for multiple testing). ANOVA, analysis of variance; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; PTPN2, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    失去PTPN2促进CEACAM1和CEACAM6巨噬细胞中表达。(一)PTPN2沉默在转染前THP-1巨噬细胞主要(WT)等位基因SNP rs1893217空向量(EV),或在PTPN2小(Var)等位基因。后选择稳定的克隆,细胞被感染K12, LF82或米AIEC 1小时。描述代表蛋白质免疫印迹的图像表示。从WT (B)腹膜巨噬细胞分离,Ptpn2 -Het (Het)或Ptpn2KO (KO)感染小鼠和K12 LF82或米AIEC 1小时。描述代表蛋白质免疫印迹的图像表示。(氟)WT、电动汽车和Var THP-1细胞(C、E)和腹膜巨噬细胞从WT Het, KO小鼠(D, F)感染K12, LF82或米AIEC 2小时,孵化与庆大霉素和细菌负荷(C, D)和复制(E, F)决定在指定的时间点。星号表示统计意义(* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001,方差分析与Bonferroni调整多个测试)。方差分析,方差分析;米AIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;PTPN2、蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型;WT,野生型。

    鉴于STAT1磷酸化水平的增加和先前的报道,IFN-γ-driven STAT1激活促进CEACAM1和CEACAM6表达式,32我们评估是否可拆卸的STAT1的细菌负荷的影响。STAT1 siRNA-treatment减少细菌吸收(图3一),但并不影响细菌复制(图3 b)。STAT1沉默抑制bacteria-induced CEACAM1 mRNA和蛋白诱导(图3 c, D),这表明STAT1介导CEACAM1表达增加Ptpn2ko巨噬细胞。

    STAT1 inhibition normalises CEACAM expression and inhibits bacterial uptake. Peritoneal macrophages were isolated from WT, Ptpn2-Het (HET) or Ptpn2-KO (KO) mice, STAT1 silenced using siRNA and cells infected 24 hours later with K12, LF82 or mAIEC for 2 hours, incubated with gentamycin containing medium and (A) bacterial uptake and (B) replication analysed at the indicated time points; (C) mRNA expression of CEACAM1 normalised to untreated control and Actb after 24 hours; or (D) for the indicated proteins by Western blot after 30 min. Asterisks denote statistical significances (*p<0.05, **p<0.01, ANOVA with Bonferroni correction for multiple testing). ANOVA, analysis of variance; CEACAM, carcinoembryonic antigen cellular adhesion molecule; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; STAT1, signal-transducer and activator of transcription 1; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    STAT1抑制正常化CEACAM表达和抑制细菌吸收。腹膜巨噬细胞从WT孤立,Ptpn2 -Het (Het)或Ptpn2KO (KO)小鼠,STAT1沉默使用核和细胞感染与K12的24小时后,LF82或米AIEC 2小时,孵化与庆大霉素包含介质和细菌吸收(A)和(B)复制在指定的时间点进行分析;(C)的mRNA表达CEACAM1未经处理的控制和正常化Actb24小时后;或(D)表示蛋白质免疫印迹后30分钟。星号表示统计意义(* * * p < 0.05, p < 0.01,方差分析与Bonferroni调整多个测试)。方差分析,方差分析;CEACAM,癌胚抗原细胞粘附分子;米AIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;STAT1,信号转导和转录激活1;WT,野生型。

    增加细菌生存部分由于自噬缺陷

    的损失PTPN2自噬在IEC和妥协THP-1单核细胞。29日由于自噬是肠道细菌处理的一个重要因素,33我们调查是否增加细菌复制PTPN2缺乏/变异巨噬细胞可能是由于自噬缺陷。在WT巨噬细胞,感染K12, LF82或米AIEC导致增强LC3B转化为其lipidated形式(LC3B-II)和减少p62,表明自噬的激活,而ATG16L1水平没有影响。PTPN2不足或变体THP-1细胞,然而,未能诱导自噬(图4一)。同样,自噬诱导细菌感染的巨噬细胞减少Ptpn2 -在那些从Het,完全没有Ptpn2ko小鼠(图4 b)。在WT和Ptpn2 -Het巨噬细胞,米AIEC colocalised与自噬体(可见LC3B明亮punctae colocalise mCherry-tagged米AIEC)虽然在WT比更高的程度Ptpn2het细胞。在Ptpn2ko细胞表现出细菌负担高于WT细胞,然而,很少LC3B明亮punctae是可见的,他们没有colocalise mCherry-tagged米AIEC (图4 c)。这清楚地表明,Ptpn2不足和PTPN2变异细胞缺陷在自噬诱导细菌感染。自噬通过雷帕霉素诱导自噬的诱导Ptpn2 -Het,Ptpn2ko巨噬细胞(图4 d),但没有影响细菌吸收(图4 e),只有部分减少细菌复制(图4 f)。相反,自噬抑制使用3-methyladenine (3-MA)导致增强细菌在WT巨噬细胞增殖,但没有影响细菌增殖PTPN2-deficient巨噬细胞(在线补充图3)。这表明损失(功能)Ptpn2导致自噬缺陷但对细菌复制的影响似乎只是部分由于缺乏自噬。而巨噬细胞自噬显然是减少PTPN2-deficient /变种,损失(功能)PTPN2没有影响bacteria-induced ROS生产(在线补充图3 b)。

    Defective autophagy in PTPN2-deficient cells contributes to enhanced bacterial replication. (A) PTPN2 was silenced in THP-1 macrophages prior to transfection with WT PTPN2, an empty vector (EV), or Var PTPN2 as in figure 1 and infected with K12, LF82 or B2 for 24 hours. Depicted are representative Western blots for the indicated proteins. (B) Peritoneal macrophages were isolated from WT, Ptpn2-Het (HET) or Ptpn2-KO (KO) mice and infected with K12, LF82 or mAIEC for 24 hours. Depicted are representative Western blot pictures for the indicated proteins. (C) Peritoneal macrophages were infected with mCherry expressing mAIEC for 4 hours and stained for LC3B. Bacteria colocalising with autophagosomes versus total bacteria were counted in 20 cells/condition. Scale bar: 10 µm. (D–F) Peritoneal macrophages were infected with K12, LF82 or mAIEC and incubated in the presence of rapamycin for the indicated time. (D) Representative Western blot picture for LC3B, (E) bacterial uptake after 1 hour, and (F) bacterial replication. (*P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). ANOVA, analysis of variance; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; PTPN2, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    有缺陷的细胞自噬在PTPN2-deficient有助于增强细菌复制。(一)PTPN2是沉默与WT PTPN2 THP-1巨噬细胞转染前,空向量(EV),或Var吗PTPN2就像在图1和感染K12, LF82或B2 24小时。描述是代表西方印迹显示蛋白质。从WT (B)腹膜巨噬细胞分离,Ptpn2 -Het (Het)或Ptpn2KO (KO)感染小鼠和K12 LF82或米AIEC 24小时。描述代表表示蛋白质免疫印迹的照片。(C)腹膜巨噬细胞感染了mCherry表达米LC3B AIEC 4小时和染色。细菌colocalising与自噬小体和总细菌数在20个细胞/条件。比例尺:10µm。(D-F)腹膜巨噬细胞感染K12, LF82或米AIEC和孵化的雷帕霉素的显示时间。(D)代表免疫印迹LC3B图片,1小时后细菌吸收(E), (F)细菌复制。(* P < 0.05, * * * * * P < 0.01, P < 0.001)。方差分析,方差分析;米AIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;PTPN2、蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型;WT,野生型。

    Ptpn2缺乏导致有缺陷的溶酶体酸化

    巨噬细胞通常在溶酶体降解吞噬坏死细胞和细菌,这一过程由自噬和依赖溶酶体的酸化。34 35自Ptpn2有缺陷的巨噬细胞无法有效降低细菌甚至自我吞噬恢复时,我们下一个评估是否这可能是由于有缺陷的溶酶体酸化。对于这一目标,我们使用pHRhodamine-coupled细菌粒子,这显示增加荧光在酸性环境中。在WT巨噬细胞,荧光是清晰可见,表明细菌粒子被运送到溶酶体与低pH值(图5一个)。在Ptpn2het巨噬细胞,若丹明信号降低,但仍可检测,而在Ptpn2ko细胞,没有可见的罗丹明明亮的细菌,这表明有一个缺陷在细菌运输到溶酶体或溶酶体酸化缺陷(图5 b)。与lysoTracker与此一致的是,染色,染色酸性溶酶体,显著降低Ptpn2 -Het,Ptpn2 -KO巨噬细胞(图5 c)。进一步调查机制导致有缺陷的溶酶体的酸化Ptpn2ko巨噬细胞,我们评估了mRNA表达的蛋白质参与蛋白质endoplasmatic网的货物运输到溶酶体,或在维持质子梯度在溶酶体膜,包括cation-independent和cation-dependent mannose-6-phosphate受体(分别CI-M6pr和CD-M6pr)、葡糖脑苷脂酶(Gba)氯通道Clc7 LAMP1 LAMP2,积分和溶酶体膜蛋白2(编码Scarb2)。我们发现显著降低CI-M6pr的表达式Ptpn2het,Ptpn2ko巨噬细胞,符合贩卖mannose-6-phosphate缺陷标记酶溶酶体所需酸化(图5 d)。36此外,LAMP1染色表明,细菌没有colocalise溶酶体Ptpn2ko巨噬细胞(图5 e),表明缺陷细菌处理和运输到溶酶体。

    Disturbed lysosomal function in PTPN2-defective cells. (A, B) Peritoneal macrophages from WT, Ptpn2-Het (HET) or Ptpn2-KO (KO) mice were infected with K12-pHRhodamine particles that are fluorescent in acidic environment. Depicted are (A) representative images and (B) flow cytometry measurements of rhodamine fluorescence. (C) Peritoneal macrophages were infected with mAIEC and stained with LysoTracker and analysed by flow cytometry. (D, E) Peritoneal macrophages were infected with mCherry-expressing mAIEC. The graphs show (D) mRNA expression of the indicated genes and representative Western blot for cation-independent mannose-6-phosphate receptor protein after 24 hours, and (E) representative images from LAMP1 immunofluorescence. Scale bars: 10 µm. *p<0.05, **p<0.01, ANOVA. ANOVA, analysis of variance; LAMP1, lysosome-associated membrane protein; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; M6pr, mannose-6-phosphate receptor; PTPN2, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    干扰在PTPN2-defective细胞溶酶体的功能。从WT (A, B)腹膜巨噬细胞,Ptpn2 -Het (Het)或Ptpn2KO (KO)小鼠感染K12-pHRhodamine粒子荧光在酸性环境中。描述(A)代表图像和(B)罗丹明荧光流式细胞仪测量。(C)腹膜巨噬细胞被感染米AIEC和彩色LysoTracker并通过流式细胞术分析。(D, E)与mCherry-expressing腹膜巨噬细胞被感染米AIEC。图形显示(D)表示基因的mRNA表达和免疫印迹代表cation-independent mannose-6-phosphate受体蛋白质后24小时内,(E)代表从LAMP1免疫荧光图像。规模的酒吧:10µm。* * * p < 0.05, p < 0.01,方差分析。方差分析,方差分析;LAMP1 lysosome-associated膜蛋白;米AIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;M6pr mannose-6-phosphate受体;PTPN2、蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型;WT,野生型。

    缺陷细菌运输到溶酶体与溶酶体的酸化的缺陷Ptpn2-KO巨噬细胞

    由于自噬是必不可少的入侵细菌的胞内运输到溶酶体,37我们下一个解决自噬是否激活了雷帕霉素恢复细菌进入溶酶体的本地化Ptpn2ko细胞。在rapamycin-treatedPtpn2ko巨噬细胞,本地化的细菌进入溶酶体确实恢复(图6,colocalisation米AIEC LAMP1,子面板八世),但仍没有pHRhodamine亮点检测感染pHRhodo粒子,表明自噬激活可以恢复交通细菌进入溶酶体的能力Ptpn2ko细胞,但在溶酶体酸化存在缺陷(图6子面板iii)。治疗IFN-γCI-M6PR STAT1减少表达和激活。38因此,我们假设,STAT1观察到的水平升高Ptpn2ko巨噬细胞可能有助于减少CI-M6pr蛋白表达和随后的缺陷在这些细胞的溶酶体酸化。为了验证这个假设,我们沉默STAT1和随后激活自噬雷帕霉素治疗后感染米AIEC或pHRhodo粒子。在此设置中,我们清楚地观察到细菌LAMP1-positive溶酶体和pHRhodamine-bright点(图6子面板v和x),除了恢复溶酶体的酸化Ptpn2 -KO巨噬细胞,STAT1沉默也恢复CI-6Mpr表达式(在线补充图4)。伴随STAT1沉默和自噬诱导完全正常化增加细菌吸收和复制(图6 b, C)。类似的影响细菌复制观察rapamycin-treated PTPN2-deficient THP-1细胞过表达CI-M6pr (图6 d, E,在线补充图4 c)。综上所述,这表明细菌处理中观察到的缺陷Ptpn2缺乏细胞缺陷的结果自噬和溶酶体的酸化,而恢复的流程重新清除胞内细菌的能力Ptpn2ko细胞。

    Autophagy activation combined with STAT1 silencing normalises bacterial handling in PTPN2-defective cells. (A) Peritoneal macrophages from WT, Ptpn2-Het (HET), or Ptpn2-KO (KO) mice were infected with pHRhodamine linked K12 (A, images in upper panel) or with mCherry-expressing mAIEC and autophagy induced using rapamycin and/or STAT1 silenced using siRNA. Depicted are representative fluorescent images and mean fluorescent intensity for LysoTracker stained cells. Scale bars: 10 µm. (B, C) Peritoneal macrophages were infected with K12 (K), LF82 (LF) or mAIEC (mA) and treated with rapamycin and/or STAT1 siRNA and analysed for (B) bacterial invasion after 1 hour, and (C) bacterial replication at the indicated time points. (D, E) THP-1 cells expressing PTPN2-specific shRNA (KD) were transfected with an empty vector (EV) or a CI-M6P overexpressing vector and infected with K12 (K), LF82 (LF) or mAIEC (mA) and treated with rapamycin. The graphs show (B) bacterial uptake after 1 hour, and (C) bacterial replication at the indicated time points. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA. ANOVA, analysis of variance; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; M6P, mannose-6-phosphate; PTPN2, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2; STAT1, signal-transducer and activator of transcription.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    自噬激活结合STAT1沉默正常化细菌处理PTPN2-defective细胞。(一)从WT腹膜巨噬细胞,Ptpn2 -Het (Het),或Ptpn2KO (KO)小鼠感染pHRhodamine与K12 (A,图片在上面板)或mCherry-expressing米AIEC和自噬诱导使用雷帕霉素和/或使用核STAT1沉默。描述代表荧光图像和平均荧光强度LysoTracker染色细胞。规模的酒吧:10µm。(B, C)腹膜巨噬细胞感染K12 (K), LF82(低频)或米AIEC (米)和雷帕霉素治疗和/或STAT1 siRNA和分析(B) 1小时后细菌入侵,和(C)细菌复制在指定的时间点。(D, E) THP-1细胞表达PTPN2-specific成分(KD)转染空向量(EV)或CI-M6P overexpressing向量和感染K12 (K), LF82(低频)或米AIEC (米一)和雷帕霉素治疗。图形显示(B)细菌吸收1小时后,和(C)细菌复制在指定的时间点。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001,方差分析。方差分析,方差分析;米AIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;M6P mannose-6-phosphate;PTPN2、蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型;STAT1,信号转导和转录激活。

    老鼠缺乏Ptpn2在巨噬细胞更容易米AIEC感染

    测试缺陷细菌的体内后果处理与PTPN2-loss巨噬细胞,小鼠缺乏PTPN2髓细胞(Ptpn2-LysMCre老鼠;主要PTPN2-loss在巨噬细胞26),Ptpn2fl/fl控制口头填喂法与10连续四天9米AIEC或非侵入性K12大肠杆菌。与细菌的体外缺陷处理一致,我们观察到增加米AIEC负载的凳子上Ptpn2-LysMCre小鼠脾脏和增强细菌易位,肠系膜淋巴结和肝脏,核纤层蛋白的细菌计数升高一个固有层巨噬细胞(图7模拟)。mAIEC只引起轻微的疾病Ptpn2-LysMCre但不Ptpn2fl/fl同窝出生的(图7 e, F),但没有明显的差异可检测在组织学得分由感染和健康人Ptpn2fl/fl或Ptpn2-LysMCre老鼠(图7 g),而炎症标记物,如髓过氧物酶和mRNA水平的炎性细胞因子在AIEC-infected升高Ptpn2-LysMCre老鼠(图7 h l)。符合我们体外观察,使用雷帕霉素激活自噬,或抑制CEACAM1使用抑制anti-CEACAM1抗体,部分避免增加/吸收肠道细菌易位在巨噬细胞和正常疾病活动Ptpn2-LysMCre老鼠(在线补充图5)。这些数据清楚地表明损失Ptpn2在巨噬细胞阻碍潜在致病菌的间隙和促进易感性AIEC全身疾病的体内。

    Mice lacking PTPN2 in macrophages are more susceptible to mAIEC infection.Ptpn2fl/fl and Ptpn2-LysMCre littermates were orally infected for 4 days with 109 LF82 or mAIEC and Escherichia coli load in (A) the stool at day 5, (B) in the spleen, (C) mesenteric lymph nodes, (D) the liver and (E) lamina propria macrophages determined by plating on LB agar plates. (F) Disease activity index (DAI) over the course of the experiment. (G) Representative histological pictures and histopathology scoring. (H) Myeloperoxidase (MPO) levels in colon pieces. (I–L) mRNA expression levels of the indicated genes in the colon normalised to Gapdh and the median of untreated controls. *P<0.05, **p<0.01, ANOVA. ANOVA, analysis of variance; mAIEC, mouse adherent-invasive Escherichia coli; PTPN2, protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    老鼠在巨噬细胞更容易缺乏PTPN2 mAIEC感染。Ptpn2fl / fl和Ptpn2-LysMCre同窝出生的是口头感染与10 4天9LF82或米AIEC和大肠杆菌负载在第五天(A)上厕所,脾(B), (C)肠系膜淋巴结、肝脏(D)和(E)固有层巨噬细胞由电镀磅琼脂板上。(F)疾病活动指数(DAI)的实验。(G)代表组织学图片和组织病理学评分。结肠(H)髓过氧化酶(MPO)水平。(我)表示基因的信使rna表达水平结肠正常化Gapdh和未经处理的中值控制。* * * P < 0.05, P < 0.01,方差分析。方差分析,方差分析;mAIEC、鼠标adherent-invasive大肠杆菌;PTPN2、蛋白质酪氨酸磷酸酶non-receptor 2型。

    讨论

    我们表明,正常PTPN2表达和功能在肠巨噬细胞/髓细胞清除肠道adherent-invasive细菌,是至关重要的PTPN2缺乏严重妥协有效macrophage-mediated消除入侵的细菌,从而促进AIEC- - - - - -诱发肠道疾病。巨噬细胞防止系统传播的细菌破坏上皮屏障39和macrophage-induced免疫反应对腔的病原体和pathobionts附着细菌过度生长限制,40从而形成肠道菌群组成。41-43IBD患者携带的微生物PTPN2 -SNP rs1893217不同于微生物组的病人没有变异。24 44符合这一点,SNP rs1893217或损失的存在Ptpn2导致增加入侵细菌易位,再加上有缺陷的间隙,影响可能导致细菌组成的变化观察到PTPN2变体载体IBD患者。缺陷应对AIEC巨噬细胞的损害PTPN2函数是明确的临床重要性的高位AIEC IBD患者肠活检中发现的。5除了解释微生物组成的改变PTPN2不同航空公司,我们的研究结果确定额外的机制如何PTPN2变异有助于增加患炎症性肠病的风险。

    Ptpn2-LysMCre老鼠缺乏Ptpn2主要在巨噬细胞和单核细胞26显示增加粘附和入侵AIEC挑战,而且显示消化系统易位和AIEC-induced疾病。因此,我们的数据表明,自噬和溶酶体酸化中观察到的缺陷Ptpn2缺乏体内巨噬细胞有一个明确的相关性。

    细菌是积极了,随后在巨噬细胞退化的两个不同的机制:(1)通过内吞作用/吸收吞噬作用和交付到溶酶体,45和(2)自噬/ xenophagy细菌,坚持目标细菌细胞膜,进入细胞溶质和/或逃避endosome-lysosome通路。33细胞内囊泡是高度动态的和相互联系的,自噬小泡促进后期核内体与溶酶体融合。34 35因此,自噬缺陷,如观察到PTPN2不足或有缺陷的细胞,至关重要的是妨碍打击入侵细菌的能力。这与我们的观察和以前公布的体外研究表明自噬缺陷在IEC和单核细胞缺乏PTPN2。22基因研究指向自噬缺陷的一个重要贡献,炎症性肠病的发展,46和变异autophagy-inducing受体NOD2 autophagy-initiator分子ATG16L1是最早与IBD相关的基因。47 48细菌诱导自噬小体的招聘网站产品的细菌入口。37它被描述,AIEC可以颠覆自噬通过阻断autophagosome-lysosome融合,导致感染的细胞凋亡中性粒细胞和整体AIEC负担增加。49这些发现表明自噬缺陷阻碍AIEC结关并最终促进入侵病原体的生存。值得注意的是,我们观察到autophagy-activation不仅在AIEC-infected细胞,而且在非侵入性K12的存在大肠杆菌,在PTPN2-deficient巨噬细胞再次被废除。这表明PTPN2损失不仅影响响应病原体/ pathobionts,但也妥协的生理反应温和的共生体。

    炎症性肠病的一个重要对于小鼠模型观察和学习的相关性AIEC感染这些模型是使用最广泛的AIEC模型应变,LF82,通过绑定CEACAM6进入肠上皮细胞和巨噬细胞。30.然而,老鼠细胞不表达CEACAM6因此不是很容易感染人类AIEC菌株。30.这个问题是克服在一些研究利用转基因小鼠表达人类CEACAM3, 5、6和7。50CEACAMs iec的这些老鼠的表达式模式对应于观察人类,然而,它也导致了地穴增生和异常的隐窝形态。50因此,这个模型可能不是最佳适合研究AIEC-host交互。相比之下,我们最近发现米AIEC27入侵老鼠巨噬细胞,因为它是有效的结合,通过使用CEACAM1进入宿主细胞,这是小鼠肠上皮细胞和肠巨噬细胞中高度表达。51因此,这部小说米AIEC应变可能代表一个更合适的应变的影响为研究AIEC殖民IBD的小鼠模型。

    AIEC操纵宿主感染的反应,也就是说,据报道,AIEC应变LF82促进巨噬细胞的生存通过抑制核转录因子(NF) -κB信号,52但是最近的研究表明,细胞内AIEC生存早期感染取决于NF-κB激活,53虽然AIEC减弱同一信号通路。54此外,AIEC比非侵入性更耐溶酶体超氧化物大肠杆菌菌株。54AIEC也更耐溶酶体酸性pH值,使他们能够生存在巨噬细胞内,而不需要逃避时间/核内体。55这是极大的兴趣并减少PTPN2-deficient巨噬细胞溶酶体的酸化。因此,功能丧失PTPN2可能促进细胞内生存AIEC在两个方面:(1)影响运输到溶酶体的细菌和(2)限制酸化在溶酶体中,从而影响降解细菌细胞的能力。

    总之,我们表明,自体免疫风险基因PTPN2参与处理入侵病原体及其损失巨噬细胞清除pathobionts妥协。我们不仅发现了一些分子机制导致细菌缺陷处理,但也证明有效的细菌清除率的重要性在AIEC巨噬细胞,防止肠道炎症感染。这可能不仅功能解释观察到的改变在IBD患者携带的微生物组成PTPN2SNP rs1893217,24 44但至少在一定程度上也可以解释,为什么病人携带这种变异更容易受到炎症性肠病的发展。

    数据可用性声明

    所有数据都包含在相关研究文章或上传在线补充信息。

    伦理语句

    病人同意出版

    确认

    我们感谢教授分析师Nicole Beauchemin(古德曼癌症研究中心,麦吉尔大学)的批判阅读手稿CEACAM生物学和有价值的输入。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 贡献者夫人:研究和实验设计、数据采集、分析和解释,写的手稿;灰、PC、VC、ASa, as - b气体分离器:数据采集和分析;女士:提供患者样本;简森-巴顿:与细菌隔离和文化支持,数据解释和关键知识输入;DFM:数据解读、研究设计、监督的实验中,资金,稿件的编辑;MLT和女士提供了老鼠。所有作者回顾了手稿。

    • 资金这项研究是由美国国立卫生研究院研究经费支持DFM (2 r01dk091281;和1 r01ai153314);克罗恩氏的高级研究奖和结肠炎基金会DFM;和瑞士国家科学基金会的研究津贴(P300PB_177932)和哈特曼穆勒夫人基金会的资助这项研究是由一个先进的支持。从瑞士国家科学基金会博士后奖学金(项目Nr P300PB_177932)夫人,通过国家卫生研究院资助2 r01dk091281和1 r01ai153314 DFM、和克罗恩病结肠炎DFM基金会高级研究员奖。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

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