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胰腺
原始研究
溶解cox - 2表达的衰老细胞可以抑制胰腺癌前病变的生长
  1. Dror Kolodkin-Gal1，2，
  2. Lior Roitman3.，
  3. Yossi Ovadya3.，
  4. Narmen Azazmeh1，
  5. 本杰明Assouline1，
  6. 耶胡达施莱辛格4，
  7. 雷切尔因1，2，
  8. 扫罗的情况1，2，
  9. Yonatan Khalatnik1，2，
  10. 安娜Hochner-Ger1，2，
  11. 阿什拉夫阿訇2，
  12. 乔纳森·亚伯拉罕·德马2，
  13. 埃坦冬天5，
  14. 哈达尔发现Benyamini5，
  15. 莎罗娜Elgavish5，
  16. Areej AS Khatib6，
  17. 凯伦·梅尔7，
  18. Karine亚特兰大7，
  19. 伊莱Pikarsky7，
  20. 奥伦Parnas将4，
  21. 尤金龟子1，
  22. 吉迪恩Zamir2，
  23. 以太Ben-Porath1，
  24. 瓦莱里·Krizhanovsky3.
  1. 1发育生物学与癌症研究系“，，以色列-加拿大医学研究所，希伯来大学哈大沙医学院，耶路撒冷,以色列
  2. 2外科，哈大沙-希伯来大学医学中心，耶路撒冷,以色列
  3. 3.分子细胞生物学系“，，魏茨曼科学研究所，雷,以色列
  4. 4Lautenberg免疫和癌症研究中心的Concern基金会实验室，希伯来大学哈大沙医学院IMRIC，耶路撒冷,以色列
  5. 5Info-CORE，希伯来大学I-CORE生物信息学部门和哈大沙医疗中心，耶路撒冷,以色列
  6. 6理学院生物科技系硕士，伯利恒大学，伯利恒、巴勒斯坦
  7. 7病理学系，哈大沙-希伯来大学医学中心，耶路撒冷,以色列
  1. 对应到以色列耶路撒冷希伯来大学哈大沙医学院Ittai Ben-Porath;ittaibp在{}mail.huji.ac.il；以色列耶路撒冷希伯来大学哈大沙医学院尤瓦尔·多尔;yuvald在{}ekmd.huji.ac.il；吉迪恩·扎米尔，哈达沙-希伯来大学医学中心，以色列耶路撒冷;rgideonz在{}hadassah.org.il；瓦莱里·克里扎诺夫斯基，以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所;valery.krizhanovsky在{}weizmann.ac.il

摘要

客观的细胞衰老通过阻断癌前细胞的增殖来限制肿瘤的发生。此外，衰老细胞可发挥旁分泌效应影响肿瘤生长。衰老细胞存在于恶性前胰腺上皮内瘤变(PanIN)病变中，但其对疾病的影响尚不明确。目前尚不清楚旨在消除病变衰老细胞的senolytic药物是否有助于阻止肿瘤的发展。

设计为了揭示衰老细胞的功能及其对早期胰腺肿瘤发生的潜在贡献，我们从kras驱动的小鼠模型中形成的PanINs中分离并表征了衰老细胞，并测试了通过senolytic治疗对其进行靶向消除的结果。

结果我们发现，衰老的PanIN细胞通过表达包括高Cox2水平在内的促炎特征发挥肿瘤促进作用。bcl2家族抑制剂ABT-737的溶色治疗消除了表达cox - 2的衰老细胞，间断的短时间治疗过程显著减少了PanIN的发展和胰腺导管腺癌的进展。

结论这些发现揭示了衰老的PanIN细胞支持肿瘤的生长和进展，并首次表明消除衰老细胞可能是有效的癌前病变进展的预防性治疗。

  • 胰腺肿瘤
  • 细胞生物学
  • 细胞周期控制

数据可用性声明

数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。mRNA-seq表达谱存入基因表达综合(GEO)数据库，登录号为GSE128319 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128319)．scRNA-Seq数据可在GSE141017 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE141017)．没有准入或使用条件。

https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名4.0未移植(CC BY 4.0)许可发布，该许可允许其他人复制、重新发布、混合、转换和基于此作品的任何目的，只要原始作品被正确引用，提供许可证链接，并说明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-321112

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 衰老细胞存在于恶性病变前，包括胰腺上皮内肿瘤(PanINs)，但它们是否影响病变的生长和进展尚不清楚。具有senolytic活性的药物最近被确认并显示在临床前模型中改善了许多疾病表型。它们在癌症治疗中的潜在益处还有待证实。

    新的发现是什么?

    • 衰老细胞为PanIN的生长提供了重要的支持，至少部分是通过Cox2的活性。通过Bcl2抗凋亡蛋白家族的抑制剂ABT-737可溶除表达cox - 2的衰老细胞，定期治疗可显著减少PanIN的生长和胰腺导管腺癌的进展。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 应用senolytic治疗可能有助于预防PanINs的进展，特别是在有风险的人群中，如家族性胰腺炎患者。在衰老细胞促进肿瘤发生的其他情况下，Senolytic治疗可能具有潜力。

    简介

    细胞衰老是癌症发展的主要障碍，阻止潜在转化细胞的增殖。1 - 3发生肿瘤转化的细胞衰老主要由癌基因活性和DNA损伤反应诱导，并由包括p16在内的几种主要途径介导Ink4a和p53肿瘤抑制因子。衰老细胞在肿瘤中被检测到，通常在恶性肿瘤前阶段，与肿瘤抑制作用一致。4然而，现在已经清楚的是，衰老细胞可以通过附加的，非细胞自主的机制影响肿瘤的发生，主要由衰老相关的分泌表型(SASP)介导，这涉及到大量细胞因子，生长因子和重塑酶的分泌。5个6SASP的组成和水平高度依赖于环境，由DNA损伤促进，并由包括核因子-κB (NFκB)在内的多种调控因子介导。5个6

    衰老细胞在癌症中的非细胞自主作用是复杂的。在某些环境中，衰老细胞通过免疫细胞的募集或衰老表型的增殖被证明可以抑制肿瘤的发生，7号到9号而在其他情况下，这种细胞通过分泌肿瘤刺激细胞因子或产生免疫保护环境促进肿瘤的发生。10 - 13然而，对于衰老细胞在不同肿瘤类型、分期和细胞间隔中的流行情况以及它们的功能，总体上了解甚少。

    在小鼠模型中，衰老细胞被证明在很大程度上促进了衰老和相关疾病，这表明消除它们可能是有益的。14日15目前已经确定了几种具有senolytic活性(优先消除衰老细胞)的药物，包括Bcl2抗凋亡蛋白家族的抑制剂，foxo4衍生肽，达沙替尼和槲皮素的组合，心脏糖苷和其他药物。3 14 15这些药物，当在各种临床前模型中使用时，可以改善各种组织中广泛的疾病表型，并延长寿命。3 16 17然而，senolytic药物在癌症治疗或预防方面的潜在益处和具体用途在很大程度上仍是未知的，这取决于衰老细胞在不同疾病环境中所扮演的角色。

    恶性胰导管腺癌(PDAC)是最致命的肿瘤类型之一，最近在治疗方案上几乎没有进展。18 19炎症被认为促进PDAC的形成，因为胰腺炎是该疾病的一个风险因素，20.实验诱导的胰腺炎在小鼠模型中加速向恶性发展。21 - 24日衰老细胞在胰腺上皮内肿瘤(PanINs)中被检测到，PanINs是PDAC最常见的前体。23 25 26PanIN病变中衰老细胞的存在是否影响PanIN的生长和PDAC的进展尚不清楚。根据尸检评估，PanIN病变在一般人群中有很大一部分被发现，27 28PDAC高危人群，如遗传性胰腺炎或肥胖症患者，PanIN的形成率较高。29 30这表明具有潜在进展风险的恶性前胰腺疾病可能普遍存在，因此，了解这些病变中衰老的影响是重要的。

    在这里，我们开始揭示衰老细胞在恶性前胰腺病变中的功能，并测试通过senolytic治疗消除它们的潜在效果。我们的研究结果显示，这些非分裂细胞表达高Cox2水平，为PanIN的发展和进展提供了必要的支持，消除这些细胞的senolytic治疗可以有效阻止PanIN的生长和PDAC的形成。

    结果

    衰老细胞和增殖细胞共同驻留在PanINs中

    为了在PanIN形成的快速模型中跟踪衰老细胞的外观，我们使用了在腺泡细胞特异性控制下携带诱导Cre的小鼠Ptf1a启动子，一个条件喀斯特G12D等位基因和条件tdTomato报告基因(Ptf1a-CreER+ / -；LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato老鼠)。通过他莫西芬治疗，这些三转基因小鼠可以激活腺泡细胞中的突变Kras和tdTomato报告基因。我们用它莫西芬治疗6-8周大的三转基因小鼠，并在随后的不同时间点收集它们的胰腺(图1一个)．在他莫西芬治疗10天后，约50%的腺泡细胞中检测到激活tdTomato和Kras的重组(图1 b而且在线补充图1A)．

    Kras-driven PanINs contain intermixed dividing, apoptotic and senescent cells. (A) Diagram showing the timeline of Kras activation in Ptf1a-CreER+/–; LSL-Kras+/G12D; LSL-tdTomato mice by tamoxifen injection and subsequent analysis time points. (B) tdTomato fluorescence (red) in sections of pancreata collected 10 days after tamoxifen administration. (C) H&E-stained sections of pancreata from triple-transgenic (right) and control double-transgenic mice (left) 35 or 90 days after tamoxifen treatment, showing PanIN1 development in Kras-activated mice. (D) Percentages of tissue area occupied by acinar to ductal metaplasia (ADM) and PanIN lesions at indicated time points after tamoxifen treatment. Values indicate mean across mice (dots) per group ±SE. n=3 for 15 and 35 days, n=5 for 90 days. (E) Pancreas sections from Kras-activated PanIN1-bearing (right) and control (left) mice 3 months after tamoxifen treatment, stained for the proliferation marker Ki67, the apoptosis marker cleaved caspase 3 (CC3), the senescence markers SA-βGal and p16Ink4a, and for p53. (F) Percentage of Ki67+ cells at indicated time points after tamoxifen treatment in pancreas of control mice (black), in regions outside of PanINs in Kras-activated mice (pink), and within PanIN lesions of Kras-activated mice (red). Values indicate mean across mice (dots) in each group ±SE. n=5 for ≤10 days and n=4 for 90 days. (G) Percentage of CC3+ cells in the same samples scored and presented as in (F). (H) Representative FACS analysis of SA-βGal activity, detected with the C12FDG fluorescent substrate and tdTomato fluorescence, in pancreas cells isolated 3 months after tamoxifen treatment from control and Kras-activated mice. Gates indicate tdTomato+ SA-βGal– (red) and tdTomato+ SA-βGal+ (green) cell fractions. (I) Percentage of SA-βGal+ cells out of tdTomato+ cells in control and Kras-activated mice, analysed by FACS as in (H). n=4 control and n=5 Kras-activated mice, collected in two independent experiments. (J) FACS histogram of cell size (forward scatter area, FSC-A) of tdTomato+ SA-βGal– (red) and tdTomato+ SA-βGal+ (green) cell fractions isolated from pancreata of KRas-activated mice. ***P<0.001, t-test. Scale bars=50 µm. PanINs, pancreatic intraepithelial neoplasia.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    kras驱动的PanINs包含分裂、凋亡和衰老细胞的混合。(A)显示Kras激活时间线的图表Ptf1a-CreER+ / -；LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato小鼠经他莫昔芬注射及后续分析时间点。(B)他莫西芬给药后10天胰腺切片上的tdTomato荧光(红色)。(C)三转基因小鼠(右)和对照双转基因小鼠(左)在他莫西芬治疗后35天或90天的胰腺h&e染色切片，显示kras激活小鼠PanIN1的发育。(D)他莫西芬治疗后指示时间点腺泡-导管化生(ADM)和PanIN病变所占组织面积百分比。数值表示每组小鼠的平均值(点)±SE。15和35天N =3, 90天N =5。(E)他莫西芬治疗3个月后，kras激活的panin1小鼠(右)和对照小鼠(左)的胰腺切片，对增殖标记Ki67、凋亡标记cleaved caspase 3 (CC3)、衰老标记SA-βGal和p16进行染色Ink4a和p53。(F) Ki67的百分比+他莫西芬治疗后指示时间点的胰腺细胞(黑色)、kras激活小鼠PanINs外区(粉色)和kras激活小鼠PanIN病变内(红色)。数值表示每组小鼠的平均值(点)±SE。≤10天N =5，≤90天N =4。(G) CC3的百分比+(H) SA-βGal活性的代表性FACS分析，用C12FDG荧光底物和tdTomato荧光，在他莫西芬治疗3个月后分离出对照和kras激活小鼠的胰腺细胞。盖茨表示tdTomato+SA -β加- - - - - -(红色)和tdTomato+SA -β加+(绿色)细胞组分。(I) SA-βGal百分比+细胞从tdTomato中取出+对照组和kras激活小鼠的细胞，用FACS分析如(H)。n=4个对照组和n=5个kras激活小鼠，收集于两个独立实验。(J) tdTomato细胞大小的FACS直方图(forward scatter area, FSC-A)+SA -β加- - - - - -(红色)和tdTomato+SA -β加+(绿色)从kras激活小鼠胰脏分离的细胞片段。* * * P < 0.001, t检验。比例尺=50 μ m。胰腺上皮内瘤变。

    Cox2 is preferentially expressed in non-dividing senescent PanIN cells. (A) SASP-associated genes upregulated in SA-βGal+ vs SA-βGal– PanIN cells isolated from Ptf1a-CreER+/–; LSL-Kras+/G12D; LSL-tdTomato mice 3 months after tamoxifen treatment, determined by mRNA-seq. The senescence activator Cdkn2a is shown on right. n=3 mice, PAdj <0.1 for all genes. (B) Gene sets upregulated in SA-βGal+ vs SA-βGal– PanIN cells. values indicate –log10 of adjusted P value as determined by ingenuity pathway analysis. (C) Cox2 stain (brown) of pancreas sections of control and Kras-activated mice, 3 months after tamoxifen treatment. (D) Percentage of Cox2+ cells at indicated time points after tamoxifen treatment in pancreas of control mice (black), in regions outside of PanINs in Kras-activated mice (pink), and within PanINs in Kras-activated mice (red). Values indicate mean across mice (dots) in each group ±SE. n=3 for both time points. (E) Co-staining of pancreas sections from control and Kras-activated mice for Cox2 (yellow) and the proliferation marker Ki67 (green), showing lack of overlap. (F) Percentage of Cox2+ cells, Ki67+ cells and cells expressing both proteins, in pancreas sections of Kras-activated mice (left); graph on right shows same analysis for BrdU+ cells. Values indicate mean percentages ±SE. Scored in >10 section areas from 5 or 3 mice (for Ki67 and BrdU, respectively), with a total of >1500 PanIN cells scored. (G) Mean area ±SE of Cox2– and Cox2+ PanIN cells. n=127 cells per group, from two mice. (H) Serial pancreas cryosections from Kras-activated mice stained for Cox2 (brown) or SA-βGal (blue). Arrows indicate examples of regions showing overlapping stain. (I) Uniform manifold approximation and projection (Umap) cell clustering of the scRNA-Seq expression profiles of epithelial cells from Ptf1a-CreER+/–; LSL-Kras+/G12D; LSL-tdTomato mice, derived from Schlesinger et al.33 Shown are cells combined from 17D, 6 wk and 3–6 months after Kras activation, as well as cells from Ptf1a-CreER+/–; LSL-tdTomato control mice (see online supplemental figure 4). The senescent cell cluster is labelled as cluster 18. (J) Expression levels of Cdkn2a, Ptgs2, and Mki67 (encoding the proliferation marker Ki67) across cells. Red—high relative expression, grey—low expression. ***P<0.001, t-test. scale bars=50 µm. BrdU, bromodeoxyuridine; IGF, insulin-like growth factor; VEGF, vascular endothelial growth factor; IL-6, interleukin 6; HGF, hepatocyte growth factor; NFκB, nuclear factor-κB; PanINs, pancreatic intraepithelial neoplasia; SASP, senescence-associated secretory phenotype;TGF, transforming growth factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    Cox2在非分裂的衰老PanIN细胞中优先表达。(A) SA-βGal中sapp相关基因上调+对SA -β加- - - - - -PanIN细胞分离Ptf1a-CreER+ / -；LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato小鼠在他莫昔芬治疗3个月后，通过mRNA-seq测定。衰老激活剂Cdkn2a如图所示。n=3只小鼠，所有基因的PAdj均<0.1。(B) SA-βGal基因上调+对SA -β加- - - - - -PanIN细胞。值指示-log10通过匠心路径分析确定的调整后的P值。(C)他莫昔芬治疗3个月后，对照组和kras激活小鼠胰腺切片Cox2染色(棕色)。(D) Cox2的百分比+在他莫西芬治疗后的指示时间点，对照组小鼠胰腺内的细胞(黑色)、kras激活小鼠PanINs外区(粉色)和kras激活小鼠PanINs内区(红色)。数值表示每组小鼠的平均值(点)±SE。两个时间点N =3。(E)对照组和kras激活小鼠的胰腺切片Cox2(黄色)和增殖标记Ki67(绿色)的联合染色，显示缺乏重叠。(F) Cox2的百分比+细胞,Ki67+kras激活小鼠胰腺切片中表达这两种蛋白质的细胞和细胞(左);右图显示了BrdU的相同分析+细胞。数值为平均百分比±SE。5只或3只小鼠(分别为Ki67和BrdU) >10切片区评分，共>1500个PanIN细胞评分。(G) Cox2的平均面积±SE- - - - - -和Cox2+PanIN细胞。每组127个细胞，取自两只小鼠。(H) kras激活小鼠的一系列胰腺冷冻切片，Cox2染色(棕色)或SA-βGal染色(蓝色)。箭头表示重叠着色区域的例子。(I)来自上皮细胞的scRNA-Seq表达谱的统一歧管近似和投影(Umap)细胞聚类Ptf1a-CreER+ / -；LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato小鼠，来源于施莱辛格等．33显示的是Kras激活后17D、6周和3-6个月合成的细胞，以及Ptf1a-CreER+ / -；LSL-tdTomato对照组小鼠(见在线补充图4)．衰老细胞簇被标记为第18簇。(J)表达水平Cdkn2a，Ptgs2,而且Mki67(编码增殖标记Ki67)跨越细胞。高红相对表达，低灰相对表达。* * * P < 0.001, t检验。比例尺=50 μ m。BrdU溴脱氧尿苷;IGF，胰岛素样生长因子;VEGF，血管内皮生长因子;IL-6，白细胞介素6;HGF，肝细胞生长因子;nf -κB，核因子-κB; PanINs, pancreatic intraepithelial neoplasia; SASP, senescence-associated secretory phenotype;TGF, transforming growth factor.

    Kras激活后1个月首次观察到腺泡到导管化生(ADM)和PanIN-1病变的形成，Kras激活后90天这些病变丰富，很少有更晚期的病变(图1 c, D)．如预期的那样，病变由td番茄表达细胞(在线补充图1B)．在PanINs中，约30%的细胞Ki67增殖标记阳性，平均12%的细胞为凋亡标记cleaved caspase 3 (CC3)阳性(图1比)．衰老标记SA-βGal的染色表明PanINs中存在衰老细胞，p16细胞亚群的阳性染色支持这一结果Ink4a而p53，这一状态的两个主要激活因子(图1 e)．FACS定量分析显示~20%的tdTomato+SA-β gal阳性细胞(图1 h,我)．与它们的衰老状态一致，这些细胞的大小也更大(图1 j)．这些结果表明，PanINs含有分裂细胞、凋亡细胞和衰老细胞，它们分布在病变内部。有趣的是,SA -β加+td番茄阴性部分中也检测到细胞(图1 h)．进一步分析非上皮细胞部分发现SA-βGal的存在+成纤维细胞，表达升高Cdkn2a以及免疫细胞，包括巨噬细胞(在线补充图2)．因此，除了在PanINs中存在外，衰老细胞似乎也存在于这些病变的间质中。

    衰老的PanIN细胞表达Cox2

    为了深入了解衰老PanIN细胞的特性，我们在Kras激活90天后分离三转基因小鼠的胰腺，并用FACS tdTomato分离+SA-βGal细胞- - - - - -或SA -β加+（在线补充图3A)．比较这两种细胞群的转录组发现Cdkn2a，编码p16Ink4a，在SA-βGal中+细胞(图2一个而且在线补充图2C)，以及与细胞骨架结构、细胞粘附和其他与衰老相关的通路相关的基因集的变化(在线补充图3B)．细胞因子编码基因在衰老细胞中上调，与SASP激活一致(图2 b而且在线补充图3C)．包括上调的细胞因子编码基因Cxcl1, Cxcl5, Cxcl14, Tnf，Ccl2, Il18而且白细胞介素6,sapp的所有已知组成部分(图2一个)．

    在上调的sap相关基因中Ptgs2,编码Cox2酶(环加氧酶2)，负责前列腺素E2的合成，是炎症的核心驱动因素(图2一个)．Cox2先前被证实在PanINs和pdac中上调，其促炎活性促进疾病进展。31日32然而，病变内部表达cox - 2的细胞身份尚未确定。我们对Cox2的PanIN切片进行染色，发现20%-30%的细胞表达该蛋白(图2氟)．PanIN病变中染色细胞多为上皮细胞，偶见间质成纤维细胞染色(图2 c)．为了进一步确定Cox2在衰老PanIN细胞中的表达是否优先升高，我们绘制了Cox2、增殖标记Ki67和溴脱氧尿苷(BrdU)的切片。这揭示了一个相互排斥的模式，表明Cox2+细胞不会增殖(图2 e, F)．PanINs内表达cox - 2的细胞比cox -阴性细胞平均更大，与衰老状态一致(图2 g)．SA-βGal和Cox2在连续冷冻切片上的染色显示重叠模式(图2 h)．这些结果表明，Cox2的表达与PanIN细胞的衰老部分特异性相关。

    为了获得衰老细胞亚群的进一步评估，我们转向单细胞转录组学。我们最近进行了胰腺的单细胞RNA-SeqPtf1a-CreER+ / -；LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato在Kras激活后的几个时间点，一项分析发现衰老PanIN细胞的亚簇33（图2我而且在线补充图4)．对这些数据的进一步分析表明Ptgs2(编码Cox2)对衰老亚簇细胞高度特异性，也表达Cdkn2a，并与增殖的PanIN细胞簇(图2 i, J)．分别为分裂、衰老和Cox2的百分比+细胞与在组织染色中观察到的细胞不同，可能是由于在scRNA-Seq之前的细胞分离程序存在偏差。这一分析支持了衰老的、不分裂的细胞部分的鉴定，即在PanINs中表达升高的Cox2。

    为了测试Cox2活性是否影响病变生长，我们用Cox2抑制剂sulindac治疗三转基因小鼠3周，从Kras激活3个月开始，这个时间点PanINs已经形成。与未处理的同窝小鼠相比，处理过的小鼠PanIN区域显著减少(约5倍)(图3A及B)．苏林达处理的小鼠显示PanIN细胞增殖下降(图3 c)和tdTomato+治疗后1周从小鼠分离的细胞facs显示增殖相关基因组表达减少(图3 d)．这些结果表明，Cox2在衰老的PanIN细胞中表达，其活性促进PanIN病变的生长。

    Cox2 inhibition by sulindac treatment suppresses PanIN development. (A) H&E (top) and Alcian blue (bottom) stains of pancreas sections from Kras-activated mice treated with the Cox2 inhibitor sulindac for 3 weeks starting at 11 weeks of age, or untreated. (B) Percentage of PanIN-occupied area in untreated and mice treated with sulindac for 3 weeks, measured by image analysis of Alcian blue stained regions. n=3 mice (dots). (C) Percentage of PanIN cells staining positive for BrdU incorporation, indicating S phase, in mice treated for 3 days with sulindac and in control mice. n=3 mice. (D) Gene sets downregulated in tdTomato+ cells isolated from PanIN-bearing mice treated with sulindac for 1 week, relative to untreated mice. values indicate –log10 of adjusted P value. Graph values indicate mean±SE. *P<0.05, t-test. Scale bar=50 µm. BrdU, bromodeoxyuridine; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasia.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    舒林酸抑制Cox2可抑制PanIN的发展。(A) kras激活小鼠胰腺切片的H&E(上)和阿利新蓝(下)染色，这些小鼠从11周龄开始接受Cox2抑制剂舒林达克治疗3周，或未接受治疗。(B)未治疗和接受舒林酸治疗3周小鼠panin占区百分比，通过阿利新蓝染色区图像分析测量。N =3只老鼠(点)。(C)在舒林酸治疗3天的小鼠和对照组小鼠中，BrdU掺入的PanIN细胞染色阳性的百分率，显示为S期。n = 3老鼠。(D) tdTomato基因下调+与未处理的小鼠相比，从舒林酸处理1周的含panin小鼠中分离的细胞。值表示调整后P值的-log10。图值为平均值±标准差。* P < 0.05, t检验。比例尺=50 μ m。BrdU溴脱氧尿苷;胰腺上皮内瘤变。

    用bcl2家族抑制剂ABT-737处理可以去除衰老的PanIN细胞

    接下来，我们开始测试是否可以通过药物溶senolytic治疗来消除衰老的PanIN细胞，以及这是否会影响PanIN的发展和向癌的进展。我们用Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D小鼠在接受胰腺炎诱导剂青绿素治疗后，会产生炎症促进的PanINs，其中包含衰老细胞，并更迅速同步地发展到癌期。23 26 34 35我们和其他人已经证明，衰老细胞的存活依赖于Bcl2家族抗凋亡蛋白的上调，而抑制Bcl2、Bclxl和Bclw的小分子ABT-737在培养和体内诱导了衰老细胞的凋亡。13 16 36-38

    我们首先检测了Bcl2家族蛋白是否在PanINs中表达，以及其表达是否与衰老有关。Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D小鼠，而不是对照组小鼠，在3个月大时，在绿绿素治疗后2周，出现了大面积的低级别PanINs (图4 a, B)．这些PanINs被SA-βGal所占据+含有表达Bcl2、Bclxl和Bclw蛋白的细胞，与正常对照组小鼠的导管和腺泡隔室(图4 b)．用流式细胞术成像检测发现SA-βGal+细胞由CK19的15%组成+青光斑处理过的细胞Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D老鼠(图4 c, D)，与Ptf1a-CreER驱动模型(图1我)．三种bcl2家族蛋白在PanIN区域的表达分布是不均匀的。Bclxl表达在PanIN病变中最一致上调，并与Cox2共定位(图4 e)．这表明ABT-737可靶向清除PanINs中的bcl2家族表达细胞。我们没有在衰老细胞亚群中检测到Bcl2家族编码基因mRNA水平的增加(数据未显示)，这与我们之前的研究一致，即这些蛋白的上调主要发生在转录后水平。37

    Bcl2-family proteins are expressed in PanIN lesions of caerulein-treated Pdx-Cre; LSL-Kras mice (A). Timeline of treatments and analysis of Pdx1-Cre+/–; LSL-Kras+/G12D and control Pdx1-Cre+/–mice. Caerulein was injected at 2.5 months of age to induce acute pancreatitis, and analysis was performed 2 weeks subsequently. (B) Representative images of consecutive pancreas sections stained for SA-βGal, CK19 labelling PanIN ducts and Bcl2 family proteins. CK19 was costained with Bcl2 family members on same sections. (C) Representative images of SA-βGal negative (top) and positive (bottom) cells isolated from mouse pancreata analysed by ImageStreamX. SA-βGal stain appears as dark stain in phase-contrast image. (D) Percentage of SA-βGal+ CK19+ cells in dissociated pancreata of Pdx1-Cre+/–; LSL-Kras+/G12D and control Pdx1-Cre+/–mice as identified by analysis in ImageStreamX. (E) Representative images of pancreas sections stained for Cox2 and Bclxl. Arrowheads indicate examples of cells expressing both proteins. Values indicate mean across n=5 mice per group, ±SE. *P<0.05. PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasia.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    bcl2家族蛋白在青青素治疗的PanIN病变中表达Pdx-Cre;LSL-Kras小鼠(A).治疗时间线和分析Pdx1-Cre+ / -；LSL-Kras+ / G12D和控制Pdx1-Cre+ / -老鼠。2.5月龄时注射青绿素诱导急性胰腺炎，2周后进行分析。(B) SA-βGal、CK19标记PanIN导管和Bcl2家族蛋白连续胰腺切片染色的代表性图像。CK19与Bcl2家族成员在同一切片上。(C) SA-βGal阴性细胞(上)和阳性细胞(下)的代表性图像，从小鼠胰腺分离，用ImageStreamX分析。SA-βGal染色在相衬图像中呈深色染色。(D) SA-βGal含量+CK19+游离胰腺中的细胞Pdx1-Cre+ / -；LSL-Kras+ / G12D和控制Pdx1-Cre+ / -小鼠经ImageStreamX分析鉴定。(E) Cox2和Bclxl染色的胰腺切片代表性图像。箭头表示表达这两种蛋白质的细胞的例子。数值表明每组n=5只小鼠的平均值，±SE。* P < 0.05。胰腺上皮内瘤变。

    为了测试Bcl2蛋白家族抑制是否消除衰老的PanIN细胞，我们进行了处理Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D给药后，在3月龄时连续2 d给予ABT-737, 1 d后处死小鼠(图5一个)．我们观察到abt -737处理小鼠PanINs中表达凋亡标志物CC3的细胞数量增加，表明Bcl2家族抑制导致PanIN细胞凋亡(图5 b, C)．这些凋亡细胞常脱落到PanIN管腔内。我们没有检测到CC3+治疗后基质成纤维细胞、巨噬细胞或其他基质成分中的细胞(在线补充图5)．重要的是，ABT-737处理导致SA-βGal比例显著降低+和cox2表达细胞(共定位)，与bcl2家族抑制优先消除衰老细胞(图5 d)．此外，bclxl阳性细胞的数量也减少，表明它们是优先靶向的(图5 h,我)．有趣的是，在去除衰老细胞的同时，我们观察到在这个即时时间点，剩余PanIN细胞的分裂率增加(在线补充图6)．这表明分裂的PanIN细胞并不是治疗的优先靶点。不分裂的衰老细胞的消除可能部分反映了Ki67的比例增加+当不分裂的细胞，衰老细胞，被去除。这些结果表明ABT-737抑制Bcl2家族可以消除约50%的衰老和Cox2+PanIN病变内的细胞，这一比率与我们之前的研究一致。13 16 37

    Bcl2-family protein inhibition reduces the numbers of senescent Cox2+ cells. (A) Timeline of treatments and analysis of Pdx1-Cre+/–; LSL-Kras+/G12D mice, including the caerulein treatment point, followed by treatment with ABT-737 2 weeks subsequently, and analysis of mice 2 days later. (B) Pancreas sections from mice treated with ABT-737 or vehicle stained for cleaved caspase-3 (CC3, green), and for CK19 (red). (C) Percentage of CC3+ cells in PanINs from mice treated with ABT-737 or vehicle, quantified by image scoring. Values indicate mean across n=4 mice per group, ±SE. (D) Serial sections from same mice stained for SA-βGal (blue, top) and Cox2 (red, bottom). Arrowheads indicate representative regions of colocalisation. (E) Percentage of SA-βGal+ cells out of CK19+ cells in pancreata from same mice, quantified by imaging cytometry. Values indicate mean across n=6 mice per group, ±SE. (F) Pancreas sections from ABT-737 and vehicle-treated mice stained for Cox2 (brown). (G) Percentage of Cox2+ cells in PanINs from same mice, quantified by image scoring. Values indicate mean across n=4 mice per group, ±SE. (H) Pancreas sections from ABT-737- and vehicle-treated mice stained for Bclxl (red). (I) Bclxl stain per section in PanINs from same mice, quantified by image analysis, scoring red signal per section area. Values indicate mean across n=4 mice per group, ±SE. *P<0.05, **P<0.01, t-test. a.u., arbitrary units; CC3, cleaved caspase 3; PanINs, pancreatic intraepithelial neoplasia.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    bcl2家族蛋白抑制减少了衰老Cox2的数量+细胞。(A)治疗时间线和分析Pdx1-Cre+ / -；LSL-Kras+ / G12D小鼠，包括青绿素治疗点，随后用ABT-737治疗2周后，2天后分析小鼠。(B)经ABT-737或载药处理的小鼠胰腺切片，切片上有cleaved caspase-3 (CC3，绿色)和CK19(红色)染色。(C) CC3的百分比+使用ABT-737或对照剂处理的小鼠PanINs中的细胞，通过图像评分量化。数值表明每组n=4只小鼠的平均值，±SE。(D)同一小鼠的SA-βGal(蓝色，上)和Cox2(红色，下)染色的连续切片。箭头表示共同居住的代表性区域。(E) SA-βGal百分比+从CK19细胞中分离出来+来自同一小鼠的胰腺细胞，用成像细胞术定量。数值表明每组n=6只小鼠的平均值，±SE。(F) Cox2染色的ABT-737和载药处理小鼠胰腺切片(棕色)。(G) Cox2的百分数+通过图像评分量化来自同一小鼠的PanINs细胞。数值表明每组n=4只小鼠的平均值，±SE。(H) ABT-737处理小鼠和对照处理小鼠的胰腺切片，Bclxl染色(红色)。(I)相同小鼠PanINs中每切片Bclxl染色，通过图像分析量化，每切片区域评分红色信号。数值表明每组n=4只小鼠的平均值，±SE。*P<0.05， **P<0.01, t检验。A.u，任意单位;CC3, cleaved caspase 3;胰腺上皮内瘤变。

    去除衰老细胞减少PanIN的形成和PDAC的进展

    我们接下来评估了靶向衰老PanIN细胞是否影响疾病发展。为此，我们测试了ABT-737在肿瘤发生过程中的周期性治疗效果。从3个月大的时候开始，我们注射青绿素治疗Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D给老鼠注射ABT-737，每个月连续两天，超过4个月，然后对动物实施安乐死(图6我们推断，这种间歇性治疗可能有助于了解衰老细胞清除对肿瘤形成过程的影响。abt -737治疗的小鼠与药物治疗的小鼠相比，病变形成明显减少，没有明显的全身毒性(图6 b, C)．随着PanIN形成的显著减少，在治疗小鼠中观察到由细胞因子阵列检测到的炎症细胞因子表达显著下降(图6 d)．我们没有检测到表达Dclk1的细胞百分比的变化，这标志着一个假定的癌症起始细胞亚群39（在线补充图7)，表明ABT-737处理后PanINs存在的减少并不是由于该种群的去除。这些结果表明，通过抑制Bcl2家族蛋白靶向衰老细胞可以抑制PanIN的发育。

    Elimination of senescent cells blocks PanIN development and reduces PDAC incidence. (A) Timeline of caerulein and repeated ABT-737 treatments during PanIN and PDAC formation period. ABT-737 was administered for 2 days every month, for four consecutive months, and mice were either sacrificed after the last treatment (point 1), or maintained for a further 3.5 months (point 2). (B) Representative images of pancreatic sections from time point one stained for CK19, SA-βGal and CD45, labelling hematopoietic cells. (C) Percentage of tissue area containing ADM and PanIN lesions in mice treated with ABT-737 (n=6) or vehicle (n=3). Values indicate mean per group ±SE. (D) Levels of cytokines and chemokines in pancreata of Pdx1-Cre+/-; LSL-Kras+/G12D mice treated with ABT-737, as measured by cytokine array. Values are shown relative to levels in vehicle-treated mice (pool of 3 mice per group). (E) Percentages of mice treated with ABT-737 or with vehicle that showed PDAC formation upon sacrifice at time point 2. Images show representative whole pancreas from mice in each group. Arrow indicates a large PDAC lesion. *P<0.05, χ2 test between ABT-737 and vehicle treated groups. (F) Pancreas to body-weight ratio in same mice as in (E). Values indicate mean across mice ±SE, n numbers as in (E). (G) Representative images of pancreatic sections from time point two stained as indicated. (H) Percentage of tissue area occupied by ADM, PanINs or PDAC in the same mice. *P<0.05, t test. ADM, acinar to ductal metaplasias; ns, not significant; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasia; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    衰老细胞的消除阻断PanIN的发展，减少PDAC的发生率。(A) PanIN和PDAC形成期青绿素和ABT-737反复处理的时间线。ABT-737每个月给药2天，连续4个月，小鼠要么在最后一次治疗后被处死(点1)，要么继续维持3.5个月(点2)。(B)时间点1的胰腺切片的代表性图像，CK19、SA-βGal和CD45染色，标记造血细胞。(C) ABT-737 (n=6)或对照剂(n=3)治疗小鼠中含有ADM和PanIN病变的组织面积百分比。数值为每组平均值±SE。(D)胰腺细胞因子和趋化因子的水平Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D经ABT-737治疗的小鼠，通过细胞因子阵列测定。数值显示的是相对于载药处理小鼠的水平(每组3只小鼠)。(E)经ABT-737或载药处理的小鼠在2时间点牺牲后显示PDAC形成的百分比。图像显示每组小鼠的代表性全胰腺。箭头表示较大的PDAC病变。* P < 0.05,χ2ABT-737与车辆处理组之间的试验。(F)与(E)相同小鼠的胰腺与体重比。数值表示小鼠的平均值±SE, n个数如(E)所示。(G)从时间点二染色的胰腺切片的代表性图像。(H)同一小鼠中ADM、PanINs或PDAC所占组织面积的百分比。*P<0.05, t检验。ADM，腺泡到导管化生;Ns，不显著;PanIN:胰腺上皮内瘤变;PDAC，胰导管腺癌。

    我们接下来测试了在肿瘤发生的早期阶段，ABT-737靶向衰老细胞是否影响PanINs进展为癌的能力。我们对待Pdx1-Cre+/-；LSL-Kras+ / G12D在接触青光蓝素后，对小鼠进行ABT-737注射，每月注射4个月，然后继续保持未治疗的小鼠3.5个月(图6在这个时间点，71%的药物治疗小鼠发展为PDAC，显示出较大的实体肿瘤和增大的胰腺尺寸;相比之下，接受abt -737治疗的小鼠中只有25%患癌(图6 eg而且在线补充图8)．组织学分析显示，PDAC在治疗小鼠的胰腺面积显著减少(图6 h)．总之，这些发现表明，衰老细胞为PanINs向癌的发展和进展提供了必要的支持，至少部分通过其Cox2的表达，这些细胞可以通过bcl2家族抑制有效地消除，导致肿瘤发生的减少。

    讨论

    由于诊断处于晚期，治疗选择有限，PDAC的死亡率仍然极高。18 19这种可怕的状况要求对疾病的发展过程进行进一步详细的剖析，以便能够确定新的治疗窗口和预防疾病的方法。在这里，我们提供的研究结果表明，senolytic治疗可能代表一种新的PDAC预防治疗过程。

    我们发现PanINs内细胞亚群之间的协同作用，其中衰老的非分裂细胞刺激病变的生长和进展，至少部分由促炎Cox2酶介导。阻断这种活性，或消除衰老细胞，显著减少PanINs的生长，表明这种相互作用在肿瘤发生的早期阶段是必不可少的。这些发现揭示了衰老细胞在胰腺癌发展中的双重作用:虽然进入衰老的PanIN细胞可能无法转化为分裂的肿瘤细胞，但它们在微环境中的保留为非衰老的癌前细胞提供了必要的支持。然而，随着患者病变发展为恶性肿瘤，肿瘤细胞可能变得独立于这种必要的支持，衰老诱导因子p53和p16的失活突变提供了增殖优势。

    我们在这里表明，使用Bcl2家族抑制剂ABT-737治疗，ABT-737是迄今为止发现的最有效的溶血药物之一，3 14 15可以靶向PanINs内表达cox - 2的衰老细胞，并且定期治疗可以显著减少PanIN的形成和进展。这是特别引人注目的，鉴于治疗的间歇性质，而不是连续治疗:每月2天的治疗足以达到强大的抗肿瘤作用。

    炎症信号通路在胰腺癌中的重要性已在多项研究中得到描述，慢性胰腺炎是该疾病的主要危险因素。20 21NFκB通路在ras驱动疾病的促炎激活中起重要作用。24 40Cox2，它的直接靶标，41似乎是胰腺原菌源性炎症的关键成分，其过表达足以诱导小鼠形成恶性病变前病变。23 24 32我们在这里表明，Cox2的原基因贡献是由一组癌前细胞提供的，即非分裂的衰老细胞，而不是增殖的肿瘤细胞，这表明在肿瘤发生的早期阶段存在“分工”。Cox2被描述为SASP的一个组成部分，5在这个早期阶段，它代表了衰老对疾病的贡献。与之前的研究一致，26然而，我们发现衰老标志物在单个细胞水平上并没有完全重叠，表达分布略有不同Cdkn2a而且Ptgs2在scRNA-Seq分析中观察到，表明Cox2+细胞是病变内几种类型的非分裂细胞状态中的一个子集。33

    的Ptf1a-CreER在该模型中，致癌Kras在腺泡细胞中被激活，在没有外部炎症诱导的情况下提供了PanIN的快速形成。在这个模型中，我们发现通过非甾体抗炎药苏林酸对Cox2的药物抑制显著抑制PanIN的生长，这表明Cox2+细胞提供主要的原源性炎症驱动，对疾病的发展至关重要。的Pdx1-Cre驱动模型需要外部诱导炎症，用青绿素急性治疗2天，以及时和同步形成PanIN。这些病变中含有的衰老细胞数量与心脏组织中相似Ptf1a-CreER老鼠。虽然我们没有在这个模型中测试后续舒林酸治疗的效果，但值得注意的是，senolytic治疗与舒林酸治疗有类似的效果，并减少了炎症细胞因子的分泌，这表明即使在促进肿瘤的急性胰腺炎事件之后，衰老细胞持续产生炎症信号对病变生长是必不可少的。先前的研究表明，当表达kras的小鼠暴露于慢性青青色素诱导的胰腺炎中超过3个月时，衰老细胞不会出现病变，病变进展更快。23因此，在慢性炎症存在的情况下，衰老细胞可能没有提供额外的炎症效益，但限制了病变的生长，因此被淘汰了。有趣的是，这项工作还发现，在胰腺炎停止后，衰老细胞在病变中重新出现，23与我们的发现一致。

    衰老和SASP对病变发展的整体贡献可能通过直接刺激邻近细胞，或间接通过改变肿瘤微环境发生。虽然我们没有检测到Cox2邻近细胞增殖率的增加+细胞(数据未显示)，不能排除直接刺激。衰老间质细胞的存在也可能代表着衰老细胞与微环境相互作用的一种形式，并对肿瘤形成的潜在贡献，这些区域需要进一步解剖。由于全身给药，我们不能排除它们对其他细胞类型的潜在影响，包括衰老间质细胞。然而，我们的组织切片染色显示，ABT-737治疗后发生凋亡的原代细胞是衰老的PanIN细胞。

    总之，进一步的研究应该提供更详细的分析，通过Cox2、SASP或其他手段，发挥原生源效应的衰老细胞亚型的身份和特征，以及它们的作用机制。未来的工作应该解决senolytic治疗对其他细胞类型的潜在影响，如衰老的cox - 2阴性细胞和肿瘤微环境中的细胞。

    Senolytic治疗目前正进入几种与年龄有关的疾病的临床试验阶段。3.溶智药物治疗癌症的潜力目前正开始被探索。在各种癌症环境中使用senolytics需要对肿瘤细胞和基质成分之间发生衰老的环境以及衰老细胞所起的作用有详细的了解，而这是目前所缺乏的知识。我们最近发现，senolytic治疗可改善衰老诱导的表皮增生和不典型增生，使人联想到光化性角化病。13目前的研究表明，在PDAC发展的高风险患者群体中，或在因其他条件(如胰腺炎)而怀疑早期疾病的患者群体中，定期方案下的senolytic治疗可被视为预防性治疗。PanIN病变在健康老年人群中的高患病率，在遗传性胰腺炎患者中的发病率增加，-表明特定人群可以从旨在减少PanINs生长和进展潜力的治疗中受益，这一概念可能扩展到其他恶性前疾病。

    方法

    老鼠

    以下小鼠系从杰克逊实验室获得，在整个研究过程中保持在特定的无病原体环境中，并按指示进行交叉:Ptf1a-CreER(C57Bl6),Pdx1-Cre（C57Bl6), LSL-Kras+ / G12D(混合C57Bl6, 129sv)，LSL-tdTomato(菌株Ai14, C57Bl6)。在腺泡细胞中诱导Kras激活，Ptf1a-CreER;LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato三组转基因小鼠和对照组在6周龄时皮下注射两剂量400 mg/Kg的他莫西芬(Sigma)来激活cre介导的重组。评估重组LSL-Kras+ / G12D用半定量PCR法对分离的tdTomato基因组DNA进行等位基因分析+用ImageJ软件对凝胶进行图像分析，计算重组与非重组产物分数。为了获得BrdU标记，小鼠在牺牲前2小时腹腔注射100 mg/Kg BrdU。对于Kras激活后的Cox2抑制，Ptf1a-CreER;LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato从Kras激活后15周开始，小鼠接受0.6 mg/mL溶解在饮用水中的苏林酸(Sigma S4429)，并添加5 mg/mL蔗糖来补偿苦味。对于胰腺炎的诱发，Pdx1-Cre;LSL-Kras+ / G12D小鼠和对照组接受每天7小时的腹腔注射青绿素，持续2天，中间间隔1天。青绿素(Sigma, C9026)在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中稀释，以50µg/Kg体重注射。为了消除衰老细胞，Pdx1-Cre;LSL-Kras+ / G12D从治疗后2-3周开始，连续2天腹腔注射ABT-737 (25 mg/Kg)。在需要的地方，每隔1个月重复注射一次。ABT-737(药明康德)在DMSO中溶解，在30%丙二醇、5%吐温80、3.3%葡萄糖的工作溶液中制备，pH值为4-5。实验中使用了雄性和雌性小鼠。进行基因组DNA测序Trp53与参考基因组进行BLAST比对，未发现p53基因突变。

    组织学，免疫组化和细胞因子阵列

    胰切片或用福尔马林固定，石蜡包埋，或在OCT溶液中冷冻切片。5-7µm石蜡切片用标准程序染色，使用的试剂为ImmPress试剂试剂盒(Vector #MP-7401/7402)和DAB过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories)，或结合荧光二抗体(Jackson)。使用了以下抗体:Ki67 (NeoMarkers RM9106S0)， E-cadherin (BD Pharmingen 610182)， tdTomato (anti dsRed, Clontech 632496)， BrdU (BioRad MCA2060)， Cox2 (Abcam ab179800)， p16 (Santa Cruz sc-1207)， Bclw(细胞信号31H4)， Bclxl(细胞信号54H6)， Bcl2 (Abcam, ab182858)，细胞角蛋白19 (DSHB TROMA III)， CC3(细胞信号9661)，CD45.2 (Biolegend 109802)， p53 (Santa Cruz Fl393)， Vimentin (Abcam ab24525)， F4/80 (Biolegend 123109)和Dclk1 (Abcam ab31704)。SA-βgal染色10µm冷冻组织切片用0.5%戊二醛在PBS中固定15 min，用添加1mm MgCl的PBS冲洗2在X-Gal染色液(1mg /mL X-Gal, 5mm亚铁氰化钾，5mm亚铁氰化钾和1mm MgCl)中孵育12-16小时2在pH值5.5的PBS中)。切片用核快红(Sigma)反染色，脱水，用二甲苯基安装液(Eukitt)安装。采用阿利新蓝溶液(Bio-Optica 04-1 60 802)粘多糖染色法检测PanIN，室温30 min，苏木精反染。图像采集在Olympus DP71显微镜、Olympus CX41共聚焦显微镜或蔡司LSM710共聚焦显微镜上。使用斐济1.51 j的Cookbook扩展中的细胞计数器插件，将染色蛋白阳性的细胞作为PanIN细胞或显微镜视野中每只小鼠3-6视野中的细胞总数的百分比进行评分。阿利新蓝阳性面积和Bclxl染色的计算是通过使用ImageJ 1.51 k测量超过定义阈值的染色场面积来完成的。在细胞大小分析中，Cox2和E-cadherin共染色以标记细胞边缘，并使用ImageJ跟踪细胞周长。在苏木精和伊红染色切片上评估ADM、PanIN和PDAC的形成，由病理学专家对对照剂和abt -737处理小鼠的整个组织切片进行手动评分。为了测量细胞因子表达水平，从ABT-737和载体处理的小鼠的胰腺中提取的裂解液，每组3个，根据制造商的说明使用ARY006小鼠细胞因子阵列试剂盒(R&D Systems)进行测试。

    流式细胞仪分析

    小鼠胰腺分离成单细胞悬液时，用剪刀将胰腺切碎，胰蛋白酶- edta在37°C孵育10分钟，然后用胶原酶P (Sigma, 11213857001) 1mg /mL在37°C孵育20-30分钟，然后用70 μm和40 μm滤网过滤。纯化的细胞与荧光β-半乳糖苷酶底物C孵育1233 μ M的FDG (Invitrogen D-2893)在37°C下孵育1小时，然后根据C12FDG和tdTomato或Epcam荧光，使用Aria III分选器(BD Biosciences)，对CD31进行门控- - - - - -和CD45- - - - - -细胞排除内皮细胞和免疫细胞。成像流式细胞术如前所述，42用ImageStreamX流式细胞仪(Amnis)成像。用于FACS的抗体:Cd45 (eBiosciences 25-0451-82)， Cd31 (eBiosciences 17-0311-80)， Epcam (Biolegend 118212)， Cd140a (Biolegend 135919)， Pdpn (Biolegend 127423)， F4/80 (Biolegend 123117)和CK19 (DSHB TROMA III)。

    RNA提取和RNA序列

    对于mRNA-seq，我们分离出tdTomato+SA -β加- - - - - -和tdTomato+SA -β加高分离自三只小鼠的部分，门控排除内皮细胞和免疫细胞(CD31- - - - - -、CD45- - - - - -)．采用TRIzol (Invitrogen)萃取法和RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen)萃取法从facs分选的细胞中分离总RNA，每个样本使用> 10000个细胞。采用改良的CEL-Seq2协议进行谱分析:合成3 ' cDNA并进行条形码，然后进行RNA合成，用在体外对端测序的转录和文库生成。使用Cutadapt对适配器和poly-A尾巴的Reads进行解复用、质量过滤和修剪，并使用Tophat2将其与小鼠基因组(GRCm38)对齐。差异表达基因由DESeq2确定，使用PAdj <0.1截止。利用PAdj <0.1的匠心路径分析(Qiagen)对上调和下调的基因集进行富集，并通过GSEA对来自分子特征数据库标记集的基因集和表达hras的衰老人IMR90成纤维细胞上调基因的基因集进行检测9和衰老的小鼠星状细胞。8在tdTomato上也进行了同样的分析+从表达kras的小鼠中分离出来的细胞，用舒林酸治疗3天或不治疗。单细胞RNA-Seq数据采集和分析在Schlesinger中进行了描述等，33并在分离的胰腺上进行Ptf1a-CreER;LSL-Kras+ / G12D；LSL-tdTomato在Kras激活后的指示时间点，以及对照组Ptf1a-CreER;LSL-tdTomato老鼠。所示数据仅包括上皮细胞簇。我们使用Seurat R包(V.2.3.4)执行基于图的无监督聚类、统一流形逼近，用于数据分析和二维空间可视化。

    统计分析

    双尾未配对-小鼠组比较采用检验和方差分析。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。mRNA-seq表达谱存入基因表达综合(GEO)数据库，登录号为GSE128319 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE128319)．scRNA-Seq数据可在GSE141017 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE141017)．没有准入或使用条件。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    所有实验都得到了希伯来大学和哈大沙医疗中心动物护理和使用联合机构委员会以及魏茨曼研究所动物护理和使用机构委员会的批准。

    致谢

    我们感谢Yelena Piontek和Norma E. kidiss - bassir的组织学准备，Malka Chaouat和Zippora Shlomai的实验建议，Yuval Nevo的生物信息学协助，以及Yael Gabai的图像分析。

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

    脚注

    • DK-G、LR和YO贡献相当。

    • 贡献者DK-G、LR、YO、YD、GZ、IB-P、VK设计研究并撰写稿件，DK-G、LR、YO进行实验，NA、BA、SH、RK、YK、AH-G、AI、YD辅助实验分析，EW、HB、SE进行生物信息学分析，AASK、KM、KA、EP进行病理分析，YS、OP进行scRNA-seq研究分析。

    • 资金本研究得到了Barbara R. Newman(纪念Daniel Newman (GZ)、Brenda B. Johnston(纪念Theodore A. Johnston (GZ))、以色列科学基金会(1009/13,IB-P)、以色列科学基金会Morasha项目(1245/16,IB-P.)、以色列科学基金会- broad研究所项目(2621/18,IB-P.)、以色列卫生部首席科学家(3-15017,IB-P)、Alex U. Soyka项目(IB-P和YD)、以色列癌症研究基金(ICRF)项目资助(GZ)、以色列科学基金会-加拿大项目(2633/17,VK)、Sagol长寿研究所、QuinQuin基金会、Rising Tide基金会和Thompson家族基金会(VK)以及欧盟FP7和H2020(309688和856487,VK)下的欧洲研究理事会。

    • 相互竞争的利益VK是senolytics和senolytic方法的专利作者和senaur Bio的顾问。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。