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摘要
目标治愈性乙型肝炎病毒(HBV)治疗的主要目标是减少或灭活肝内病毒共价闭合环状DNA (cccDNA)。因此，精确的cccDNA定量在临床前和临床研究中至关重要。Southern blot (SB)允许cccDNA可视化，但缺乏敏感性，非常费力。定量PCR (qPCR)没有这样的限制，但由于病毒复制中间体(RI)的共检测，可能会出现不准确的定量。使用不同的样品、保存条件、DNA提取、核酸酶消化方法和qPCR策略阻碍了标准化。在ICE-HBV联盟中，在六个实验室中比较了肝组织和细胞培养中cccDNA分离和qPCR定量的现有和新的方案，以制定最佳实践的循证指导。
设计交换参考材料(hbv感染的人源小鼠肝脏和HepG2-NTCP细胞)进行交叉验证。各组比较了不同的DNA提取方法(Hirt提取、总DNA提取加或不加蛋白酶K处理(+PK/−PK))和核酸酶消化方案(质粒安全的atp依赖性DNase (PSD)、T5外切酶、外切酶I/III)。用qPCR和SB法对样品进行分析。
结果Hirt和- PK萃取减少了共存RI形式。qPCR检测到cccDNA和无蛋白放松环状HBV DNA (pf-rcDNA)。T5和Exo I/III核酸酶能有效去除所有RI形式。相比之下，PSD不消化pf-rcDNA，但不太容易诱导cccDNA过度消化。在稳定的组织(如Allprotect)中，核酸酶对cccDNA有不利影响。
结论我们在这里提出了一个全面的基于证据的指导，优化，控制和验证cccDNA测量使用现有的qPCR分析。
- 慢性肝炎
- 乙型肝炎
- 肝
- 实时PCR
- 肝活组织检查
数据可用性声明
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关于这个话题我们已经知道了什么
乙型肝炎病毒(HBV)基因组，即共价闭合环状DNA (cccDNA)，在肝脏中的持久性是制定HBV治疗策略的主要障碍，其准确量化在临床前和临床研究中至关重要。然而，由于感染细胞中存在HBV DNA分子的异质性，通过PCR定量cccDNA缺乏标准化，在技术上具有挑战性。
这项研究补充了什么
不同的cccDNA提取和定量方案交叉验证使用感染组织和细胞培养。我们提供的实验证据表明，由于样品保存条件和核酸酶处理，某些HBV DNA形式共存和潜在的cccDNA过度消化仍然对基于pcr的cccDNA定量提出了挑战。结果支持根据样本类型优化、控制和验证cccDNA测量的建议。
这项研究如何影响研究、实践或政策
这项工作为通过qPCR定量cccDNA的最佳实践提供了基于证据的指导。所提供的信息将有助于HBV治愈研究项目，旨在评估疗法在临床前研究和临床试验中对HBV库的影响。
介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是慢性乙型肝炎(CHB)的病因，尽管有有效的预防疫苗和有效抑制病毒复制的治疗方法，但HBV仍使2.96亿乙肝病毒携带者面临发展为肝硬化和肝细胞癌的风险。1因此，迫切需要开发具有治愈慢性乙型肝炎潜力的疗法。然而，独特的HBV复制策略使得病毒根除具有挑战性。2了解和精确监测感染细胞和循环中存在的不同病毒成分对于开发和评估新的治疗策略至关重要。
HBV是一种包膜病毒，拥有一个小的(3.2 kb)部分双链(ds)放松环状DNA (rcDNA)基因组，特异性感染人类肝细胞。在感染时，rcDNA被细胞酶修复，产生双链episomal DNA基因组，即共价闭合环状DNA (cccDNA)。3 4（在线补充图1）.通过与组蛋白和非组蛋白结合，cccDNA在细胞核内形成一个稳定的小染色体，作为所有病毒转录本的转录模板。核苷类似物(NAs)和α干扰素是唯一被批准的CHB治疗方法，但主要是抑制性的，因为它们不能清除肝脏中的cccDNA。由于cccDNA在HBV持久性中的核心作用，消除该分子构成了治愈性治疗的最终目标。5这样的目标可能很难实现，目前的研究方法旨在实现功能性治愈，其定义为血清中HBsAg和不可检测的HBV DNA的丢失。2目前探索的治疗策略包括，除其他外，使用衣壳组装调节剂和进入抑制剂，这也可以阻止cccDNA的形成和cccDNA池的肝内扩增，6使用siRNA技术降解HBV转录本，免疫介导的清除和沉默cccDNA分子，或通过基因编辑使其失活。7因此，评估新疗法对cccDNA负荷和活性的影响是至关重要的。此外，我们对临床前模型和患者活检中的cccDNA生物学的理解仍然有限。由于活检材料的缺乏，非侵入性生物标志物(如HBcrAg, HBV RNA)越来越多地被研究作为替代cccDNA标记。8然而，对于这些生物标志物的初步验证，需要适当的cccDNA定量。
HBV研究及其转化到临床的一个主要限制是缺乏基于pcr的标准化方法，允许在HBV感染样本中特异性cccDNA定量。主要的挑战是，当来自病毒输入或与cccDNA序列相同的共存复制中间体(RI)存在大量过量的rcDNA时，如何通过定量PCR可靠地检测cccDNA (在线补充图1）.为了获得特异性，PCR方法使用横跨rcDNA内聚末端区域的引物优先检测cccDNA (在线补充图2A）.不幸的是，这种方法不是完全特异性的，因为它仍然检测到一定数量的高丰度RI，导致cccDNA数量的高估。9日10只有当HBV复制较低时(如NA治疗期间)，用PCR定量cccDNA才显得准确。11日12因此，在具有高病毒生产力的样本中或在接受和未接受治疗的样本之间测量cccDNA仍然具有挑战性，降低RI水平是强制性的。
为了在PCR前降低HBV RI水平，已经提出了各种核酸酶和DNA提取方法，尽管它们在不同实验环境中处理不同HBV DNA形式的功效和特异性存在很大差异。传统的Hirt方法采用十二烷基硫酸钠裂解和高分子量细胞染色质和蛋白质结合DNA的高盐沉淀13从而丰富了无蛋白(pf) DNA分子的恢复，并促进了与病毒聚合酶共价连接的rcDNA的去除。Hirt DNA提取后的Southern blot (SB)可以显示不同的HBV DNA分子，包括cccDNA。14然而，这种方法需要大量的核酸，因此缺乏灵敏度;它不适合肝活检分析或高通量分析，不允许精确量化。
常用的核酸酶显示出略有不同的底物特异性，但有一个共同的特点，即保留封闭环状的dsDNA不被消化。11日15日除了使用不同的核酸酶外，使用不同的DNA提取程序、qPCR条件和归一化增加了可变性，阻碍了实验室之间可靠的比较分析。因此，我们试图通过交叉验证实验比较最常用和更新的协议来协调cccDNA量化过程。基于所获得的结果，我们也根据样本类型提出了控制和验证cccDNA测量的最佳实践建议。
材料与方法
有关人肝嵌合小鼠的产生、感染、治疗和病毒特征，以及HepG2-NTCP细胞培养样本的感染、核酸酶消化和qPCR检测，请参见在线补充资料。
肝组织和细胞样本的制备
在牺牲时取出的肝脏标本在2-甲基丁烷中快速冷冻，并在−80°C保存，直到进一步使用。每个实验室从一只高度感染、未经处理的uPA/SCID/米色/IL2RG-/- (USG)小鼠中提取3块冷冻肝脏(每块约13毫克)。组织块分别在300µL 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM EDTA (pH 8.0)缓冲液中均质，使用一次性均质机(Biomasher II, DWK生命科学，Wertheim，德国)，然后混合并平均分配到三种DNA提取物中。hbv感染的HepG2-NTCP细胞在被分离和运送到四个参与的实验室之前被聚集在一起。每个实验室都收到一个大约1×10的冷冻细胞颗粒7细胞，到达时将其溶解在900µL 10 mM Tris-HCl/10 mM EDTA缓冲液中，并对三种DNA提取均匀分布。由于所有样本都被汇总并在DNA提取中平均分配，结果可以直接相互比较，而不需要对细胞DNA进行额外的归一化。
DNA提取程序
按照制造商的推荐，使用MasterPure完全DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre，可通过Lucigen, Middleton, Wisconsin, USA)分离细胞总DNA。12日19有蛋白酶K处理的总DNA提取(+PK)和没有PK的总DNA提取(−PK)的过程完全相同，除了PK消化步骤在−PK提取中被省略。简单地说，样品被分割在几个微管中(根据制造商的说明，7×105每300µL裂解缓冲液添加4.4 mg组织或细胞)和10 mM Tris-HCl/10 mM EDTA缓冲液，最终体积各为300µL。加入一体积的双浓缩TCL缓冲液(Lucigen)裂解细胞。随后，用2µL RNase A (Lucigen)在37°C下消化30分钟。对于+PK萃取，加入2µL PK (Lucigen)，在56℃下孵育1小时。加入300 μ L MPC缓冲液(Lucigen)后，将样品混合并在冰上孵卵5分钟，然后进行10分钟高速离心，使蛋白质成粒。DNA通过异丙醇沉淀从上清液中回收，溶解在10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA缓冲液中，从一次提取和样品中提取的DNA再次合并。DNA含量通过荧光法(Qubit, Invitrogen)或分光光度法(NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)测定。该协议的详细版本可以在ICE-HBV协议数据库(https://ice-hbv.org/protocol/a-modified-kit-based-hbv-protein-free-dna-extraction-from-liver-tissues-and-cell-cultures-for-hbv-cccdna-southern-blot-and-qpcr /）.为了比较不同的裂解缓冲液，也使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Hilden，德国)的RLT缓冲液重复了该协议。将部分小鼠肝组织按照制造商推荐的方法浸泡在Allprotect Tissue Reagent (Qiagen)中，并在- 20°C下保存几个月。
三分之一的肝脏匀浆和细胞悬液根据Hirt进行DNA提取。13简单地说，样品在10 mM Tris-HCl/10 mM EDTA缓冲液中进一步稀释，最终体积为3 mL。通过加入SDS(终浓度0.6%)，在室温下缓慢搅拌30分钟，实现细胞裂解。加入KCl(终浓度0.5M)后，在4°C下孵育过夜，然后在4°C下14 500 g离心30 min。从上清液中提取DNA，用苯酚提取两次，用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取一次，然后用乙醇沉淀过夜。通过离心将DNA制成颗粒，在70%乙醇中洗涤，并溶解在10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA缓冲液中。
如前所述进行SB分析。19日20该协议的详细版本可以在ICE-HBV协议数据库(https://ice-hbv.org/protocol/a-sensitive-and-rapid-southern-blot-assay-based-on-branched-dna-technology-for-the-detection-of-hbv-dna-in-cell-culture-and-liver-tissue-samples /)和as在线补充文件。
结果
hbv感染肝组织cccDNA提取方案的比较
收集了目前可用的cccDNA提取和定量的新方案，并根据所描述的方案进行交叉验证图1一个。取自hbv感染的人源化小鼠的冷冻肝组织被用作参考材料(在线补充图3）.我们比较了包括(+PK)或不包括(−PK) PK消化步骤的总DNA提取方法，以及不包括PK消化的经典Hirt DNA提取(Hirt)。13忽略PK应该有助于去除共价蛋白结合的HBV DNA，并作为Hirt提取的潜在替代方法进行了研究。先前发表的cccdna选择性PCR策略21基于选择性引物和Taqman探针检测除G (在线补充表1)，并且不会与人类或小鼠基因组序列或HBV DNA整合发生交叉反应，12采用改进的PCR条件进行交叉验证(详情见在线补充图2A-C）.cccDNA检测的特异性是通过连续稀释血清来源的rcDNA和HBV质粒(作为cccDNA替代品)和增加血清来源的rcDNA (在线补充图2D, E）.这些分析表明，即使使用cccDNA选择性PCR引物和探针，当rcDNA水平超过cccDNA水平250倍以上时，血清rcDNA仍能以假阳性的方式扩增。在这种情况下，测量到的cccDNA水平增加，如果不包括降低rcDNA水平的策略，精确的cccDNA定量是不可能的。
不同DNA提取方法对hbv感染USG小鼠肝组织cccDNA qPCR和SB定量的影响(A)用于交叉验证的实验设计示意图。(B)三个实验室使用HBV DNA探针对未消化的DNA提取物进行SB分析。(C) DNA提取物中HBV总DNA和cccDNA的qPCR检测。条形图描绘了这四个实验室的中位数和范围。(D)每个实验室分别显示cccDNA的qPCR测量，相对于+PK DNA提取的量。条形图描述了重复测量的平均值。+PK，蛋白酶K消化提取总DNA;−PK，不经蛋白酶K消化的总DNA提取;cccDNA，共价闭合环状DNA; HBV, hepatitis B virus; Hirt, Hirt DNA extraction, which does not include a proteinase K digestion; qPCR, quantitative PCR; SB, Southern blot.
为了评估不同实验室中三种不同的DNA提取方法，我们首先分析了一只高病毒血症小鼠的肝脏。Hirt和- PK提取可降低SB上的HBV RI水平(图1 b)与+PK萃取相比较。在Hirt和−PK提取程序后，观察到约3.5 kb的“慢迁移带”(已知包含pf rcDNA或去蛋白(dp)-rcDNA)和2.1 kb的“快迁移带”(超螺旋cccDNA)的经典模式。然而，在+PK提取物中大量的RI阻止了明显的条带的显示。值得注意的是，使用高灵敏度的bDNA检测方法，−PK中仍然存在大量涂片，Hirt提取的DNA在未感染小鼠的样本中不存在(参见中示例)在线补充图8C)，并指出这些信号是hbv特异性的。与SB一致，所有实验室的qPCR检测结果显示，Hirt和−PK提取液中HBV DNA总量(1.6log和1.3log减少)和cccDNA (0.5log和0.4log减少)分别较低(图1 c)，与+PK样本比较。蛋白结合RIs的减少明显提高了cccDNA PCR定量的选择性(图1 c)所有实验室(图1 d）.
cccDNA计数正常化到细胞水平
对于所有下游交叉验证实验，使用相同数量的肝组织或细胞数量，以方便实验室和设置之间的比较。然而，在日常实践中，在分析嵌合肝脏时，病毒DNA计数必须归一化到细胞数，以解释输入物质数量或人肝细胞水平的差异。据此，我们测定了基因组DNA (gDNA)和线粒体DNA (mtDNA)的恢复情况(在线补充图4A-C）.尽管已知经典Hirt提取的上清液含有较低水平的高分子量核酸，但在我们的Hirt制备中始终提取基因组DNA，尽管与+PK提取相比，在Hirt和- PK条件下，这些DNA物种的回收率略有降低。然而，这一趋势在各种分析中是相似的，这表明病毒DNA可以归一化为来自相同提取的gDNA或mtDNA。此外，不同裂解缓冲液的直接比较显示，TCL裂解缓冲液(Lucigen)导致gDNA水平比RLT裂解缓冲液(Qiagen)低三倍，尽管这些缓冲液不影响mtDNA的恢复(在线补充图4D-F）.gDNA的这种差异富集将使病毒DNA的正常化向靶细胞倾斜，必须在正常化策略中加以考虑。一种改良的碱性提取Hirt程序，22日23日在两个实验室对肝组织和细胞培养样本进行了测试，结果显示，与原始Hirt相比，基因组DNA恢复较低，但仍可量化(在线补充图5）.通过只富集超螺旋DNA物种，该方法也消除了除“快速迁移带”外的所有HBV DNA物种。
嵌合肝组织中不同核酸酶和消化条件的比较
接下来我们测试了不同的核酸酶和条件来比较它们的功效。基于不同实验室常用的现有方案，T5外切酶被用于两种设置，一种是较强的(' T5 ': 10U, 45分钟)，另一种是较温和的(' T5低':5U, 30分钟)，因为在该联合研究中偶尔观察到cccDNA的过度消化，预计较温和的消化条件将降低这种影响。PSD在经典设置(“PSD”:10U，在20µL总体积中使用6小时)和在更高体积中使用更多单位的设置(“PSD高”:30U，在200µL总体积中使用2小时)中使用，这是基于组织来源样本的经验。ExoI /III组合使用一种设置进行测试(20U ExoI, 25U ExoIII, 2小时)。所有核酸酶治疗均不同程度地降低HBV DNA总量(图2一个）.然而，在实验室之间观察到相当大的差异。使用经典的+PK DNA提取物，“PSD低”条件无法有效地消化总HBV DNA。这很可能是由于提取物中存在的污染物或不适当的pH值对酶的抑制引起的，因为“PSD高”或“PSD低”条件下使用柱纯化+PK DNA弥补了这一问题(数据未显示)。
核酸酶消化对hbv感染USG小鼠肝组织中不同DNA提取物的影响柱状图描述了所有DNA提取物和实验室中HBV DNA (A)和cccDNA (B)的qPCR测量结果，没有核酸酶消化(孵化柱)或经过指定的核酸酶处理。条形图描述了三个实验室的值的中值和范围。每个实验室都重复进行核酸酶消化。核酸酶处理后的值(拷贝数/PCR)首先归一化为各自DNA提取物中未消化的值，然后从Hirt或- PK DNA提取物中得到的所有值归一化为+PK提取物。(C) mtDNA DNA通过线粒体基因ND2的qPCR，描述为在各自DNA提取物中归一化为未消化值的任意单位。(D)在其中一个实验室进行SB分析，使用第二个稳定的HBV感染和未经处理的USG小鼠，所有三种DNA提取物和四种核酸酶消化条件，使用HBV DNA探针(上图)和cccDNA带的密度分析(下图)。“X”表示由于高背景染色而无法定量的样品。这些样本分别在两个不同的印迹上进行，但都含有相同数量的未消化DNA，借助印迹之间的密度测定进行标准化。ND2，线粒体编码NADH:泛素氧化还原酶核心亚基2。 +PK, total DNA extraction with proteinase K digestion; −PK, total DNA extraction without proteinase K digestion; cccDNA, covalently closed circular DNA; HBV, hepatitis B virus; qPCR, quantitative PCR; SB, Southern blot.
当使用cccDNA选择性引物时，我们观察到在核酸酶处理后，即使在Hirt和- PK DNA提取物中，cccDNA计数也有相当大的减少，这表明在这个高度感染的样本中，在这些提取后仍然检测到残留的HBV RI (9×10)8HBV DNA GE/mL) (图2 b）.人类线粒体基因ND2作为episomal DNA的细胞替代标记的分析(图2 c)，揭示了核酸酶消化后mtDNA水平也降低了，尽管程度较低，这表明cccDNA检测的降低不仅是由于引物特异性的提高，部分原因是由于cccDNA的丢失。尽管在实验室中观察到相当大的差异，但在所有DNA提取物和实验室中，T5或Exo I/III处理后的cccDNA中位数水平比PSD处理低3.3倍。为了阐明这些差异的原因，我们使用相同的未消化和消化样本进行了qPCR和SB分析的直接比较(图2 d）.两种方法都证明，所有核酸酶消化都能减少HBV DNA拷贝数(qPCR)和SB上的典型涂片。然而，PSD不能消化通常发现pf-rcDNA的“慢迁移”带，而T5和Exo I/III消化除含有cccdna的“快速迁移”带外的所有HBV DNA形式。此外，在相同的提取过程中，基于外切酶或基于PSD的处理后，cccDNA条带显示出非常相似的密度，这表明PSD消解后观察到的更高的cccDNA PCR计数是由于测量了“慢迁移”带中存在的分子。
用qPCR法检测cccDNA和pf-rcDNA，效率相同
为了评估cccDNA PCR是否能以与cccDNA本身相同的效率识别“慢迁移”带中的HBV DNA物种，我们进行了制备琼脂糖凝胶电泳，分别对不同的HBV DNA带进行了PCR切除和分析。分析了一只未治疗hbv感染小鼠和两只拉米夫定(Lam)治疗小鼠(分别为6周和12周)的肝脏样本;在线补充图3B)，它们被认为具有较低水平的干扰RI。用- PK法提取的DNA在“PSD high”和“T5”消化后进行SB和qPCR。高度感染样本中由HBV RI组成的SB特征性涂片(图3一)和总HBV DNA拷贝(图3 b)在lam处理的小鼠中减少，因此可以在PSD消化前后通过qPCR测量特定的cccDNA (图3 b）.然而，T5处理去除了“慢迁移”带，导致cccDNA PCR测量值比PSD处理低四倍，而快速迁移的cccDNA带的密度保持不变，无论核酸酶消化(图3一）.有趣的是，与未治疗的小鼠相比，经lam治疗的小鼠的cccDNA水平似乎以时间依赖的方式下降。
通过cccDNA-选择性qPCR检测pf-rcDNA的效率与cccDNA相同，但通过T5外切酶处理将其去除。平行SB (A)和qPCR (B)分析3只稳定hbv感染的USG小鼠(拉米夫定治疗或未治疗6或12周后)。用- PK提取肝脏DNA，用核酸酶消化或在分析前不消化。(A) SB使用HBV DNA探针(上面板)和pf-rcDNA(中面板)和cccDNA带(下面板)的密度分析。在消化之前，通过qPCR与人类特异性引物将DNA量归一化至ND2，以确保装载等量的人类细胞DNA。(B) qPCR检测HBV总DNA(灰色条)和cccDNA(检查条)，通过未消化DNA提取物中的人HBB计数归一化到人肝细胞。cccDNA拷贝数/细胞如图所示。(C)制备琼脂糖凝胶，使用与(A)中相同的样品和凝胶电泳相同的设置。分别切除上下条带，提取DNA进行qPCR分析(总HBV DNA和cccDNA)。分别计算来自SB上条带(上)和SB下条带(下)的所有样本的HBV DNA总拷贝数与cccDNA拷贝数的比例。 +PK, total DNA extraction with proteinase K digestion; −PK, total DNA extraction without proteinase K digestion; cccDNA, covalently closed circular DNA; HBV, hepatitis B virus; Lam, lamivudine; NT, non-treated; qPCR, quantitative PCR; SB, Southern blot.
使用相同的样品制备琼脂糖凝胶，分别切除慢迁移和快迁移条带，用qPCR分析总HBV DNA和cccDNA (在线补充图6）.两种PCR方法都以非常相似的方式检测到cccDNA条带，所有小鼠和处理的HBV DNA总与cccDNA拷贝的比例是相同的，除了未经处理的未消化样本(图3 c）.这一观察结果证实，两种PCR方法均检测到仅由cccDNA组成的“快速迁移”带。有趣的是，当分析“慢迁移”带时，也观察到相同的模式，这表明该带中存在的DNA物种与cccDNA本身一样，是cccDNA PCR的有效模板。未处理、未消化的样本中比例略高，可能是由于HBV RI的联合检测，仅在该样本中呈现可见涂片。综上所述，保留慢迁移条带的样品中较高的cccDNA PCR计数强烈表明pf-rcDNA是cccDNA PCR的有效模板。然而，这个带的确切组成还需要进一步研究。值得注意的是，cccDNA形成的一个潜在中间体，封闭的负链rcDNA (CM-rcDNA)，也可能存在于“慢迁移”带中。17cccDNA的缺口(发生在活跃的转录过程中7或在提取过程中不小心)会导致超卷的丢失，缺口的cccDNA会与pf-rcDNA一起迁移(见下文和在线补充图8C）.因此，旨在检测包含在“快速迁移”带中的cccDNA的定量策略应该包括T5或ExoI/III核酸酶，而PSD处理将确保包含潜在损坏的、缺口的cccDNA。
HepG2-NTCP细胞中cccDNA提取和定量方案的比较
按照同样的标准和用于肝组织的方案，我们比较评估了不同的DNA提取方法对HBV感染的HepG2-NTCP细胞中HBV DNA水平的影响。总HBV DNA qPCR检测结果表明，Hirt和−PK萃取液分别以1.7和1.5对数实质上去除了蛋白结合的HBV DNA形式(图4一）.因此，与+PK提取相比，cccDNA计数减少了中位数0.9和0.8 log，表明cccDNA选择性提高(图4A、B）.接下来，我们将不同的核酸酶消化条件应用于这三种DNA提取方法(图4氟）.在+PK提取物中，去除RI可通过PCR降低cccDNA计数。然而，在Hirt和- PK DNA中，在核酸酶消化后，没有观察到进一步显著的cccDNA下降，这表明HBV RI已通过提取过程被充分去除，允许精确的cccDNA定量。所有核酸酶处理后cccDNA水平的轻微降低反映在ND2测量中，表明圆形DNA分子的一般小损失(图4 e）.SB在图4 f复制了与肝组织相似的特征HBV DNA模式，尽管有较少的ri来源涂片。然而，在Hirt和- PK DNA提取物中，T5和ExoI/III后PCR测定的cccDNA水平比psd法低1.5倍。同样，SB观察到的“慢迁移”带仅在基于核酸酶的处理后才降解。
不同DNA提取方法和核酸酶酶切对hbv感染HepG2-NTCP细胞cccDNA qPCR和SB定量的影响(A-F)在感染后第9天收获的冷冻细胞颗粒被运送到参与实验的实验室。(A)未消化DNA提取物中HBV总DNA和cccDNA的qPCR检测。条形图描绘了这四个实验室的中位数和范围。(B)每个实验室分别显示cccDNA的PCR测量结果，并相对于+PK DNA萃取物中的量。条形图描述了重复测量的平均值。(C, D) qPCR检测所有DNA提取物和实验室中HBV总DNA (C)和cccDNA (D)，可以不经过核酸酶消化(孵化条)，也可以经过指定的核酸酶处理(重复执行)。条形图描述了三个实验室的值的中值和范围。核酸酶处理后的值(拷贝数/PCR)首先归一化为各自DNA提取物中未消化的值，然后从Hirt或- PK DNA提取物中得到的所有值归一化为+PK提取物。(E) mtDNA DNA通过线粒体基因ND2的qPCR，描述为在各自DNA提取物中归一化为未消化值的任意单位。 (F) SB using HBV DNA probes (top panel) and densitometric analysis of the cccDNA band (lower panel). The ‘X’ denotes a sample that could not be quantified because of high background staining. The samples were run on two separate blots with identical amounts of non-digested DNA, with the help of which densitometry was normalised between blots. +PK, total DNA extraction with proteinase K digestion; −PK, total DNA extraction without proteinase K digestion; cccDNA, covalently closed circular DNA; HBV, hepatitis B virus; qPCR, quantitative PCR; SB, Southern blot.
另一个可以影响cccDNA测量的因素是接种物的存在，接种物中含有大量的HBV颗粒，可以在培养中持续存在。为了评估输入病毒对cccDNA定量的影响，我们用高滴度hepad38衍生的接种物(MOI 4000)感染HepG2-NTCP细胞，并在没有或存在进入抑制剂布利威肽(BLV)的情况下随访9天。24接种物中含有高水平的pf-rcDNA，在blv处理的细胞中持续到第9天，在此期间，生产感染的建立被排除在外(在线补充图7A）.该污染物可通过' T5 '处理去除，产生约。qPCR检测到cccDNA水平低两倍(在线补充图7B）.值得注意的是，使用这种高灵敏度的bDNA技术，SB检测到几种耐t5的HBV DNA。有趣的是，这些形式在碱性Hirt提取条件下不可见(在线补充图5B）.
DNA质量和储存条件对cccDNA定量的影响
核酸酶处理有一定风险，应谨慎使用。首先，我们观察到不同实验室之间，甚至同一实验室内重复之间的消化效率存在很大差异(数据未显示)。其次，过多的消化条件会导致cccDNA的过度消化。第三，提取DNA的质量是至关重要的，因为cccDNA的缺口将使其成为T5 ExoIII的模板，但不是PSD的模板，而所有酶(除ExoI外)都会作用于含有双链断裂的受损cccDNA。与核酸酶处理相关的风险的例子和解释可以在在线补充结果和图8。
另一个影响提取DNA质量的因素是储存条件。在这项研究中，我们使用了新鲜冷冻的冷冻样本;然而，肝活检的冷冻保存在临床研究中很少可行。取而代之的是使用组织防腐剂。为了模拟这些条件，冷冻保存了两只感染hbv的未处理的人源化小鼠和两只sirna处理的小鼠的小肝脏碎片19被转移到Allprotect，一种常见的组织防腐剂Qiagen，并在- 20°C保存几个月，然后用- PK提取，并用' PSD high '或' T5 '消化(图5一个）.与平行分析的新鲜冷冻样品相比，allprotect保存的样品在qPCR核酸酶酶切后显示出整体上更高的cccDNA水平降低，PSD约为1log, T5约为2log。作为比较，来自sirna处理小鼠的新鲜冷冻肝组织中定量的cccDNA没有因PSD处理而减少，这表明在这种情况下足够低的HBV DNA水平用于特定的cccDNA定量。因此，在Allprotect储存后，mtDNA的减少甚至比cccDNA的下降更明显，而新鲜冷冻组织DNA的mtDNA水平仅小幅下降(图5 b）.这些数据暗示了包括切口和双链断裂在内的一般DNA损伤，并要求在使用核酸酶消化all protect储存的样品时非常谨慎。
核酸酶处理在allprotect储存的样品中有过度消化cccDNA的风险。新鲜冷冻肝组织与全保保存肝组织核酸酶消化的比较。使用−PK方法从两只未治疗的HBV感染小鼠和两只用靶向所有HBV转录本的siRNA治疗的小鼠中提取肝脏DNA，为期6周。DNA用PSD或T5外切酶酶切，qPCR检测cccDNA (A)和ND2 (B)。每个圆点代表一只小鼠，柱状中位数。+PK，蛋白酶K消化提取总DNA;−PK，不经蛋白酶K消化的总DNA提取;cccDNA，共价闭合环状DNA;乙型肝炎病毒;qPCR，定量PCR;siRNA，小干扰RNA。
cccDNA定量的讨论和建议
为了提高我们对cccDNA生物学的认识，验证血清学生物标志物，并评估新疗法对cccDNA水平和活性的影响，可靠和标准化的cccDNA定量分析是至关重要的。为了以比以前更可靠的方式实现这一目标，比较协议和跨实验室进行交叉验证实验至关重要。这项共同努力的结果为指导研究人员和临床试验研究人员设计和执行准确量化cccDNA的方案提供了新的信息。
并行qPCR和SB结果的对比分析是我们研究设计的一个优势，使我们能够了解每种方法如何影响结果，并确定最关键的点。在图6，我们总结了在我们的联盟中验证的方法和与cccDNA定量相关的观察结果。因为所有方案都必须适应样本类型、感染水平和治疗，所以没有一种方案能满足所有需求。相反，我们提供指导和一般建议，总结于表1。
研究的主要发现的示意图。该流程图总结了cccDNA定量的实验流程，并强调了qPCR和SB的最佳和次优结果，包括主要的注意事项。cccDNA，共价闭合环状DNA;qPCR，定量PCR;SB，定量PCR。
通过对三种DNA提取方法的比较，我们可以发现，不仅是Hirt程序，而且商业试剂盒中快速核酸纯化的PK消化步骤可以有效降低HBV DNA RI，从而提高cccDNA PCR检测的选择性。然而，基于−PK或hirt的提取13 22 23可能不足以在高复制环境下进行特定定量，仍然需要核酸酶处理。因此，我们建议进行DNA提取以减少RI和病毒粒子，核酸酶处理以进一步减少非cccdna物种，以及跨越rcDNA内聚末端区域的PCR设计。这种cccdna选择性PCR的使用进一步得到了以下事实的支持:所测试的任何提取方法(−PK、Hirt、碱性Hirt)都不能保证基因组DNA的完全耗尽，这可能是整合HBV序列的来源。这里使用的所有核酸酶都不同程度地降低了RI量，即使当−PK或Hirt DNA提取程序已经降低了HBV RI水平。然而，所有核酸酶都表现出特定的优势和劣势。PSD在+ pk提取的肝脏DNA中表现不佳，可能是由于这些提取物中存在杂质，而T5和Exo I/III外切酶表现类似，尽管高浓度和孵育时间具有cccDNA过度消化的风险。此外，所测试的核酸酶的效率在实验室之间甚至在给定的实验室内都是不同的。这些变化的原因尚不清楚，但可能取决于微小的处理差异、输入DNA的变化和样品杂质的存在。此外，我们发现组织防腐剂特别容易破坏cccDNA。因此，核酸酶在allprotect保存的样品中诱导了cccDNA PCR水平的强烈降低。 Since patient liver biopsies are often stored in Allprotect or similar tissue preservatives, omission of nuclease digestions should be considered. Ideally, liver biopsy samples should be fresh-frozen and cryopreserved. Thus, digestion conditions have to be carefully titrated to avoid unspecific side activities potentially leading to cccDNA digestion or to insufficient digestion of other HBV DNA forms. Since it is laborious to determine whether a nuclease treatment is needed for every sample and condition, we recommend including it for fresh and fresh-frozen samples.
此外，我们观察到PSD不能消化“慢迁移”带，尽管这种处理从−PK和Hirt样品中去除了大部分RI。此外，我们证明，在没有核酸酶处理的情况下，即使在低复制水平的设置下，pf-rcDNA仍然存在，并且这种“缓慢迁移”的带可以通过cccdna选择性PCR检测到。因此，我们建议在不需要检测该带时使用外切酶治疗。SB检测到的这种“慢迁移”带的精确组成尚不完全清楚，但它似乎包含了一种分子混合物，这些分子去除了共价附着的HBV聚合酶，但仍未修复或处于修复过程的不同阶段，如DP-rcDNA或CM-rcDNA。3 4完全修复的尚未共价闭合和超螺旋的HBV DNA分子(未成熟的cccDNA)也将出现在该带内。3 4在细胞培养实验中，“慢迁移”带的一个突出部分可能由输入病毒组成。由于尚不清楚哪些因素和环境(感染状态或治疗)可能会影响rcDNA向cccDNA的转化，“慢迁移”带的强度也可能在样品和实验设置之间有所不同。此外，提取方法的选择也会影响检测到的HBV DNA分子数量。在将原始Hirt与已知优先提取超螺旋DNA的改良碱性Hirt并排比较时，“缓慢迁移”的条带(可能是由具有不同程度超螺旋的环状HBV DNA引起的)似乎丢失了(在线补充图5）.因此，需要进一步的研究来评估这种差异的生物学意义，包括“慢迁移”带在内的cccDNA定量策略是合理的。
对于体外感染研究，我们建议使用基于外切酶的处理(T5或Exo I/III)来去除接种物中存在的非cccdna物种。这种污染物在SB上以显著的“缓慢迁移”带的形式存在，并持续到HepG2-NTCP细胞感染后第9天，尽管使用了已知的进入抑制剂(布利韦肽)，以消除产生性HBV感染的建立。24尽管这里显示的例子使用了极高的MOI (4000)， T5外切酶有效地减少了hirt提取样品中的这种污染物，允许通过qPCR进行特定的cccDNA测量。因此，建议在细胞培养中加入进入抑制剂控制，以排除输入HBV DNA造成的干扰。
由于含有缺口或双链断裂的cccDNA会成为核酸酶的模板，并与pf-rcDNA一起迁移到SB上，因此评估每个提取物中DNA的质量至关重要。我们建议使用线粒体dna -一种episomal dsdna -作为cccDNA的替代品，并在核酸酶消化前后的每个样本中通过PCR定量线粒体基因。根据我们的经验，小于1log的减少表明DNA足够完整，而大于1log的减少则表明DNA受损。mtDNA在以外核酸酶为基础而非psd为基础的消化后过度消化，表明DNA含有单链缺口。因此，外切酶处理后，cccDNA也会被切割和减少。mtDNA水平的PCR评估将表明样品和提取后DNA的质量。
我们承认目前的cccDNA定量方法还不是最优的，并鼓励优化或开发用于DNA提取和cccDNA定量的新方法。25理想情况下，改进的基于pcr的方法在存在污染HBV DNA物种时对cccDNA应该具有更高的特异性，并且应该是稳健的、敏感的和适用于所有病毒分离物。当新的程序允许避免使用核酸酶时，将达到一个里程碑。采用数字PCR (digital PCR, dPCR)代替qPCR，使灵敏度显著提高，并带来了无PCR标准绝对定量的主要优势，从而限制了其可变性。12个26然而，即使使用dPCR, cccDNA在序列相同的HBV DNA物种的复杂混合物中的有限特异性仍然存在。新的方法，以可视化的cccDNA在感染细胞中正在开发，可以补充定量分析，并用于证实PCR和SB结果。27此外，还需要更多的研究来确定所有HBV DNA形式的性质、它们在HBV生命周期中的作用以及它们如何受到各种操作的影响。
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致谢
我们感谢Tassilo Volz, Elena S. Kim, Soujuan Wang, Romina Bester, Chloé Saint Jean, Laura Dimier, Maud Michelet, Emmanuel Combe和Moritz Grunwald的大力技术支持，并感谢程国锋，William E. Delaney和Dieter Glebe的智力投入和建设性讨论。我们要感谢ICE-HBV、ANRS和DZIF对这一倡议的支持。
参考文献
脚注
推特@BingqianQu, @ProtzerUlrike
贡献者LA、BT、JL、MLu、HG、SU、UP、SPF、MLe、FZ、MD发起研究，设计主要实验，讨论数据。CK, JL, BT和MY生成细胞培养样本。LA生成肝组织样本。LA、BT、MY、CK和BQ进行了交叉验证实验。MY, LA和JL表演了Southern blot。洛杉矶分析了数据。LA和MD在BT, MLe和FZ的支持下撰写了手稿。所有作者都阅读并修改了手稿。MD作为本次研究的担保人。
资金这项研究部分得到了德国感染研究中心(diff - bmbf 05.816;05.820)向MD、UP和SU提供了合作拨款(ANRS-DZIF MoU 2016)，向FZ、ML、BT、MD、UP和SU提供了合作拨款。BT、MLe和FZ得到了法国国家研究局(ANR)监督的公共拨款的支持，这是第二项“avenir投资”计划的一部分(参考文献:ANR-17- rhhs -0003)。UP和SU也得到了德国研究基金会(DFG)通过SFB-TRR 179 272983813的支持。MD也通过SFB841 A5得到DFG的支持。HG获得了美国国立卫生研究院的资助(R01AI110762和R01AI123271)。对支持这项工作的所有资金来源予以承认。
相互竞争的利益LA, BT, MY, CK, BQ, MLu, JL和MLe声明没有利益冲突。FZ: Aligos, Antios, Arbutus, Assembly, Blue Jay, Enanta, Enochian, Gilead, GSK，志盟的顾问。HG: Aligos和装配顾问;杨梅的股东。向上:Aligos, Arbutus, Gilead, GSK，赛诺菲，Vaccitech, VirBio的顾问。与雅培和罗氏进行研究合作。SCG细胞疗法的股东和董事会成员。MD:与Gilead、MYR GmbH/Hepatera和HUMABS BioMed合作研究;Gilead和Aligos的顾问。SPF:雇佣和股东吉利德科学公司。
患者和公众参与患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
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