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客观的胃癌(GC)是一个癌症相关死亡的主要原因。虽然微生物除了幽门螺杆菌也可能导致胃致癌,野生型无菌(GF)小鼠模型研究人类胃微生物群的角色在这个过程中还没有可用的。我们旨在评估GF鼠胃移植的组织病理学特征与来自不同胃疾病患者胃微生物群与微生物群及其关系。
设计微生物群在语料库和窦组织和胃液体从12患者胃发育不良或GC分析。此后,语料库做了活检,窦组织和胃液体从患者(分别为n = 15 n = 12)与慢性浅表胃炎,肠上皮化生或GC被接种到42 GF C57BL / 6小鼠。胃微生物群被扩增子测序分析。小鼠胃的组织病理学特征分析了免疫组织化学在接种后1个月。一组独立的额外15 GF老鼠也分析了1年。
结果的微生物群落结构发育不良患者或GC语料库和腔是相似的。胃微生物群从肠上皮化生或GC患者选择性殖民鼠标胃和诱导癌变前的病变:壁细胞和损失增加炎症病灶,F4/80和ki - 67表达,CD44v9 / GSII凝集素的表达。明显发育不良的变化被发现在接种后1年。
结论主要的组织病理学特征癌变前的变化是可再生的女朋友小鼠移植患者胃微生物群与肠上皮化生或GC。我们的研究结果表明,GF老鼠是用于分析关联的因果关系在人类胃微生物的研究报道。
- 胃癌
- pre-malignancy
- 发育不良
- 肠道微生物
数据可用性声明
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
幽门螺杆菌是一个重要因素与胃癌(GC)的发展。
Mouse-adapted幽门螺杆菌或insulin-gastrin来华的老鼠被广泛用作胃疾病动物模型。
有什么新发现吗?
胃微生物群移植(GMT)从人类患者肠上皮化生或GC无菌(GF)诱发小鼠胃壁细胞,增生的上皮的化生发展和扩张区。
人类微生物群选择性殖民鼠标接受者和似乎导致癌变前的GC病变特征的发展。
在格林尼治时间后长期随访的老鼠,进一步恶化前的变化观察发育不良的腹部。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
这个研究表明,微生物以外的其他成员幽门螺旋杆菌触发特性与人类的GC。
移植人类微生物群胃GF老鼠提供了一种新的动物模型研究人类胃疾病。
介绍
胃癌(GC)是一个全球恶性肿瘤死亡率的主要来源。1虽然遗传因素或可能导致GC行为风险,2它是最具代表性的实例癌症微生物引起的致癌物质,幽门螺杆菌,这是第一个承认细菌致癌物。3幽门螺旋杆菌感染引发慢性浅表胃炎(CSG),4,根据科雷亚的被广泛接受的级联理论,按顺序随后萎缩与壁细胞损失,肠上皮化生(IM)和发育不良,最终导致GC。5高酸性胃环境限制了微生物的生长,从而减少感染的风险由病原体进入消化道。6随着胃致癌级联的发展,减少胃酸分泌由于壁细胞损失允许殖民,慢性萎缩性胃炎后各种细菌的生长。7
的角色幽门螺旋杆菌在GC开发,包括其毒性,遗传多样性和宿主炎性反应,都已经被广泛地研究过了。8 9有趣的是,对GC引起的幽门螺旋杆菌已经发现不同,只有少数幽门螺旋杆菌-感染者最终罹患癌症。10因此,非幽门螺旋杆菌胃微生物也可能参与致癌作用幽门螺旋杆菌:11日12的确,在胃癌患者,肠道共生的丰度高,检测出了幽门螺杆菌出席少量。13胃微生物群的动态还依赖于胃蛋白酶原I / II比,14使用acid-suppressive质子泵抑制剂等药物15和疾病状态。13 16 17胃微生物群的结构可以改变在科雷亚的级联,表明生态失调与GC进展。16这种致癌进展可能潜在的致病机制包括硝酸盐还原菌、乳酸外生或活性氧,都被认为是致癌的。18 - 20
为了更好地理解生物学的胃致癌作用,小鼠模型可以提供一个控制系统评估胃微生物群落的功能性质是从人类在不同疾病阶段。21转基因insulin-gastrin (INS-GAS)小鼠自发发展胃腺癌或小鼠感染mouse-adapted幽门螺杆菌物种加速疾病进展是最被广泛接受的鼠标GC模式。22日23日然而,许多因素促进循环胃泌激素升高会导致慢性胃炎和胃肠道肿瘤在这些模型。
探索发展的微生物群GC的角色,我们移植胃微生物群(称为胃微生物群移植(格林尼治时间))从人类各种胃肠疾病患者进入无菌小鼠(GF)。此外,我们描述和比较胃GMT接受者之间的微生物群的概要文件,以及捐助者与不同的疾病,包括GC。在此,我们报告“致病”胃微生物群的IM和GC诱导癌变前的患者的胃粘膜病变接受者GF老鼠。
方法
详细的方法中可以找到在线补充材料。
招聘和样本收集
胃活检标本或胃液体收集病人(≥19岁)接受胃镜检查各种胃疾病的标准,包括CSG、IM, pathology-confirmed GC,或胃发育不良,在获得书面知情同意。队列组在这项研究中所含微生物群(1)胃粘膜组织和流体之间的比较,(2)胃粘膜tissue-derived格林尼治时间为个月观察,(3)胃fluid-derived格林尼治时间为个月观察,(4)胃粘膜tissue-derived格林尼治时间为1年的观察。群都是相互独立的。本研究机构审查委员会批准延世大学医学院(IRB 4-2011-0149, IRB 4-2013-0880)。
组织病理学分析
胃组织在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片5µm。部分是deparaffinised二甲苯和水化。水化胃组织部分接受了)染色、免疫荧光和免疫组织化学。
结果
描述人类微生物群的胃粘膜组织和胃液体
格林尼治时间实验前,我们检查了微生物群的胃组织和流体从患者(n = 12)胃发育不良或独立GC (在线补充表1)。发育不全是一种癌前状态,往往先于GC和GC因此被视为一个风险因素。26获得一个更好的胃的解剖表示微生物群组成,我们取样语料库和窦组织(图1一个)。此外,我们分析了胃液体作为微生物定殖的壁垒因为它的酸度,6最近吞噬微生物出现在口腔和食道会影响胃微生物群,很难发现真正的病原体在胃里。分类分布在胃标本所示在线补充图1 a - c。总的来说,样品被属的成员主要是殖民幽门螺杆菌(类Epsilonproteobacteria),链球菌(杆菌),普氏菌(拟杆菌门),嗜血杆菌(Gammaproteobacteria),奈瑟氏菌属(Betaproteobacteria)。
胃微生物群的多样性胃发育不良或胃癌患者(GC)。(A)胃粘膜组织收集从语料库和腔和发育不良患者胃液体提取或GC (n = 36个样本12例)被用于微生物群16 s dna分析。(B)α多样性的语料库和窦组织和胃液体基于观察操作分类单位的数量和香农和逆辛普森指数。差异被Mann-Whitney测试评估。* P < 0.05;ns,不重要。(C)的相对丰度之间的相关性幽门螺杆菌香农和逆辛普森指数在语料库,腔和胃液体。(D)的主坐标分析的加权UniFrac距离人类胃微生物群落由疾病和采样站点/源。
物种丰富度和均匀度估计使用操作分类单位的数量和香农和逆辛普森指数。虽然在大多数情况下,未予重视胃液体丰富度较低,但均匀度高于文集或窦标本(图1 b)。然而,α多样性有很大的不同幽门螺旋杆菌感染状态(在线补充图1 d)。两个12例被认为幽门螺旋杆菌基于反负幽门螺旋杆菌免疫球蛋白G(免疫球蛋白)反应,组织学和弯曲杆菌例如生物(CLO)测试。当我们分析的多样性指数和相对丰度之间的相关性幽门螺旋杆菌对于每一个标本,香农指数是在良好的协议幽门螺旋杆菌丰富,与辛普森指数显著相关胃粘膜组织和胃液体(图1 c)。疾病状态只在这些样本(α多样性的影响最小在线补充图1 e)。
β多样性计算使用未加权的UniFrac系统距离矩阵,和社区结构呈现在主坐标分析情节(图1 d),显示不同的集群根据组织采样站点/源(置换多元方差分析p < 0.05;在线补充图1 f)。特别是胃液体样品形成一个单独的集群的粘膜样本,表明胃液体中的微生物群组成不同于胃粘膜组织(在线补充图1 g),这是由一项研究的发现,而胃组织和液体微生物群。27与胃腔相比,具有极低的pH值1 - 2,粘膜表面的pH值6 - 7更适合殖民。6集群中的每个组织抽样,样本相同的诊断组部分集群。
患者胃粘膜组织和流体从IM或GC引起化生的变化在人类胃microbiota-transplanted GF老鼠
我们人类胃接种微生物群在GF C57BL / 6小鼠使用内窥镜获得人体胃组织样本来自不同胃疾病患者(CSG、IM和GC),这是代表阶段科雷亚的级联。5捐赠者之一CSG集团四个捐助者IM组,和两个捐助者在GC组阳性幽门螺旋杆菌在幽门螺旋杆菌免疫球蛋白反应,组织学和CLO测试(在线补充表2)。语料库和窦的组织分别接种到各自的女朋友老鼠。这种接种方法设计,因为先前的报告认为可能的殖民不均幽门螺旋杆菌感染(腔,语料库主导或pan-gastritis)幽门螺旋杆菌-感染人类的胃28和微分语料库和腔之间的微生物群组成。29 30第一次接种后一个月,我们定量分析免疫细胞标记接受者GF老鼠组织病理学和微生物群落结构,在老鼠人类捐赠者和接受者的扩增子测序基因(见16 s rRNA图2一个实验设计)。
组织病理学分析接受者无菌(GF)小鼠胃移植人类内镜活检组织。(一)实验设计:人类语料库和窦粘膜组织从慢性浅表胃炎患者(CSG),肠上皮化生(IM)或收集胃癌(GC)扩增子测序和微生物群移植(n = 30 15例样本)。C57BL / 6 GF小鼠口服管理从语料库收集的与人体胃组织碎或腔连续三天。语料库和窦的组织人类微生物群胃移植GF老鼠收集30天后扩增子测序和细胞谱系分析(n = 60个样本30老鼠)。(B)代表)染色图像的女朋友鼠胃接种磷酸缓冲盐(PBS),人类CSG,人类IM或GC粘膜组织。酒吧= 200µm规模。(C)免疫荧光染色对F4/80巨噬细胞(绿色)和DAPI染色(蓝色)在小鼠的胃每组(上),和F4/80量化+细胞20×字段(盒须图,每个点代表平均数量从10图片在每一个鼠标,n = 3 PBS组GF的老鼠,n = 10 CSG, IM和GC GF组小鼠,分别)。酒吧= 100µm规模。为H (D)免疫组织化学+/ K+腺苷三磷酸酶壁细胞的女朋友每组小鼠的胃,和H的量化+/ K+腺苷三磷酸酶+每个腺壁细胞(平均数±标准差,每个点代表平均数量从10图片在每一个鼠标,n = 3 PBS组GF的老鼠,n = 10 CSG, IM和GC GF组小鼠,分别)。酒吧= 200µm规模。(E)的免疫荧光染色griffonia simplicifolia凝集素II (GSII,绿色),胃内因子(GIF、红)和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI(=蓝色),每组小鼠胃(左)。量化的GSII+/ GIF+细胞/腺(盒须图,每个点代表平均计数从五个图像在每个鼠标,n = 3 PBS组GF老鼠,n = 10 CSG, IM和GC GF组小鼠,分别)。酒吧= 100µm规模。ki - 67 (F)免疫组织化学的女朋友每组小鼠的胃。量化ki - 67+细胞、胃粘膜组织分为10分数(从基础坑地区)和ki - 67+细胞被计算为每个分数。半透明的彩色图表示的意思是每个女朋友±SD鼠样本。不透明的彩色图形显示的平均数量ki - 67+细胞在每个分数(每个点代表平均数量从10图片在每一个鼠标,n = 3 PBS组GF老鼠,n = 10 CSG, IM和GC GF组小鼠,分别)。酒吧= 50µm规模。*,p < 0.05;* *,p < 0.01;* * *,p < 0.001;* * * *,p < 0.0001。
接种IM-mucosal或GC-mucosal组织诱导GF小鼠的胃化生的变化(图2 b,在线补充图2)。虽然PBS-inoculated CSG-inoculated老鼠显示小的胃发炎,IM-inoculated或GC-inoculated小鼠炎症显著高于成绩(在线补充图3)。大量积累F4/80+巨噬细胞炎性病灶的检测IM-inoculated和GC-inoculated老鼠(图2 c,在线补充图3 b)。acid-secreting胃壁细胞的损失是一个著名的代表表型上皮化生和被认为是一个初始事件的胃稀土。31日因此,我们调查是否人类微生物群胃引起的胃化生开发收件人GF老鼠。H+/ K+atp酶是主要的质子泵的胃,存在于壁细胞,和明显损失的H+/ K+腺苷三磷酸酶+壁细胞中观察到GC-inoculated GF老鼠(图2 d,图3 c在线补充)。免疫荧光图像受体小鼠胃透露GSII翻番+/ GIF+细胞,这是一个标记为解痉药polypeptide-expressing化生(SPEM),32在IM-inoculated和老鼠GC-inoculated GF (图2 e,在线补充图3 d)。CD44v9+细胞已报告被发现在各种类型的胃粘膜化生,以及在GC,33我们发现CD44v9+包括+细胞显著增加GF GC-inoculated胃的老鼠(在线补充图3 E和E”)。ki - 67+增殖细胞显著增加不仅在脖子上,还在中间区域,胃粘膜IM-inoculated和老鼠GC-inoculated GF (图2 f,在线补充图3 f)。这些病理变化中发现女朋友鼠胃的语料库多病灶的模式,而不是corpus-antrum边境或腔区域。
胃液体主要由盐酸和蛋白水解酶,6和其极低的pH值可能导致独特的胃液体微生物群。考虑到胃液体不同的微生物群的粘膜组织,我们也进行了GMT GF C57BL / 6小鼠使用patient-derived胃液体(在线补充表3)。从病人诊断为CSG胃液体样本收集,IM或GC被接种到女朋友老鼠通过口头填喂法连续三天,和老鼠牺牲30天后。
作为供体GC粘膜组织诱导化生受体GF老鼠(图2),我们检查是否人类GC patient-derived胃液体也可能诱发胃上皮血统变化。胃的女朋友从CSG患者接种小鼠胃液体,IM或GC分析以同样的方式(在线补充图4)。类似于发现观察接种小鼠胃组织,IM或GC胃fluid-inoculated GF老鼠还显示胃化生的变化(在线补充图4 b)。F4/80+巨噬细胞积累检测IM-inoculated或GC-inoculated老鼠,但不是在CSG-inoculated GF老鼠(在线补充图4 c)。H的损失+/ K+腺苷三磷酸酶+壁细胞中检测出IM-fluid和GC-fluid接种组(在线补充图4 d)。GSII+/ GIF+SPEM细胞也明显高于IM-inoculated GC-inoculated老鼠比CSG-inoculated GF老鼠(在线补充图4 e)。ki - 67+细胞数量显著增加在脖子上和胃的中部地区IM-inoculated和GC-inoculated组,与CSG集团(在线补充图4 f)。综上所述,这些数据表明微生物群从胃组织和胃液体从患者IM和GC引起炎症和收件人GF小鼠胃化生的变化。
人类微生物群胃可以选择性地移植到女朋友小鼠模型
评估移植人类微生物群胃是否能成功移民GF老鼠,我们分析了人类微生物群组成的捐赠者和GF鼠标接受者和探索它们之间的关系。微生物DNA提取患者胃粘膜组织收集的CSG, IM或GC和小鼠接种病人组织16 s rRNA基因扩增子序列。
鼠标接受者的物种丰富度远远低于在人类捐助者基于观察类群的数量和香农指数(图3一,在线补充图5),这表明人类胃tissue-derived微生物群的成员有选择地殖民GF鼠标胃。捐献的微生物群在接受者的选择性殖民预计,考虑到人类和小鼠的胃解剖和功能上是截然不同的。34-37相比之下,丰富逐渐减少小鼠接种CSG小鼠接种IM或GC,所观察到的丰富往往是类似于人类捐助者(图3 b,在线补充图5 c)。当捐赠者微生物群的语料库和腔相比,虽然在语料库和窦组织社区结构从同一个捐赠者没有聚集在一起(在线补充图5 d),人类的捐助者和GF鼠标收件人显示显著差异的总体α多样性。在层次聚类,幽门螺旋杆菌人来华的捐助者被组合在一起,清晰可辨的人(在线补充图5 e)。幽门螺杆菌是顶级属区分人类捐赠者和受体小鼠的微生物群的结构;在捐赠者,非常丰富,但很少殖民收件人的粘膜组织(图3 c)。此外,Turicibacter和Hungatella,属于门厚壁菌门最成功的类群,移植小鼠胃粘膜,而他们在人类丰度很低。虽然人类的胃微生物群优先殖民移植的女朋友鼠标胃,我们观察到共享类群在两个不同的主机在各自的疾病(图3 c),指出其比例之间的相关性在人类捐赠者和鼠标接受者(在线补充图6):丰度拟杆菌,Blautia,片球菌属,普氏菌和链球菌患者之间可比性CSG CSG-inoculated老鼠;的人拟杆菌和嗜血杆菌在IM和患者之间的可比性IM-inoculated老鼠;和乳酸菌,片球菌属和韦永氏球菌属GC和患者之间的可比性GC-inoculated老鼠。佣金,我们认为人类胃tissue-derived微生物群可以有选择地殖民GF鼠标的胃。
微生物的人类患者的胃粘膜组织(捐赠者)与慢性浅表胃炎,肠上皮化生或胃癌和胃的微生物群移植无菌鼠(接受者)。(A)人类捐助者(浅蓝色)的多样性指数和鼠标接受者(灰色)。(B)多样性根据捐赠者和接受者的疾病状态。(C)分类的捐赠者和接受者在属水平。(D)的相对含量,不同疾病的微生物属人类的捐赠者和各自的鼠标接受者。没有显示细菌相对丰度小于0.1%。细菌是列在统计上显著的秩序,这是利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验评估。*,p < 0.05;* *,p < 0.01;* * *,p < 0.001。
当微生物群在捐助者被三元观想情节,家庭在CSG包括显示高浓缩Akkermansiaceae包括,而富含GCGemella_f和Veillonellaceae(在线补充图6 b)。在收件人,Akkermansiaceae和Enterococcaceae分别显示,CSG-inoculated浓缩和GC-inoculated老鼠。明显不同的两大属三个疾病之间的相对丰度Akkermansia和不动杆菌捐助者之一。在收件人中,属与相对含量,包括明显不同链球菌,普氏菌,拟杆菌和罗思氏菌属(图3 d)。接下来,我们评估微生物类群被反射的供体和受体之间的个人疾病样本通过成对比较使用线性判别分析效果的方法。在人类的捐助者,Solibacter和梭状芽胞杆菌比我更有识别力的CSG和GC (在线补充图7)。Akkermansia更有识别力的CSG的GC。Lautropia比CSG更有识别力的IM。不动杆菌比CSG更有识别力的GC。在鼠标收件人,双歧杆菌属,葡萄球菌和气单胞菌属更有识别力的CSG-inoculated小鼠比IM-inoculated或GC-inoculated老鼠(在线补充图7 b)。链球菌,韦永氏球菌属,Anaeromyxobacter和嗜血杆菌比CSG-inoculated歧视IM-inoculated老鼠的老鼠。韦永氏球菌属也更有识别力的GC-inoculated小鼠比CSG-inoculated老鼠。当个体的相对丰度属检查在每个疾病状态,我们注意到Akkermansia,Cutibacterium和Faeclibaculum比患者更丰富CSG IM或GC (在线补充图8)。类似的趋势似乎是维护在小鼠移植每个疾病组的微生物群,和这些属居高不下的丰度CSG-inoculated老鼠。Gemella和韦永氏球菌属在CSG-inoculated IM-inoculated或GC-inoculated高于老鼠。嗜血杆菌收入最高的是IM-inoculated老鼠。
GF小鼠接种的微生物组成胃液体从患者CSG收集,IM或GC,以及捐赠者的胃液体,被16 s rRNA基因测序分析。结果可比性的胃tissue-derived微生物群移植的α多样性和选择性殖民(在线补充图9模拟)。
微生物代谢途径和类群的贡献增加coexpression GSII / GIF和ki - 67
识别微生物类群和代谢特性,可能导致GSII的感应+/ GIF+和ki - 67+细胞在小鼠格林尼治时间,我们首先分析了这两个标记之间的相关性和微生物的相对丰度的家庭。GSII / GIF是SPEM的标记,和ki - 67细胞增殖的一个标志。细胞表达的数量测量这些标记在受体小鼠的语料库组织,和ki - 67+细胞中检测到地峡和颈部区域。斯皮尔曼微生物丰度之间的相关性在主机和GSII / GIF和ki - 67的表达在老鼠身上进行分析(图4 a - b,在线补充图10)。Akkermansiaceae是负相关的标记细胞捐献者和接受者样本,而Gemella_f和Aerococcaceae,Granulicatella属于,表现出正相关性。与此同时,尽管不那么明显,Helicobacteraceae在捐赠者似乎与ki - 67呈正相关,而Erysipelotrichaceae在接受者,Turicibacter属于,更积极与GSII / GIF和ki - 67。
微生物类群和代谢功能与组织病理学相关标记。(A - B)的细菌丰度的关系在人类捐助者(A)和(B)无菌(GF)鼠标接受者GSII的数量+/ GIF+或ki - 67+细胞GF小鼠的胃。每个点代表的斯皮尔曼等级系数之间的家庭层次丰富和GSII的数量+/ GIF+(轴)或ki - 67(轴)细胞。颜色显示phylum-level每个家庭的信息,和大小的圆形突出相对丰度的平均值。(C - D)丰富的代谢组KEGG模块微生物群积极的还是消极的与GSIIGIF(浅蓝色酒吧)和ki - 67细胞丰度(深蓝色酒吧)(C)人类捐赠者和接受者(D)老鼠。
代谢途径分析浓缩,供体样品和受体小鼠分组基于高或低的细胞表达GSII / GIF和ki - 67在胃里,不论捐赠者的疾病状态(在线补充图11)。39 KEGG PICRUSt2分析检索模块38显著不同的供体或受体微生物群,感应GSII / GIF或ki - 67的表达。一个模块,semi-phosphorylative Entner-Doudoroff通路,葡萄糖酸→glyceraldehyde-3P +丙酮酸',在GSII coenriched / GIF-low捐助者和受助者组,和模块的杆菌肽运输系统在GSII coenriched / GIF-low和ki - 67低组接收样品。同时,ki - 67高母群体样本显示最大数量的丰富京都基因和基因组的百科全书(KEGG)模块,包括多个运输系统对铁和其他分子,多个葡萄糖磷酸转移酶系统、尿素循环,脯氨酸生物合成和VI型分泌系统(图4 c - d)。
幽门螺旋杆菌是与生产有关的致癌N亚硝基的化合物在胃肠道,19和之间的联系幽门螺旋杆菌感染和GC开发大量研究支持。因此,我们评估是否充足的幽门螺旋杆菌在供体标本会影响组织病理学变化与捐赠者的疾病状态有关。我们发现数量的无显著差异幽门螺旋杆菌艾滋病患者和幽门螺旋杆菌消极的患者在元数据(在线补充表2 - 3)。在捐赠样本,来自GC组引起的最低数量幽门螺旋杆菌小鼠胃组织移植和胃fluid-transplantation (在线补充图12)。在炎症得分没有显著差异,ki - 67+和GSII+GIF+细胞之间的地峡地区观察幽门螺旋杆菌艾滋病患者和幽门螺旋杆菌阴性组(在线补充图12罪犯)。
出现发育异常的1年期收件人GF老鼠格林尼治时间的变化
评估人类胃微生物群的长期影响胃的女朋友老鼠,我们接种胃语料库从三个供体组和窦组织到女朋友C57BL / 6小鼠分别(图5一个)。收件人组由六个老鼠CSG、三个IM和六个GC (图5 b,在线补充表4)。微生物群落结构定量分析在格林尼治时间后1年。虽然没有自发的野生型的女朋友老鼠胃部病变的发展观察一年(在线补充图13),我们确实发现长期解决人类微生物群胃引起胃部病变,如炎症、囊性扩张,侵蚀、孔穴的增生和化生多病灶的模式,在鼠标胃语料库。还值得注意的是,癌前病变指出:一些发育异常的病变(细胞拥挤没有分层、伸长、核多形性,杂乱无章39鼠标的胃中发现了(图5 c,在线补充图13 b)。发育异常病变的发病率是16.67%,66.67%和50%的CSG IM或GC微生物群移植组,分别。此外,增殖CD44v9+细胞位于小鼠胃的发育异常的区域(图5 d)。尽管分钟炎性变化被认为在corpus-antrum边境和腔,显著的病理变化(包括发育不良)主要是观察到小鼠模型的语料库。微生物分析检测到鼠标胃通过16 s rRNA基因测序显示几个类群出席不同的丰度之间的老鼠有或没有发育异常的病变(图5 e,在线补充图14)。包括那些更普遍发育异常的小鼠不动杆菌和未赋值的属Lachnospiraceae,嗜血杆菌和梭菌属,而包括non-dysplastic老鼠更普遍Oscillibacter,拟杆菌,Turicibacter,Muribaculum和Sphingbium。总的来说,这些长期数据表明GC-derived或IM-derived微生物群发起与胃粘膜炎症和诱发癌变前的病变细胞谱系改变GF老鼠。
组织病理学分析无菌(GF)不同的老鼠和丰富微生物属胃微生物群移植后1年(格林尼治时间)。(一)实验设计:人类语料库和窦粘膜组织从慢性浅表胃炎患者,肠上皮化生或收集胃癌微生物群移植(n = 16 8例)的样本。C57BL / 6 GF小鼠口服接种切碎人体胃组织收集从语料库或腔连续三天。语料库和窦的组织人力GMT GF老鼠收集1年后扩增子测序和细胞谱系分析(n = 15 15老鼠)的样本。(B) Heatmap-based注释的炎症,孔穴的增生、囊性扩张,在每个女朋友鼠标侵蚀、化生和发育不良。(C)代表)染色图像的GF与炎症小鼠的胃,孔穴的增生、囊性扩张,侵蚀、化生和发育异常病变。酒吧= 100µm规模。(D)免疫荧光染色对ki - 67(绿色),CD44v9(红色)和DAPI(蓝色)在《火焰杯》中鼠标的胃。酒吧= 100µm规模。(E)的相对含量之间的微生物属老鼠有或没有明显的发育异常的军团。 Bacteria are listed in statistically significant order, which was assessed by the Mann-Whitney test. *, p<0.05; **, p<0.01.
讨论
粪便微生物群移植是一个成功的方法改变接受者的肠道的微生物组成40并已应用于调节微生物多样性或结构与各种癌症的发展。41-44大约103-10年4细菌细胞存在于胃,明显低于在粪便样本中细菌数量。45虽然胃以外的微生物群的成员幽门螺旋杆菌也可能导致胃致癌作用,人类微生物群胃胃致癌的作用还没有被彻底调查在动物模型。移植的人类微生物群胃到老鼠GF可以合适的实验模型,模仿人类胃微生物环境调查胃微生物群的作用。立在格林尼治时间我们的研究表明,人类的许多特性的GC GF小鼠的胃。我们观察到,当微生物来源于IM或GC患者移植到老鼠的女朋友,肿瘤出现前的特性,包括增加炎症,降低壁细胞,增加细胞增殖,诱导。此外,长期的观察小鼠接种微生物群从IM或GC显示功能的发育异常患者的小鼠胃发病率相对较高(图5)。有趣的是,观察胃的发育异常的变化在一个CSG-inoculated GF鼠标在1年。值得注意的是捐献者是一个62岁的女人有着悠久历史的慢性胃炎、和韩国是一个具有高发病率国家GC。
组织病理学观察发现,包括慢性炎症、壁细胞和增加SPEM细胞损失和增殖细胞GF老鼠,是按照最初的发展阶段为GC基于科雷亚的级联。5这些发现表明,肿瘤出现前的胃粘膜的变化中诱导GF胃粘膜。壁atrophy-induced SPEM小鼠模型已经建立了通过管理大剂量服用它莫西芬,dmp - 777或L635。46-48然而,这些代谢和消除在很短的时间,因此,任何metaplastic-induced伤害是逆转药物代谢。在我们的研究中,小鼠胃化生是人类引起的胃细菌和坚持了一年多。分析鼠标黏膜组织病理变化在格林尼治时间1个月后,我们观察到相似的表型在粘膜tissue-administered和胃fluid-administered组。这些结果表明,组织病理学改变收件人GF老鼠确实人类胃造成的微生物群。
胃上皮细胞肿瘤的变换可以由慢性炎症引起的,和幽门螺旋杆菌感染被认为是一个主要危险因素。49有趣的是,我们发现GC-derived和IM-derived微生物群促进肿瘤出现前的表现型GF小鼠胃中明显的缺失幽门螺旋杆菌。在老鼠,它通常需要16周后感染h .猫属壁atrophy-induced上皮化生发展发生。50然而,肿瘤出现前的变化检测到格林尼治时间只有1个月后在我们的实验。因此,人类胃以外的微生物群的成员幽门螺旋杆菌可能诱发肿瘤出现前的鼠标粘膜的变化。
胃微生物群会影响胃致癌作用,和潜在的角色的特定类群,包括幽门螺旋杆菌已报告在胃致癌作用。51胃粘膜组织的微生物群进行深入剖析和胃液体,我们揭示了微生物群多样性的特征和成分在个人疾病组。此外,微生物类群之间的相关性及其代谢途径基于两个疾病进展标记,GSII+/ GIF+和ki - 67+细胞,进行了分析。我们的研究表明,特定的细菌属,包括嗜血杆菌和韦永氏球菌属格林尼治时间,与炎症和化生的鼠标粘膜。有趣的是,尿素循环浓缩在捐赠样本诱导更高水平的ki - 67。尿素是一种胃环境中可用的氮源。52来自尿素氮可能被纳入N导致GC的亚硝基的化合物,通过细菌的转换。53感染幽门螺旋杆菌据报道,GC发育的影响。8 9除了研究幽门螺旋杆菌调节胃致癌作用,非造成的风险幽门螺杆菌也被不断提出。11日12在我们的研究中,幽门螺旋杆菌并不是唯一因素致癌表型的变化,当我们观察到没有显著差异幽门螺旋杆菌丰度之间的捐赠者和疾病人群幽门螺旋杆菌-积极的和消极的组织程度的慢性炎症和增加SPEM细胞和增殖细胞的主要上皮血统。的确,幽门螺旋杆菌很少殖民GF老鼠的肚子在格林尼治时间后1个月。因此,划定候选人类群可能与观察到的表型变化。支持,研究人员报道,GF INS-GAS老鼠发育滞后胃肠道上皮内瘤相比,与特定的无菌小鼠后幽门螺旋杆菌感染,23表明特定的肠道微生物群在特定无菌小鼠影响的发展幽门螺旋杆菌相关的胃疾病。此外,胃殖民与共生植物加速杜松子酒的发展限制,INS-GAS老鼠,54这与我们的研究结果是一致的。相比之下,我们多次检索Akkermansia和拟杆菌从不同的分析了CSG捐助者和接受者。有趣的是,Akkermansia现在认为是一个有益的微生物,因为它有助于粘蛋白生产和保护肠道屏障机制,导致抗炎作用。55
本研究的局限性包括老鼠格林尼治时间用于实验的小样本大小容量的限制我们的女朋友鼠标设备,缺乏可行的微生物的定量测量,成功殖民的某些微生物(特别是人类的胃幽门螺旋杆菌)在小鼠胃,导致困难来推断人类胃微生物群的整体交互胃疾病进展。尽管这些限制,我们表明,从患者IM和GC格林尼治时间触发慢性炎症的发展和恶化前的病变,包括壁细胞损失,化生,增生的上皮区和扩张,在收件人GF老鼠。这些变化预测是由胃微生物群。我们还描述了一种新的动物模型为研究人类在人类胃胃疾病微生物移植到老鼠的女朋友。与传统的动物模型相比,包括与mouse-adapted INS-GAS老鼠或治疗幽门螺杆菌格林尼治时间紧张,这女朋友小鼠模型更可能是一个“人性化胃微生物群。我们的模型可以应用于研究与微生物因素和宿主基因之间的相互作用,探索微生物菌株或代谢物的治疗影响治疗胃的疾病。
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我们感谢Byung Min, Jongseok金,李Sungeun技术援助。
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脚注
S-KK, JCP和KHK共同第一作者。
肯尼迪KTN和永昌龙联合高级作者。
S-KK JCP, KHK同样起到了推波助澜的作用。
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。作者,所以李大坝,已被添加。
贡献者永昌龙,KTN和肯尼迪构思,设计和指导这项研究。永昌龙,JCP, SDL和BRH收集人类的样本和安排的临床资料。KHK、YC、提单、J-JL HJ,哟,S-HK KTN GF鼠标执行实验,观察了GF鼠标表型。S-KK J-KY, YC和肯尼迪获得并分析了微生物群数据。S-KK JCP, KHK解释结果和起草了手稿。肯尼迪,共青团KTN审查和编辑的手稿。所有作者讨论的结果和评论手稿。
资金本研究支持部分由韩国国家研究基金会(批准号。联盟- 2017 r1a2b201288714和联盟- 2017 m3a9f304772821)和韩国卫生技术研发项目(HI17C1516010018)通过韩国健康产业发展研究所,由卫生部&福利,韩国永昌龙;韩国鼠标表现型项目(nrf - 2016 m3a9d5a01952416)和韩国国家研究基金会(nrf - 2017 m3a9f3041234) KTN;韩国国家研究基金会(nrf - 2014 m3c9a3068822和联盟- 2017 m3a9f3047857)肯尼迪;韩国国家研究基金会(NRF - 2020 r1c1c1004778) S-KK;和教师科研补助金延世大学医学院(6-2016-0059)JCP。出版的部分支持由大脑韩21个项目;JKY和YC是这个项目的奖学金获奖者。
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