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肝脏病学
原始研究
乙型肝炎病毒整合促进肝细胞癌局部和远端致癌驱动因子改变
  1. 卡米尔Peneau1，2，
  2. Sandrine Imbeaud1，2，
  3. 蒂齐亚娜·拉·贝拉1，2，
  4. 西奥·Z·赫希1，2，
  5. 斯特凡诺卡鲁索1，2，
  6. 朱利安Calderaro3.，
  7. 瓦莱丽-4，5，
  8. Jean-Frederic布兰科6，7，8，
  9. Eric Letouze1，2，
  10. 租用Nault1，2，9，
  11. 古丽亚娜Amaddeo10，
  12. 杰西卡Zucman-Rossi1，2，11
  1. 1科德利埃研究中心，Sorbonne Université， INSERM, Université de Paris，巴黎、法国
  2. 2实体肿瘤功能基因组学实验室，équipe labellisée法国国家抗癌实验室，Labex肿瘤免疫学，巴黎、法国
  3. 3.服务d 'Anatomopathologie，Hôpital亨利·蒙多，阿普斯，蒙多研究学院Biomédicale，完成、法国
  4. 4病理科，Hôpital博尚，APHP，克里希、法国
  5. 5Université巴黎·狄德罗，法国国家研究中心，炎症研究中心27号(CRI)，巴黎、法国
  6. 6服务Hépato-Gastroentérologie et肿瘤学消化，Hôpital Haut-Lévêque，波尔多州，波尔多、法国
  7. 7病理科，CHU波尔多GH Pellegrin，波尔多、法国
  8. 8Université波尔多，插入，转化肿瘤学研究，BaRITOn，波尔多、法国
  9. 9服务'Hépatologie, Hôpital阿维森纳，Hôpitaux巴黎塞纳-圣德尼大学。，APHP，博比尼、法国
  10. 10服务'Hépato-Gastro-Entérologie, Hôpital亨利蒙多，APHP, Université巴黎Est Créteil，插入U955，生物医学研究所，完成，巴黎大区、法国
  11. 11Hôpital Européen乔治·蓬皮杜，AP-HP，巴黎、法国
  1. 对应到Jessica Zucman-Rossi教授，索邦大学科利埃研究中心Université，巴黎Inserm, Université de Paris，法国巴黎75006;jessica.zucman-rossi在{}inserm.fr

摘要

客观的乙肝病毒感染是世界范围内肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。乙肝病毒通过整合人类基因组直接推动致癌。这项研究旨在精确地描述HBV整合，与病毒和宿主基因组学和临床特征相关。

设计一种新的管道被建立起来，用于在肿瘤和非肿瘤肝组织上进行病毒捕获，这些肿瘤和非肿瘤肝组织来自法国的177名患者队列，主要来自欧洲和非洲。每个整合事件的克隆性由整合序列的本地化、方向和内容决定。在三个选定的肿瘤中，使用长读测序或Bionano全基因组图谱重建了复杂的整合。

结果复制HBV DNA在非肿瘤组织中更频繁地被检测到，并与更多的非克隆整合相关。在HCC中，HBV整合的克隆选择与两种不同的致癌机制有关。首先，在癌驱动基因附近整合病毒增强子可能导致癌基因的强过表达。其次，我们在HBV整合位点发现了导致癌症驱动基因的频繁染色体重排(Tert, tp53, myc)远处的变化。此外，HBV整合具有直接的临床意义，因为大量插入的HCC发生在年轻患者中，预后较差。

结论肝组织中HBV整合的深度表征突出了与肝癌发生相关的新的HBV相关驱动机制。HBV整合有多种直接致癌后果，这仍然是HBV感染患者随访的一个重要挑战。

  • 肝细胞癌
  • 乙型肝炎
  • 癌症遗传学

数据可用性声明

数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。本文报道的LICA-FR队列测序数据已存入欧洲基因组-phenome Archive (EGA)数据库(RNA-seq fastq files accessions (EGAS00001001284)， (EGAS00001002879)， (EGAS00001003310)， (EGAS00001003837)和(EGAS00001004629);WES bam文件访问(EGAS00001000217)， (EGAS00001001002)， (EGAS00001003063)， (EGAS00001003130)， (EGAS00001003837)和(EGAS00001004629);通过国际癌症基因组联盟(ICGC)数据访问委员会，WGS bam文件访问(EGAS00001000706)、(EGAS00001002408)、(EGAS00001002888)、(EGAS00001003063)、(EGAS00001003837)和(EGAS00001004629)。资料可于以下网址重复使用及查阅:https://ega-archive.org/studies/EGASxxx持有ICGC数据访问合规办公室的访问权限。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323153

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • HBV感染是世界范围内肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。

    • HBV是一种小型DNA病毒，可以整合到人类基因组中，从而发挥促进致癌的作用。

    • 对来自亚洲患者的肝癌进行下一代测序的研究指出，HBV通过插入突变促进肝癌的发展。

    新的发现是什么?

    • 复制HBV DNA在非肿瘤组织中更频繁被检测到，并与更高数量的整合相关。

    • 通过HBV插入突变发生的HCC与肿瘤驱动基因附近的整合序列中病毒增强子的存在有关。

    • 与远距离病毒整合相关的癌症驱动基因的频繁拷贝数改变也可驱动hbv诱导的致癌。

    • HBV整合的数量是HBV相关HCC的独立预后因素。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 大量的HBV整合与非肿瘤肝组织中的病毒复制和肿瘤中的不良预后相关，这表明在生命早期提供有效的抗病毒治疗的重要性，以限制HBV整合的数量，并对抗HBV相关的肝癌的直接发展。

    • 这项研究强调hbv相关的HCC是由不同的机制促进的，强调了这些肿瘤的异质性和分子特征对确定新的特异性治疗机会的重要性。

    简介

    尽管实施了疫苗接种规划，儿童新感染病例大幅减少，但2015年全球慢性乙肝病毒感染者占全球人口的比例仍高达3.5%。1此外，只有9%的感染者得到诊断，其中只有8%正在接受治疗，这使乙肝成为世卫组织目前优先考虑的一个主要公共卫生威胁。1 2乙肝病毒感染的负担与肝细胞癌(HCC)的发展密切相关，肝细胞癌是世界上最常见的原发性肝癌，也是癌症死亡的第四大原因。3.持续的HBV感染实际上导致了全世界50%的HCC病例，在一些感染流行的地区高达85%。4即使接受抗病毒治疗的患者在病毒抑制的情况下仍有发生肝细胞癌的风险。5 - 8

    hbv相关的HCC发生在肝硬化和正常肝脏中，9这种病毒除了能引起肝脏的慢性炎症外还有自己的致癌特性。HBV是一种3.2 kb的DNA小病毒，可以整合到人类DNA中，并通过插入突变或通过蛋白HBx等病毒癌蛋白的表达促进细胞转化。10 - 12由于乙肝病毒的整合发生在感染早期，13比较发生在正常肝细胞和肿瘤细胞中的插入可能有助于识别与肿瘤发展相关的新的基因组缺陷。

    下一代测序技术的发展使HBV插入在HCC起始和发展中的作用得到了更精确的表征。在14到18岁与癌症相关的基因，比如叔，CCNE1而且KMT2B已被确定为HCC中HBV插入的周期性靶向，具有特定的功能后果和临床结果。16个月19 - 21日因此，肝细胞中整合的HBV DNA的存在被指出是通过这些基因的表达或功能的改变而导致肝癌发生的驱动因素。12但到目前为止，这种对肝癌中HBV插入的鉴定主要在亚洲人群中进行，那里的HBV基因型B和C是最常见的HBV株。22此外，由于HBV相关HCC的很大一部分不包含任何已知癌症相关基因的整合，另外两种涉及整合HBV DNA的独立机制被提出:诱导染色体不稳定和改变的HBV基因的持续表达。23然而，上述三种机制之间的相互作用以及它们各自或协同作用在HCC发生和发展中可能发挥的确切作用仍有待充分阐明。

    因此，在这项工作中，我们开发了一个基于病毒捕获的可靠分析管道，以表征177名患者队列中的HBV整合，以及肿瘤及其相应的非肿瘤肝组织中的基因组重排、临床特征和病毒特征。我们还研究了反复的HBV整合对基因表达和染色体不稳定的致癌后果，涉及肝癌的发生。

    材料与方法

    (扩展在线补充材料和方法部分)。

    从1128名患者中收集了包含1128例冰冻HCC和1063例非肿瘤对应体的一系列组织样本(在线补充图1)．临床及血清学资料收集自各中心(在线补充表1)．根据先前描述的方案进行病毒DNA筛查24使用特定的HBV探针(在线补充表2)．

    HBV病毒捕获使用单链生物素化探针(SeqCap EZ Designs, Roche NimbleGen, Madison, Wisconsin, USA)对177个冷冻HCC和170个匹配的非肿瘤肝组织进行了检测，以分布在8个主要HBV基因型和4个人类区域的40个参考文献为目标(叔启动子,CCNE1，CCNA2而且KMT2B；在线补充表3)．在使用SeqCap-EZ-HyperCap Workflow (Roche)进行双捕获步骤之前，制备1 kb片段的DNA文库并进行多路复用。用Illumina MiSeq仪器进行测序，得到2×250核苷酸的成对末端读数。

    集成事件的分析按照流程图(在线补充图2)．简单地说，HBV和人类参考文献的测序数据是一致的(在线补充表3)．每个细胞的HBV拷贝数从HBV基因组的平均阅读覆盖率评估，包括整合的和片段的HBV (在线补充图3A)．使用htslib包提取配对和嵌合读数，以识别HBV/人连接断点并评估整合事件的克隆性。使用k-means方法将8809个整合事件分为三类:(1)“克隆整合”(>48%的细胞)，(2)“唯一整合”(<3%的细胞)和(3)“亚克隆整合”(3% - 48%的细胞)(在线补充图3B)．对于20对肿瘤和非肿瘤组织，病毒捕获和全基因组测序(WGS)鉴定的整合事件具有可比性(在线补充图3C,D)．在HepG2中，集成断点被注释为复制时间(ENCODE)，25hbv阳性肝脏中前20%高表达基因，常见和罕见脆弱位点，26成人肝脏重复序列、CpG岛和染色质结构(ROADMAP)。27如果两个断点聚集在相反方向的25 kb内，则命名为“经典”插入;如果两个断点聚集在同一方向的25 kb内，则命名为“局部反转”;如果只识别出一个断点，则命名为“大规模重排”;如果识别出两个以上的断点，则命名为“插入集群”。

    驱动基因的基因组DNA测序对265个肿瘤及其邻近肝组织进行了高覆盖率WGS测序(n=62)或全外显子组测序(WES, n=203)，并在叔启动子与Sanger或MiSeq。

    HBV片段型检测以特异性dna酶/ taqman为基础的检测24在162个肿瘤和155个非肿瘤肝脏组织(在线补充表2)．

    病毒mRNA和特异性基因mRNA筛选采用定量逆转录酶(qRT)-PCR方法，使用10个探针集覆盖主要HBV基因型的8个HBV区域，检测HCV、HDV或TERT的表达(在线补充表2)．

    HBV复制形式如果HBV片段DNA和HBV基因组前RNA (pgRNA)均被识别，则被认为存在于一个组织中。当检测到不含pgRNA的片段形式时，组织被认为含有“片段的非复制性HBV DNA”。

    rna测序(RNA-seq)和转录组学分析在265个肿瘤(130个hbv阳性，135个hbv阴性)和24个hbv阳性非肿瘤组织中使用Illumina TruSeq或法国IntegraGen公司HiSeq2000上的Illumina TruSeq rna试剂盒。19我们使用了Bioconductor的limma包28用基因集富集分析(GSEA)方法的内部适应测试所有表达基因的差异表达。29肿瘤按照之前使用BioMark PCR系统对190个基因的qRT-PCR描述的G1-G6转录组组进行分类。30 31

    HBV变异分析根据前面描述的命名法进行病毒捕获。22日32

    细胞培养，转染和双荧光素酶测定如前所述，在购买自美国型培养集合的HuH7细胞中进行。33

    读测序在三个hbv阳性肿瘤(#1151T， #1597T， #1994T)中使用单分子实时技术、PacBio-SMRTcell系统(ICGex平台，法国Curie研究所)和共识循环测序算法(Pacific Biosciences)进行。全基因组图谱由美国加利福尼亚州拉霍亚的Bionano Genomics对相同的样本进行了分析。

    统计分析R V.3.6.0 (http://www.R-project.org)，就变量类型应用了各种统计检验。如前所述，对经R0肝切除术治疗的原发性肝癌肿瘤患者进行生存分析。34

    结果

    HBV整合发生在开放的染色质区域，与病毒在肝脏中的复制有关

    我们对177例HCC和177例HBV阳性患者的170例非肿瘤肝组织进行了HBV病毒捕获，用一种新的生物信息学管道分析人类基因组中的HBV整合，并精确识别插入事件的结构及其克隆性(见“材料和方法”部分和在线补充表1)．在84%的非肿瘤肝组织(170个中的143个)中，我们在HBV/人连接处识别出6610个HBV整合断点，对应于独特(82%)、亚克隆(17%)或克隆(1%)事件，涉及相似的所有HBV基因型(图1一个；在线补充图4；在线补充表4)．在人类基因组中，HBV整合断点富集于活跃和开放的染色质区域，接近早期复制和高表达基因。简单重复序列的整合也更为频繁，特别是在端粒和次端粒区域，但在Alu基序、脆弱位点或长/短穿插核元件中则没有(LINE/ sin;在线补充图5A)．对非肿瘤组织中394个亚克隆或克隆整合事件的重建显示，它们都包含整个HBV序列的大部分(中位数为2912个核苷酸)，其中42%的事件在靶向人类序列和整合的HBV序列之间有1- 8个核苷酸同源性，这表明微同源性介导的端连接(在线补充图5B,C)．

    HBV integrations in non-tumour tissues are associated with viral replication and more frequent in large highly expressed genes. (A) Repartition of clonality between all HBV integration events detected in viral capture (n=8809). (B) Coding genes with or without HBV integrations according to the gene length and the median gene expression in non-tumour liver tissues. Genes with recurrent clonal or subclonal HBV integrations are annotated. (C) Number of HBV integrations identified in non-tumour samples (n=142) according to the presence of episomal HBV DNA and replicative HBV DNA (Jonckheere’s trend test). (D) Correlations between HBV copy number/cell in 170 non-tumour liver tissues assessed by viral capture and clinical or molecular features. Positivity for hepatitis B surface antigen (HBsAg), hepatitis B e antigen (HBeAg), HBV DNA (by PCR) in the patients’ serum and duration of antiviral treatments were obtained from clinical data. Wilcoxon signed-rank, Kruskal-Wallis or Pearson’s correlation statistical tests were applied with respect to the type of variable. P values were adjusted for multiple testing using the Benjamini-Hochberg method (false discovery rate). AFB1, aflatoxin-B1; BCP, basal core promoter; FPKM, fragments per kilobase of exons per million reads; PC, PreCore; RT, reverse transcriptase.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    非肿瘤组织中的HBV整合与病毒复制相关，且在大的高表达基因中更为频繁。(A)病毒捕获中检测到的所有HBV整合事件之间的克隆性重新划分(n=8809)。(B)在非肿瘤肝组织中，根据基因长度和中位基因表达，编码有或没有HBV整合的基因。带有重复克隆或亚克隆HBV整合的基因被注释。(C)在非肿瘤样本(n=142)中，根据片段性HBV DNA和复制性HBV DNA的存在(Jonckheere趋势检验)确定的HBV整合数量。(D)通过病毒捕获和临床或分子特征评估170个非肿瘤肝组织中HBV拷贝数/细胞之间的相关性。根据临床资料，测定患者血清中乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、HBV DNA (PCR)阳性率及抗病毒治疗时间。对变量类型采用Wilcoxon - signed rank、Kruskal-Wallis或Pearson相关统计检验。使用Benjamini-Hochberg方法(错误发现率)调整多次测试的P值。AFB1 aflatoxin-B1; BCP, basal core promoter; FPKM, fragments per kilobase of exons per million reads; PC, PreCore; RT, reverse transcriptase.

    在非肿瘤肝组织中，在20个具有以下特征的基因中发现了重复克隆/亚克隆插入:高表达(7/20，每千碱基外显子片段每百万读>100,p<0.001)或非常大的基因(11/20，>100 kb, p<0.001)，例如FN1(14例),CPS1(4例), KCNT2或ADH1B(3例),ADH4或ADH6或ALB(2例,图1 b)．包括所有插入事件FN1,HBV断点分布在整个基因中，主要在内含子中(72/78)，没有特定的热点(在线补充图6A)．26例HBV整合的RNA-seq分析FN1位点鉴定出两种主要类型的融合转录本:(1)帧外HBx-FN1转录本方向相同或相反(9/26);(2)帧内HBx-FN1转录本由S ORF 458位置的隐接位点产生(11/26;在线补充图6A)．总的来说，融合转录本bs - fn1的多样性开始于不同的外显子FN1且HBV整合靶向基因的整体过表达缺失表明，在非肿瘤肝组织中的大多数克隆/亚克隆插入并不能证明有功能作用(在线补充图6B)．有趣的是，克隆插入表明，在170个非肿瘤样本中，有11%的非肿瘤肝细胞局部增殖，均在纤维化肝脏(F2-F4)中，炎症反应降低，核因子-κB/肿瘤坏死因子信号减弱，通过非肿瘤组织的一个亚组RNA-seq检测(在线补充图6C)．

    在170个分析的非肿瘤肝组织中，每个细胞的高HBV拷贝数与女性性别、年轻年龄、非洲或亚洲地理来源以及血清中乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)和HBV DNA阳性显著相关。相比之下，慢性肝病的辅助因素如活动性HCV或HDV感染、酒精消费或代谢综合征的存在与较低的HBV拷贝数和较少的HBV整合相关。只有18%的样本含有复制性HBV，它们在A型基因中富集，并显示出更多的整合，这表明HBV复制和整合是相互关联的过程(图1 c, D；在线补充图4)．同时，HBV拷贝数高的样本显示基底核心启动子(BCP;A1762T/G1764A)或RT区:已知的有利于病毒复制的突变32（图1 d)．

    复杂的HBV整合和病毒基因组重排在HCC中是常见的

    在分析的177例HBV相关HCC中，88%的人基因组中有HBV整合，在HBV/人连接处共有2199个断点，其中31%对应于克隆事件(图1一个；图2一个)．绝大多数(82%)肿瘤至少有一个克隆HBV整合，而非肿瘤肝组织中只有11% (p<0.001)。图2 b)．总的来说，HBV整合的数量与每个细胞的HBV拷贝数高度相关(图2 c)．然而，尽管肿瘤显示出每个细胞较高的HBV拷贝数，但与相应的非肿瘤组织相比，它们每个样本的HBV断点数量较低(平均12 vs 39, p<0.001) (图2 d；在线补充图7)．这可能反映了感染期间大量肝细胞中独特HBV整合的高度多样性，以及转化细胞的克隆扩增引起的多样性降低。在这两种组织中，HBV整合最频繁的热点是在HBx基因DR1序列(1817-1836)周围的c端区域，对应于HBV双链线性DNA形式的末端(图2 e)．在肿瘤中，只有部分HBV基因组被检测到，对应于整合的HBV DNA与HBx基因的频繁截断(在线补充图8A)．此外，肿瘤中的HBV基因组在病毒序列中包含更多的结构变异(缺失、复制、倒置;图2 f)，只有3%的肿瘤结构变异在邻近的肝组织中被观察到(17/514)。最后，人类基因组中HBV/人连接的定位和定位显示肿瘤中频繁的染色体重排，这表明与非肿瘤肝组织相比，其整合过程或整合后结构修饰更为复杂(在线补充图8B)．

    Tumours and non-tumour tissues have different HBV integration profiles and structures of HBV sequences. (A) Pan-genomic view of genomic locations of all HBV integration breakpoints in tumours (up) or non-tumour tissues (down) in 347 HBV-positive samples (non-tumour liver, n=170, and tumour samples, n=177). A line corresponds to a 1M-bin region. (B) Proportion of non-tumour tissues and tumours harbouring only unique integrations, at least one subclonal integration or at least one clonal integration (χ2 test). (C) Correlation between the HBV copy number per cell and the number of HBV integration breakpoints (Pearson’s correlation). (D) Number of HBV integration breakpoints per sample (Wilcoxon signed-rank test). (E) Localisation of HBV integration breakpoints along the HBV genome in tumours and non-tumour samples according to the orientation of the integrated sequence. (F) Number of structural variants in HBV genome per sample (Wilcoxon signed-rank test). (G) Proportion of non-tumour and tumour samples containing replicative HBV DNA, episomal non-replicative HBV DNA or no HBV episomal form (χ2 test). centr, centromeric; SV, structural variant; telo, telomeric.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    肿瘤和非肿瘤组织具有不同的HBV整合谱和HBV序列结构。(A) 347个HBV阳性样本(非肿瘤肝脏，n=170，肿瘤样本，n=177)中肿瘤(上)或非肿瘤组织(下)中所有HBV整合断点基因组位置的泛基因组视图。一条直线对应1M-bin区域。(B)只有唯一整合、至少一种亚克隆整合或至少一种克隆整合的非肿瘤组织和肿瘤的比例2测试)。(C)每个细胞的HBV拷贝数与HBV整合断点数之间的相关性(Pearson’s Correlation)。(D)每个样本的HBV整合断点数(Wilcoxon符号秩检验)。(E)肿瘤和非肿瘤样本中HBV基因组中HBV整合断点的定位，根据整合序列的方向。(F)每个样本HBV基因组的结构变异数(Wilcoxon符号秩检验)。(G)非肿瘤和肿瘤样本中含有复制型HBV DNA、片段型非复制型HBV DNA和无片段型HBV的比例(χ2测试)。中心,着丝粒;SV，结构变体;telo,端粒。

    HBV在肿瘤中的复制频率(7%)低于非肿瘤(18%，p<0.001) (图2 g)．此外，对HBV转录本的分析显示，即使在含有病毒集体形式的肿瘤中，来自整合HBV DNA的截断HBx转录本也比完整的转录本占主导，这表明肿瘤中的集体形式只占HBV DNA的一小部分(在线补充图8C,D)．此外，大多数带有克隆HBV整合的肿瘤在S区显示高mRNA表达水平(补充图8E)．最后，通过分析病毒基因组中HBV变异的等位基因频率，在140例中有138例的肿瘤及其相应的非肿瘤肝组织中发现了相同的主要基因型。令人惊讶的是，我们在肿瘤中观察到影响HBeAg产生(A1762T和G1764A BCP变异，G1896A PC变异)和抗病毒耐药相关突变(RT区)的HBV变异的阴性选择，这表明HBV序列变异的出现旨在提高病毒适应度，但对肿瘤的发展没有特定的优势(在线补充图8F)．总之，这些结果表明，HBV在非肿瘤和肿瘤肝组织中的整合可能反映了不同的病毒动态和选择过程，没有直接相关。

    人类染色体重排经常被HBV整合所划分

    从121例HCC的捕获、WES或WGS测序中确定的504个克隆整合中，179个事件(36%)精确匹配人类基因组中染色体拷贝数改变(CNA)的边界，显示病毒插入事件和染色体结构重排之间的直接关系(图3一)．克隆选择了与cna相关的整合，这表明这些特定的改变被积极选择并构成了癌症驱动事件(图3一)．事实上，在>10样本中观察到三种主要的带有HBV整合的CNA类型:(1)染色体17p的大量缺失，包括TP53(15个肿瘤)和经常与着丝粒插入相关(8/15)，(2)局灶性增益叔5p(14个肿瘤)和(3)8q染色体上的大量增加包括MYC(13个肿瘤)和与着丝粒插入相关的(4/13)(图3 b；参见示例#1733T和#1597T图3 c, D)．

    HBV integrations induce chromosomal rearrangements and distant driver oncogenic alterations. (A) Proportion of HBV integration breakpoints (n=1436) associated with a copy number alteration (CNA) in 121 HBV-positive tumours (χ2 test). (B) Pan-genomic view of the number of HBV integration breakpoints according to their association with a CNA, split by chromosome arms. The three genomic regions containing the higher number of HBV integrations associated with CNA are annotated. Fisher’s exact tests were performed to compare the number of integrations with or without CNA and p-values were adjusted for multiple testing. (C) Translocation-like event in tumour #1733T: HBV integration is associated with a focal gain on chr5p and a large deletion on chr17p. (D) Duplication-inverted-like event in tumour #1597T, reconstructed with long-read sequencing: HBV integration is associated with a focal amplification including TERT.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    HBV整合诱导染色体重排和远程驱动致癌改变。(A) 121例HBV阳性肿瘤中与拷贝数改变(CNA)相关的HBV整合断点(n=1436)的比例(χ2测试)。(B)根据与CNA的关联，按染色体臂划分的HBV整合断点数量的泛基因组观点。包含与CNA相关的高数量HBV整合的三个基因组区域被注释了。进行Fisher确切检验以比较有或没有CNA的积分次数，并调整p值以进行多次检验。(C)肿瘤#1733T易位样事件:HBV整合与chr5p上的局灶性增加和chr17p上的大量缺失相关。(D)肿瘤#1597T中复制倒置样事件，用长读测序重建:HBV整合与局灶扩增相关，包括叔．

    为了研究整合和染色体改变是如何相关的，我们分析了三个选定的病例，使用长读测序(PacBio)和Bionano绘图来生成基因组组装，并在更大的尺度上研究重排。在#1151T号肿瘤中，我们在第8q号染色体上发现了两个不同的HBV整合，连同整个人类基因组的复制，导致了57 Mb的8个拷贝扩增，包括MYC致癌基因。我们重建了两个不同的整合事件:(1)HBV整合导致染色体间t(8q21;17p11)易位，导致一个大的17p缺失;(2)HBV整合位于8q中心区，与一个可能反映同染色体iso(8q)的复制倒置事件相邻。在线补充图9A)．肿瘤#1597T (图3 d)，我们确定了一个叔与多个结构变异相关的8个拷贝扩增，包括位于染色体1q中的两个HBV整合(在线补充图9B)．

    令人惊讶的是，即使合并相关重排的HCC在其基因组中HBV合并和CNA数量显著增加，这两个特征并不相关(在线补充图10A)，这意味着只有一小部分病毒整合与染色体重排有关，特别是位于中心点或端粒区域的整合。有趣的是，在非洲裔的年轻患者中，着丝粒整合丰富(在线补充图10B）;端粒HBV整合通常直接发生或接近端粒重复(如#4229T和#4268T in)在线补充图10C)并在有HBV复制的肿瘤和大量的CNA中富集(在线补充图10A)．正如在肿瘤#1994T中使用Bionano测序所示，端粒HBV整合可以支持另一条染色体末端的一个大染色体区域的易位(在线补充图10D)．总体而言，在肿瘤中发现的41%的克隆HBV整合与人类基因组的大规模重排有关，其中48%与CNA有关。在功能上，整合相关的重排经常改变癌症驱动基因，或与复发相关的距离TP53或MYC改变，或局部与叔改变。

    HBV基因组可以整合在癌症驱动基因中独联体激活的后果

    在肿瘤中，与非肿瘤组织相比，HBV整合在人类基因组中遵循不同的分布，且HBV拷贝数/细胞与克隆事件的数量相关(图2一个；图4一)．这些克隆插入在癌症驱动基因周围富集，表明包含这些事件的细胞有很强的功能选择(在线补充图11A)．然而，在229个基因附近(±25 kb)存在克隆整合的基因中，只有3个基因在2个以上的HCC中反复出现:叔(n = 48),CCNE1(n = 4),KMT2B(n = 3)。另外四个基因在两个样本中有HBV整合:AHRR，NRG1，TRIM16L而且ST18（图2一个；在线补充表4)．35

    HBV integrations in the TERT promoter induce a strong activation of TERT promoting hepatocellular carcinoma (HCC) development. (A) HBV copy number/cell in 177 tumours from the capture series according to their number of clonal HBV integration breakpoints (Jonckheere’s trend test). (B) Integrated HBV sequences located in the TERT promoter in 48 tumours harbouring clonal HBV integrations at this locus. The position of the breakpoints, of the viral enhancer regions and the orientation of the integrated sequences are annotated along the HBV genome. mRNA expression (-ddCT) from qRT-PCR data are represented above. (C) The impact of HBV integration in the TERT promoter was evaluated using promoter luciferase assays in Huh7 liver cell lines. Constructs of TERT promoter containing different HBV-integrated sequences with or without scrambled enhancer regions were compared with the WT promoter and to the TERT promoter with mutations at the −124 or −146 hotspots. Error bars correspond to SD of three independent transfections for each plasmid (Student’s t-test). (D) Molecular profile of 121 HBV-positive tumours with alterations in 14 HCC-associated genes (HBV integration, SV/CNA or mutation), according to clinical and other molecular features. mRNA expression of TERT, EPCAM and MKI67 were obtained from RNA-seq. AFB1, aflatoxin B1; Enh, enhancer; CNA, copy number alteration; SV, structural variant; WT, wild type; ns, not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    HBV整合叔启动子诱导强激活叔促进肝细胞癌的发展。(A)根据克隆HBV整合断点的数量(Jonckheere趋势检验)，从捕获序列中提取177个肿瘤的HBV拷贝数/细胞。(B)整合HBV序列位于叔在48个肿瘤中发现了该位点的克隆HBV整合启动子。断点的位置，病毒增强子区域和整合序列的方向是沿着HBV基因组注释的。qRT-PCR数据中的mRNA表达(-ddCT)见上图。(C) HBV整合的影响叔在Huh7肝细胞系中使用启动子荧光素酶分析评估启动子。构造的叔将包含不同hbv整合序列的启动子与WT启动子和叔−124或−146热点突变的启动子。误差条对应于每个质粒的三次独立转染的SD(学生t检验)。(D) 121例14个hcc相关基因(HBV整合、SV/CNA或突变)改变的HBV阳性肿瘤的分子谱，根据临床和其他分子特征。mRNA表达叔，EPCAM而且MKI67均从RNA-seq中获得。AFB1，黄曲霉毒素B1;掺剂;CNA，拷贝号变更;SV，结构变体;WT，野生型;Ns，不显著。

    所有HBV整合在叔基因座位于启动子区或5 '非翻译区(图4 b；在线补充图11B)．大多数启动子的整合都是相同的5 ' >3 '方向，并包含两个病毒增强子区域(48个中的35个)。增加mRNA叔病毒整合位于更靠近叔ATG (<800 bp)，但与插入序列的方向无关(图4 b，在线补充图11C)．此外，与启动子突变相比，HBV插入在- 124和- 146热点和无病毒插入的结构变异诱导CNA的过表达更高(在线补充图11D)．造型叔荧光素酶报告载体肿瘤#3885T中发现启动子整合(在线补充图11E,F)，我们证实了这一点叔激活是由两种病毒增强子引起的，增强子1比增强子2提供更强的激活(图4 c)．HBV插入叔启动子仅存在于同一区域的突变或结构变异中，且在每细胞HBV拷贝数较高(p<0.001)的肿瘤中更为频繁，该肿瘤由更多的HBV克隆插入(p<0.001)和更多的HBV复制(p=0.01;图4 d)．

    我们先前描述了两个肿瘤与HBV插入CCNE1或CCNA2基因是同种HCC (CCN-HCC)的一部分，其特征是由应激复制诱导的特定染色体重排(模板插入周期)。19我们在的启动子中发现了另外三个HBV整合CCNE1使用病毒捕获和RNA-seq显示明显的正常过表达CCNE1成绩单(在线补充图12A、B)．三个KMT2B外显子3-6之间的整合也被发现，它通过替代剪接或内含子保留来增加mRNA表达并改变转录本结构(在线补充图12A、C)．总的来说,叔非增殖性肿瘤中启动子整合丰富(p=0.007;图4 d)．相比之下，肿瘤的HBV整合CCNE1，CCNA2或KMT2B非肝硬化患者(5/8)，非洲或亚洲血统(6/8)，属于增殖型HCC，与G1相关(对于KMT2B-整合型HCC)或G3(用于CCN-HCC)转录组亚组。有趣的是，CCN-HCC显示叔启动子的改变KMT2B-整合型HCC未见表现叔启动子或任何其他驱动基因的改变，表明不同的致癌过程(图4 d)．

    临床特征、HBV和人类基因组改变的综合分析

    为了整合肿瘤中发现的所有基因组改变，我们分析了130例hbv阳性HCC亚组与135例在WGS或WES和RNA-seq中测序的hbv阴性肿瘤的比较19 34(见在线补充表1有关该系列的描述)。HBV HCC患者年龄较轻，非洲或亚洲血统较多，并表现出特定的辅助因素:HDV感染或致癌物暴露特征(图5一个，第一列)。事实上，两个零星突变特征22和24，分别是酸性马兜铃酸(AA)和黄曲霉毒素B1 (AFB1)暴露的特征，在hbv阳性患者中更为频繁。转录组学和基因组学分析显示HBV感染与G3转录组类之间的联系更为频繁TP53突变和更少CTNNB1肿瘤突变。

    Integrative analysis reveals that a high number of HBV integrations is associated with poor survival of patients. (A) Mosaic plot: association of HBV infection with patient, tumour and viral characteristics in a series of 265 HCC (next-generation sequencing series) and association of geographic origin, aflatoxin B1 exposure, HDV infection, hepatitis B surface antigen (HBsAg) negativity or number of HBV integrations with patient, tumour and viral characteristics in a series of 177 HBV-positive HCC (capture series). Blue and red circles indicate negative and positive associations, respectively. Colour intensities represent different levels of statistical significance. Statistical analysis was performed using χ2 test, Wilcoxon signed-rank test or Pearson’s correlation with respect to the type of variable. (B) Kaplan-Meier curves for 5-year overall survival from 119 patients after curative R0 resection. (C) Multivariate Cox regression model for overall survival analysis. AA, aristolochic acid. *p<0.05; **p<0.01.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    综合分析显示，HBV整合率高与患者生存期差相关。(A)马赛克图:265例HCC中HBV感染与患者、肿瘤和病毒特征的相关性(下一代测序系列)，以及177例HBV阳性HCC中地理来源、黄曲霉毒素B1暴露、HDV感染、乙肝表面抗原(HBsAg)阴性或HBV与患者、肿瘤和病毒特征的整合数量的相关性(捕获系列)。蓝色和红色的圆圈分别表示消极和积极的联系。颜色强度代表不同的统计显著性水平。用χ2检验、Wilcoxon符号秩检验或Pearson与变量类型的相关性。(B) 119例治愈性R0切除术后5年总生存期的Kaplan-Meier曲线。(C)综合生存分析的多元Cox回归模型。AA，马兜铃酸。* p < 0.05;* * p < 0.01。

    此外，在捕获分析的177名hbv阳性患者中，有60名来自非洲;他们更年轻，在HCC中频繁出现afb1突变特征，其特征是高表达的祖标记，如EPCAM（图5一个)．除HBV基因型外，肿瘤中未发现特异性病毒特征与患者的地理来源显著相关。在有辅助因素的患者中，而AFB1暴露与TP53R249S突变，HBV/ hdv相关的HCC在叔启动子或其他驱动基因。最后，10例HBsAg血清学阴性患者血清中hbvdna阴性，肝脏中hbvdna阳性;他们的肿瘤显示每个细胞的HBV拷贝数和HBV整合的低趋势，这些HCC在G1转录组组中富集。值得注意的是，这些hcc中有两例有HBV克隆整合叔启动子(#4229T和#4265T)。

    具有大量HBV整合的肿瘤与不良预后相关，独立于其他特征，如肿瘤大小、微血管浸润、分化状态和转录组组(图5 b-5c；在线补充表5)．肿瘤中高数量的整合和生存率差之间的这种联系独立于HBV感染的其他特征。有趣的是，这些患者明显更年轻，肿瘤中含有高比例的HBV整合，影响癌症驱动基因，如叔(p=0.02)通过插入启动子，TP53(p < 0.001)MYC(p=0.03)通过hbv相关的CNA (图5一个)．

    讨论

    这项研究对主要来自欧洲和非洲的一大批患者的非肿瘤和肿瘤肝组织中的HBV基因组进行了综合分析。一方面，非肿瘤组织中的HBV整合反映了肝组织中活跃的病毒复制和肝细胞的扩张，炎症相关基因表达较低。另一方面，肿瘤中的hbv整合序列强调了具有hbv相关结构重排或插入突变作为驱动改变的细胞的功能选择。

    我们基于病毒捕获结合冷冻组织上的WGS和WES对HBV整合进行识别的方法，能够基于其克隆性对整合进行特征描述，用定量方法将检测到的事件精确定义为“克隆”、“亚克隆”或“唯一”。与之前的研究相比，根据癌发生过程中克隆细胞的扩展和功能基因组改变的选择，在这里，与非肿瘤肝组织相比，在肿瘤中发现了更多的克隆HBV插入。14 15 21 36在同一行中，我们观察到简单重复序列中HBV整合的重要富集，这表明在病毒捕获中精确过滤检测到的插入事件以去除重复的重要性。因此，我们的研究基于对HBV整合的高度自信描述，提供了肝组织整合过程的全面视角。

    在非肿瘤肝脏中，我们证实整合事件在染色质开放的人类基因组区域发生得更频繁，21日37部分由微同源介导的末端连接引起。15 38 39更重要的是，病毒复制与反映感染细胞数量增加或单个细胞内多步骤整合过程的整合数量有关。这两种假说可能同时发生在肝脏中。最近的一项体外研究13表明感染后第一周内的整合率不受复制抑制的影响，这表明大部分的整合事件发生在最初的感染。然而，所有基于ngs的研究，包括我们的研究，都确认了在一些细胞克隆中存在几个克隆整合。因此，多个HBV整合必须在单个细胞中以较低的速率积累，由活跃的复制促进。

    在正常肝脏的肝细胞内，HBV整合的数量可能会随着时间的推移而增加，因为体内和体外研究表明，HBV整合发生在感染后的早期，13 40 41大多数事件可以被认为是乘客。然而，克隆整合的存在(即，存在于给定冷冻样本的所有细胞中)反映了肝细胞的扩张，这一过程似乎在非肿瘤组织和肿瘤中不同。在非肿瘤组织中，这可能是由慢性炎症诱导的选择性压力和肝脏中肝硬化结节的出现所解释的，但这一过程似乎独立于整合和病毒复制，正如已经提出的那样。42-44事实上，在我们的研究中，这些组织中的克隆整合并不会导致功能上的后果，而是位于整合反复针对的区域(大的，高表达的基因)，并且与病毒复制无关。然而，由于含有克隆整合的非肿瘤组织显示炎症反应相关基因的下调，这表明一些具有逃避免疫抗病毒反应的选择性优势的肝细胞可能发生积极增殖并获得对恶性转化的保护特征。

    尽管大多数HBV整合是过客事件，没有任何功能后果，但有些可能是驱动因素，并促进肝硬化或非肝硬化肝的HCC起始。虽然在之前的研究中整合已经与CNA相关，14 45 46我们首次发现了HCC中与病毒插入相关的周期性结构重排。通过通常位于中心点或端粒区域的整合，HBV参与了大量复杂的结构重排，经常诱导chr8q(包括MYC和chr5p(包括叔位点)和chr17p的损失(包括TP53轨迹)。因此，在具有整合相关重排的肿瘤中，HBV整合与位于远处的癌症驱动基因的改变有关。当HBV DNA整合发生在双链断裂时，23日47hbv整合序列划分CNA的存在可能是机会机制的结果。然而，我们的数据显示，肿瘤中HBV整合的数量与CNA之间没有相关性;它强调了由于整合相关重排导致的特定改变在促进肝细胞选择和HCC发展中的作用。

    HBV整合也可能通过插入突变改变病毒整合序列中最接近的基因来促进致癌。我们的研究证实叔启动子是HCC中主要的HBV整合热点，三分之一的HBV相关HCC在该热点存在克隆整合。在这些肿瘤中，强烈激活叔是由于病毒增强剂的存在，正如已经报道的那样，16 48在ATG起始密码子附近，并以方向无关的方式。此外，HBV整合CCNA2或CCNE1我们小组之前的一项研究已经对基因进行了研究。19hbv整合序列可以直接改变蛋白质的结构CCNA2)或由于增强子序列而诱导强过表达(forCCNE1)．这两个基因之一的改变可诱导强增殖、复制应激和直接促进非肝硬化肝(CCN-HCC)上特定亚群HCC肿瘤发展的重排特征。最后，即使需要进一步的研究来完全了解功能后果，肿瘤与HBV整合KMT2B也主要发生在前体标记高表达的非肝硬化肝脏上，提示hbv整合序列诱导的另一种强烈的直接机制。

    总的来说，这项研究强调了除了其他辅助因素外，肝癌发生过程中HBV整合、HBV复制和染色体不稳定性之间相互作用的复杂性。一方面，黄曲霉毒素B1暴露(主要存在于非洲)可能通过直接引发hbv相关HCC的发展TP53R249S突变。49另一方面，HDV感染限制了HBV的复制50病毒整合加速了年轻患者的慢性炎症和纤维化。重要的是，我们的系列研究表明，肿瘤中HBV整合的数量是病毒特征中与不良预后相关的唯一标记。

    综上所述，与HBV整合相关的结构重排是一种通过远距离改变癌驱动基因来驱动致癌的机制，不同于独联体-激活插入突变。这强调了hbv相关HCC的异质性，以及分子特征对确定新的特异性治疗机会的重要性。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。本文报道的LICA-FR队列测序数据已存入欧洲基因组-phenome Archive (EGA)数据库(RNA-seq fastq files accessions (EGAS00001001284)， (EGAS00001002879)， (EGAS00001003310)， (EGAS00001003837)和(EGAS00001004629);WES bam文件访问(EGAS00001000217)， (EGAS00001001002)， (EGAS00001003063)， (EGAS00001003130)， (EGAS00001003837)和(EGAS00001004629);通过国际癌症基因组联盟(ICGC)数据访问委员会，WGS bam文件访问(EGAS00001000706)、(EGAS00001002408)、(EGAS00001002888)、(EGAS00001003063)、(EGAS00001003837)和(EGAS00001004629)。资料可于以下网址重复使用及查阅:https://ega-archive.org/studies/EGASxxx持有ICGC数据访问合规办公室的访问权限。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    该研究得到了机构审查委员会(IRB)委员会的批准。

    致谢

    作者要感谢居里研究所的Alain Nicolas、Sylvain Baulande和Sonia Lameiras在分析PacBio结果和设置病毒捕获方面的帮助。作者感谢Quentin Bayard和Karl Hong在分析Bionano测序结果方面的帮助。作者也要感谢Gabrielle Couchy, Iadh Mami, Bénédicte Noblet, Massih Ningarhari, Jill Pilet和Jie Yang在分子生物学实验中的帮助。

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

    脚注

    • 推特@Zucmanrossi

    • 贡献者JZ-R构思并指导了这项研究。CP和JZ-R设计了研究并撰写了手稿。CP和TLB进行实验。CP、SI、TZH、SC、EL和JZ-R对数据进行了分析和解释。JC、VP、J-FB、J-CN和GA提供了必要的生物资源并收集了临床数据。所有作者都批准了最终稿，并对其知识背景进行了批判性修改。

    • 资金这项工作得到了ANRS(法国国家艾滋病和病毒性肝炎研究机构)的支持。该组织得到了法国国家抗癌法(Equipe Labellisée)、Labex肿瘤免疫学(investissement d 'avenir)、IREB拨款、贝当古-舒勒医学基金会、SIRIC CARPEM、罗森医学基金会、巴黎抗癌法Comité (prix René et André Duquesne)和基金会Mérieux的支持。该项目得到了ANRS(法国国家艾滋病和病毒性肝炎研究机构)的奖学金支持。TLB得到了来自IUH的“Attractivite IDEX”奖学金的支持，TZH得到了来自Cancéropole Ile de France和百时美施贵宝企业基金会的奖学金，SC得到了CARPEM和Labex肿瘤免疫学的支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。