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胰腺
原始研究
在胰腺癌前体分子异质性和共性胃和肠道表型
  1. Sven-Thorsten Liffers1,2,
  2. 劳拉·戈弗雷1,2,
  3. 丽莎Frohn3,
  4. 丽娜一3,
  5. Aslihan Yavas3,
  6. 丽塔Vesce3,
  7. 沃尔夫冈•戈林3,
  8. Friederike V Opitz3,
  9. Nickolas Stoecklein4,
  10. Wolfram Trudo Knoefel4,
  11. 安娜梅丽莎Schlitter5,
  12. 京特·Kloppel5,
  13. Elisa Espinet6,7,8,
  14. Andreas Trumpp6,7,8,
  15. Jens T Siveke1,2,
  16. 艾琳埃斯波西托3
  1. 1桥实验研究所肿瘤治疗,埃森大学西德癌症中心医院,埃森、德国
  2. 2实体瘤转移肿瘤,德国癌症联盟(DKTK、合作伙伴网站埃森)和德国癌症研究中心,DKFZ,海德堡、德国
  3. 3海因里希·海涅大学病理学研究所和杜塞尔多夫大学医院,杜塞尔多夫、德国
  4. 4一般,内脏和儿科手术,Heinrich-Heine-University和杜塞尔多夫大学医院,杜塞尔多夫、德国
  5. 5病理研究所,科技想象图,慕尼黑、德国
  6. 6HI-STEM-Heidelberg干细胞技术和实验医学研究所GmbH是一家,海德堡、德国
  7. 7分裂的干细胞和癌症,德国癌症研究中心和DKFZ-ZMBH联盟,海德堡、德国
  8. 8德国癌症协会,(DKTK),海德堡、德国
  1. 对应到艾琳埃斯波西托教授病理学研究所Heinrich-Heine-University杜塞尔多夫和杜塞尔多夫大学医院,40225年杜塞尔多夫,德国;Irene.Esposito在{}med.uni-duesseldorf.de

文摘

客观的由于有限的可改变的危险因素,二级预防策略基于早期诊断是首选途径改善胰腺导管腺癌的预后(PDAC)。在这里,我们提供了一个比较形态形成PDAC前兆分析针对解剖致癌作用的过程和处理蔓延前的病变的异质性。

设计针对性和全基因组测序信号低,全基因组甲基化和转录组分析是应用于122年最后一个集体形态特征明显低级和高级PDAC前兆,包括肠道和胃导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)和胰腺上皮内瘤(PanIN)。

结果粘蛋白基因的表观遗传调控决定PDAC前兆的表型。PanIN和胃IPMN显示导管分子概要文件和许多类似的监管途径,包括Notch通路,但可以被反复删除杰出和微分甲基化,部分由于mucin-like 3的表达。肠道IPMN显然是不同的病变在分子水平上更不稳定的基因型相关,可能不同的导管细胞室。

结论PDAC前体与胃和肠道表型是异构的形态、遗传和表观遗传资料。这种异质性不同的细胞的身份有关,可能不同的病因学。

  • 胰腺病理
  • 胰腺肿瘤
  • pre-malignancy——胃肠道
  • 基因表达
  • 基因突变

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 326550

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    已知关于这个主题是什么呢

    • 导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)和胰腺上皮内瘤(PanIN)是众所周知的胰腺导管腺癌(PDAC)前体和关于他们的形态学和免疫组织化学特点和基因档案。

    • PanIN和胃IPMN主要是局部的外围管道系统和基于它们的大小主要是杰出的。

    • 肠道IPMN大多主要与高频管病变玲娜突变。

    这个研究增加了

    • PanIN和胃IPMN有非常相似的遗传和表观遗传剖面导管细胞间的可追溯性。

    • 微分的表观遗传调控和表达mucin-like 3 (MUCL3)和复发的存在拷贝数变异(主要是删除)在胃IPMN可能表明这些病变的发展潜力高。

    • 肠道IPMN显示一个独特的遗传景观和更高层次的基因组不稳定性较高的扩散率已经在低度病变,建议更高的发展相比PanIN和胃IPMN易感性。

    • 肠道IPMN显示upregulation粘蛋白分泌相关的基因签名,分明表观遗传资料基于DNA甲基化模式与PanIN和胃IPMN相比,有关他们不同的成年细胞类型在导管内舱。

    这项研究可能会如何影响研究、实践或政策

    • Immunophenotypical,必要时,分子亚型在正确分类基本PDAC前体与不同病理报告的进展和其使用风险应该被强制执行。

    • 尽管他们的相似之处,区分PanIN和胃IPMN相关,应该追求可用(例如,玲娜突变),可能是新成立的标记,如MUCL3。

    • PDAC前体subtype-directed血统和病原学的因素的研究将允许识别和评价lesion-specific预防策略。

    介绍

    胰腺导管腺癌(PDAC)是一种最积极的人类肿瘤和代表第四个在西方国家癌症相关死亡的最常见原因。1治疗手术方法只在大约20%的患者是可行的。2尽管许多进展在过去的几年内,PDAC病人幸存的数量超过5年令人失望的低,大多数病人将屈服于他们的疾病。3 - 5目前治疗策略集中打击先进的疾病,目前在大约一半的情况下诊断,结合标准化疗与目标免疫疗法迄今受益有限。6 7

    与其他固体肿瘤,如肺癌、乳腺癌或者结肠癌,只有少数已知因素增加PDAC发展的风险。6 8在至少部分修改的因素,长期吸烟、肥胖、糖尿病和非遗传性慢性胰腺炎与PDAC终生危险性增加三倍到6倍。其他因素包括遗传原因确认或仍然未知的基因改变,有效的筛选策略的人仍下落不明。9日10因此看来,唯一有效的策略大大改变这种惨淡的疾病的预后是检测和治疗非常早期的阶段,可能在其前体病变阶段。11

    导管内和胆囊病变属于PDAC目前公认的前兆,包括胰腺上皮内瘤(PanIN)、导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)、导管内oncocytic乳头状肿瘤,导管内tubulo-papillary肿瘤和粘液性囊性肿瘤。12日13其中,PanIN和IPMN最相关的由于他们的频率(PanIN)和相关的临床挑战治疗(IPMN)。PanIN代表最漫长和经典PDAC best-characterised前兆,尽管他们进步频率较低。14日15IPMN包含三个组织病理学亚型,即肠、胃和pancreatobiliary,以不同的形态、immunophenotype,部分,生物的行为。13尽管有这些差异,无数重叠的功能存在,区别并不总是明确的。例如,尽管肠道IPMN通常是局部的在主胰管,他们可能会延长,甚至很少发生,在外围分支导管。同样适用于branch-duct胃IPMN,可以扩展或发生在主胰管。此外,混合免疫表型检测在大约5%的情况下,最近,一个可能的来源的肠道IPMN胃IPMN提出了。16日17此外,PanIN和胃IPMN之间的区别主要是基于它们的大小(分别为< 0.5厘米,> 1厘米)和不同的频率玲娜突变。然而,他们共享一个共同的本地化和一个相同的形态学和免疫概要文件(图1一个),呈现区别不是简单的小IPMN(“初始”)。18这种区别可能的临床相关性,例如,设置的术中检查胰颈缘:而留下PanIN将没有任何后果在大多数情况下,一个残胃复发IPMN可能承担的风险更高。19日20

    Intraductal precursors of pancreatic cancer: morphology and genetics. (A) Morphology and immunohistochemistry: PanIN and gastric IPMN are distinguished according to morphology and size and display an identical immunohistochemical profile with diffuse positivity for MUC5AC and no expression of MUC1 and MUC2. Intestinal IPMN are clearly distinct lesions, both on the morphological and immunohistochemical level, characterised by positivity for MUC2 and MUC5AC. H&E and immunohistochemistry (see ‘Materials and methods’ section; scale bar=200 µm). (B) Targeted-next-generation sequencing analysis: low-grade and high-grade PanIN, gastric IPMN and intestinal IPMN were included in the analysis. Cases with a concomitant PDAC are indicated with a black square and those with associated PDACs are marked in addition with a white X. Labelled mutations represent pathogenic mutations according to the ClinVar database and/or the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines with an allele frequency of ≥3%. Red squares represent missense mutations, grey squares are nonsense mutations and blue squares are frameshift mutations. Empty squares indicate absence of pathogenic mutations. Analysis was performed using a 21-gene custom panel on the S5 Ion Torrent platform (Phred score ≥30, coverage ≥500). IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; MUC1, mucin 1; MUC2, mucin 2; MUC5AC, mucin 5; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    管内的胰腺癌的前身:形态学和遗传学。(A)形态学和免疫组织化学:PanIN和胃IPMN杰出根据形态和大小和显示一个相同的免疫组织化学剖面与扩散积极性MUC5AC MUC1和MUC2的表达。肠道IPMN显然是不同的病变,在形态学和免疫组织化学水平,特点是MUC2和MUC5AC的积极性。)和免疫组织化学(见“材料和方法”部分;酒吧= 200µm)。(B) Targeted-next-generation测序分析:低档、高档PanIN IPMN胃和肠道IPMN被包括在分析中。例相应PDAC表示黑方块和那些相关PDACs标记除了白色x标记突变代表根据ClinVar数据库和/或致病突变的美国大学医学遗传学和基因组学指南的等位基因频率≥3%。红色方块表示错义突变,灰色方块无意义突变和蓝色方块移码突变。空方块显示没有致病突变。分析使用已定义面板在S5离子激流平台上(phr分数≥30日报道≥500)。 IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; MUC1, mucin 1; MUC2, mucin 2; MUC5AC, mucin 5; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.

    最近的研究试图阐明前体病变浸润性癌症的恶化。因此,PanIN被量化的遗传进化,露出一段大约7年所必需的一个启动细胞发展成转移性癌症。21然而,这种模式往往与快速进行性疾病的临床观察与系统性传播前临床的外表,因此建议额外的可能性,没有完全阐明更迅速发展模型如chromothripsis而不是或除了线性分段遗传进化。22日23日逐步发展模式被认为在IPMN中发挥作用,但这些病变的自然历史尤其是考虑到不同的亚型,在很大程度上仍是个未知数。24

    因此明显,许多问题关于胰腺癌的发展从起源的细胞前体高档和侵入性损伤及其相互关系保持开放。在这项工作中,我们提供的第一个广泛的遗传和表观遗传描述PDAC前体分子比较关注肠道和胃IPMN PanIN。

    材料和方法

    额外的协议和完整的程序中描述在线补充材料和方法部分。

    研究群体

    组织收集的前驱病变PDAC从2008年- 2021年154个病人动手术。研究对象包括132个不同的前体病变,包括PanIN (n = 55)和IPMN (n = 77);59个病灶(44.6%)的上下文中发生PDAC (表1,在线补充图1)。所有病变被审查评审所有幻灯片根据当前标准和术语。12个25只包含在预先存在PanIN导管。代表幻灯片从所有病变与抗体染色粘蛋白1 (MUC1),粘蛋白2 (MUC2),粘蛋白5 (MUC5AC)和尾型同源框2 (CDX2)组织病理学亚型。13只有形态学和免疫组织化学被认为是区分PanIN和胃IPMN和IPMN子类型化。诊断是由一个病理学家拥有超过20年的经验在胰腺病理学(IE);困难的情况下,讨论了与另一个病理学家拥有超过50年的经验在胰腺病理学(门将)。在IPMN和PDAC PDAC被定义为“关联”如果有明显形态学证据的起源来自IPMN(即入侵组件起源于导管内病变)。如果IPMN不是PDAC空间相关,这被认为是一个“伴随”PDAC。集体79前体病变(其中66也被用于这项研究分子分析)和24 PDAC标本被张幻灯片分析免疫组织化学测试三叶草的表达因子3 (TFF3)和mucin-like 3 (MUCL3)蛋白(在线补充表1 a, b)。

    把这个表:
    表1

    研究群体

    估计信号低DNA拷贝数变异的全基因组测序和甲基化数据

    这一分析,36 PanIN(28低级和8高档),38胃IPMN(29低级和9高档)和21肠道IPMN(8低级和13个高档)。28病变胃IPMN (11 PanIN, 13和4肠道IPMN)被分析信号低全基因组测序(WGS)。简单地说,从formalin-fixed孤立的基因组DNA,石蜡包埋(FFPE)样本与Ampli1放大WGA的工具包(Menarini硅生物系统、博洛尼亚、意大利)根据制造商的指示。十毫升Ampli1 WGA的产品被用来清理1.8×SPRIselect珠子(贝克曼库尔特,Lahntal,德国)。之后,信号低全基因组库准备与Ampli1低通工具包(Menarini硅生物系统公司)根据制造商的指示。片段上的最终确定库浓度分析仪(先进的分析技术,艾姆斯,爱荷华州,美国)与安捷伦高灵敏度基因组DNA 50 kb工具包(安捷伦科技,Ratingen,德国)。一个额外的大小选择不做。100点的克分子数相等的图书馆与离子S5系统池创建和测序(ThermoFisher科学、Dreieich、德国)中描述在线补充方法。

    离子浏览器套件序列映射到GRChr37 / hg19基因组。离子记者软件(V.5.12.0.0)用于拷贝数确定低通的测序。日志2(肿瘤/正常)值的计算为每个地区。作为对照组,六个正常组织样本由腺泡的组织分离和测序方法。拷贝数的地区一个日志2比率大于+ 0.2,小于−0.2被认为是。中值的绝对值成对差异值设置为< 0.35。

    额外67病变(24 PanIN 26 IPMN胃和肠道IPMN 17日)进行分析使用的数据与英飞纳姆甲基化DNA甲基化概要文件获得史诗BeadChip(见下文,“差异甲基化分析”)。在这里,拷贝数变异(CNV)估计conumee包(V.1.3)26使用默认设置。正常控制服务的结合强度大部分腺泡样(n = 11);变化的0.2和0.2−意味着段值被设置为阈值来定义拷贝数的收益与损失。检测常见的史诗和低通样本之间的区域,床上文件生成并与BEDTools (V.2.3)。27常见的区域被定义,如果三个或三个以上样本分析前驱病变内共享相同的位点。对于那些来袭,注释策划NCBI RefSeq基因从UCSC基因组浏览器检索(GRCh37 / hg19)。

    差异甲基化分析

    与英飞纳姆甲基化DNA甲基化资料测量史诗BeadChip(美国圣地亚哥Illumina公司)基因组学和蛋白质组学的核心设施海德堡德国癌症研究中心。甲基化分析使用R Bioconductor包冠军(V.2.14.0)。28简而言之,IDAT文件加载到冠军和预处理。在第一步中,所有探头检测p值> 0.01被排除在外。其后排除探测珠数> 3至少5%的样本,non-cg探针,单核苷酸多态性(SNP)包含探测器和性探针也被过滤。过滤数据集是正常使用β混合物分位数扩张(BMIQ)方法和批处理微分分析前纠正。不同甲基化探针被δ0.2定义和调整后的p值(Benjamini-Hochberg方法)≤0.05。系统发育树的绘制使用R-package猿(V.5.3)。

    结果

    形态

    样本队列由55 PanIN(41.7%)、46个胃IPMN(34.8%)和21肠道IPMN (15.9%) (表1)。Pancreatobiliary和混合型IPMN被排除在进一步分析由于小样本大小。PanIN和胃IPMN显示相同的immunophenotype (图1一个),著名根据既定标准。12个25

    基因突变、融合转录分析和染色体拷贝数PDAC前兆的畸变

    针对下一代测序了59个样本,包括7控制正常腺泡的组织样品。在细节,23 PanIN(17个低级和6高档;12的情况下没有PDAC), 23岁胃IPMN(17个低级和6高档)和6肠IPMN(2低级和4高档)测序使用自定义的小型面板(图1 b;在线补充表2)。

    喀斯特G12突变的外显子2中PanIN 16/23(69.5%),胃IPMN 19/23(82.6%)和2/6(33%)肠道IPMN。喀斯特Q61第3外显子突变被发现在一个PanIN胃IPMN,占总数的5.1%喀斯特突变的情况下(在线补充表3)。致病性R201玲娜变异存在于17/29 (58.6%)IPMN和2/23 PanIN(8.6%),而IPMN 1/29(3.4%)显示玲娜Q227突变。致病性TP53突变被发现在四个高档病变(2 IPMN(2.2%)和2 PanIN (8.7%))。此外,ARID1A,PIK3CA,STK11,PTEN和CDKN2A废话和移码突变中观察到一些个人病变(图1 b;在线补充表3)。的总体频率突变PanIN标本没有PDAC没有明显不同于PanIN与PDAC标本(没有显示)。IPMN有显著更高的等位基因频率(VAF)的变体喀斯特和玲娜比PanIN (在线补充图2 a - b),可能是由于污染切割PanIN正常组织的损伤。皮尔森相关分析的双突变(喀斯特和玲娜)胃IPMN样本证实这两个突变的VAFs之间的正相关(r = 0.9795, p≤0.0001,图2 c在线补充),这表明这些最有可能发生在相同的细胞。

    没有突变的6例(4 PanIN,胃IPMN和肠道IPMN)受到融合转录分析检查可能的替代司机。五个样本显示没有检测融合成绩单(图中未显示);在一个案例中(低级PanIN),分析由于RNA质量不足是不可能的。形态不是预测的遗传状况;代表病变与相同的形态和不同的基因变化的例子所示在线补充图3。

    接下来,我们评估CNV由两个正交的方法:DNA甲基化数组数据和全基因组测序信号低。三国前体病变,PanIN显示样本受基因影响的最低数量损失和收益(n = 22日61%),其次是胃IPMN (n = 29, 76%)和肠道IPMN(21日100%)(表2一个)。没有关系的程度发育不良和CNV的存在/没有(在线补充表4)。虽然肠道IPMN显示一般每个样本放大删除和数量增多,但有一个显著的差异中等大小的删除胃IPMN (4.5 Mb)与PanIN (0.7 Mb)和肠道IPMN (2.3 Mb)。CNV值所示在线补充表5。此外,只有显示胃IPMN亏损的TP53(对应。17)CDKN2A(对应。9)在多个样本(表2 b)。删除11号染色体上完全是在肠道中发现IPMN影响假定的肿瘤抑制基因CTNND1,即,自动取款机和KMT2A。旁边这个轨迹,肠道IPMN通常受到放大(图2 b和C)。这一发现得到粒度中值为5.1 Mb /放大与1.2 Mb /放大和2 Mb /放大PanIN和胃IPMN分别(表2一个)。此外,周期性区域包含一个公认的致癌基因只在肠道IPMN检测。在肠道IPMN前兆,放大的高患病率染色体7 (表皮生长因子受体,见过,BRAF)、8日(MYC),12 (CDH4)和20 (玲娜),这是放大在5个或更多情况下(表2 b)。明显高于ki - 67在肠道IPMN那时率(在线补充图5)可能会进一步支持更高水平的基因组不稳定性的存在肠道IPMN。

    把这个表:
    表2

    (一)概述DNA拷贝数变异(CNV)的胰腺前体病变,(B)基因组区域受到CNV的详细概述

    Copy number variation (CNV) in PanIN, gastric and intestinal IPMN. CNVs were detected in PanIN and IPMN over the whole-genome by low-coverage sequencing. Regions in red show copy number gains and regions in blue represent copy number losses. (A) PanIN (n=11, 9 low-grade and 2 high-grade) do not possess repeated or larger regions of CNV; (B) gastric IPMN (n=13, 9 low-grade and 4 high-grade lesions) reveal three distinct repeated regions of copy number loss at chromosome 6, 9 and 18; (C) intestinal IPMN (n=4, 2 low-grade and 2 high-grade) had the highest frequency of chromosomal alterations. The broad genomic alterations generally involve entire chromosomes and are mostly located on chromosome 7, 8, 12, 18 and 20 (dark grey background=high-grade lesions, light grey background=low-grade lesions; log2 value, threshold±0.2). IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    拷贝数变异(CNV) PanIN,胃和肠道IPMN。基因拷贝数异变在PanIN发现,IPMN信号低的全基因组测序。地区红色显示拷贝数增加和地区蓝色代表拷贝数的损失。(一)PanIN (n = 11日9低级和2高档)不具备CNV的重复或较大的地区;(B)胃IPMN (n = 13日9低级和4高档病变)显示三种不同的重复区域拷贝数在6号染色体丢失,9和18;(C)肠道IPMN (n = 4, 2个低级和2个高档)染色体改变的频率最高。广泛的基因组变化通常涉及整个染色体,大多位于染色体7,8、12、18和20(深灰色背景=高档病变,浅灰色背景=低度病变;日志2值、阈值的±0.2)。IPMN,导管内乳头状粘液性肿瘤;PanIN,胰腺上皮内瘤。

    全基因组DNA甲基化分析PDAC体细胞

    DNA甲基化数据生成79 FFPE样本不同的前体病变,包括27 PanIN(20低级和7高档),32个胃IPMN(24个低级和8高档)和20肠道IPMN(8低级和12高档)。相比之下,我们从正常的腺泡的生成DNA methylome概要,导管和神经内分泌细胞的隔间。因此,腺泡的大部分组织(n = 11),主要管(n = 11)和分支管道(n = 8)细胞制剂以及流式细胞仪(荧光激活细胞分类)排序β-cells (n = 3)从健康胰腺组织被包括在分析中。此外,我们添加了公开的样本FACS-sorted导管细胞(n = 4)和FACS-sorted腺泡细胞(n = 4)内部控制。29 30

    数据处理后,702 656调查被用来分析细胞类型和前体lesion-specific DNA甲基化配置文件。尽管内部之间不同的样品制备和公开可用的样本(即FFPE vs新鲜冷冻),多维标度显示一个连贯的腺泡的大部分人口的组织样本和腺泡排序,而传播的导管细胞更大(在线补充图4)。基于探针的层次聚类与已知的导管和腺泡的标记清晰分离正常细胞的数量(在线补充图4 b)。论文认定位于腺泡的标记基因的甲基化水平较高的导管细胞,而导管标记hypermethylated在腺泡的细胞。两两比较的对照组显示类似数量的差异甲基化探针(12.4%)和导管和腺泡和导管细胞β-cells (11.3%)。然而,基于多维标度,β-cells之间的距离,另两个正常胰腺腺泡和导管细胞之间的细胞类型大于(图3一)。最高程度的显著差异甲基化检测肠道IPMN和β-cells之间(26.8%),而没有观察到显著差异甲基化CpG主要分支和导管和胃之间IPMN PanIN病变,分别为(图3 b)。解决潜在功能的影响之间的差异甲基化检测探针(纯数字)不同的前体病变,我们寻找丰富KEGG(京都基因和基因组的百科全书)基因集。这一分析显示许多不同基因集富集PanIN和肠道IPMN之间,涉及的信号通路以及通路调节信息和cell-extracellular矩阵相互作用(图3 c)。当比较胃和肠道IPMN,只有三个丰富基因集,包括微分调节的粘蛋白类型O-glycan生物合成和刺猬信号通路,等等。值得注意的是,由于低数量的纯PanIN和胃IPMN之间,没有检测到显著富集基因集,主张两个病变之间的高度相似性,提出的系统发育树分析(图3 d)。

    DNA methylation profiling of normal pancreas cells and PDAC precursor lesions. (A) Multidimensional scaling based on the 5000 most variable CpG probes. (B) Scatter plots showing pairwise comparisons of methylated probes between indicated precursor lesions and cell types. Significantly hypermethylated probes (delta beta ≥0.2; adjusted p value ≤0.05) are coloured in red and hypomethylated (delta beta ≤−0.2; adjusted p value ≤0.05) in blue, respectively. (C) KEGG pathway enrichment analysis of differentially methylated probes between IPMN and PanIN. (D) Phylogenetic tree displaying the relationship between precursor lesions and pancreatic cell types based on DNA methylation data. ABC, ATP-binding cassette; ECM, extracellular matrix; gIPMN, gastric IPMN; iIPMN, intestinal IPMN; IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; TRP, transient receptor potential.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    DNA甲基化分析正常的胰腺细胞和PDAC前体病变。(A)多维标度的基础上,5000年大多数变量CpG探针。(B)散点图显示甲基化探针之间的两两比较显示前体病变和细胞类型。明显hypermethylated探针(δβ≥0.2;调整后的p值≤0.05)在红色和hypomethylated彩色(δβ≤−0.2;分别在蓝色调整p值≤0.05)。(C) KEGG通路富集分析差异甲基化探针IPMN和PanIN之间。(D)系统发育树显示前体病变和胰腺细胞类型之间的关系基于DNA甲基化数据。ABC,磷酸腺苷盒;ECM,细胞外基质; gIPMN, gastric IPMN; iIPMN, intestinal IPMN; IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; TRP, transient receptor potential.

    我们下一个评估潜在的差异之间的甲基化模式低档、高档肿瘤出现前的前驱病变。值得注意的是,我们发现没有明显的DMP低级和高级肠与胃之间IPMN或肠道IPMN与胃IPMN PanIN,分别。当比较低级和高级PanIN病变,86重要的纯与59 PanIN低档、高档样本之间的基因被发现,然而,没有候选人基因或基因网络发展成为明显的作为有前途的候选人司机(在线补充表6 a, B)。

    转录组分析PDAC体细胞

    得到的特点进一步洞察PanIN IPMN,转录组数据来自41个不同FFPE样本来自10 PanIN(4 6低级和高级),12个胃IPMN(6 6低级和高级),12个肠道IPMN(6 6低级和高级),4 PDAC (IPMN无关)和3腺泡的大部分组织的样本。主成分分析显示一个清晰的分离肠道IPMN,和其他前体(图4一)。观察到的模式是类似与DNA甲基化的结果数据,进一步突显出PanIN之间的密切关系和胃IPMN也在转录水平。始终,只有很少的基因差异表达与胃IPMN PanIN (图4 b)。可视化管道RNAseq)(毒蛇)分析显示相似在途径激活胃IPMN PanIN与肠道IPMN相比。这种比较显示在两个前体病变(如胃IPMN和PanIN)基因的Notch信号(即HEYL-Hes-Related家庭BHLH转录因子与YRPW主题,JAG1参差不齐的规范等级配体1,TGFA转化生长因子α)被激活与肠道IPMN (图4 c)。切口的激活信号也观察到单样本基因集充实(ssGSEA)的基础上癌症的标志基因集(图4 d),主张不同的胃而不是肠道IPMN Notch信号活动。

    Transcriptomics-based comparative analysis of precursor lesions. (A) Principal component analysis with the 500 most variable genes displaying a precursor-specific clustering. (B) Upset plot summarised the differentially expressed genes between the three precursors. (C) The precursor-specific activation of transcription factors detected by VIPER analysis based on group-wise comparisons. (D) Single sample gene set enrichments analysis indicates precursor-specific activation of hallmark of cancer gene sets from the MSigDB collection. gIPMN, gastric IPMN; iIPMN, intestinal IPMN; IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; NES, normalised enrichment score; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Transcriptomics-based前体病变的比较分析。(一)主成分分析与500年变化最大的基因显示precursor-specific集群。(B)沮丧情节概括三个前兆之间的差异表达基因。(C)的precursor-specific激活转录因子检测到基于group-wise毒蛇分析比较。(D)单样本基因集丰富功能分析表明precursor-specific激活癌症的标志从MSigDB收集基因集。胃IPMN gIPMN;iIPMN肠道IPMN;IPMN,导管内乳头状粘液性肿瘤;NES,正常化浓缩分数;PanIN,胰腺上皮内瘤。

    识别和验证的前体subtype-specific标记

    我们进一步验证数据通过比较他们最近发表全面的胰腺细胞转录组描述获得健康的器官捐赠者。31日在这里,消化酶的表达水平较高,包括CPA1(carbopeptydase A1),PRSS1(蛋白酶丝氨酸1)和相关的转录因子FOXP2基因(forkhead盒P2)和RBPJL(复合信号结合蛋白为免疫球蛋白Kappa J地区),从正常胰腺(获得样品中发现了图5一个)。有趣的是,逐步减少表达水平确定了一些标记(CPA1,RBPJL),当从前体通常位于周边导管系统,如PanIN和胃IPMN,典型的主要管病变,如肠道IPMN。最有趣的是,肠道IPMN表现出一种与基因相关的子群MUC5B艾滋病患者导管细胞,这已被确认为“小”正常胰腺导管的细胞群。31日这种亚型的特点是粘液分泌相关基因的表达水平更高。因此,更高水平的三叶草的因素TFF3的启动子区域选择性unmethylated,发现肠道IPMN与所有其他前体病变相比,无论是在信使RNA和蛋白质表达水平,分别为(图5 a - b,在线补充图5)。此外,肠道IPMN显示高度差异甲基化基因,如FOXP2基因,DCLK1(doublecortin-like激酶1)BICC2(bicaudal C同族体2)(在线补充图6),这可以归因于祖标记,可能表明存在仍然不明progenitor-like细胞群在胰腺导管系统。

    Identification of different precursor subtype-specific markers. (A) Hierarchical clustering of RNA sequencing data based on published marker genes for distinct normal pancreas cell populations.29 (B) Mean CpG methylation of all TFF3 annotated probes. CpGs located in the coding region are coloured in red (unmethylated: mean β-value <0.4; intermediate: mean β-value >0.4 and <0.6; methylated: mean β-value >0.6). (C) Hierarchical clustering displaying the expression of genes involved in the Mucin type O-glycan biosynthesis and mucins expressed in precursor lesions. (D, E) Mean CpG methylation of the first 20 MUC2 (D) and MUCL3 (E) annotated probes. CpGs located in the coding region are coloured in red (unmethylated: mean β-value <0.4; intermediate: mean β-value >0.4 and <0.6; methylated: mean β-value >0.6). gIPMN, gastric IPMN; iIPMN, intestinal IPMN; IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; TFF3, trefoil factor 3.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    识别不同的前体subtype-specific标记。(A)发布基于层次聚类的RNA序列数据标记基因的正常的胰腺细胞群。29日(B)意味着CpG甲基化TFF3带注释的调查。论文认定位于编码区用红色颜色(unmethylated:意味着β-value < 0.4;中级:意味着β-value > 0.4和< 0.6;甲基化:是指β-value > 0.6)。(C)层次聚类显示在粘蛋白类型O-glycan生物合成相关基因的表达和黏蛋白表达的前驱病变。(D, E)的意思是前20的CpG甲基化MUC2(D)和MUCL3(E)带注释的调查。论文认定位于编码区用红色颜色(unmethylated:意味着β-value < 0.4;中级:意味着β-value > 0.4和< 0.6;甲基化:是指β-value > 0.6)。胃IPMN gIPMN;iIPMN肠道IPMN;IPMN,导管内乳头状粘液性肿瘤;PanIN胰腺上皮内瘤;PDAC,胰腺导管腺癌;TFF3,三叶草因子3。

    进一步关注粘蛋白新陈代谢,我们发现的一个浓缩O-linked糖基化签名丰富在通过应用ssGSEA IPMN亚型(在线补充图7)。作为这个基因组已经观察到甲基化水平(图3 c),我们进一步分析了个人在区分PanIN基因表达和评估其影响,胃和肠道IPMN相互借鉴。在已知precursor-specific表达MUC2(图5 c - d),MUC5AC和MUC6(图5 c),首次分析确定MUCL3作为一个潜在的候选人区分PanIN胃IPMN转录和甲基化(图5 e)的水平。免疫组织化学分析证实更频繁的MUCL3表达式在胃IPMN PanIN (p = 0.02) (在线补充图5)。

    讨论

    在这项研究中,胰腺癌前体与胃和肠道使用基因表型进行分析,外遗传性和转录组的方法来解决它们分子概要文件和评估他们的细胞身份和可能的相似成人胰腺细胞的隔间。我们的主要结果集成genome-based方法的证据不同的基因组结构模式和粘蛋白基因表观遗传调控的潜在的不同表型的PDAC前兆。

    胃IPMN PanIN显示大幅重叠基因表达和DNA甲基化谱,一般以众多监管途径,包括Notch信号,由以前的功能性研究支持在PanIN-driven胰腺癌生成Notch信号。尺码到目前为止,大多数函数性数据都集中在acinar-ductal化生和PanIN形成和发展。而一些小鼠模型已报告引起不同亚型的IPMN结合KC或KPC鼠标35 36基因定位的额外途径,如g蛋白偶联受体(GPCR) (鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α刺激(玲娜)),转换增长因子α(TGFα),开关/蔗糖Non-Fermentable(瑞士/ SNF),无翼/集成(WNT)魔杖phosphoinosotide-3激酶PI3K通路,37切口的功能作用信号发展的胃和肠道IPMN没有明确定义。我们的发现表明,缺口信号选择性参与胃而不是肠道前体的发展。人们很容易推测PanIN和胃IPMN截然不同的前体细胞(与肠道IPMN)响应或要求Notch信号活动。此外,他们显示非常相似的甲基化资料与导管细胞从主和branch-duct室(图3 b, D)。这可能出现在与先前的研究将一个至关重要的角色,喀斯特,切口PDAC前兆信号acinar-ductal重组和发展。38然而,通过比较我们的结果与从单细胞表示正常胰腺组织的分析,31日我们观察到一个保留的表达腺泡的标记在PanIN和胃IPMN,仍可能指向一个贡献的腺泡的细胞室这两种病变,虽然轻微污染由腺泡的细胞显微解剖过程中不能被完全排除。

    有趣的是,WGS和DNA甲基化资料显示更频繁(76% vs 61%) CNV在胃IPMN PanIN病变,与染色体区域受到周期性删除只存在于胃IPMN,因此建议更高的胃IPMN诱变因素的影响,这可能影响他们的进展。39 40重要的微分表达式MUCL3胃IPMN进一步巩固发展潜力高的假设这些病变与PanIN相比,这个分子以来前所述PDAC中过表达,促进其发展通过影响核factor-kappa B信号通路,41但需要更多的数据来证实这些观察。此外,诊断价值的区分PanIN MUCL3胃IPMN可能只有在缺乏表达的情况下,这将排除胃IPMN。发育不良的程度似乎没有与复发性CNV的存在有关,因为低档、高档病变的比例两组没有明显的不同。这是与以往的研究相比,显示出罕见,大多是临时CNV在低级PanIN和IPMN42和识别之间的关联更频繁的在IPMN CNV和更高的组织学分级。43另一方面,CNV分析IPMN主要混合表型透露经常性收益在染色体3中,7、8 - 12,与我们的结果一致。44

    据我们所知,本研究是第一个显示肠道IPMN深刻不同的甲基化资料与PanIN和胃IPMN (图3 a - c),这表明不同细胞的身份。事实上,单细胞测序研究显示一定程度的异质性的细胞群健康成人胰腺。31日45一个小导管的细胞群(定义为MUC5B-positive导管细胞),特点是粘蛋白分泌相关基因的表达水平更高,如TFF3被描述,根据我们的基因和蛋白表达数据(图5 a - b,在线补充图5),可能与肠道IPMN。人们很容易推测,暴露的导管细胞室环境致癌物质,例如,由于胆汁返流作为pancreato-biliary结的解剖变异的结果46个47或改变口腔、胃和肠道微生物,48可能引起肠道表型开关作为第一的适应性反应敏感的细胞类型,其次是发育不良和癌症。由于导管细胞室是唯一一个能够实现长期扩张瀑样从成人健康小鼠,获得49这样一个敏感的细胞类型可能代表一个成年人progenitor-like细胞位于胰腺导管。该模型支持的临床观察,肠道IPMN通常是局部的主胰管,更直接的接触环境致癌物的管道系统的外围。此外,肠道differentiation-dysplasia-carcinoma模型,可能涉及到progenitor-like细胞,已经确认在其他肿瘤类型,如巴雷特食管腺癌,胃癌。50虽然在人类胰腺祖细胞的存在仍争论不休,51微分祖先基因的甲基化模式与其他病变类型相比,肠IPMN发现在这项研究认为不同成人参与这些病变导管细胞类型,包括mucin-secretion签名的激活肠道重组。

    值得注意的是,甲基化概要文件之间的比较低级和高级的前驱病变显示没有明显差异甲基化区域的各种病变的比较亚型。这个分析是有限的总体相对少量的高档病变,临床样本中发现的很少,不平衡组大小。然而,尽管有这些限制,我们的研究结果提供没有明确证据的重要作用差异甲基化区域之间低级和高级胰腺前体病变。

    根据这些结果和最近发表的数据,模型发展的胃和肠道胰前驱可以提出(图6)。根据这个模型,喀斯特突变,非常频繁的基因事件在PanIN和初级和IPMN复发,52 53诱发胃胰导管细胞重编程独立于他们的本地化。在外围隔间,PanIN和胃IPMN通常是局部的,进展和恶性转化是罕见的事件,可能与Notch信号激活,在胃IPMN观察复发性缺失和额外的收购,可能subclonal突变事件不与整个病变的检测方法,如目前的研究之一。单细胞测序确实揭示了胃IPMN intralesional遗传异质性,subclonal突变涉及ARID1A和RNF43基因。54这些可以提供选择性利用单细胞组织在一个明确的病变和解释“失踪”基因驱动的事件的一个子集前体病变在目前的调查研究。同样,一个细胞转录组研究进行一个小集体IPMN不同亚型识别细胞集群的低级IPMN与基因表达的变化中发现类似高档病变。55在主管室另一方面,接触环境致癌物和慢性炎症诱发肠道分化。这可以新创或之前发生喀斯特突变和胃分化细胞与更高频率的周期性的放大,如CNV分析所示,即使在低度病变和较高的增殖活动39 40(图2,在线补充图5)。因此,我们发现黏液O-glycan生物合成途径,这被证明能影响人类癌症进展和转移的相关流程,包括胰腺癌42 56是最高的监管途径不同肠道和胃IPMN之间和肠道之间IPMN和PanIN (图3 c)。所示图6混合表型的发生,也从胃、肠道IPMN进化,一些建议,16可以用这个模型来解释。总的来说,观察不同外遗传性模式支持进一步探索不同的成年人类胰腺细胞车厢,以及病原学的和环境因素分析作为一个令人兴奋的研究领域。

    Model of development of pancreatic cancer precursors. KRAS mutations induce a gastric phenotype characteristic of mostly peripherally located lesions, such as PanIN and gastric IPMN, which are additionally Notch-dependent. Recurrent deletions occur only in gastric IPMN. These share a very similar mucin profile with PanIN, but they can be distinguished to some extent by different MUCL3 expression, with lack of expression arguing against gastric IPMN. Further stimuli, such as exogenous factors related to a different microenvironment and possibly acting on a minor MUC5B-positive ductal cell population, induce an intestinal phenotype, driven by KRAS and/or GNAS mutations, with differential regulation of the mucin type O-glycan biosynthesis, expression of MUC2, CDX2 and TFF3 and recurrent amplifications. Mixed phenotypes and/or a transition from a gastric to an intestinal phenotype may also occur. CNV, copy number variation; IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasms; MUC1, mucin 1; MUC2, mucin 2; MUC5AC, mucin 5; PanIN, pancreatic intraepithelial neoplasias; TFF3, trefoil factor 3.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    胰腺癌的发展模式的前兆。喀斯特突变引起的胃表型特征主要是周边的病变,如PanIN和胃IPMN,此外Notch-dependent。反复删除只出现在胃IPMN。这些有着非常相似的粘蛋白与PanIN概要文件,但是他们可以区分由不同MUCL3表达式,在某种程度上缺乏表达反对胃IPMN。进一步的刺激,例如外生因素与不同的微环境和可能作用于一个小MUC5B-positive导管细胞群,引起肠道表型,由喀斯特和/或玲娜粘蛋白类型的突变,与微分调节O-glycan生物合成,MUC2的表达,CDX2 TFF3和复发性放大。混合表型和/或过渡从胃到肠道表型也可能发生。CNV,拷贝数变异;IPMN,导管内乳头状粘液性肿瘤;MUC1,粘蛋白1;MUC2,粘蛋白2;MUC5AC、粘蛋白5;PanIN胰腺上皮内瘤;TFF3,三叶草因子3。

    这项研究有一些局限性,主要是相关的方法论的类型和执行多个的困难,全基因组分析存档石蜡材料,一侧的限制分析样本的数量和影响的类型的选择分析,例如,有针对性的与whole-exome测序,。此外,出于类似的原因,intralesional异质性,之前已经报道过,44在这项研究没有解决和一些前体病变,如pancreatobiliary IPMN,必须排除由于低数量。

    然而,通过应用多个目标和全基因组分析,我们能够提供第一个全面、大规模的胰腺癌前体分子分析胃和肠道的表现型,展示他们的分子异质性,这可能是不同的细胞相关身份和不同的病因学。此外,无论上述技术的局限性,我们指出一些重叠在甲基化和转录组水平的目标,作为例证TFF3,MUC2和MUCL3,尽管这些分析并不总是在同一组织标本。因此,我们坚信,研究关于前体病变的PDAC应该区分不同的实体和亚型,而不考虑他们作为一个群体。还需要进一步的研究来更好的描述易感细胞类型的胰腺导管舱以及鉴别肠重编程的可移动的原因。

    数据可用性声明

    RNAseq数据可在公共、开放获取存储库。史诗般的数据可在合理的请求。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    本研究大学医院的伦理委员会批准的杜塞尔多夫,德国(伦理。3821)。

    确认

    我们感谢DKFZ微阵列单元的基因组学和蛋白质组学的核心设施提供人类甲基化数组Illumina公司和相关服务。PF张和K Savvatakis承认他们的帮助在准备从FFPE FACS-sorted细胞组织。我们要感谢的支持生物杜塞尔多夫大学医院的德国。

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    补充材料

    脚注

    • S-TL和LG是共同第一作者。

    • JTS和IE是联合的资深作者。

    • 推特@IEspositoPATH

    • 调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。表2的格式已经被修正和图3更新。

    • 贡献者S-TL EPIC-based CNV分析和执行methylome和转录组的分析数据和写的手稿。LG methylome数据分析和比较提供了单细胞的数据和写的手稿。如果收集样品,进行低通WGS和有针对性的门店,她准备进一步分析的DNA / RNA通过手动或者采用激光辅助显微解剖和疣状的一部分执行。LH组和免疫组织化学结果和评估写的手稿。AY导致形态学和免疫组织化学分析和写论文。房车执行和评估免疫组织化学。WG和FVO评估专家组测序和执行和评估融合转录分析。NS造成了研究设计和规划和解释的WGS实验。WTK导致了研究设计、样本数据收集和解释。AMS导致样本收集和分析和研究设计。 GK contributed to the study design and results interpretation and wrote the paper. EE and AT contributed to the methylome analysis and interpretation of the results. JTS planned and supervised the methylome and CNV analysis, contributed to the interpretation of the results and wrote the manuscript. IE conceived the study, planned all experiments, performed the morphological re-evaluation, supervised the WGS and NGS analysis, the sample preparation for further analysis and the immunohistochemistry, interpreted the results, wrote and submitted the manuscript. IE and JTS act as guarantors of the manuscript.

    • 资金这项工作是德国研究基金会赠款支持(DFG) IE(格兰特N°ES285/6-1和ES 285/8-1)。即进一步支持的欧洲委员会(H2020,赠款协议N°824946 - simbit)。JTS支持德国癌症协会(DKTK),由德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、德国研究基金会;# 405344257 / SI 1549/3-2 SI1549/4-1),德国癌症援助(# 70112505 / PIPAC, # 70113834 / PREDICT-PACA)和德国联邦教育和研究(BMBF;01 kd2206a / SATURN3)。这项工作的一部分代表之一的博士论文作者(低频)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。