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肝脏病学
原始研究
HCV全基因组分析用于开发高效培养系统和揭示基因4型抗病毒耐药性
  1. 长诉范教授1，
  2. 马丁·彼得森休乌1，2，
  3. Ulrik Fahnøe1，
  4. Carlota Fernandez-Antunez1，
  5. 达里尔·休谟1，
  6. 克里斯蒂安同步信道ø远2，3.，
  7. Santseharay拉米雷斯1，
  8. Jens Bukh1
  1. 1哥本哈根丙型肝炎方案(CO-HEP)，传染病科，赫维德沃医院和免疫和微生物科，哥本哈根大学卫生和医学科学学院，哥本哈根、丹麦
  2. 2Hvidovre医院临床微生物科，Hvidovre、丹麦
  3. 3.健康与医学科学学院临床医学系，哥本哈根大学，哥本哈根、丹麦
  1. 对应到Jens Bukh教授，Hvidovre医院传染病科，Kettegård Alle 30, DK-2650，丹麦Hvidovre;jbukh在{}sund.ku.dk

摘要

客观的hcv基因4型感染是中东/非洲肝脏疾病的一个主要原因，某些亚型与直接作用抗病毒(DAA)治疗失败的风险增加有关。我们的目标是开发感染性基因型4细胞培养系统，以了解抗病毒耐药性的进化遗传景观，这有助于保存基于daa的治疗的未来疗效。

设计在肝源性细胞中检测HCV重组体。与DAAs长期共培养可诱导抗病毒耐药表型。整个hcv编码序列的下一代测序(NGS)确定了突变网络。利用逆向遗传学研究了抗性相关取代(RAS)。

结果利用ED43(Core-NS5A)/ jfh1 -嵌合病毒中识别的取代物结合选定的ns5b变化，在Huh7.5细胞中适应了体内感染性ED43(4a)克隆。NGS和连锁分析允许识别在培养适应过程中出现的多个遗传分支，其中一个分支有31个替换，导致强大的复制/繁殖。用9个临床相关蛋白酶daa、NS5A-DAA和NS5B-DAA治疗培养适应的ED43会导致药物靶向特异性RAS的复杂动力学，并伴有全基因组替代的共选择。批准的DAA组合对原始病毒有效，但对相应药物靶点的RAS变体无效。然而，使用glecaprevir/pibrentasvir再治疗对NS5A抑制剂和sofosbuvir耐药变体仍然有效。带有NS3-156、NS5A-28、30、31和93位点和NS5B-282位点特异性RAS的重组体是可行的，但NS3-A156M和NS5A-L30Δ位点(缺失)导致表型减弱。

结论迅速出现的复杂突变进化景观定义了HCV-RASs的持久性，赋予耐药性水平，导致基因4型的治疗失败。glecaprevir/pibrentasvir的高耐药屏障可以防止抗病毒耐药性的持续和传播。

  • 丙肝病毒
  • 耐药性
  • 丙型肝炎
  • 基因型

数据可用性声明

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http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323585

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    本研究的意义

    关于这个主题我们已经知道了什么?

    • HCV基因4型在中东和非洲高度流行，特别是在埃及。

    • 直接作用抗病毒药物(DAAs)对基因型4有效，但一般治疗失败，涉及特定亚型的报道。

    • 与其他基因型相比，RAS NS5B-S282T在基因4型感染患者中更常见。

    • 低收入国家的再治疗具有挑战性，因此，确定最佳一线疗法非常重要。

    • 缺乏有效的传染性HCV基因4型细胞培养系统，这对抗病毒耐药性的研究提出了挑战。

    新的发现是什么?

    • 一株体内传染性HCV基因型4a克隆(菌株ED43)适应于细胞培养中高效复制和繁殖。

    • 基于下一代测序的单倍型重建显示，在DAA治疗过程中，药物靶点出现了复杂的耐药相关取代(RASs)进化网络，并伴有全基因组取代的协同选择。

    • 基线NS5A耐药在治疗失败中起核心作用。

    • 使用glecaprevir/pibrentasvir再治疗对基线NS5A抑制剂和sofosbuvir耐药的病毒仍然有效。

    • 我们在培养中观察到基因4型NS5B-S282T RAS的持久性。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的研究对细胞培养中DAAs耐药的ras出现的进化景观提供了独特的概述，这为避免daa耐药变异的出现和传播的策略提供了有价值的信息，以预防未来临床治疗失败。

    • 高效的基因型4a感染系统为候选疫苗的开发和测试提供了一个关键工具，这是在全球范围内消除HCV的一个关键干预措施。

    简介

    丙肝病毒感染仍然是一个重要的健康威胁，每年有7100万慢性感染者，导致40万人死亡。使用靶向病毒非结构蛋白酶(NS3P)、NS5A和ns5b聚合酶的直接作用抗病毒药物(DAA)将治愈率提高到90%。1然而，抗性相关取代(RAS)的出现1 2降低DAA方案的疗效。3 4治疗失败已被广泛报道，而且随着患者在世界范围内接受治疗，这种情况还将增加。1

    HCV表现出广泛的遗传多样性，有8个主要基因型和>90个亚型。5 - 7基因4型占全世界感染病例的约8%，在中东、北非和中非占主要地位。5特别是，埃及500万HCV感染者中约93%是由基因4型引起的。5这种基因型是高度异质性的，>18可识别的亚型。5 6 8此外，由于人类移民以及静脉注射吸毒者和高危性行为者之间传播的增加，基因4型目前在欧洲的流行率正在上升。54a亚型很常见，特别是在埃及，原型4a菌株ED43的起源。5 9 10

    已批准的DAA方案对基因型4非常有效。11 - 13然而，在基因4型感染患者的亚群中，已有和紧急的RASs的治疗失败率很高。14-19仅在埃及，约240万患者接受了DAAs治疗，特别是各种NS5A抑制剂与聚合酶抑制剂sofosbuvir的联合治疗。20.尽管持续病毒学应答(SVR)率为90%，但仍有治疗失败的报道。18抗病毒药物耐药性不一定会改变目前的治疗指南，但它可能会影响未来的治疗选择。尽管daa耐药发生率较低，但同一分子类药物之间广泛的交叉耐药可能限制未来的治疗选择，特别是在没有开发额外的抗病毒药物用于治疗HCV的情况下。因此，了解daa病毒耐药性的新知识对于防止未来的治疗失败和避免耐daa病毒的出现和向高度暴露人群传播非常重要。这项工作将需要详细了解ras产生的机制。

    此外，预防丙型肝炎疫苗对于预防全球传播至关重要。代表主要HCV基因型的高效感染细胞培养系统可以在候选疫苗的开发和测试中发挥重要作用。基于灭活全病毒颗粒的候选疫苗依赖于细胞培养中病毒的高效生产，而对于HCV来说，这只能在病毒适应后才能实现，因此，了解这一过程是产生相关候选疫苗的基础。此外，评估疫苗诱导广泛的跨基因型中和抗体的能力需要建立代表HCV遗传异质性的培养系统，在这里感染全长系统是最相关的，因为它们概括了整个病毒生命周期。研讨会

    经过复杂的适应过程，筛选出基因型1a、2a、2b、3a和6a的菌株，建立了高效的全长感染培养体系。3 4 - 28对于基因型4，最近报道了一个完整的细胞培养系统，但在Huh7.5细胞中繁殖有限，29因此，大多数病毒生命周期、抗病毒药物和疫苗开发的研究仍然需要高滴度体系。本研究旨在为HCV基因4a型开发一个强大且高效(高感染滴度)的全长感染系统，从而深入分析DAA耐药出现的进化网络，并评估临床相关DAA方案的有效性和耐药屏障。

    材料和方法

    HCV基因4a型克隆的构建

    报道了体内感染株ED43的克隆。10将ED43 5'UTR - ns5a重组蛋白的5'UTR替换，生成ED43 Core-NS5A (C5A)和JFH1-NS5B及非翻译区(utr)组成的嵌合基因组30.与相应的JFH1序列。突变采用QuikChange位点定向突变试剂盒(Agilent)或融合PCR引入。最终质粒制备的HCV序列经Sanger测序(Macrogen)确认。核苷酸和氨基酸(aa)号为ED43全长重组序列。

    培养病毒的生产和分析

    用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher)将RNA转录本转染到Huh7.5细胞中，检测HCV重组体的活力。26细胞每2-3天传代一次，按照描述进行病毒传代。3.收集的细胞球以2000 rpm离心5分钟，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2-3次(Sigma-Aldrich)，储存在1 mL Trizol (ThermoFisher)中。感染滴度测定在三个重复和报告作为日志10每毫升焦距形成单位(log10洁净/毫升)。24

    回收病毒的基因组分析

    下一代测序(NGS)按照描述进行。3 33节简单地说，提取RNA，进行逆转录(RT)-PCR，以获得完整的HCV开放阅读框(ORF)扩增子。33RT使用引物5 ' -CTAAGGTCGGAGTGTTAAGC-3 '， PCR使用引物5 ' -TGCCTGATAGGGTGCTTGCG-3 '和5 ' -AGGTCGGAGTGTTAAGCTGCC-3 '。PCR扩增物用NEBNext Ultra II FS DNA文库准备试剂盒(New England Biolabs)处理。为了覆盖NS3P、NS5A结构域I或NS5B-palm结构域(高达167 aa)，我们进行了大小选择。测序由Illumina Miseq使用500 cycles v2试剂盒进行。数据分析单核苷酸多态性(SNP)。31日32对编码频率≥2%的snp进行LinkGE连锁分析。31日32用GraphPad Prism版本6重建和绘制单倍型。

    对于ORF分析，连锁和单倍型重构不能应用于一个读对。因此，我们使用了SNP变异随时间的频率发展。对于特定的样本，PCR扩增子被亚克隆到TOPO-XL2载体(ThemoFisher)，允许ORF连锁分析。桑格对每个克隆进行测序，并对其进行排列，以建立系统发育和祖先重建。31

    对于ED43(C5A)重组体，用桑格法分析回收的病毒。3.对于病毒5'UTR序列，我们在培养上清上使用5'RACE程序。3 26PCR产物由Sanger进行分析。3.

    病毒贮存和治疗化验

    抑制剂(Acme Bioscience)在二甲基亚砜中稀释。34 27 34使用ED43-20m的第5、7和10通道进行逃逸和治疗试验(图1 a, B)，而不是最终的ED43cc病毒，以优化不同实验的时间。RAS的反基因检测使用了ED43-31m/+A1973T/-Q2931R(命名为ED43-31m_opt)重组蛋白(图1一个)．

    Full-length HCV genotype 4a infectious cell-culture system. (A) Schematic overview of the culture adaptation process of strain ED43. Substitutions introduced into the full-length recombinant ED43-20m are shown in black. Adaptive substitutions identified during passage of the ED43-20m virus are indicated by colours from panels B and C. (B) HCV infectivity (bars) determined by FFU assays and shown by mean of triplicates±SEM (left y-axis; break indicates the cut-off of the assay), and emergence of substitutions for ED43-20m (lines) during adaptation following transfection (T; samples not available from days 0 to 27) and serial passages (P1, 2, 3, etc.). Only substitutions with SNP frequencies >20% at any time-point are shown (right y-axis). For substitutions that emerged with similar patterns, means±SEM are shown. The substitutions with similar SNP frequencies are grouped and shown with the same colour. (C) Clonal ORF sequence analysis of ED43-20m virus obtained from the 6th and 10th passages; phylogeny was generated as described.31 Subsequently, ancestral reconstruction was performed based on alignment and phylogeny to predict the appearance of respective substitutions. Only substitutions indicated in (B) are shown. (D,E) Infectivity titres (y-axis) of specific ED43 recombinant viruses at indicated days (x-axis) after transfection of Huh7.5 cells. J6/JFH1 was included as a control. #The data were obtained from a separate experiment with similar J6/JFH1 titres. Statistical significance (p<0001, two-way ANOVA) is carried out for indicated samples and shown with asterisks (***). ANOVA, analysis of variance; FFU, focus-forming unit; ORF, open reading frame; SNP, single nucleotide polymorphism; SEM, standard error of the mean.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    全长HCV基因4a型感染细胞培养系统。(A)菌株ED43的培养适应过程示意图。在全长重组基因ED43-20m中引入的替换用黑色表示。在ED43-20m病毒传代过程中发现的适应性替换用面板B和c的颜色表示。(B)通过FFU测定的HCV传染性(bar)，用三倍率±SEM表示(左y轴;break表示检测的终止)，以及在转染后的适应过程中出现ED43-20m(系)的替换(T;从0天到27天没有样本)和连续通道(P1, 2, 3等)。仅显示任何时间点SNP频率>20%的替换(右y轴)。对于以相似模式出现的替换，表示均值±SEM。SNP频率相似的替换被分组，并用相同的颜色显示。(C) ED43-20m病毒第6代和第10代克隆ORF序列分析; phylogeny was generated as described.31随后，根据排列和系统发育进行祖先重建，预测各自取代的出现。只列出了(B)中所示的替换。(D,E)转染Huh7.5细胞后，特异性ED43重组病毒在指定天数内的感染滴度(y轴)(x轴)。J6/JFH1作为对照。＃数据来自与J6/JFH1滴定相似的单独实验。统计显著性(p<0001，双向方差分析)采用星号(***)表示。方差分析，方差分析;洁净,focus-forming单位;ORF，开放式阅读架;SNP，单核苷酸多态性;SEM，均值的标准误差。

    Substitution networks emerging in NS5A domain I under treatments with NS5A inhibitors. (A–E) ED43 full-length cultures were treated with ombitasvir (A), elbasvir (B), ledipasvir (C), velpatasvir (D) and pibrentasvir (E). (A–C): Inhibitor concentration: 100x-EC50. (D) Initial concentration: 10x-EC50; increased to 100x-EC50 at day 28. (E) Treatment initiated at 5x-EC50, then increased to 10x- and 100x-EC50 at days 33 and 40, respectively. (F) Efficacy of pibrentasvir against ED43 full-length DAA escape viruses. Values are means of triplicates±SEM. (G) EC50 values and 95% CI of indicated escape viruses were calculated from data shown in (F) and online supplemental figure 6. (H) Fitness of ED43 recombinant viruses harbouring NS5A RASs. #The data were obtained from the experiment shown in figure 2F. For details, see figure 2 legend. RAS, resistance-associated substitution; SEM, standard error of the mean.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    在NS5A抑制剂的作用下，NS5A结构域I出现了取代网络。(A -E) ED43全长培养物分别用ombitasvir (A)、elbasvir (B)、ledipasvir (C)、velpatasvir (D)和pibrentasvir (E)处理。(A - C):抑制剂浓度:100x-EC50．(D)初始浓度:10x-EC50；增加到100 x-ec50在28天。(E) 5x-EC开始治疗50，然后增加到10x-和100x-EC50分别在第33和40天。(F)吡brentasvir对ED43全长DAA逃逸病毒的疗效。数值为三倍平均数±扫描电镜。(G)电子商务50根据(F)和所示数据计算逃逸病毒的值和95% CI在线补充图6．(H)携带NS5A RASs的ED43重组病毒的适应度。＃数据是从实验中得到的图2 f．有关详细信息,请参见图2传奇。RAS, resistance-associated替换;SEM，均值的标准误差。

    Substitution networks emerging in NS3P domain under protease inhibitor treatments. (A–C) ED43 full-length cultures were treated with protease inhibitors paritaprevir (A), grazoprevir (B) and glecaprevir (C) and analysed by NGS. The percentage of HCV-antigen positive cells was determined by immunostaining (line graph, left y-axis). The distribution of haplotypes (bar graphs, right y-axis) was determined by linkage analysis and indicated by different colours. Treatments were initiated with concentrations equivalent to 8x-EC50, then concentrations were increased to 128x-EC50 at day 16 (paritaprevir), 70 (grazoprevir) and 63 (glecaprevir). Only haplotypes constituting ≥2% of the viral population are shown. Supernatant samples from the last treatment time-points were used for passage. P1 and P2: the first and second passages. (D) Efficacy of glecaprevir against indicated ED43 full-length DAA escape viruses. Values are means of triplicates±SEM. (E) EC50 values and 95% CI of indicated escape viruses were calculated from data shown in (D) and online supplemental figure 4. Fold changes in EC50 values were compared with the original ED43. (F) Fitness of ED43 recombinant virus harbouring NS3P RASs. For details, see figure 1D,E legend. The corresponding drug targets and protein-specific numbers are indicated for RASs. Other substitutions are shown with polyprotein specific numbers. #The data were obtained from a separate experiment with similar titres of the original virus. NGS, next-generation sequencing; RAS, resistance-associated substitution; SEM, standard error of the mean.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    蛋白酶抑制剂处理下NS3P结构域出现替代网络。(A - C) ED43全长培养物分别用蛋白酶抑制剂paritaprevir (A)、grazoprevir (B)和glecaprevir (C)处理，并用NGS分析。用免疫染色法测定hcv抗原阳性细胞的百分比(线图，左y轴)。单倍型的分布(柱状图，右y轴)由连锁分析确定，并用不同颜色表示。处理开始时的浓度相当于8x-EC50，然后浓度增加到128x-EC50第16天(paritaprevir)， 70天(grazoprevir)和63天(glecaprevir)。只有单倍型构成≥2%的病毒种群被显示。最后一个处理时间点的上清样本用于传代。P1和P2:第一和第二段。(D) glecaprevir对ED43全长DAA逃逸病毒的疗效。数值为三倍平均数±扫描电镜。电子商务(E)50逃逸病毒的值和95% CI根据(D)和在线补充图4．EC的折叠变化50值与原始ED43进行比较。(F)携带NS3P RASs的ED43重组病毒的适应度。有关详细信息,请参见图1 d, E传奇。RASs的相应药物靶点和蛋白特异性数量已被标明。其他的取代用多蛋白特异性数字表示。＃这些数据是从一项独立的实验中获得的，实验中原始病毒的滴度相似。门店,下一代测序;RAS, resistance-associated替换;SEM，均值的标准误差。

    Substitution networks emerging in NS5B-palm domain under sofosbuvir treatment. (A) ED43 full-length cultures were treated with sofosbuvir and analysed by NGS. Treatment was initiated with 1x-EC50, then increased to 2x-EC50 at day 9. (B) Efficacy of sofosbuvir against indicated ED43 full-length DAA escape viruses. Values are means of triplicates±SEM. (C) Fitness of ED43 recombinant viruses harbouring RAS NS5B-S282T. For details, see figure 2 legend. NGS, next-generation sequencing; SEM, standard error of the mean.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    在sofosbuvir治疗下，NS5B-palm结构域出现替代网络。(A)用sofosbuvir处理ED43全长培养物，用NGS分析。治疗开始使用1x-EC50，然后增加到2x-EC50一天9。(B) sofosbuvir对ED43全长DAA逃逸病毒的疗效。数值为三倍平均数±扫描电镜。(C)携带RAS NS5B-S282T的ED43重组病毒的适应度。有关详细信息,请参见图2传奇。门店,下一代测序;SEM，均值的标准误差。

    在病毒扩散(≥90% HCV抗原阳性细胞)时开始治疗，在细胞传代培养时每2-3天添加抑制剂。3.对于使用所述方法的浓度-响应测定，3 4 27准备了未处理和单次处理逃逸病毒的库存。为了从逃逸的病毒中制备病毒株，从处理实验中回收的上清液被用于感染naïve Huh7.5细胞，然后在没有抑制剂的情况下培养，直到病毒扩散。病毒株序列经NGS鉴定。半最大有效浓度(EC50)值使用GraphPad Prism版本6计算。

    对于指定DAA浓度的联合处理，使用脱出的备用病毒感染naïve Huh7.5细胞，并跟踪直到病毒扩散。3.在治疗开始时(第0天)收集病毒上清，此后经常收集病毒上清，用NGS确认HCV序列。除非另有说明，病毒治疗28-30天。之后，无药物培养14天3.；如果未检测到HCV抗原阳性细胞，则定义感染已根除。3 4

    结果

    HCV基因4a型全长感染性细胞培养体系的建立

    与大多数HCV原型克隆一样，基因型4a原型菌株ED43 (pED43)的全长克隆在黑猩猩中具有传染性，但在Huh7.5细胞中没有。10因此，我们的目标是识别允许培养这个全长克隆的适应性替换。据报道，JFH1-NS5B在细胞培养中具有很高的复制活性。35 36利用这一点，我们证明了对于不同的基因型，具有基因型特异性的Core-NS5A (C5A)、JFH1-NS5B和jfh1 - utr的重组体的细胞培养适应可以识别出允许复制相应全长基因组的突变。21因此，我们首先出于同样的目的生成了基于jfh1的ED43-C5A重组体。

    Culture-efficient ED43 (C5A)改编重组

    含有或不含A1672S(NS4A)的ED43(C5A)克隆的RNA转录本，用于培养基因型1a、2a和2b菌株，24 - 27日随访30天未发现HCV抗原阳性的Huh7.5细胞。然而，ED43(C5A)-2 m (图1一个)与A1786V(NS4B)，之前用于ED43 5'UTR-NS5A重组的适配，30.A1672S(NS4A)在第52天扩散(4.0 log)10FFU/mL)，并获得5名替补球员(在线补充表1)，添加到ED43(C5A)-2 m。由此产生的ED43(C5A)-7 m在转染后第11天扩散，产生4.1 log10第二通道中的FFU/mL。加上两个之前确定的替换，3 4 25导致ED43(C5A)-9米(图1一个而且在线补充表1)在转染后第6天扩散，产生4.2 log10第二通道FFU/mL (在线补充表1)．

    高滴度-传染性- ed43全长重组体的研究进展

    为了适应pED43，10我们生成了包含9个ED43(C5A)- 9m取代基和6个NS5B取代基的重组体(A499V, Q514R, D559G, Y561F, L574R, C575Y)，之前用于基因型1a, 2a, 2b, 3a和6a的培养适应(图1一个)．21除了这15个改变外，我们还使用了另外的NS5B取代，产生了两种不同的重组体:一种是3个NS5B改变(D128E, D258E和M564V;ED43-18m)或5个NS5B更改(添加K380R和E389T创建ED43-20m) (图1一个)．这些NS5B变化是基于ED43和其他菌株的聚合酶序列的比较分析而选择的。这一分析导致了对ED43中不同的保守残基的识别，我们假设这可能对细胞培养中的病毒活力很重要(在线补充图1A)．转染后，ED43-18m无法存活，但ED43-20m在第41天扩散(2.6 log)10洁净/毫升)。在连续传代过程中，感染滴度增加，达到~5.0 log10第10段FFU/mL (图1 b而且表1)．

    把这个表:
    表1

    ED43重组病毒在培养适应过程中的非同义ORF突变

    为了识别在Huh7.5细胞中ED43-20m序列传代过程中发生的取代，我们使用NGS分析了细胞外病毒rna。以相似模式出现的替换被分组如所示图1 b．L1466M(NS3)和K2597N(NS5B)在第二次传代时出现在80%的>病毒群中(图1 b)．然而，带有这些替换的重组(ED43-22m)的适应度仍然很低，病毒获得了额外的变化(在线补充图2)．因此，我们研究了其他替代模式(图1 b)．如图1B所示，两种不同的病毒种群在文章6中表现出相对相等的流行率。然而，有一个种群在第10段中占了优势。通过进一步分析第6代和第10代病毒(图1 c)，对扩增子TA克隆进行Sanger测序分析。根据系统发育学对克隆进行连锁分析和祖先重建。在所有克隆中均观察到L1466M和K2597N，随后出现了两种不同的病毒群体。有趣的是，我们发现无细胞病毒和细胞相关病毒之间的突变模式相似(图1 b而且在线补充图3)．

    基于ED43-20m适应过程中的进化，我们构建了一个包含除A1973T(NS5A)以外所有显性第10代取代的重组体(图1 a, B)．我们还介绍了F1572L，在ED43(C5A)- 7m恢复病毒中检测到，并在ED43-20m的前5个传代中出现。图1 a, B而且在线补充表1)．由此产生的ED43-31m传播很快，产生约4.3 log10洁净/毫升(图1 a, D)．在第二传代中，我们没有在5%的病毒种群中检测到其他替换(表1)．然而，该病毒的滴度与ED43-20m传代10时观察到的滴度不匹配，因此有进一步优化的空间。

    在最初的20万个取代基中，Q2931R和C2992Y已部分恢复(表1)， R2931Q转染后ED43-31m titt增加(图1 d)．此外，引入A1973T(NS5A)后，ED43-31m的滴度进一步增加(在ED43-20m第10代病毒中检测到，但最初不包括在ED43-31m中)(图1 d)．因此，我们生成了一个包含A1973T和Q2931R反转(ED43-31m/+A1973T/-Q2931R;或ED43-31m_opt)，扩散动力学快，略高，约4.6 log10转染后滴度(FFU/mL)图1 e)．

    最后，我们发现在5'UTR (ED43-31m_opt with 5'UTR G38A)中携带G38A突变的重组基因，命名为ED43cc, GenBank登录:MW531222)，在ED43-20m第10代检测到，产生了与ED43-20m病毒第10代相似的最高滴度，分别为4.7和5.1 log10转染和第二代分别为FFU/mL。我们没有检测到第二传代病毒中5%的病毒群出现额外的替换(表1)．

    总之，我们揭示了HCV培养适应性的独特进化细节，并开发了全长4a重组体，在Huh7.5细胞中稳健繁殖。与公认的ED43克隆相比，ED43cc有32个变化，其中NS3/4A、NS5A和NS5B分别有5、4和13个编码变化(在线补充图1B)．

    HCV进化遗传网络导致基因型4a的daa耐药

    慢性基因型4感染患者推荐的基于daa的治疗方案包括NS3蛋白酶(grazoprevir, paritaprevir和glecaprevir)， NS5A (elbasvir, ledipasvir, ombitasvir, velpatasvir和pibrentasvir)和NS5B聚合酶(sofosbuvir)抑制剂。11日13病毒耐药性出现的进化特征尚未得到很好的描述。HCV基因型4a感染培养系统可以作为一个有价值的模型来探索病毒从DAAs逃逸的决定因素。因此，我们进行了NGS和连锁分析，允许详细调查培养逃逸实验中出现的RASs，并使用反向遗传学检查了整个HCV基因组中假定的适应度补偿取代的进化。3 31 32

    在蛋白酶抑制剂治疗过程中，RASs出现的进化途径

    为了诱导蛋白酶抑制剂(pi)的病毒逃逸，我们使用浓度相当于8xEC的paritaprevir、grazoprevir或glecaprevir对ED43病毒进行了长期治疗5031日32（图2 a - c)．对于paritaprevir, NS3P-D168E在治疗开始后第7天出现，并在第16天病毒逃逸时成为主要RAS。在较高的抑制剂浓度(128xEC50)， D168E的患病率下降，并出现不同的RASs单独或组合。Y56H+D168A在第21天出现频率较低，但在病毒逃逸后占主导地位。逃逸病毒(PAResc)与原始病毒相比，对所有检测的pi表现出交叉耐药性，EC增加了≥64倍50（图2 e；在线补充图4)．然而，含有Y56H+D168A的ED43重组蛋白被高度衰减(图2 f)和工程RASs在第二次无药物传代后恢复(表2)．因此，可能需要补偿性替换来维持这些RASs的稳定性，在逃逸病毒第二次传代期间(图2一个)．治疗期间对完整病毒ORF的NGS分析显示，置换模式复杂(在线补充图5A)．T1566S[NS3-helicase (NS3H)]和K2317T(NS5A)与Y56H/D168A一起出现，提示连锁(在线补充图5A)．此外，Q1552L(NS3H)和V1656M(NS3H)在无药传代中进化，提示在病毒适应度中起作用(在线补充图5A)．

    把这个表:
    表2

    二代培养中重组ED43病毒携带RASs的NGS分析

    同样，我们调查了grazoprevir和glecaprevir治疗下RASs的模式。处理开始后，出现了不同的RASs，包括A156T/V (图2 b, C)．然而，病毒传播直到第53天才发生，即使A156T在第21天出现>50%。病毒逃逸与T156被M156取代有关。grazoprevir (GRAesc)和glecaprevir (GLEesc)逃逸病毒对pi具有高度耐药性，EC中>增加500倍50（图2 d, E；在线补充图4)．然而，ED43重组载体A156T/V/M被高度衰减(图2 f)，转染后A156T/V恢复正常。31A156M保持不变，但病毒获得了额外的编码ORF变化，包括在第二传代(表2)．此外，在抑制剂处理过程中，我们发现了NS3P外复杂的动态取代网络(在线补充图5B,C)．我们在重组A156M病毒中检测到I2841V，在graaesc病毒第二传代中检测到的频率为5%。有趣的是，携带I2841V的A156M重组病毒高效且基因稳定(图2 f而且表2)．

    NS5A抑制剂诱导的进化

    在ombitasvir、elbasvir和ledipasvir治疗下(浓度相当于100xEC50)，导致ED43脱出的主要RASs在第5天出现(图3 a - c)．3.病毒从ombitasvir (OMBesc)、elbasvir (ELBesc)和ledipasvir (LEDesc)逃逸后，RASs产生高水平耐药性(图3 g而且在线补充图6)成为主流(图3 a - c)．主要NS5A RASs L28V (ombitasvir)、L30H+M31V (elbasvir)和L30P+Y93H (ledipasvir)在引入ED43重组体时，没有导致高的适应度损失，并在第二次传代后保持(图3 h而且表2)．

    对于velpatasvir，我们没有观察到100xEC的病毒逃逸50并在10xEC下进行了实验50．L30F+M31V的主要RASs不像ombitasvir、elbasvir和ledipasvir那样迅速获得，表明具有更高的耐药屏障(图3 d)．直到第28天，这些RASs在逃逸病毒中占主导地位。这里，浓度增加到100xEC50，导致病毒种群多样化，与病毒抑制增强相关(图3 d)．L28M+L30F+M31V作为主要人群出现，导致病毒逃逸(VELesc)和对NS5A抑制剂的高耐药水平(pibrentasvir除外)(图3 f, G而且在线补充图6)．ED43 L28M+L30F+M31V重组蛋白在第二次传代(图3 h而且表2)．

    全基因组NGS显示，在逃避ombitasvir、elbasvir、ledipasvir和velpatasvir的病毒中出现了ns5a结构域I外的取代(在线补充图7A-D)．

    Pibrentasvir 10 xec50治疗导致病毒根除。然而,5 xec50治疗导致第33天逃跑(图3 e)．有趣的是，我们主要观察到NS5A RAS L30Δ(删除)(图3 e)，并且在增加浓度(10xEC)时未观察到病毒抑制50和100年xec50)，表明L30Δ具有高抗性。事实上，逃逸病毒(PIBesc)显示出对所有NS5A抑制剂的高水平耐药性(图3 f, G而且在线补充图6)．与其他ns5a - ras相比，ED43-L30Δ重组蛋白被高度衰减，并在第二次传代后获得额外的取代(图3 h；表2)．其中一种取代，T2047I (T75I, ns5a编号)，也在PIBesc的第二次无药传代中发现，增加了L30Δ重组体的适应度(图3 e、H而且在线补充图7E)．

    sofosbuvir诱导的进化

    用sofosbuvir治疗的ED43病毒最初在2xEC时被抑制50但在第77天逃脱了(图4一)．治疗过程中HCV-ORF的NGS分析强调，在单个NS5B-RAS S282T逐渐出现的基础上，有一个复杂的替代补选网络(在线补充图8)，与S282T+V322A (图4一)．有趣的是，S282T+V322A在无药物传代过程中数量增加(图4一)．SOFesc病毒对sofosbuvir (图4 b)．值得注意的是，ED43重组体含有或不含A1309P(NS3H)的S282T，该重组体在S282T (在线补充图8)，身体相对健康(图4 c)和连续两次无药传代后S282T维持(表2)．

    临床相关DAA组合对基因4a型的疗效

    推荐的DAA组合包括paritaprevir/ombitasvir、grazoprevir/elbasvir、ledipasvir/sofosbuvir、velpatasvir/sofosbuvir和glecaprevir/pibrentasvir。11日13这些方案有效地抑制原始ED43病毒(图5和6)．LED(5xEC)处理除外501) / SOF (xec50)，我们持续检测到hcv阳性细胞，原始病毒在所有治疗中都被根除。接下来，我们测试了DAA组合是否对相应的单一药物逃避ED43变体仍然有效。

    Efficacy of DAA combinations containing PIs and NS5A inhibitors against ED43 escape viruses. (A–C) For each DAA combination, concentrations of 5x-EC50 of NS5A inhibitors were used in combination with either 2x-, 4x- or 8x-EC50 of corresponding PIs. Black dashed lines indicate the time when the treatments were stopped. (D–F) NGS analysis of complete ORF sequences of viruses that escaped from DAA combinations. Only SNP of non-synonymous mutations with frequencies>20% in pre- and/or post-treatments are shown. These SNPs showed a frequency of <20% in the original virus that underwent treatments with single inhibitors (online supplemental figures 5 and 7). The putative RASs are shown in red. The corresponding drug targets and protein specific numbers are indicated for RASs. NGS, next-generation sequencing; ORF, open reading frame; PIs, protease inhibitors; SNP, single nucleotide polymorphism.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    含pi和NS5A抑制剂的DAA组合对ED43逃逸病毒的疗效(A-C)对于每个DAA组合，5x-EC的浓度50的NS5A抑制剂与2x-、4x-或8x-EC联合使用50相应的π。黑色虚线表示治疗停止的时间。(D-F)从DAA组合中逃逸的病毒完整ORF序列的NGS分析。在治疗前和/或治疗后仅显示频率为>20%的非同义突变SNP。这些SNPs在使用单一抑制剂治疗的原始病毒中频率<20%。在线补充图5和7)．假定的RASs用红色表示。RASs的相应药物靶点和蛋白特异性数已被标明。门店,下一代测序;ORF，开放式阅读架;π,蛋白酶抑制剂;SNP，单核苷酸多态性。

    Efficacy of DAA combinations containing NS5A inhibitors and sofosbuvir against ED43 escape viruses. (A,B) For each DAA combination, concentrations of 5x-EC50 of NS5A inhibitors were used in combination with either 1x- or 2x-EC50 of sofosbuvir. (C,D) NGS analysis of complete ORF sequences of viruses after combination treatments. For details, see figure 5 legend. NGS, next-generation sequencing; ORF, open reading frame.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    含NS5A抑制剂和sofosbuvir的DAA联合抗ED43逃逸病毒的疗效(A,B)对于每种DAA组合，5x-EC的浓度50的NS5A抑制剂与1x-或2x-EC联合使用50sofosbuvir。(C,D)组合处理后病毒完整ORF序列的NGS分析。有关详细信息,请参见图5传奇。门店,下一代测序;ORF，开放式阅读框。

    基于piis (paritaprevir, grazoprevir或glecaprevir)和NS5A抑制剂(ombitasvir, elbasvir或pibrentasvir)的DAA方案对逃脱其中一种药物的病毒无效，因此在基线时存在RASs (图5 a - c)．3 4 31只有glecaprevir/pibrentasvir能够在治疗期间控制GLEesc和PIBesc病毒感染(图5 c)．相比之下，paritaprevir/ombitasvir和grazoprevir/elbasvir组合对抑制PI或ns5a耐药病毒感染无效(图5 a, B)，在治疗两周后，它逃逸了。

    从这些联合处理中逃逸的病毒的NGS和连锁分析表明，除了基线的RAS外，它们都在新靶点(图5 d-f而且在线补充图9)．此外，联合治疗后出现了药物靶点外的额外取代(图5 d-f)．特别是I2841V出现在含有NS3P-A156M的gracc病毒中。

    同样，我们测试了NS5A (ledipasvir或velpatasvir)和NS5B (sofosbuvir)抑制剂对各自LEDesc、VELesc和SOFesc病毒的DAA组合，发现这些病毒感染没有被根除(图6 a, B)．与ledipasvir/sofosbuvir相比，velpatasvir/sofosbuvir治疗可有效抑制和延迟SOFesc病毒的传播。

    联合处理后，原LEDesc和VELesc病毒保持NS5A RASs (图6 c, D而且在线补充图10)．最初的SOFesc病毒获得NS5A L28M, L30H和L30S，同时保持NS5B-S282T，并在整个ORF获得额外的替换(图6 c, D)．

    格列卡普revir/吡brentasvir作为HCV基因型4a的再治疗选择，在培养中有基线耐药

    我们的数据表明，DAA组合不能根除对其中一种抑制剂有耐药性的病毒感染。临床上，glecaprevir/pibrentasvir已被研究为hcv感染的daa方案失败的患者的再治疗选择。37因此，我们研究了它对PAResc、GRAesc、OMBesc、LEDesc、ELBesc、VELesc和SOFesc病毒的有效性。感染的培养物用4xEC处理50glecaprevir / 5 xec50pibrentasvir。治疗第7天感染得到抑制，28天治疗后除PAResc和GRAesc病毒外，其余病毒均被根除(图7)．对glecaprevir/pibrentasvir逃逸病毒的NGS分析表明，GRAesc病毒主要携带NS3P-A156M(结合NS3P-A151V)和NS5A-L30P+P32L (图7 b)．parsc病毒保持NS3P-Y56H+D168 A/V，并获得NS5A-L30Δ+T75I(作为一个小群体)(图7 b而且在线补充图11)．在NS3P和NS5A结构域I外出现的替换中，我们还在gracc病毒中发现了I2841V(NS5B) (图7 b)．因此，基线PI耐药损害了格列卡普revir/pibrentasvir的有效性。

    Evaluation of glecaprevir/pibrentasvir as a re-treatment option against ED43 DAA escape viruses. HCV infections (A) and NGS analysis of complete ORF sequences of viruses (B) after treatments with glecaprevir/pibrentasvir. DAA escape viruses that were not eradicated by other investigated DAA combinations, were all treated with glecaprevir/pibrentasvir. Concentrations of 4x-EC50 of glecaprevir in combination with 5x-EC50 of pibrentasvir were used. For details, see figure 5 legend. NGS, next-generation sequencing; ORF, open reading frame.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    评价格列卡普韦/比布伦塔韦作为ED43 DAA逃逸病毒的再治疗方案。丙型肝炎病毒感染(A)和NGS分析的完整ORF序列的病毒(B)治疗后格列卡普韦/匹brentasvir。其他被研究的DAA组合未根除的DAA逃逸病毒均使用格列卡韦/匹brentasvir治疗。4 x-ec浓度50联合5x-EC的疗效50比布伦塔韦的剂量。有关详细信息,请参见图5传奇。门店,下一代测序;ORF，开放式阅读框。

    讨论

    我们揭示了病毒适应性，从而开发了HCV基因4型的高滴度全长感染培养系统，这是中东和北非/中非慢性肝病的主要原因。利用细胞培养适应的ED43(4a)病毒和详细的NGS结合单倍型重建分析，我们发现在DAA处理下，RASs和药物靶点外的其他取代物进化出了复杂的网络，这导致了RASs的阳性选择，导致了高水平的耐药性。我们进一步证明，在培养中，格列卡普revir/pibrentasvir作为病毒逃逸NS5A抑制剂或sofosbuvir的再治疗选择仍然有效。这是高度相关的，因为大多数基因4型患者已接受NS5A抑制剂联合sofosbuvir治疗。

    最近，Watanabe报道了ED43感染系统等．29该系统是通过使用先前在ED43复制子中发现的取代物开发的，38最终的ED43病毒可产生约3.5 log的传染性滴度10感染39天后为FFU/mL。29在这里，我们报告了一种不同的策略，它是基于使用替换赋予病毒复制和传播结合高传染性滴度。在此之前，我们已经成功地将基因型3a和6a在相应的C5A重组体中识别的替换与NS5B的变化结合起来，使其在培养中高效生长，这包括对序列的修改，以反映与其他基因型3a和6a序列的一致。3 4然而，对于原始的ED43，克隆中的NS5B序列与其他沉积的基因型4a序列相比已经反映了共识。39相反，我们专注于ED43-NS5B的10个氨基酸，它们不同于其他HCV基因型菌株的保守序列，这些HCV基因型菌株已经开发了高效的感染培养系统(在线补充图1A）21并发现这些变化的一个子集促进了ED43全长克隆的适应。我们的ED43cc病毒是高效的，产生滴度约5.1 log10感染6天后FFU/mL (表1)．应该注意的是，ED43cc病毒包含通过广泛的适应过程确定的大量替代。因此，我们不能排除这些适应性替代可能影响病毒对DAAs抗性的选择。在我们的研究和研究中发现的替代品中渡边等，29271位(V271F/G)和2413位(D2413G)的取代现象普遍存在，提示这些变化可能对该病毒株的培养活力很重要。值得一提的是，选择对DAAs的病毒抗性和开发全病毒候选疫苗需要高效病毒。

    基因型4a ED43复制子系统已经开发。38 40然而，本研究中发现的细胞培养适应性突变可能是产生更有效的基因型4亚基因组复制子的替代方法，正如最近对基因型3a的菌株DBN3a所证实的那样。4 41这种带有或不带有RAS的复制子，只再现病毒的细胞内复制，是研究抗病毒药物对复制影响的有用工具，但不能用于理解全基因组突变网络。22

    感染性细胞培养系统是疫苗开发的重要工具。具有高传染性滴度的ED43cc病毒的高效生长可能允许生产足够的病毒，以产生灭活的全病毒候选疫苗，用于临床前试验。或者，进一步的细胞培养适应可以通过ED43cc的连续传代实现，如前所述的另一个重组体。23因此，高度适应的ED43cc病毒可能有助于生产全病毒颗粒疫苗研究所需的HCV病毒粒子。尽管如此，我们必须承认，在培养中培养ED43所需的细胞培养适应性替代对整体病毒对中和抗体的敏感性的假定影响，这可能会影响疫苗诱导的免疫反应。特别是，C458R(E2)已被证明可诱导病毒逃离宿主免疫反应。42此外，适应性替代也可能影响病毒对DAAs的敏感性，并促进病毒逃逸;然而，由于HCV的培养研究依赖于适应性突变，这是细胞培养系统的普遍局限性。

    我们发现，在不同的DAA处理下，含有不同RASs的异源ED43病毒种群进化，这导致了RASs的阳性选择，具有高水平的抗性(图2A-C, 3A-E和4A)．此外，RASs的出现和数量不仅取决于药物的初始效力(EC50)．浓度为8xEC50在grazoprevir和glecaprevir治疗期间出现了A156T/V/M，而paritaprevir治疗期间没有，这表明尽管药效相似，但在长期治疗中glecaprevir和grazoprevir的选择压力更高(图2一个对于NS5A抑制剂，观察到类似的效果，因为尽管表现出类似的效力，在长期治疗中，ombitasvir选择单一RAS，而ledipasvir和elbasvir选择双RAS (图3一在分别使用含ombitasvir和ledipasvir的方案治疗失败后，基因4型感染患者也出现了观察到的RASs L28V和L30R+Y93H。43

    此外，我们的数据表明，病毒逃逸严重依赖于相应的含有ras的ED43变体的适应度。大多数NS3P RASs对病毒适应度有害，并恢复到野生型，正如之前在培养中的其他基因型所显示的那样。31对于A156M，虽然在ED43中单独引入时保持了它，但需要进行补偿性替换来提高适应度(图2 f)．在临床中，在grazoprevir/elbasvir失效的hcv感染患者中已经检测到这种RAS，包括在基因4型感染中。44

    适应度成本较高的NS5A RAS仅为NS5A-L30Δ，可部分由NS5A- t75i (图3 h)．根据L30Δ适应度的丧失，我们先前发现，NS5A- p32的缺失导致适应度低，但它在基因1型病毒中对所有临床相关NS5A抑制剂产生了高水平的耐药性。34在基因1型感染的glecaprevir/pibrentasvir失效的患者中，也观察到NS5A-P32缺失。45

    NS5B-S282T通常与适应度降低有关，因此，在hcv感染患者的基线中很少检测到它。2然而，据报道，该RAS可以在sofosbuvir治疗下的培养中选择。3 4 46我们的研究表明，S282T在sofosbuvir治疗基因型4a下逐渐被选择，并在没有药物压力的情况下保持(图4一)．事实上，与其他基因型相比，S282T在DAA失败后基因型4感染患者中更常见。14日15日47在之前的细胞培养研究中，我们证明了含有S282T的基因型6a重组体的适应性严重受损，与相对适合的4a重组体(图4 c)，提示S282T基因型间存在差异。3.在基因4型中观察到的这种相对适合度优势可以使S282T病毒在治疗失败后积累额外的替代品，以促进其长期存在。如果同样的情况发生在患者身上，它可能因此降低含sofosbuvir方案的耐药屏障。

    DAA联合治疗基因4型尚未在培养中进行详细研究。我们的数据显示，推荐的DAA方案对原始基因型4病毒(图5A-C和6A,B)．同样，这些疗法在临床上也非常有效。11日13尽管如此，病毒对DAA组合的耐药性仍然是一个问题，这可能阻碍治疗。在埃及，基因4型感染患者中有3%-5%出现治疗失败。12由于抗病毒药物耐药导致的治疗失败普遍与NS5A抑制剂耐药有关，挽救性DAA方案的一个有效选择应该包括泛基因型NS5A抑制剂吡brentasvir，它对大多数NS5A耐药变体具有更高的效力。34事实上，我们证明了glecaprevir/pibrentasvir对携带NS5A RASs的4a病毒仍然有效(图7)．这种有效性可能是由于比布伦塔韦的耐药屏障很高，如耐药谱测试(图3 f)．34此外，含有NS5B-S282T的病毒也通过这种组合被根除。这一发现对于使用含有NS5A抑制剂联合sofosbuvir的方案失败的患者具有重要意义，该方案已用于埃及大量感染者的治疗。此外，由于本研究中ED43病毒适应度的最大损失仅与NS3-156和NS5A-L30Δ上的取代物的引入有关，所以格列卡普韦/比布纳沙韦表现出了很高的耐药屏障。事实上，据报道，使用NS5A抑制剂和sofosbuvir治疗失败的患者使用glecaprevir/pibrentasvir治疗后，>的SVR达到90%。37重要的是，大多数患者在再治疗前有基线NS5A RASs。37

    在我们的研究中，具有NS3P RASs的病毒给予高水平的glecaprevir耐药性不能被glecaprevir/pibrentasvir (图7)．这些病毒的可能的再治疗方案包括velpatasvir/sofosbuvir/voxilaprevir或glecaprevir/pibrentasvir的三重组合，并添加sofosbuvir和/或利巴韦林，这已在患者中显示出极大的疗效。48 49因此，在未来的研究中，使用已开发的基因型1a、2a、2b、2c、3a、4a和6a的感染性全长培养系统，测试这些组合对PI逃逸病毒的影响是有意义的。21日29日50

    综上所述，我们开发了一套高效的HCV基因4a型全长感染培养体系。除了用于提高我们对DAA耐药性的了解外，该系统还可以作为开发HCV疫苗的有用工具，这是控制全球HCV的迫切需要。23在这里，我们对目前用于治疗基因4型感染的所有临床相关DAAs进行了广泛分析。NGS和连锁分析揭示了处理过程中不同RASs选择的复杂动态。在ED43重组体中观察到的NS5B-S282T相对较高的适应度和稳定性可能与使用含sofosbuvir方案治疗后，该RAS在基因4型感染中的持久性有关。然而，我们发现，格列卡普revir/pibrentasvir可能是一种有前途的挽救性DAA方案，用于在使用sofosbuvir/NS5A抑制剂方案失败后再治疗基因型4患者，正如最近使用全长培养系统对基因型2患者所显示的那样。50详细了解在此产生的ras出现背后的进化机制，有助于避免耐daa病毒的出现和传播，从而防止未来的治疗失败。

    数据可用性声明

    所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。

    伦理语句

    病人同意发表

    致谢

    我们感谢Anna-Louise Sørensen和Lotte Mikkelsen (Hvidovre医院)提供的实验室援助，感谢Bjarne Ørskov Lindhardt (Hvidovre医院)和Carsten Geisler(哥本哈根大学)提供的宝贵支持。我们感谢C.M. Rice(洛克菲勒大学，纽约)和R. Purcell(美国国立卫生研究院，贝塞斯达)提供试剂。

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

    脚注

    • 贡献者研究概念与设计:LP、SR、JB。数据采集:LP、MSP、UF、CF-A、DH、KS、SR。数据分析与解释:LP、UF、SR、JB。稿件准备:LP、SR、JB。审定稿件:所有作者。资源:LP、UF、CF-A、KS、SR、JB。学习督导:SR和JB。

    • 资金本研究得到了H地区基金会(SR, JB)、Lundbeck基金会(JB)、诺和诺德基金会(JB)、丹麦独立研究基金(DFF)、医学科学(SR, JB)、丹麦创新基金(感染- era EU, JB)、Candys基金会(LP, CF-A, JB)、丹麦癌症协会(JB)和魏曼基金会(UF)的资助。JB是2015年的诺和诺德奖获得者和2019年的诺和诺德基金会杰出研究者奖获得者。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。