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肝脏病学
原始研究
自发性细菌性腹膜炎的新病理机制:细胞和细菌蛋白酶破坏细胞连接
  1. 玛丽hader1，
  2. 菲利普Neubert1，
  3. 伊娃rin1，
  4. 安妮卡Scholtis1，
  5. 露塞尔Broncy1，
  6. 海蒂Gschwendtner1，
  7. 阿恩Kandulski1，
  8. 弗拉德帕维尔1，
  9. 亚历山大Mehrl1，
  10. Christoph Brochhausen2，
  11. 苏菲Schlosser1，
  12. 卡斯滕Gulow1，
  13. 克劳迪娅Kunst1，
  14. 玛蒂娜·穆勒1
  1. 1内科I科、消化内科、肝病科、内分泌科、风湿病科和传染病科，雷根斯堡大学医院，雷根斯堡，巴伐利亚、德国
  2. 2病理科，雷根斯堡大学医院，雷根斯堡，巴伐利亚、德国
  1. 对应到Martina博士教授Müller，雷根斯堡大学医院内科一科，德国雷根斯堡93053;martina.mueller-schilling在{}ukr.de

摘要

客观的自发性细菌性腹膜炎(SBP)是肝硬化的一种危及生命的并发症，1年死亡率为66%。从肠道到肠系膜淋巴结的细菌易位(BT)对收缩压的发病机制至关重要。

设计由于BT预先假定肠上皮渗漏，因此在肝硬化患者和对照组的结肠活检中检查了粘液和上皮细胞连接(e -钙粘蛋白和occludin)的完整性。SBP-inducing大肠杆菌（大肠 杆菌),变形杆菌（p . 君子兰)是从肝硬化患者腹水中分离出来的，并与Caco-2细胞共同培养，以表征细菌对细胞的作用。

结果SBP-derived大肠 杆菌而且p . 君子兰以剂量依赖和时间依赖的方式导致细胞间连接的显著减少。这种效果通过活细菌与上皮细胞的直接相互作用而增强。occludin的降解是通过蛋白酶体增加的泛素化介导的。值得注意的是，一种新的细菌蛋白酶活性对e -钙粘蛋白的裂解至关重要。

结论肝硬化患者的结肠粘液厚度减少，这使得细菌与上皮细胞接触。肠道细菌利用上皮细胞的蛋白酶体诱导闭塞蛋白的降解。我们发现了患者来源的sbp诱导细菌的一种新的细菌蛋白酶活性，它负责e -钙粘蛋白结构的切割。这种蛋白酶活性的抑制导致细胞连接的稳定。因此，通过阻断泛素-蛋白酶体系统和/或细菌蛋白酶活性来靶向这些机制可能会干扰BT，并构成一种新的创新治疗策略，以预防肝硬化患者的收瘫。

  • 腹膜炎
  • 细菌易位
  • 肝硬化
  • 大肠杆菌

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-321663

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    研究意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 自发性细菌性腹膜炎(SBP)是肝硬化的一种危及生命的并发症，1年死亡率高达66%。

    • 迫切需要新的收缩压治疗方案;药物治疗仅限于高复发率和增加抗生素耐药性的抗生素。

    • 肠上皮屏障功能受损引起的细菌易位(BT)是SBP发病机制的关键。

    新的发现是什么?

    • 肝硬化患者结肠粘液和细胞连接蛋白作为sbp诱导细菌的进入位点发生改变。

    • 大肠杆菌（大肠 杆菌),变形杆菌（p . 君子兰)从SBP患者腹水中分离出来的蛋白触发闭塞蛋白降解和e -钙粘蛋白的裂解，这是两种重要的细胞连接成分。

    • 细菌诱导的occludin减少是通过内源性蛋白酶体降解介导的。

    • 值得注意的是，我们发现了一种新的细菌蛋白酶活性大肠 杆菌而且p .奇异君子兰，它负责E-cadherin的切割，因此构成了一个可药物治疗的靶点。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这些发现有助于更好地理解SBP的分子病理机制，并能够鉴定新的药物靶点以保护粘膜上皮屏障功能和预防BT。

    • 抑制泛素-蛋白酶体系统是一种通过稳定occludin来保持细胞-细胞接触的治疗选择。

    • 抑制新发现的细菌蛋白酶活性代表了一种针对特定致病性的直接治疗方法大肠杆菌而且p . 君子兰通过阻止e -钙粘蛋白裂解来抑制BT。

    简介

    自发性细菌性腹膜炎(SBP)是肝硬化最有害的并发症之一，定义为无腹腔内炎症源的腹水细菌感染。由于一年死亡率高达66%，收缩压仍然是医疗保健领域的一个严重挑战。1 2目前，收缩压是通过>250多形核粒细胞/µL腹水来诊断的。尽管使用头孢菌素或哌拉西林-他唑巴坦进行抗生素治疗，3 470%的病例会再次发生收缩压，并恶化生存机会。1 5 6因此，迫切需要新的SBP治疗方案。我们知道细菌易位(BT)与大肠杆菌（大肠 杆菌)，肺炎克雷伯菌链球菌是最常见的微生物，从肠道到肠系膜淋巴结对SBP的发展至关重要。7号到9号BT是由肠道免疫系统受到抑制，小肠细菌过度生长和微生物多样性减少所驱动的。8 10 - 14此外，增加肠上皮屏障的通透性也是非常重要的。因此，细胞间连接在BT的发展中起着重要的作用。15 - 17日

    为了改善SBP的诊断和开发新的治疗方案，需要进一步研究BT的分子机制，以确定药物靶点。我们研究了肝硬化和收缩压患者结肠活检中黏液和细胞间连接蛋白表达的变化。此外，我们建立了体外模型，研究了患者源性sbp诱导的作用大肠 杆菌而且变形杆菌（p . 君子兰)在肠上皮细胞紧密和粘附的连接上。我们发现了细菌蛋白酶在肠上皮不稳定中的新作用，为理解SBP发病机制增加了一个新发现，并强调了肠-肝轴的重要性。与临床相关的是，通过基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂抑制这种新发现的细菌蛋白酶活性作为概念证明代表了一种针对特异性致病性的新治疗方案大肠 杆菌而且p . 君子兰通过阻止e -钙粘蛋白裂解来抑制BT。

    材料与方法

    病人

    左半结肠活检来自接受结肠镜检查的患者(伦理投票16-101-0382，雷根斯堡大学，德国)。所有患者均获得书面知情同意。在使用咪达唑仑和/或异丙酚的清醒镇静下，使用标准高清内窥镜(Olympus CF HQ 190L)进行结肠镜检查。肝硬化的诊断由临床、实验室或影像学检查确定。排除标准为怀孕、胃肠道疾病、炎症、HIV和丙型肝炎病毒感染。给出了病人的特征在线补充表1-5．

    细胞培养和细菌

    人类Caco-2细胞(DSMZ, Braunschweig, Germany)使用添加10%胎牛血清(Bio&Sell, Nürnberg, Germany)的最低必需培养基(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)培养，不添加抗生素。为了培养HCT-116细胞(DSMZ, Braunschweig, Germany)， McCoy 's 5A改良培养基(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)中添加了10%不含抗生素的胎牛血清。十个不同的大肠 杆菌从SBP患者的腹水中分离出菌株，并由Robert Koch研究所(柏林，德国)进行血清分型。用于分析开发、验证和验证，大肠 杆菌使用ATCC25922 (O6:Hnt) (ATCC, Manassas, Virginia, USA)。此外，ap . 君子兰菌株是从SBP患者的腹水中提取的(有关抗生素谱，请参阅在线补充表6)．细菌在37°C的Luria-Bertani肉汤中搅拌培养。用感染倍数(MOI) 0-10、细菌过夜培养(SN)上清液或热灭活(HI)细菌(65°C, 5 min)共培养实验。有关transwell实验，请参阅补充材料和方法部分。

    occludin和E-cadherin的免疫沉淀及泛素化检测

    将细胞裂解液与抗occludin和抗e -cadherin抗体与蛋白A琼脂糖偶联孵育，并通过Western blot分析其泛素化。欲了解更多细节，请参阅补充材料和方法部分。

    冰冻的结肠活检切片

    结肠活检组织转入汉克斯的平衡盐溶液(Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德国)，嵌入Tissue-Tek (Sakura Finetek Europe, Alphen aan den Rijn，荷兰)，并在液氮中快速冷冻。使用cryomicrotome (Leica CM3050 S Cryostat, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)将组织块切割成8µm切片。

    粘液染色

    冷冻结肠活检切片风干30分钟。将载玻片用4%甲醛固定30分钟，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并根据制造商的方案(阿利新蓝染色试剂盒，Abcam，柏林，德国)用阿利新蓝染色。

    免疫荧光和显微技术

    为了分析occludin和E-cadherin的表达，细胞和结肠活检用甲醛固定，皂素渗透。随后，用小鼠抗occludin-594(用于结肠活检)、小鼠抗occludin-488(用于Caco-2细胞)或抗大鼠E-cadherin-594(用于结肠活检和Caco-2细胞)抗体对occludin和E-cadherin进行染色。欲了解更多细节，请参阅补充材料和方法部分。

    蛋白酶活性测定

    使用荧光标记MMP底物和凝胶明胶法检测细胞和细菌蛋白酶活性。18

    广谱MMP抑制剂BB-9419用于阻断人蛋白酶(MMP抑制剂分析试剂盒;BML-AK016, Enzo生命科学，Lörrach，德国)。不同纯化的人基质金属蛋白酶用10µM BB-94在37°C下预孵育1小时。加入底物后，使用Tecan微板阅读器Infinite pro 200(消光/发射光谱:328/393)记录240 s后的荧光信号。此外，Caco-2细胞和(HI) sbp源性细菌(e . 杆菌p 君子兰)根据制造商的方案(PF0100, Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德国)，使用蛋白酶荧光检测试剂盒在使用或不使用BB-94抑制剂的情况下进行分析。

    统计分析

    结果用平均值±SD表示。数据分析采用Welch 's t检验或Mann-Whitney秩和检验。采用Shapiro-Wilk检验和Brown-Forsythe检验进行正态分布和方差齐性检验。采用Sigma Plot V.14.0软件(Systat, Erkrath, Germany)进行图形和统计分析。

    补充材料和方法

    扩展在线补充信息有关资料和方法可在期刊网站上查阅。包括用于定量PCR (qPCR)的引物序列(在线补充表7)．

    结果

    肝硬化与结肠黏液层的改变和细胞连接的不稳定有关

    在14例肝硬化患者和19例非肝硬化患者的结肠活检中，我们将黏液的厚度和紧密程度以及黏附连接蛋白定性为上皮屏障的基本成分。两组在年龄和性别方面都是匹配的。患者的特征，即Child-Pugh评分，药物和共病，总结在在线补充表1-5．

    有趣的是，肝硬化患者作为第一道防线的结肠黏液的厚度显著减少(图1一个, p = 0.036)。讨论了质子泵抑制剂(PPIs)诱导生态失调、小肠细菌过度生长和收缩压。20为了排除PPI对粘液厚度的影响，我们将患者队列分为PPI未治疗组和PPI治疗组。PPI治疗对粘液厚度没有影响，无论是对照组还是肝硬化患者(图1 b)．粘液厚度的减少可能导致细菌和上皮细胞的直接/更紧密的接触，因此细菌导致上皮细胞完整性的不稳定。

    Reduced thickness of colonic mucus in patients with liver cirrhosis and destabilisation of cell junctions in patients with spontaneous bacterial peritonitis (SBP). (A, left panel) Analysis of colonic mucus via alcian blue staining in biopsies of patients with liver cirrhosis (n=14) and healthy controls (n=19). Images are displayed at 20xmagnification. (A, right panel) Quantification of mucus thickness. One dot represents one patient. A significant reduction of mucus thickness was observed in patients with liver cirrhosis (p=0.036, Mann-Whitney rank-sum test). (B) Impact of proton pump inhibitor (PPI) therapy on mucus thickness in controls with (n=9, online supplemental table 3) or without PPI (n=10, online supplemental table 2) and patients with liver cirrhosis with (n=7, online supplemental table 5) or without PPI treatment (n=7, online supplemental table 4). One dot represents one patient. Treatment with PPIs did not affect colonic mucus layer thickness. (C) Immunohistochemistry of occludin and E-cadherin in colonic biopsies. One control, one Child-Pugh class A patient, one Child-Pugh class B patient with SBP and four Child-Pugh class C patients with or without SBP are shown (compare online supplemental tables 3–5, blue). The patient cohort was composed as follows: upper panel (from left to right): control patient 19, patients with liver cirrhosis 10, 6; lower panel (from left to right): patients with liver cirrhosis 5, 12, 14, 13 (compare online supplemental tables 3–5, blue). From the ascites of Child-Pugh C patient 5 and 14, Escherichia coli were isolated as the SBP-inducing bacteria (compare online supplemental tables 4–6). Arrows point to specific morphological changes regarding occludin and E-cadherin. All images are presented at 20x magnification. (D) Quantification of fluorescence intensity of occludin and E-cadherin in colonic biopsies of patients with SBP. Fluorescence intensity of patients with SBP was normalised to median fluorescence intensity of controls. Controls are shown as baseline. Cell junction proteins occludin (p=0.003) and E-cadherin (p=0.009) were significantly reduced (mean±SD, Welch’s t-test). (E) Schematic illustration of the epithelial barrier in controls and patients with SBP. Reduction of mucus thickness in patients with liver cirrhosis may facilitate bacteria-to-cell interaction. In SBP the essential cell junction proteins occludin and E-cadherin are downregulated. Thus, the mucoepithelial barrier is impaired (red arrow). Occludin is depicted in green and E-cadherin in purple.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    肝硬化患者结肠粘液厚度减少，自发性细菌性腹膜炎(SBP)患者细胞连接不稳定。(A，左图)肝硬化患者(n=14)和健康对照组(n=19)活检中阿利新蓝染色结肠粘液的分析。图像以20倍放大显示。(A，右图)粘液厚度的定量。一个点代表一个病人。肝硬化患者粘液厚度显著减少(p=0.036, Mann-Whitney秩和检验)。(B)质子泵抑制剂(PPI)治疗对对照组黏液厚度的影响(n=9，在线补充表3)或不含PPI (n=10，在线补充表2)和肝硬化患者(n=7，在线补充表5)或不进行PPI治疗(n=7，在线补充表4)．一个点代表一个病人。PPIs治疗不影响结肠黏液层厚度。(C)结肠活检中occludin和E-cadherin的免疫组化。对照1例，1例Child-Pugh A类患者，1例Child-Pugh B类患者伴收缩压，4例Child-Pugh C类患者伴或不伴收缩压在线补充表3-5,蓝色)。患者队列组成如下:上组(从左至右):对照组19例，肝硬化患者10例，肝硬化患者6例;下面板(从左至右):肝硬化患者5、12、14、13(比较在线补充表3-5,蓝色)。从Child-Pugh C患者5号和14号腹水中，大肠杆菌被分离出来作为sbp诱导细菌(比较在线补充表4-6)．箭头指向咬合蛋白和e -钙粘蛋白的特定形态变化。所有图片均以20倍放大显示。(D) SBP患者结肠活检中occludin和E-cadherin荧光强度的定量。收缩压患者的荧光强度归一化至对照组的中位荧光强度。控件显示为基线。细胞连接蛋白occludin (p=0.003)和E-cadherin (p=0.009)显著降低(均值±标准差，Welch 's t检验)。(E)对照组和收缩压患者上皮屏障示意图。肝硬化患者粘液厚度的减少可能促进细菌与细胞的相互作用。在收缩压中，重要的细胞连接蛋白occludin和E-cadherin下调。 Thus, the mucoepithelial barrier is impaired (red arrow). Occludin is depicted in green and E-cadherin in purple.

    将上皮屏障作为第二道防线，与对照组相比，SBP患者表现出occludin环的破坏和E-cadherin结构的损失(图1 c)．此外，我们观察到occludin (p=0.003)和E-cadherin (p=0.009)蛋白水平显著降低(图1 d)．因此，这些数据为SBP患者结肠上皮屏障不稳定提供了证据(图1 e)．

    大肠 杆菌菌株通过减少occludin和E-cadherin破坏上皮连接屏障

    为了分析细菌与细胞相互作用的分子机制，建立了体外模型。因此，我们测试了不同的结肠细胞系，例如Caco-2和HCT-116。Caco-2细胞显示单层增殖，细胞极化和细胞间连接的形成。相比之下，HCT-116细胞在没有极化的多层膜中生长(图2一个)．因此，Caco-2细胞已被建立为肠粘膜的优化体外模型24代表了在标准条件下分析细菌与细胞相互作用的理想工具。培养第6天时，Caco-2细胞经分化标记物碱性磷酸酶(ALPI)表达进行分化。E-cadherin和occludin蛋白水平分别稳定至第6天和第8天，随孵育时间的延长略有下降(图2 b)．6天后Caco-2细胞100%融合。在较长的孵育时间内，形成细胞多层，同时诱导细胞死亡(图2 c而且在线补充图1)．综上所述，Caco-2细胞模型在第6天提供了以下方面的最佳体外条件:(1)极化，(2)细胞间连接的形成，(3)分化和(4)细胞活力。

    Establishment of an in vitro model of the intestinal mucosa to study bacteria-to-cell interactions. (A) Electron microscopy analysis of polarised Caco-2 and unpolarised HCT-116 cells precultured for 6 days. Microvilli and cell-to-cell contacts in Caco-2 cells are indicated by arrows. (B) Western blot analyses of differentiation marker ALPI, E-cadherin and occludin. Caco-2 cells were cultured for 1–14 days. One exemplary blot with densitometric analysis out of three replicates is shown. (C) Caco-2 cells were cultured for 6, 8 and 14 days and labelled with 1 µg/mL DAPI. Quantification of DAPI-positive/dead Caco-2 cells is depicted (n=3, mean+SD, Welch’s t-test). (D) Electron microscopy imaging of Caco-2 cells with or without Escherichia coli O6:Hnt (multiplicity of infection (MOI) 5, 4 hours). Co-culture with E. coli O6:Hnt did not affect essential cellular structures, for example, brush borders and mitochondria (indicated by arrows). (E) Caco-2 cells were cultivated up to 8 days and cell junction regulation was examined by Western blot in the presence and absence of E. coli O6:Hnt for 4 hours. Densitometric analysis is given below each exemplary blot. (F) E. coli O6:Hnt-stimulated Caco-2 cells were stained with crystal violet and cell death was quantified (n=3, mean±SD). (G) Cell cycle analysis on E. coli O6:Hnt stimulation was performed by flow cytometry (n=3, mean±SD, Welch’s t-test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    建立肠粘膜体外模型，研究细菌与细胞的相互作用。(A)预培养6天的极化Caco-2和未极化HCT-116细胞的电子显微镜分析。箭头表示Caco-2细胞中的微绒毛和细胞间接触。(B) Western blot分析分化标志物ALPI、E-cadherin和occludin。Caco-2细胞培养1-14天。在三个重复的密度分析中显示了一个典型的印迹。(C) Caco-2细胞培养6、8和14天，用1µg/mL DAPI标记。描述了dapi阳性/死亡Caco-2细胞的定量(n=3，均值+SD, Welch 's t检验)。(D)加或不加Caco-2细胞的电镜成像大肠杆菌O6:Hnt(感染多重性(MOI) 5,4小时)。培养与大肠 杆菌O6:Hnt不影响基本的细胞结构，例如刷状边界和线粒体(箭头所示)。(E) Caco-2细胞培养至8天，在存在和不存在Caco-2的情况下，用Western blot检测细胞连接调节大肠 杆菌O6: 4小时。密度分析在下面的每个示范印迹。(F)大肠 杆菌O6:用结晶紫染色hnt刺激的Caco-2细胞，定量细胞死亡(n=3，均值±SD)。(G)细胞周期分析大肠 杆菌O6:流式细胞术刺激Hnt (n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。

    为了模拟细菌感染，大肠 杆菌ATCC25922 (O6:Hnt)在不同的MOI中使用长达8小时。以Luria-Bertani肉汤为对照(MOI为0)。与之共培养后，相关细胞结构如刷缘、线粒体或其他细胞器均未发生改变大肠 杆菌O6:Hnt和Caco-2细胞(图2 d， MOI 5).值得注意的是，刺激与大肠 杆菌O6:Hnt (MOI 10)下调E-cadherin和occludin达60%。这种效应在细菌处理前预培养6天的Caco-2细胞中最为显著。预培养时间越长，occludin和E-cadherin的下调越不明显，这可能是由于细胞死亡造成的(图2 c, E)．结晶紫染色未见细胞融合减少大肠 杆菌刺激(图2 f，我10)。G1G细胞增加17.7%0G1分数(p=0.043)，而subG .1存在时分数没有增加大肠 杆菌O6: Hnt (图2 g)．

    综上所述，对必需的紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的干扰是sbp相关类细菌的一个关键病理生理特征大肠 杆菌．

    然而，30分钟至2小时的短时间孵育不影响E-cadherin和occludin的蛋白质水平，4-8小时的细菌处理导致细胞间接触蛋白的剂量依赖性降低高达50% (图3模拟)．这些破坏稳定的影响大肠 杆菌O6: MOI 5处的Hnt也被免疫组化证实，occludin显著降低23% (p=0.002)， E-cadherin显著降低46% (p<0.001) (图3 f, G)．有趣的是，mRNA水平没有受到影响(图3 e)．此外，与临床相关的是，当细胞间连接蛋白的蛋白水平受到轻微或没有影响时大肠 杆菌使用SN (图3 c, D)而不是活细菌。

    Escherichia coli induced dose-dependent and time-dependent destabilisation of the intestinal epithelial barrier. Caco-2 cells were cultivated for 6 days. E-cadherin and occludin were analysed by Western blot following (A) a time kinetic or (C) incubation with increasing multiplicities of infection (MOI) of E. coli O6:Hnt. Densitometry of three experiments is given in (B) and (D) (mean±SD, Welch’s t-test). (C, D) In addition to live bacteria, supernatant of bacterial overnight culture (SN) was used for a 4 hour stimulation of Caco-2 cells (mean±SD, Welch’s t-test). (E) Quantitative PCR analysis of Caco-2 cells stimulated with E. coli O6:Hnt at MOI 10 for 4 hours (n=3, mean±SD). (F) Immunohistochemistry and (G) corresponding quantification of cell fluorescence of occludin and E-cadherin following E. coli O6:Hnt stimulation (n=3, mean±SD, Welch’s t-test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    大肠杆菌诱导肠上皮屏障的剂量依赖性和时间依赖性不稳定。Caco-2细胞培养6天。E-cadherin和occludin在(A)一个时间动力学或(C)培养与感染的多重性(MOI)增加后进行Western blot分析大肠 杆菌O6: Hnt。(B)和(D)给出了三个实验的密度(平均值±标准差，韦尔奇t检验)。(C, D)除活菌外，用细菌隔夜培养(SN)上清液刺激Caco-2细胞4小时(均值±SD, Welch’s t检验)。(E)刺激Caco-2细胞的定量PCR分析大肠 杆菌O6:在MOI 10处Hnt 4小时(n=3，平均值±SD)。(F)免疫组化和(G) occludin和E-cadherin随后相应的细胞荧光定量大肠 杆菌O6:Hnt刺激(n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。

    这些数据表明，细菌共培养Caco-2细胞诱导了时间依赖性和剂量依赖性的上皮不稳定和G1．

    Patient-derived致病性大肠 杆菌菌株诱导上皮细胞间连接不稳定

    为了研究细菌诱导的上皮不稳定的临床相关性，10大肠 杆菌分离自收缩压患者腹水(p不耐烦,derivedE．c奥利= PDEC 1 - 10)。十分之五(50%)大肠 杆菌E-cadherin和occludin (在线补充图2)．为了进一步分析，大肠 杆菌O16:H5 (PDEC 1 -轻微影响)和大肠 杆菌Ont:H7 (PDEC 2 - - -主要作用)。处理Caco-2细胞大肠 杆菌O16:H5下调E-cadherin 14%。大肠 杆菌Ont:H7使E-cadherin (p=0.029)和occludin (p=0.007)蛋白水平降低高达73%，同时导致细胞死亡(图4模拟)．重要的是，HI细菌并不影响细胞连接蛋白的水平(图4一)．为了分析细菌膜成分对上皮细胞不稳定的作用，用0.1和1µg/mL处理Caco-2细胞大肠 杆菌脂多糖(LPS) (O55:H5)。在LPS存在的情况下，occludin和E-cadherin的蛋白水平没有变化(图4 e)．因此，在Caco-2细胞表面TLR2和TLR4均未检测到，无论是在未培养细胞上，还是在PMA (phorbol 12-肉豆蔻酸13-乙酸酯)刺激后或大肠 杆菌触发TLR2或TLR4表达的LPS (O55:H5) (在线补充图3)．这些数据强调，需要活细菌来诱导occludin和E-cadherin的减少。

    Patient-derived spontaneous bacterial peritonitis (SBP)-inducing isolates with direct contact to epithelial cells trigger epithelial destabilisation. (A) Caco-2 cells were stimulated with different Escherichia coli at multiplicity of infection (MOI) 10 for 4 hours. In addition to E. coli O6:Hnt, E. coli SBP isolates (O16:H5, Ont:H7, compare online supplemental table 6) from ascites of two patients were used for stimulation. E-cadherin and occludin were analysed on protein level by Western blot with densitometric analysis (B) of three replicates (mean±SD, Welch’s t-test and Mann-Whitney rank-sum test). (C) Caco-2 cells were infected with E. coli Ont:H7 (MOI 10, 4 hours), fixed and stained with crystal violet (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (D) DAPI exclusion analysis of Caco-2 cells stimulated with patient-derived E. coli Ont:H7 (MOI 10, 4 hours) (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (E) Caco-2 cells were stimulated with 0.1 and 1 µg/mL E. coli O55:H5 LPS for 4 hours. E-cadherin and occludin protein levels were analysed by Western blot (n=3). One exemplary blot is shown. (F) Caco-2 cells were grown in 6-well plates and heat-inactivated (HI) E. coli O6:Hnt bacteria were added onto transwell inserts on top of Caco-2 cells (separated). As control, Caco-2 cells were stimulated with E. coli O6:Hnt in the same well (co-culture). Protein levels of E-cadherin and occludin were assayed by Western blot with densitometric analysis (G) of three replicates (mean±SD, Welch’s t-test). (H) Quantitative PCR analysis of MUC2 and MUC5AC 52 expression of Caco-2 cells stimulated with different (patient-derived) E. coli (O6:Hnt, O16:H5 and Ont:H7, MOI 10) for 4 hours (n=3, mean±SD, Welch’s t-test and Mann-Whitney rank-sum test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    患者源性自发性细菌性腹膜炎(SBP)诱导分离物与上皮细胞直接接触引发上皮不稳定。(A) Caco-2细胞被不同的大肠杆菌在感染多重度(MOI)为10的情况下持续4小时。除了大肠 杆菌O6: Hnt,大肠 杆菌SBP分离株(O16:H5, Ont:H7，比较在线补充表6)用于刺激两例患者的腹水。E-cadherin和occludin蛋白水平经Western blot和3个重复的密度分析(B)(均值±标准差，Welch 's t检验和Mann-Whitney秩和检验)分析。(C) Caco-2细胞被感染大肠 杆菌Ont:H7 (MOI 10,4小时)，用结晶紫染色固定(n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。(D)患者来源的Caco-2细胞的DAPI排除分析大肠 杆菌Ont:H7 (MOI 10,4小时)(n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。(E) 0.1和1µg/mL刺激Caco-2细胞大肠 杆菌O55:H5 LPS 4小时。Western blot检测E-cadherin和occlin蛋白水平(n=3)。一个典型的污点显示。(F) Caco-2细胞在6孔板中培养并热灭活(HI)大肠 杆菌O6:将Hnt细菌添加到Caco-2细胞(分离)上方的transwell插入物上。以Caco-2细胞为对照大肠 杆菌O6:同井共培养。用Western blot法测定3个重复的E-cadherin和occludin蛋白水平(均值±标准差，Welch’s t检验)。(H)定量PCR分析MUC2而且MUC5AC52Caco-2细胞表达的不同刺激(患者来源)大肠 杆菌(O6:Hnt, O16:H5和Ont:H7, MOI 10) 4小时(n=3，均值±标准差，Welch 's t检验和Mann-Whitney秩和检验)。

    为了阐明上皮屏障的不稳定是否需要细菌与细胞的直接接触，进行了transwell实验。直接接触大肠杆菌Caco-2细胞、occludin、E-cadherin下调30% ~ 40% (occludin, p=0.039)。在没有直接接触的情况下，occludin水平降低了30%，而E-cadherin水平保持不变。HI细菌对E-cadherin和occludin的蛋白水平均无影响(图4 f, G)．由于肝硬化患者的黏液厚度减少(图1 a, B)，我们假设sbp诱导细菌可能调节粘液的产生。因此，我们测量了粘蛋白的表达MUC2而且MUC5AC细菌处理后Caco-2细胞在结肠和胃中的代表性。尤其是patient-derived大肠 杆菌游客:H7减少MUC2(p = 0.013)MUC5AC(p=0.036)表达式(图4 h)．这些数据表明，上皮屏障的降解需要活细菌和上皮细胞的直接相互作用，细菌会干扰MUC2表达，结肠粘液的基本成分。

    细菌通过增强蛋白酶体降解诱导occludin下调

    由于occludin和E-cadherin的作用是在蛋白质上检测到的，而不是在mRNA水平上，我们假设通过降解来调节。因此，通过免疫沉淀研究occludin和E-cadherin的Lys-48泛素化。裂解Caco-2细胞，沉淀occludin和E-cadherin, Western blot分析。e -钙粘蛋白无泛素化改变(图5一个)．相比之下，沉淀闭塞素在细菌共孵育时显示出33%的泛素化增加(图5 b)．因此，occludin在与细菌共培养时被标记为蛋白酶体降解。为了验证蛋白酶体的降解，在刺激前4小时给药蛋白酶体抑制剂clasto-lactacystin β-内酯(LA)(2.5和5µM)大肠 杆菌O6: Hnt。蛋白酶体抑制不能阻止e -钙粘蛋白的减少。值得注意的是，在LA(5µM)的存在下，occludin降解降低了80% (图5 c, D)．这一结果与Lys-48泛素化一致，证实occludin受到大肠 杆菌-诱导的蛋白酶体降解。

    Occludin reduction via enhanced proteasomal degradation. (A) Immunoprecipitation to analyse ubiquitination of E-cadherin and occludin. Cell lysates were incubated with bead-coupled antibodies (IP). As control, pellets of preclearing (clear) and 20 µg cell lysates (input) were loaded. (B) Densitometry of ubiquitin normalised to precipitated occludin (n=3, mean±SD). (C) Co-cultivation of Caco-2 cells with proteasome inhibitor clasto-lactacystin β-lactone (2.5 and 5 µM) for 4 hours followed by stimulation with Escherichia coli O6:Hnt at multiplicity of infection (MOI) 5 for additional 4 hours. Protein regulation of E-cadherin and occludin was analysed by Western blot. (D) Occludin densitometric analysis of three replicates (mean±SD, Welch’s t-test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    通过增强的蛋白酶体降解降低Occludin。(A)免疫沉淀分析E-cadherin和occludin的泛素化。细胞裂解液与珠联抗体(IP)孵育。作为对照，装载预处理(清)球和20µg细胞裂解物(输入)。(B)泛素归一化至沉淀闭塞素密度(n=3，均值±SD)。(C) Caco-2细胞与蛋白酶体抑制剂clasto-lactacystin β-内酯(2.5和5µM)共培养4小时，然后用大肠杆菌O6:在感染多重性(MOI) 5处再加4小时。Western blot分析E-cadherin和occludin的蛋白调控。(D) 3个重复的咬合密度分析(均值±标准差，Welch’s t检验)。

    e -钙粘蛋白被一种新的细菌蛋白酶活性裂解

    由于E-cadherin的降解独立于蛋白酶体，我们假设不同的蛋白酶可能是细菌诱导该蛋白下调的原因。钙粘蛋白是基质金属蛋白酶的已知细胞底物。25日26日为了分析E-cadherin是否是MMPs的靶点，我们使用了广谱MMP抑制剂batimastat (BB-94)作为E-cadherin降解的潜在阻滞剂。

    首先，我们测试了BB-94对内源性MMPs的影响。激活的基质金属蛋白酶被分泌到细胞外空间。因此，我们用BB-94处理Caco-2细胞上清液，检测到总蛋白酶活性降低(图6)．此外，还分析了BB-94对特异性重组人基质金属蛋白酶的影响。所有测试的基质金属蛋白酶均被显著抑制，最高可达90% (图6 b)．MMP抑制剂不影响细菌增殖(图6 c)．因此，可以排除BB-94对细菌蛋白质合成的相关多效作用。因此，我们得出结论，该抑制剂可以有效地应用于我们的细菌- caco -2模型，以进一步研究并可能恢复细胞间连接蛋白E-cadherin。

    E-cadherin is a target of a bacterial protease activity. (A) Cellular protease activity±matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor BB-94 was measured by a fluorescein isothiocyanate (FITC)-coupled protease substrate. Relative FITC signal of three experiments is shown (mean±SD). (B) Inhibition of MMP activity by BB-94. Recombinant MMPs (MMP-1 (0.5 µM), MMP-2 (0.3 µM), MMP-7 (0.3 µM), MMP-8 (0.1 µM) and MMP-9 (0.3 µM)) were preincubated with BB-94 (10 µM) for 1 hour at 37°C. Fluorescent MMP substrate was added and MMP cleavage was recorded as relative fluorescence units (RFU) (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (C) Proliferation of Escherichia coli O6:Hnt ± BB-94 or DMSO was unchanged (n=3, mean±SD). (D) Densitometric analysis of cell junction proteins E-cadherin and occludin in the presence of 10 µM BB-94 (n=4, mean±SD). (E, F) Following treatment with BB-94 or BB-2516 (10 µM) for 20 min, Caco-2 cells were stimulated with E. coli O6:Hnt or patient-derived E. coli Ont:H7 at multiplicity of infection (MOI) 10 for 4 hours. E-cadherin and occludin were analysed by Western blot and (G) densitometric analysis (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (H) Qualitative PCR analysis of different MMPs and tissue inhibitor 2 of MMPs (TIMP-2) of E. coli O6:Hnt-stimulated Caco-2 cells (n=2–6, mean±SD, Welch’s t-test). (I) Cellular MMP activity was analysed by gelatin zymography. A 10% acrylamide gelatin gel (1 mg/mL) was loaded with supernatant of (un)stimulated Caco-2 cells. Recombinant MMP-2 and MMP-9 served as positive controls. One representative out of three gelatin zymography assays is shown. (J) Total protease activities of E.  coli O6:Hnt and patient-derived E. coli strains (Ont:H7 and O16:H5) were quantified by a fluorescent (FITC) protease substrate (n=5, mean±SD). (K) Total protease activity of patient-derived E. coli Ont:H7±10 µM BB-94, heat-inactivated (HI) bacteria and bacterial supernatant of bacterial overnight culture (SN) was quantified by a fluorescent (FITC) protease substrate (n=5, mean±SD, Welch’s t-test and Mann-Whitney rank-sum test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    e -钙粘蛋白是一种细菌蛋白酶活性的靶点。(A)用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联蛋白酶底物测定细胞蛋白酶活性±基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂BB-94。三个实验的相对FITC信号为(均值±标准差)。(B) BB-94抑制MMP活性。重组MMPs (MMP-1(0.5µM)， MMP-2(0.3µM)， MMP-7(0.3µM)， MMP-8(0.1µM)和MMP-9(0.3µM))与BB-94(10µM)在37℃下预孵育1小时。加入荧光MMP底物，MMP裂解记录为相对荧光单位(RFU) (n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。(C)增殖大肠杆菌O6:Hnt±BB-94或DMSO无变化(n=3，平均值±SD)。(D)细胞连接蛋白E-cadherin和occludin在10µM BB-94存在下的密度分析(n=4，均值±SD)。(E, F)用BB-94或BB-2516(10µM)处理20分钟后，用大肠杆菌O6:Hnt或患者来源大肠杆菌Ont:H7在感染多重度(MOI) 10下持续4小时。用Western blot和(G)密度分析(n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)分析E-cadherin和occlherin。(H)不同的定性PCR分析基质金属蛋白酶和MMPs的组织抑制剂2 (TIMP-2)的大肠 杆菌O6: hnt刺激的Caco-2细胞(n= 2-6，均值±SD, Welch’s t检验)。(一)明胶酶谱法测定细胞MMP活性。10%丙烯酰胺明胶凝胶(1mg /mL)加载(未)刺激Caco-2细胞的上清液。阳性对照为重组MMP-2和MMP-9。三种明胶酶谱分析中的一种具有代表性。(J)总蛋白酶活性大肠  杆菌O6:Hnt和患者来源大肠 杆菌菌株(Ont:H7和O16:H5)用荧光蛋白酶底物(n=5，均值±标准差)定量。(K)患者源性蛋白酶总活性大肠 杆菌Ont:H7±10 μ M BB-94，热灭活(HI)细菌和细菌过夜培养(SN)的细菌上清液采用荧光蛋白酶底物(FITC)定量(n=5，均值±SD, Welch 's t检验和Mann-Whitney秩和检验)。

    其次，单独使用BB-94(不含细菌)不会影响细胞连接(图6 d)．值得注意的是，BB-94在与两者共培养Caco-2细胞时导致E-cadherin的恢复大肠 杆菌O6:Hnt (p=0.037)和sbp衍生菌株大肠 杆菌Ont:H7 (p=0.016) (图6 e, G)．作为概念的证明，第二种广谱MMP抑制剂marimastat (BB-2516)重建了被下调的E-cadherin蛋白水平大肠 杆菌O6: Hnt (图6 f)．因此，像BB-94和BB-2516这样的MMP抑制剂可以保护上皮屏障，因此，可以防止BT和SBP的发展。鉴于BB-94和BB-2516的保护作用，我们研究了细胞基质金属蛋白酶是否负责细胞间连接的不稳定。令人惊讶的是，基因表达(图6 h)和内源性基质金属蛋白酶的明胶酶活性(图6我)在Caco-2细胞与大肠 杆菌．这意味着细胞基质金属蛋白酶不是细菌诱导的e -钙粘蛋白裂解的介质。我们假设，如果不是细胞蛋白酶，那么细菌蛋白酶是负责e -钙粘蛋白降解的。

    第三，我们评估了不同的蛋白酶的总活性大肠 杆菌菌株。临床兴趣，患者衍生大肠 杆菌Ont:H7对细胞接触蛋白的下调作用最为显著，表现出较高的蛋白酶活性。大肠 杆菌O6:Hnt和O16:H5的蛋白酶活性较低(图6 j)，与它们降解E-cadherin (图4一)．BB-94处理导致总细菌蛋白酶活性降低43% (p=0.058)。HI细菌和SN细菌的总蛋白酶活性分别显著降低85%和88% (p=0.001和p=0.008)。这表明细菌蛋白酶活性只在很小的程度上释放到SN中(图6 k)．总之，这些数据表明细胞连接蛋白E-cadherin被活细菌的细菌蛋白酶降解。

    SBP-derivedp . 君子兰显示新的蛋白酶活性

    为了推广我们观察到的一种新的细菌蛋白酶活性负责e -钙粘蛋白的裂解，我们测试了其他参与SBP发病机制的细菌菌株。我们分离了p . 君子兰一例急性-慢性肝衰竭患者腹水的毒株。这p . 君子兰使E-cadherin和occlin蛋白水平降低63%，同时导致细胞死亡(图7 a, B)．如上图所示，BB-94对细菌增殖无影响(图7 c)．值得注意的是，BB-94治疗(图7 d, E)及BB-2516 (图7 j, K)添加到Caco-2后，可以恢复e -钙粘蛋白水平- p 奇异君子兰。共培养。这些数据与sbp衍生的效果一致大肠 杆菌压力校正:H7。因此，病人来源的细菌菌株- e。 杆菌而且p . 君子兰-表现出较高的bb -94敏感性和bb -2516敏感性蛋白酶活性，导致e -钙粘蛋白裂解(图6E-G,K和7D-F,J,K)．为了排除这一点p . 君子兰-诱导的细胞死亡是观察到的E-cadherin和occludin蛋白水平降低的原因，我们分析了与Caco-2共培养的细胞p .奇异君子兰(1)总数(附+脱附)，(2)附，(3)脱附。在流式细胞术中几乎没有细胞死亡迹象的附着细胞表现出E-cadherin和occludin蛋白水平的降低。E-cadherin再次被BB-94重组(图7胃肠道而且在线补充图4)．此外，在细菌- caco -2共培养中观察到的细胞死亡模式与caspase无关，因此不是分离诱导的anoikis (在线补充图4)．因此，我们表明细菌诱导的细胞死亡而不是E-cadherin和/或occludin降解是导致Caco-2细胞分离的原因。

    The novel bacterial protease activity cleaves cell junction protein E-cadherin and is a feature of different spontaneous bacterial peritonitis (SBP)-inducing bacteria. (A) Caco-2 cells were treated with SBP-derived Proteus mirabilis (compare online supplemental table 6) at multiplicity of infection (MOI) 10, heat-inactivated (HI) P. mirabilis and bacterial supernatant of bacterial overnight culture (SN) for 4 hours. E-cadherin and occludin were analysed on protein level by Western blot. (B) Caco-2 cells were co-cultured with P. mirabilis (MOI 10), fixed and stained with crystal violet. Cell survival was quantified (right panel, n=3, mean±SD). (C) Proliferation of patient-derived P. mirabilis±BB-94 or DMSO was photometrically measured (n=3, mean±SD). (D) Following treatment with BB-94 (10 µM) for 20 min, Caco-2 cells were co-cultured with P. mirabilis at MOI 10 for 4 hours. Protein levels of occludin and E-cadherin were analysed by Western blot and (E) quantified by densitometry (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (F) Total protease activity of P. mirabilis±BB-94 and HI bacteria was measured by a fluorescein isothiocyanate (FITC)-coupled protease substrate (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (G) Following treatment with BB-94 (10 µM, 20 min), Caco-2 cells were treated with patient-derived P. mirabilis at MOI 10 for 4 hours. Attached versus detached cells were analysed on protein level for E-cadherin and occludin or (H, I) induction of cell death via DAPI exclusion by flow cytometry. Total cells represent the combination of attached and detached cells (n=3, mean±SD, Welch’s t-test). (H, I) Blue lines and bars represent MOI 0, while red lines and bars represent MOI 10 P. mirabilis. (J, K) Analysis of E-cadherin and occludin protein levels by Western blot with densitometric analysis. Prior to P. mirabilis co-culture (MOI 10, 4 hours), Caco-2 cells were stimulated with 10 µM BB-2516 for 20 min (n=3, mean±SD).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    这种新的细菌蛋白酶活性可裂解细胞连接蛋白e -钙粘蛋白，是不同自发性细菌性腹膜炎(SBP)诱导细菌的一个特征。(A)用sbp来源的Caco-2细胞处理变形杆菌(比较在线补充表610，热灭活(HI)p . 君子兰细菌上清过夜培养(SN) 4小时。Western blot检测E-cadherin和occludin蛋白水平。(B) Caco-2细胞与p . 君子兰(MOI 10)，固定和染色与水晶紫。细胞存活率被量化(右图，n=3，平均值±SD)。(C)患者来源的增殖p . 君子兰±BB-94或DMSO光度测定(n=3，平均值±SD)。(D)用BB-94(10µM)处理20分钟后，Caco-2细胞与p . 君子兰MOI 10, 4小时。Western blot检测occludin和E-cadherin蛋白水平，密度法定量(n=3，均值±标准差，Welch’s t检验)。(F)总蛋白酶活性p . 君子兰采用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联蛋白酶底物(n=3，均值±SD, Welch 's t检验)检测HI细菌±BB-94。(G)用BB-94处理后(10µM, 20分钟)，用患者来源的Caco-2细胞处理p . 君子兰MOI 10, 4小时。流式细胞术分析附着细胞与离体细胞在蛋白水平上E-cadherin和occludin或(H, I)通过DAPI排斥诱导细胞死亡。总细胞数表示附着细胞和脱落细胞的总和(n=3，均值±SD, Welch’s t检验)。(H, I)蓝色线和柱状表示MOI 0，红色线和柱状表示MOI 10p . 君子兰。(J, K) Western blot与密度法分析E-cadherin和occludin蛋白水平。之前p . 君子兰共培养(MOI 10,4小时)，Caco-2细胞用10µM BB-2516刺激20分钟(n=3，均值±SD)。

    综上所述，在肝硬化合并收缩压患者中，结肠黏液层厚度减少，粘连连接蛋白E-cadherin和occludin下调。我们的Caco-2模型强调了细菌与细胞的直接相互作用对减少细胞与细胞接触蛋白至关重要。在大肠 杆菌而且p . 君子兰刺激时，细胞通过内源性蛋白酶体降解下调occludin，而细菌蛋白酶则负责e -钙粘蛋白的切割。

    讨论

    通过这项研究，我们对宿主(人)和细菌因素作为肝硬化患者BT和随后腹水感染(SBP)的介质提供了新的见解。我们在收缩压中发现了以下新的病理机制和潜在的治疗靶点。肝硬化患者表现为(1)结肠粘液厚度减少，允许细菌与上皮细胞接触。肠道细菌通过一种新的细菌蛋白酶活性诱导(2)上皮细胞occludin的蛋白酶体降解和(3)e -钙粘蛋白的裂解。这些机制(1-3)允许肠道细菌到达上皮，破坏保护性上皮屏障，从而促进BT和SBP (图8)．

    Novel pathomechanisms for spontaneous peritonitis (SBP). Patients with liver cirrhosis display (1) a reduced thickness of colonic mucus, which allows bacteria-to-epithelial cell contact. Intestinal bacteria induce (2) proteasomal degradation of occludin in epithelial cells and (3) cleavage of E-cadherin by a novel bacterial protease activity. These mechanisms (1–3) allow intestinal bacteria to reach the epithelium, destabilise the protective epithelial barrier and thus promote BT and SBP.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    自发性腹膜炎的新发病机制。肝硬化患者表现为(1)结肠粘液厚度减少，允许细菌与上皮细胞接触。肠道细菌通过一种新的细菌蛋白酶活性诱导(2)上皮细胞occludin的蛋白酶体降解和(3)e -钙粘蛋白的裂解。这些机制(1-3)允许肠道细菌到达上皮细胞，破坏保护性上皮屏障，从而促进BT和SBP。

    肝硬化患者黏液和细胞连接蛋白作为sbp诱导细菌进入位点的变化

    肠上皮将腔内微生物区系与系统组织分开。第一道防线是结肠黏液层。27肠粘液含有多种不同的蛋白质，而o -糖基化粘蛋白2 (MUC2)是其核心分子。28 29结肠以两层黏液系统处理大量细菌负荷，其中内层由密密麻麻的MUC2薄片组成，细菌无法穿透，外层为微生物群提供生态位。30.缺乏MUC2的小鼠会患上严重的结肠炎，最终患上结肠癌。29日33节约翰逊等研究表明，活动性溃疡性结肠炎(UC)患者的结肠粘液缺陷允许细菌渗透并到达上皮细胞。据我们所知，我们的数据是对肝硬化患者结肠粘液的首次分析。我们扩展了对约翰逊的观察等在UC患者中34还有索利巴等在肝硬化小鼠模型中35肝硬化患者。

    我们发现肝硬化患者粘液厚度减少。范德波斯特等研究表明，活动性UC患者中包括MUC2在内的主要结构性粘液成分减少。36这符合我们的观察MUC2当Caco-2细胞与患者来源的细胞共培养时，在体外模型中mRNA含量较低大肠 杆菌．共生菌和致病菌可以通过不同的策略改变肠道黏液层，例如，减少黏液的合成、分泌、粘度和厚度，增加黏液的降解和穿透性，以及改变黏液的组成。37值得注意的是，粘蛋白的合成也在转录和表观遗传水平上受到调控。许多转录因子已被证明可以调节MUC2．它们可以与特定的细菌或微生物产物相连接，主要通过激活核因子(NF)-κB结合到蛋白启动子的特定位点起作用MUC2．此外，包括肿瘤坏死因子和白细胞介素在内的特异性炎症标志物参与NF-κB通路并进行转激活MUC2而肿瘤坏死因子激活Janus激酶可抑制肿瘤坏死MUC2基因。38 39在结肠癌中，表观遗传机制，如启动子甲基化，组蛋白修饰和额外的微rna有助于调节MUC2．

    此外，我们还提供了与SBP患者结肠腺连接蛋白occludin和E-cadherin表达减少相关的结构变化的新数据。这些综合结果表明，肝硬化患者黏液成分的改变导致黏液屏障减弱，宿主-细菌接触增加，细胞连接蛋白减少。这些数据为进一步研究治疗性恢复粘膜上皮屏障提供了平台。我们研究的一些局限性值得考虑:小鼠模型允许从肝硬化小鼠(与胆管结扎和ccl4诱导的肝硬化小鼠相比)使用肝前门脉高压症小鼠来解剖门脉高压症的影响，因此Sorribas等肝硬化损害粘膜上皮屏障，而不是门脉高压，从而导致BT。35此外，小鼠模型允许研究肠-血管屏障，因为易位不仅仅局限于上皮肠界面。17Caco-2共培养模型具有对特定菌株及其与上皮连接蛋白相互作用进行标准化分析的优势。

    肠道细菌诱导细胞连接蛋白闭塞蛋白的蛋白酶体降解和上皮屏障的不稳定

    我们研究的另一个重要发现是细菌可以增强occludin的Lys-48泛素化。Lys-48多泛素化是蛋白酶体降解的信号靶向阻断蛋白。尽管泛素系统是真核生物所独有的，但细菌已经开发了大量能够利用宿主泛素化途径的策略。40蛋白质泛素化是由E1(泛素活化酶)、E2(泛素偶联酶)和E3(泛素连接酶)催化的级联反应。有两大类E3s, HECT型和RING/U-box型E3s。细菌表达了两者的分子模拟。此外，含有F-box结构域的蛋白质介导泛素化，在细菌效应物中也有描述。41 42通过一组泛素连接酶靶向宿主蛋白质泛素化是微生物通过修改关键宿主信号通路来建立有利于其生存和生长的条件的重要毒力策略。43 44我们假设在我们的细菌- caco -2模型中，类似的泛素化机制可能是闭塞蛋白降解的原因。这些效应子的其他作用机制是(1)催化不依赖于e1和不依赖于e2的泛素化，(2)泛素化级联的翻译后修饰，以及(3)将其催化活性与泛素化机制的组成部分耦合。41综上所述，宿主泛素化不仅对真核细胞的发育和稳态至关重要，而且对许多细菌感染的结局起着至关重要的作用。因此，通过药物抑制细菌泛素连接酶样酶靶向蛋白酶体降解应被认为是治疗细菌感染的一种新策略。抑制蛋白酶体已被证实是抗癌治疗的一种重要策略。45-49我们认为蛋白酶体抑制可能为防止闭塞蛋白降解和恢复肠屏障功能提供了一种新的选择。

    一种新的细菌蛋白酶活性切割e -钙粘蛋白，导致宿主上皮细胞完整性的破坏

    此外，我们强调了一种新的细菌蛋白酶活性，它负责E-cadherin的裂解。只有活细菌和较小程度的SN，而不是LPS，诱导细胞连接成分的减少。因此，各自的蛋白酶活性要么是活菌的一部分，要么被分泌/释放到上清液中。在患者来源的SBP分离株中检测到最高的蛋白酶活性大肠 杆菌游客:H7和p . 君子兰．由于MMP抑制剂BB-94和BB-2516可部分阻断蛋白酶活性，我们建议患者源性蛋白酶大肠 杆菌菌株表达一种靶向E-cadherin的蛋白酶。我们可以在不同的sbp诱导中验证细菌蛋白酶的活性大肠 杆菌菌株和一体p . 君子兰压力。这可能会推广我们的假设，即肠道细菌通过诱导闭塞蛋白的蛋白酶体降解和细菌蛋白酶诱导的e-钙粘蛋白切割来破坏细胞连接。

    为癌症治疗而建立的蛋白酶抑制已经从针对大谱蛋白酶的策略发展到针对特定蛋白酶的策略，并发展到癌症以外的适应症。47我们的数据表明，SBP中的蛋白酶靶点(类似于炎症性肠病的治疗方案)应该包括泛素-蛋白酶体系统抑制剂。

    靶向细菌蛋白酶为抗感染治疗提供了新的机会。耐药性是肝硬化和收缩压患者的重要问题。50由于目前抗生素的失败，显然需要更有效的药物。51我们发现了一种新的蛋白酶活性，它构成了SBP的药物靶点。我们支持下一代抗感染蛋白酶抑制剂与目前主要抗病毒的抗感染蛋白酶抑制剂相比将有更广泛的临床覆盖的想法。

    数据可用性声明

    所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。

    伦理语句

    患者发表同意书

    致谢

    我们感谢我们的病人捐赠活检。我们感谢Peter Oefner (Regensburg大学功能基因组学研究所，Regensburg，德国)和Franz Paul Armbruster (Immundiagnostik, Bensheim，德国)进行了有益的科学讨论。我们感谢Florian Zeman(德国雷根斯堡大学医院临床研究中心)在统计分析方面的协助。我们感谢Susanne Modrow、Jonathan Jantsch、Michaela Simon和Patrick Neubert(德国雷根斯堡大学医学微生物学与卫生研究所)的持续支持。我们感谢Angelika Fruth(德国柏林Robert Koch研究所)对患者源性菌株的描述和不断的支持。

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    补充材料

    脚注

    • 贡献者MM发起SBP项目并设计工作;MM、MH、KG、LB、CK负责实验设计;AK、VP和AM进行结肠镜检查并收集人体组织样本;以MH、PN、ER、AS和HG为主;CB进行了电子显微镜实验;MH起草稿件，编制数据;SS分析临床资料;MH、KG、MM撰写并编辑稿件。所有作者都同意了手稿的最终版本。

    • 资金本研究得到了德国联邦经济事务和能源部(Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand, KF 2525606CS3)的支持。

    • 相互竞争的利益MM和CK报告了联邦经济事务和能源部(德国)在研究期间的资助。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。