你在这里

  • 家
  • 存档
  • 72年卷8
  • 针对m6A读者YTHDF1增强抗肿瘤免疫力,促进anti-PD-1在结直肠癌疗效

条文本

菜单条
结肠
原始研究
针对m6读者YTHDF1增强抗肿瘤免疫力,促进anti-PD-1在结直肠癌疗效
  1. 易保1,
  2. 结合建宁翟1,
  3. 华融陈2,
  4. 气春黄1,
  5. 从梁3,
  6. Yanqiang叮1,
  7. 丹黄1,
  8. 支郭台铭1,
  9. Danyu陈1,
  10. “潘1,
  11. 魏康4,
  12. Ka Fai,4,
  13. 6月于1
  1. 1内科及药物治疗学讲座,香港中文大学,香港、香港
  2. 2麻醉和重症监护,香港中文大学,香港,香港、香港
  3. 3精密医学研究所、中山大学第一附属医院,广州,中国
  4. 4部解剖和细胞病理学,香港中文大学,香港、香港
  1. 对应到小君Yu博士,内科及药物治疗学讲座教授,香港中文大学,香港,香港;junyu在{}cuhk.edu.hk

文摘

客观的N的作用6-methyladenosine (m6一)在肿瘤免疫微环境(时间)仍然可以理解。在这里,我们从技术上说,云天化N阐明功能和机制6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (YTHDF1)在结直肠癌(CRC)的时间。

设计临床意义的YTHDF1评估在组织微阵列(N = 408)和TCGA组(N = 526)。YTHDF1函数确定同源的肿瘤,intestine-specificYthdf1兄弟老鼠,老鼠和人性化。单细胞RNA-seq (scRNA-seq)是用来配置文件。甲基化RNA免疫沉淀反应测序(MeRIP-seq),核糖体RNA序列(RNA-seq)和测序(Ribo-seq)被用来确定YTHDF1直接目标。Vesicle-like纳米颗粒(VNPs)封装YTHDF1核被用于YTHDF1沉默的体内。

结果YTHDF1表现负相关TCGA-CRC interferon-γ基因签名。认识提高,YTHDF1蛋白质与CD8负相关+t细胞浸润在独立组织微阵列军团,这意味着它的作用。遗传损耗Ythdf1增强抗肿瘤免疫力在CT26 (MSS-CRC)和MC38 (MSI-H-CRC)同源的肿瘤Ythdf1兄弟晋升的免疫抑制的时间促进CRC azoxymethane-dextran sulphate-sodium或Apc分钟/ +模型。scRNA-seq确定减少myeloid-derived抑制细胞(MDSCs),相伴与增加细胞毒性T细胞Ythdf1敲除肿瘤。集成MeRIP-seq, RNA-seq和Ribo-seq透露p65 / Rela YTHDF1目标。YTHDF1提升p65翻译上调处于受控,增加MDSC迁移通过CXCL1-CXCR2轴。增加MSDCs功能CD8对着干+T细胞。重要的是,针对YTHDF1 CRISPR(定期聚集空间短回文重复)或VNPs-siYTHDF1提高anti-PD1功效MSI-H CRC,克服了在海量存储系统(MSS)中CRC anti-PD1阻力。

结论通过一个m YTHDF1损害抗肿瘤免疫6A-p65-CXCL1 / CXCR2轴促进CRC和作为治疗目标免疫检查点封锁疗法。

  • 结肠直肠癌
  • 免疫疗法
  • 结肠致癌作用

数据可用性声明

合理的请求数据。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和许可他们的衍生产品在不同的协议,提供了最初的工作是正确地引用,给出合适的信用,任何更改表示,非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2022 - 328845

来自Altmetric.com的统计

    请求的权限

    如果你想重用任何或所有本文的请使用下面的链接,这将带你到版权税计算中心的RightsLink服务。你将能够获得快速的价格和即时允许重用内容在许多不同的方式。

    已知关于这个主题是什么呢

    • N6-methyladenosine (m6在癌症),修改扮演至关重要的角色通过调节RNA拼接,翻译和退化。

    • YTH N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (YTHDF1)是m6读者决定的命运6修改后的信使rna。然而,它的潜在作用在结直肠癌(CRC)免疫微环境(时间)是可以理解的。

    这个研究增加了

    • YTHDF1高表达基因签名和CD8与interferon-γ呈负相关+在多个群CRC患者T细胞浸润。

    • 单细胞测序表明YTHDF1导致免疫抑制时间增加MDSCs的渗透和效应T细胞减少。

    • YTHDF1促进通过免疫抑制肿瘤生长在同基因的老鼠,intestine-specificYthdf1兄弟的老鼠,CD34+CRC的人性化的小鼠。

    • RNA免疫沉淀反应综合甲基化测序,RNA-seq和Ribo-seq透露p65 / RELA YTHDF1目标,从而增加细胞因子处于受控的表达式,通过CXCL1-CXCR2 MDSCs轴的化学引诱物。

    • YTHDF1-recuited MDSCs抵销效应CD8+和CD4+T细胞的CRC,从而促进tumourigenesis。

    • 目标基因敲除或nanoparticle-encapsulated YTHDF1的YTHDF1核把anti-PD1抑制增长的微卫星instability-high (MSI-H) CRC和克服在微卫星稳定(MSS) CRC anti-PD1抵抗。

    这项研究可能会如何影响研究、实践或政策

    • YTHDF1的治疗目标是一个潜在的战略,使敏感MSI-H和MSS CRC免疫检查点封锁疗法。

    • YTHDF1作为CRC患者的预后因素。

    介绍

    结直肠癌(CRC)是全球最常见的癌症之一。它仍然是一个致命的癌症转移患者5年生存率低于20%。1免疫检查点封锁(ICB)展示了CRC患者有益。然而,只有一个小的一部分患者微卫星instability-high (MSI-H)或缺乏错配修复反应银行独立委员会。1 2因此,了解免疫逃避的分子机制在CRC和确定治疗策略的反应免疫疗法可以改善患者精通错配修复,微卫星instability-low或微卫星稳定(MSS) CRC是至关重要的。

    N6-methyladenosine (m6)是一种最丰富的RNA修改,估计3 - 5米6一个网站在每个信使rna分子。3米6修改是由作家、橡皮擦和读者。米6一个作家催化m6蛋白质复合体的形成,包括METTL3, METTL14 WTAP。米6标记也积极被橡皮擦包括FTO和ALKBH5。米6这样的读者,从技术上说,云天化N6-methyladenosine RNA结合蛋白的1/2/3 (YTHDF1/2/3), YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3绑定到m6修改后的mrna的命运来决定6修改后的mRNA。3米6监管机构如YTHDF1, METTL3 ALKBH5一直在深入研究癌症。Upregulation YTHDF1已报道在不同癌症类型与预后不良相关4 - 6和YTHDF1可以促进tumourigenesis和癌症转移。4 - 6然而,YTHDF1的作用在肿瘤免疫微环境(时间)在很大程度上是不清楚。

    在这里,我们确认YTHDF1表达与干扰素γ负相关(IFN-γ)签名在癌症基因组图谱(TCGA) CRC数据集。此外,我们第一次证明遗传枯竭Ythdf1在小鼠CRC细胞MSS和MSI-H可以诱导MDSCs积累,抑制T细胞的渗透在同源的CRC老鼠和老鼠人性化。相反,intestine-specificYthdf1兄弟驱动器的免疫抑制,促进自发CRC的形成。RNA免疫沉淀反应的综合分析甲基化测序(MeRIP-seq) RNA-seq Ribo-seq, YTHDF1-m6A-p65-CXCL1轴被确认为YTHDF1-induced免疫抑制的机制,导致招聘MDSCs功能CD8等抑制效应细胞+T细胞。此外,针对YTHDF1 CRISPR或vesicle-like纳米颗粒(VNPs)核增强anti-PD1功效MSS和MSI-H模型,支持与治疗目标YTHDF1 CRC的免疫疗法。

    方法

    临床样本

    群我由206手术切除CRC患者组织,来自威尔斯亲王医院,香港。群二世是北京群,由202年CRC患者。Paraffinised这两组样本被用来建立组织微阵列(TMA)。中提供的两组的临床病理学特征在线补充表S1and S2。所有患者知情同意了。

    人性化的小鼠模型

    五周前点头。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice were exposed to total body gamma irradiation (150–170 cGy/animal) and then intravenously injected with 5×104人类脊髓血液CD34+造血干细胞(干细胞)在24小时内。人类CD45阳性细胞CD34的百分比+人性化的小鼠在周监控8和16通过流式细胞术,CD34之后+造血干细胞移植。CD34+人性化的小鼠与人类CD45 > 20%+细胞在血液被用于建立异种移植。所有动物研究指南经动物实验伦理委员会批准后的香港中文大学。

    小鼠与intestinal-specific CRC模型Ythdf1兄弟

    Intestinal-specificYthdf1老鼠兄弟(Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre建立了)。六到八周大转基因小鼠腹腔注射它莫西芬(100毫克/公斤)激活Ythdf1超表达。对于azoxymethane-dextran sulphate-sodium(急性中耳炎/ DSS) CRC小鼠模型,小鼠腹腔注射7 - 8星期急性中耳炎(10毫克/公斤体重)(# A5486, Sigma-Aldrich)和小鼠水含有1.5%葡聚糖硫酸酯钠(DSS)(# 9011-18-1,议员生物医学)4天,急性中耳炎注射后5天。常规饮用水用于以下2周。DSS治疗了一个额外的2周期,和老鼠牺牲了80天。为Apc分钟/ +CRC的小鼠模型,Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre老鼠杂交,Apc分钟/ +小鼠产生Apc分钟/ +Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre16周后,所有老鼠都牺牲了。本研究所有动物实验动物实验伦理委员会批准中大和厦门大学。

    TCGA数据分析

    结直肠腺癌,TCGA数据(TCGA PanCancer Atlas)从cBioPortal获得(https://www.cbioportal.org/)。7 8Coexpression与斯皮尔曼在526年的相关数据进行样本从cBioPortal下载也。基因与YTHDF1信使rna表达受到基因集富集分析(GSEA_4.1.0)。9IFN-γ签名的正常化浓缩成绩反应了。分析之间的关系表达式YTHDF1处于家庭成员,来自四期患者使用的数据。高表达的肿瘤的定义与z分数高于0.7,而z分数低于−0.7低表达。χ协会决定2测试。

    统计分析

    所有测量都获得使用独立的样本而不是收集重复测量。GraphPad棱镜V.8 (GraphPad软件;加州圣地亚哥)是用于数据分析和数据显示为±SD,除非另有规定。双尾学生的学习任务是用来进行统计分析,除非另有规定。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

    额外提供的方法在线补充材料。

    结果

    YTHDF1与减少IFN-γ-related CRC基因签名和不良预后

    通过分析拷贝数变化的21米6TCGA监管机构使用的数据,我们发现YTHDF1顶部米6监管机构显示拷贝数增加或扩大近80%的CRC肿瘤(在线补充图S1A)。这样一个拷贝数的增加也整合upregulation mRNA表达(在线补充图S1A)和蛋白表达(在线补充图就是S1C在促进CRC),暗示YTHDF1功能。抗肿瘤免疫和m之间建立联系6一个监管机构,然后我们进行GSEA分析m之间的相关性6监管机构与IFN-γ响应基因签名。我们发现YTHDF1表现出显著的负相关(问与IFN-γ反应通路(< 0.0001)在线补充图印地)。值得注意的是,IFN-γ响应与诱导抗肿瘤免疫相关10 11和响应能力请疗法。12日13一致地,YTHDF1表达强烈anticorrelated 18 IFN-γ-related基因签名(图1一个),在多种癌症类型预测anti-PD1响应能力。14日15此外,的表达CD8A或CD8+T细胞的签名16是负相关YTHDF1表达式(在线补充图S1D)。在协议TCGA数据,包含IHC染色TMA从我们的CRC TMA军团YTHDF1表明高蛋白的表达式与CD8的低渗透+T细胞在人群(p < 0.001, r =−0.248, n = 206) (图1 b)和第二组(p < 0.0001, r =−0.269, n = 202) (图1 c)。这些数据强烈暗示6读者YTHDF1与受损有关抗肿瘤免疫力和降低银行独立委员会治疗功效。

    YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (YTHDF1) is associated with an immunosuppressive microenvironment in patients with colorectal cancer (CRC) and its validation by scRNA-seq in immunocompetent mice. (A) Spearman’s correlation in mRNA expression between interferon gamma (IFN-γ)-related genes and m6A regulators in The Cancer Genome Atlas dataset. (B) Correlation between protein levels of YTHDF1 and CD8+ T cell infiltration was determined by immunohistochemistry staining in cohort I (p<0.0001, r=−0.2686, n=202), and (C) validation in cohort II (p<0.001, r=−0.2477, n=206). (D) Experimental design for single-cell analysis of CD45+ cells sorted from the tumours with or without Ythdf1 by FACS, followed by droplet-enabled scRNA-seq. NC: cells with control sgRNA. Ythdf1-KO: cells with CRISPR knockout of Ythdf1. (E) Representative image (left), tumour volume (middle), and weight (right) of MC38 syngeneic tumours with or without Ythdf1 knockout injected in C57BL/6 mice. (F) Upper panel: tSNE plot showing the components of immune cells in MC38 syngeneic tumours with or without Ythdf1 knockout. Each dot represents a single cell. The same cell type was colour coded. Lower panel: subset analysis of T cell and NK cell clusters shown in tSNE projection regions. (G) Feature plots of characteristic markers of all cell types showing expression levels with low expression in dark red to high expression in bright red. (H) Gating strategies for flow cytometry. Identification of myeloid-derived suppressor cells (MDSC), M-MDSC, and G-MDSC (left). Identification of CD8+ T and CD4+ T cells (middle). Representative images showing increase of IFN-γ+ CD8+ T cells in Ythdf1-KO tumours in (D) (Right). (I) Flow cytometry analysis performed with tumours derived from the indicated cells in (D) (**p<0.01; ****p<0.0001) (linear regression (B, C), two tailed t-test (E, H, I), analysis of variance test (E)). NC: cells with control sgRNA. KO1: cells with Ythdf1 sgRNA #1. KO2: cells with Ythdf1 sgRNA #2. GrB: granzyme B.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    YTH N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (YTHDF1)与结直肠癌(CRC)患者免疫抑制微环境及其在免疫活性的验证由scRNA-seq老鼠。(A)之间的斯皮尔曼相关的mRNA表达干扰素γ(IFN-γ)-相关基因和m6癌症基因组图谱数据集的监管机构。(B) YTHDF1和CD8的蛋白质含量之间的相关性+T细胞浸润是由免疫组织化学染色在我组(p < 0.0001, r =−0.2686, n = 202)、和(C)验证在第二组(p < 0.001, r =−0.2477, n = 206)。(D) CD45的单细胞分析的实验设计+细胞从肿瘤有或没有排序Ythdf1通过流式细胞仪,其次是droplet-enabled scRNA-seq。sgRNA NC:细胞与控制。Ythdf1柯:细胞CRISPR击倒的Ythdf1。(E)代表图像(左),肿瘤体积(中间)和重量(正确的有或没有)MC38同源的肿瘤Ythdf1淘汰赛C57BL / 6小鼠注射。(F)上面板:tSNE情节显示免疫细胞的组件MC38同源的肿瘤有或没有Ythdf1淘汰赛。每个点代表一个细胞。相同的细胞类型是颜色编码。较低的面板:子集分析T细胞和NK细胞集群tSNE投影区域所示。(G)功能块特征标记的细胞类型显示表达水平较低表达在鲜红的深红色高表达。流式细胞术(H)控制策略。识别myeloid-derived抑制细胞(MDSC), M-MDSC和G-MDSC (左)。CD8的识别+T和CD4+T细胞(中间)。代表图像显示了增加IFN-γ+CD8+T细胞在Ythdf1ko肿瘤(D) (正确的)。(我)流式细胞术分析表现与肿瘤来源于表示细胞(D) (* * p < 0.01;* * * * p < 0.0001)(线性回归(B, C),正反t检验(E、H、I)方差分析测试(E))。sgRNA NC:细胞与控制。KO1:细胞Ythdf1sgRNA # 1。KO2:细胞Ythdf1sgRNA # 2。伽马线暴:granzyme B。

    同意的观点CD8低+T细胞浸润与不良预后有关,17高表达的YTHDF1(54.3%, 100/184)患者生存率的预测差CRC (p < 0.01,生存率较)(在线补充图S1E, F)。多变量Cox回归分析验证,YTHDF1 CRC在第二组是一个独立的预后因素(HR 1.764;95%可信区间1.058到2.939;p < 0.05) (在线补充图S1F)。这些研究结果进一步验证在队列我通过多变量Cox回归分析(在线补充图S1E)。

    单细胞转录组揭示YTHDF1-induced免疫抑制

    调查YTHDF1的作用在调节抗肿瘤免疫力,我们使用了CRISPR-Cas9系统淘汰赛Ythdf1(Ythdf1ko) MC38注入小鼠MSI-H CRC细胞和细胞同源的C57BL6小鼠(图1 d)。我们发现,肿瘤体积和重量都是减少的淘汰赛Ythdf1相比之下,控制(NC) (图1 e)。问Ythdf1CD45 ko影响时间,我们孤立+从肿瘤免疫细胞,进行单细胞RNA-seq (scRNA-seq) (NC: 1480个细胞;Ythdf1柯:1816细胞)。肿瘤与Ythdf1 -KO表现出强烈的粒细胞减少myeloid-derived抑制细胞(G-MDSCs、集群3)和中性粒细胞与NC组(图1 f和在线补充图S2A)。相比之下,T细胞和NK细胞在很大程度上增加了Ythdf1ko肿瘤(图1 f和在线补充图S2A)。我们进一步reclustered T和NK细胞CD4细胞+T, CD8+T, NKT和NK细胞的子集,同时确定他们在增加Ythdf1ko肿瘤与控制(图1 f)。因此我们推测YTHDF1可以通过诱导MDSC积累抑制抗肿瘤免疫。MDSCs功能标记,Il1b,最长,Cxcr2和Ccr2检查,这些基因主要是富含MDSC集群(集群3和集群4),尤其是来自肿瘤没有Ythdf1击倒(图1 g)。因此,从这个数据同源的模型支持YTHDF1在CRC的免疫抑制功能。

    Ythdf1淘汰赛减少MDSCs但增加细胞毒性T细胞浸润

    scRNA-seq分析来验证我们的发现,tumour-infiltrating免疫细胞的构成MC38同源的老鼠是由流式细胞术。我们确认Ythdf1淘汰赛显著抑制肿瘤重量和体积(图1 c)、流式细胞术显示Ythdf1淘汰赛MDSCs下降,但CD8增加+T和CD4+T细胞在肿瘤(图1 h,我)。MDSCs, G-MDSCs是主要的子集,淘汰赛Ythdf1导致显著减少G-MDSCs (图1我)。符合MDSCs的免疫抑制功能,我们观察到显著增加T细胞功能,包括IFN-γ+CD8+T细胞,Granzyme B+CD8+T细胞,IFN-γ+CD4+T细胞在Ythdf1ko组(图1 h, J)。

    我们接下来执行CT26实验(MSS-CRC)Ythdf1ko验证YTHDF1调节抗肿瘤免疫的作用。正如所料,Ythdf1ko导致减少肿瘤体积和重量(图2 a, B一起)CT26同源的老鼠,减少功能的T细胞和积累MDSCs (图2 c, D)。免疫荧光染色证实,降低渗透MDSCs (CD11b+Gr-1+)MC38和CT26同源的肿瘤Ythdf1击倒(图2 e和在线补充图开通)。总的来说,Ythdf1损耗在CRC细胞减少MDSCs和增加功能的T细胞浸润。这些发现符合临床数据证明YTHDF1 anticorrelated CD8+T细胞和IFN-γ-related签名(图1 a - c,在线补充figureS1B, D)。

    YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (Ythdf1) knockout induces antitumour immunity by reduction of myeloid-derived suppressor cell (MDSC) and increase of functional T cells in syngeneic tumours, an effect reversed by CD8+ T cell depletion. (A) Western blot validated Ythdf1 knockout in CT26 cells. (B) Representative image of CT26 syngeneic tumours with or without Ythdf1 Knockout (left). Knockout of Ythdf1 in CT26 cells inhibits tumour growth (middle) and tumour weight (right) in BALB/c mice. (C) MDSC, G-MDSC, M-MDSC, CD4+ T cells and CD8+ T cells from tumours in (B) were analysed by flow cytometry. (D) Flow cytometry analysis assessing the percentage of T cell functional markers interferon gamma (IFN-γ) and granzyme B (GrB) from tumours in (B). (E) Immunofluorescence identifying MDSCs in subcutaneous tumours from BALB/c injected with the indicated CT26 cells (n=5 each group). (F) MC38 NC or Ythdf1 knockout cells were implanted in C57BL/6 (n=6). Isotype control (IgG) or anti-mouse CD8 antibody (αCD8) were given at 200 µg/mouse on days 4, 7 and 9 post cell injection. Representative images of tumours from each group were shown. (G) Tumour volume (left) and weight (right) from tumours in (F). (H) CT26 NC or Ythdf1 knockout cells were implanted in BALB/c (n=6). Isotype control (IgG) or αCD8 were given at 200 µg/mouse on days 4, 7 and 9 post cell injection. Representative images of tumours from each group were shown. (I) Tumour volume (left) and weight (right) from tumours in (H) (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001) (two tailed t-test (B, C, D, E, G, H), two-way analysis of variance test (D, G, I)). NC: cells with control sgRNA. KO1: cells with YTHDF1 sgRNA #1. KO2: cells with YTHDF1 sgRNA #2.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    YTH N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (Ythdf1通过减少myeloid-derived)淘汰赛诱导抗肿瘤免疫抑制细胞(MDSC)和增加功能的T细胞在同源的肿瘤,CD8的逆转效果+T细胞耗竭。(一)免疫印迹验证Ythdf1在CT26细胞淘汰赛。(B)代表的形象CT26同源的肿瘤有或没有Ythdf1击倒(左)。基因敲除的Ythdf1在CT26细胞抑制肿瘤生长中间)和肿瘤重量(正确的在BALB / c小鼠。(C) MDSC、G-MDSC M-MDSC, CD4细胞+T细胞、CD8+肿瘤的T细胞(B)被流式细胞术分析。(D)流式细胞术分析评估T细胞功能的百分比标记干扰素γ(IFN-γ)和granzyme B (GrB) (B)的肿瘤。(E)免疫荧光鉴定MDSCs BALB / c的皮下肿瘤注射表示CT26细胞每组(n = 5)。(F) MC38数控或Ythdf1淘汰赛细胞植入C57BL / 6 (n = 6)。同形像控制抗体(免疫球蛋白)或anti-mouse CD8(αCD8)在200年µg /鼠标在天4日7和9细胞注入。代表从每组肿瘤显示的图像。(G)肿瘤体积(左)和重量(正确的从肿瘤)(F) (H) CT26数控或Ythdf1淘汰赛细胞植入BALB / c (n = 6)。同形像控制(免疫球蛋白)或αCD8有200µg /鼠标天4、7和9篇细胞注入。代表从每组肿瘤显示的图像。(我)肿瘤体积(左)和重量(正确的从肿瘤(H) (* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001)(正反t (B, C, D, E, G, H),双向方差分析测试(D、G I))。sgRNA NC:细胞与控制。KO1:细胞YTHDF1sgRNA # 1。KO2:细胞YTHDF1sgRNA # 2。

    我们问减毒肿瘤形成Ythdf1依赖CD8 ko+T细胞抗肿瘤免疫力。为了解决这个问题,我们CD8耗尽+T细胞与anti-CD8抗体在MC38同源的模型。与我们的假设一致,CD8的损耗+T细胞恢复增长Ythdf1ko肿瘤(图2 f, G),证明tumour-suppressing功能Ythdf1ko依赖,至少部分,CD8+T细胞。这是确诊CT26同源的老鼠显示anti-CD8抗体治疗救出被捕的肿瘤生长Ythdf1ko组(图2 h,我)。CD8枯竭+证实了T细胞通过anti-CD8抗体流式细胞术(在线补充图S3A, B)。在一起,Ythdf1淘汰赛抑制CRC增长通过CD8的感应+T cell-dependent抗肿瘤免疫力。

    Intestine-specific YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (Ythdf1) knockin promotes colorectal tumourigenesis and inhibits antitumour immunity in mice. (A) Scheme for azoxymethane-dextran sulphate-sodium (AOM/DSS) mouse model (left). Representative images of the colon at sacrifice (right). (B) Scheme for ApcMin/+ mouse model (left). Representative images of the colon at sacrifice (right). (C) Tumour number, and tumour size in WT littermates (n=16) and Ythdf1 Ki mice (n=16) mice treated with AOM-DSS (left). Tumour number, and tumour size in ApcMin/+ Ythdf1loxp/loxp (n=10) and ApcMin/+ Ythdf1loxp/loxpCDX2-cre mice (n=5) mice (right). (D) Infiltration of the indicated immune cells in tumours derived from AOM/DSS mice assessed by flow cytometry. (E) Composition of functional T cells in the tumours derived from AOM/DSS mice assessed by flow cytometry. (F) Infiltration of the indicated immune cells in the tumours derived from ApcMin/+ mice assessed by flow cytometry. (G) Composition of functional T cells in the tumours derived from ApcMin/+ mice assessed by flow cytometry. Two tailed t-test (C, E, F, G, H). WT: Ythdf1 wild type; cKI: conditional Ythdf1 knockin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    从技术上说Intestine-specific云天化N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (Ythdf1)兄弟促进结直肠tumourigenesis,抑制抗肿瘤免疫小鼠。(一)方案azoxymethane-dextran sulphate-sodium(急性中耳炎/ DSS)小鼠模型(左)。代表图像的结肠牺牲(正确的)。(B)方案Apc分钟/ +小鼠模型(左)。代表图像的结肠牺牲(正确的)。数量(C)肿瘤和肿瘤大小在WT同窝出生(n = 16)Ythdf1Ki老鼠(n = 16)小鼠接受AOM-DSS (左)。肿瘤数目、肿瘤大小Apc分钟/ +Ythdf1loxp / loxp(n = 10)Apc分钟/ +Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre老鼠老鼠(n = 5) (正确的)。(D)表示免疫细胞的浸润肿瘤来源于中耳炎/ DSS小鼠评估通过流式细胞术。(E)的合成功能的T细胞在肿瘤来源于中耳炎/ DSS老鼠通过流式细胞术进行评估。(F)渗透的免疫细胞在肿瘤来源于表示Apc分钟/ +老鼠的流式细胞术评估。(G)的合成功能的T细胞在肿瘤来源于Apc分钟/ +老鼠的流式细胞术评估。正反t (C, E, F, G, H)。WT:Ythdf1野生型;长江基建:条件Ythdf1兄弟。

    Intestine-specificYthdf1兄弟促进结直肠tumourigenesis和抑制抗肿瘤免疫小鼠

    验证在自发的结直肠tumourigenesis YTHDF1的角色,我们intestine-specific生成Ythdf1老鼠兄弟(Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre)和CRC在这些小鼠急性中耳炎发起/ DSS治疗(图3一)。我们发现的超表达Ythdf1导致增加结肠肿瘤数量和规模在急性中耳炎/ DSS模型(图3 c)。流式细胞仪显示增加MDSC渗透一起减少NK, CD4细胞+T和CD8+结肠肿瘤的T细胞Ythdf1兄弟小鼠与野生型小鼠相比图3 d)。此外,我们发现Ythdf1兄弟减少功能的T细胞的比例被granzyme B, INF-γ和TNF-α表达式(图3 e)。

    我们下一个试图验证这些结果Apc分钟/ +借自发CRC (图3 b)通过建立Apc分钟/ +Ythdf1loxp / loxpCDX2-cre老鼠。一致地,Apc分钟/ +小鼠intestine-specific兄弟Ythdf1开发的结肠肿瘤明显高于野生型的同胞(图3 c)。分析tumour-infiltrating免疫细胞显著减少渗透NK, CD4细胞+T和CD8+T细胞在肿瘤Apc最小值/ +的兄弟Ythdf1,连同MDSCs感应(图3 f)。此外,Ythdf1兄弟减少granzyme B+,INF-γ+,或者TNF-α+T细胞在Apc分钟/ +老鼠(图3 g)。总的来说,这些结果支持,YTHDF1促进免疫抑制微环境促进自发的CRC。

    针对YTHDF1通过VNP-siYTHDF1增强抗肿瘤免疫力CD34+人性化的小鼠

    确认YTHDF1的作用在调节人类抗肿瘤免疫反应,我们建立了CD34+人性化的小鼠模型。18小鼠外周血单核细胞(PBMCs)由人类CD45 > 20%+细胞被使用(图4一)。针对YTHDF1体内,我们开发了VNPs19携带核反YTHDF1。人性化NSG老鼠轴承人类CRC HCT116异种移植治疗VNP-siNC或siYTHDF1后肿瘤达到50 - 100毫米3(图4 b)。VNP-siYTHDF1显著抑制肿瘤体积和重量与VNP-siNC (图4 b, C)。我们还进行了流式细胞术分析时间(图4 d)。VNP-siYTHDF1减少MDSC渗透,但增加CD4细胞+CD8 T细胞,+T细胞和NK细胞积累(图4 e)。此外,更多的IFN-γ+,TNF-α+和granzyme B+CD8+T细胞在肿瘤接受VNP-si确认YTHDF1(图4 e)。我们也决定VNP-si的安全YTHDF1通过测量血清标志物的肝脏(丙氨酸转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶)和肾功能(肌酐和血尿素氮)。老鼠VNP-siNC或VNP-si对待YTHDF1没有显示异常的肝或肾功能指标(在线补充图S4),这表明VNP治疗耐受良好。因此,使用VNP-si YTHDF1的目标YTHDF1是一种安全有效的手段加强人性化的小鼠的抗肿瘤免疫。

    VNP-siYTHDF1 boosted antitumour immunity in CD34+ humanised mice. (A) Workflow for establishment of CD34+ humanised mice (left). Percentage of human CD45+ cells in the CD34+ humanised mice was identified by flow cytometry (right). (B) Design for establishment of HCT116 xenografts and treatment with VNP-siNC or VNP-siYTHDF1 in CD34+ humanised mice (left). Representative image of xenografts in different groups (right). (C) Tumour volume (left) and tumour weight (right) in mice in (B). (D) Gating strategies of immune cells in CD34+ humanised mice. (E) Infiltration of CD4+ T, CD8+ T, NK cells, MDSCs and functional CD8 T cells was assessed by flow cytometry in the tumours from (B) (two tailed t-test (C, E), analysis of variance test (C)). VNP, vesicle-like nanoparticles.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    VNP-siYTHDF1提高了抗肿瘤在CD34免疫+人性化的小鼠。(一)建立CD34的工作流+人性化的小鼠(左)。人类CD45的百分比+CD34细胞+人性化的小鼠被确认通过流式细胞术(正确的)。(B)设计建立HCT116 VNP-siNC或VNP-si异种移植和治疗YTHDF1在CD34+人性化的小鼠(左)。代表图像的异种移植在不同组(正确的)。(C)肿瘤体积(左)和肿瘤重量(正确的)在(B)的老鼠。(D) CD34免疫细胞的控制策略+人性化的小鼠。(E) CD4的渗透+T, CD8+NK细胞,T MDSCs和功能性CD8 T细胞是评估通过流式细胞术在肿瘤(B)(正反T检验(C, E)方差分析测试(C))。VNP vesicle-like纳米颗粒。

    YTHDF1促进翻译激活TNF / NF-κB p65信号

    识别YTHDF1抒发免疫抑制的分子机制,我们执行RNA-seq和Ribo-seq CRC细胞有或没有击倒YTHDF1。通过RNA-seq分析,MC38-NC和MC38——之间的差异表达基因YTHDF1ko细胞富集在肿瘤坏死因子和NF-κB信号通路(在线补充图S5A)。获得了一致的结果在另一个CRC细胞系CT26表明YTHDF1监管TNF / NF-κB信号通路(在线补充图S5B)。支持这些,qPCR验证Ythdf1ko降低TNF的mRNA表达/ NF-κB目标(在线补充图S6A)。此外,Ribo-seq数据显示,损失的YTHDF1是失活的肿瘤坏死因子显著相关信号(图5一个)。因此,YTHDF1击倒了核糖体保护片段的基因参与肿瘤坏死因子信号(图5一个)。因此,YTHDF1可以调节肿瘤坏死因子/ NF-κB信号通过促进蛋白质的翻译。因为YTHDF1函数作为一个m6一个读者,我们下一个执行m6免疫沉淀反应测序(MeRIP-seq)查明m6修改记录。通过筛选米6信使rna参与肿瘤坏死因子信号峰,我们确定了两米6网站接近p65 mRNA的终止密码子(图5 b),由MeRIP-qPCR验证(图5 c)。重要的是,我们发现了一个YTHDF1 p65信使RNA, RNA免疫沉淀反应之间的直接交互(RIP)测序和RIP-qPCR anti-YTHDF1抗体(图5 d)。因此,p65 mRNA YTHDF1的直接目标。我们发现,基因敲除的Ythdf1减毒p65蛋白表达,特别是核p65表达式,CT26和MC38细胞,而不影响其他监管机构的表达NF-κB通路IKKα和IκBα等(图5 e)。值得注意的是,mRNA的表达p65持平Ythdf1ko细胞(在线补充图S6B),支持YTHDF1调节p65主要在蛋白质翻译的水平,这是符合的报道YTHDF1功能促进翻译的目标。一致的结果在人类的CRC细胞显示超表达野生型YTHDF1,但并不是不正常的变异,5个6高架p65蛋白表达;相反,YTHDF1可拆卸的减毒p65蛋白在人类CRC细胞(图5 f)。RIP-qPCR使用anti-YTHDF1抗体也证实了YTHDF1之间的直接交互,p65 mRNA在人类CRC细胞(图5克)。接下来我们试图验证YTHDF1协会和p65体内。在Ythdf1兄弟老鼠,p65和phospho-p65蛋白质增加结肠肿瘤(图5 h)。集体,YTHDF1促进p65蛋白表达激活TNF NF-κB信号在体外和体内。

    YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (YTHDF1) promotes TNF/NF-kB signalling in CRC through promoting RELA (p65) mRNA translation. (A) Differentially expressed genes between CT26 cells with and without knockout of Ythdf1 were enriched in TNF signalling pathway identifying by Ribo-seq (left). Heatmap of genes on TNF signalling pathway (right). (B) Methylated RNA immunoprecipitation (MeRIP) sequencing on CT26 cells, showing m6A modifications on last exon or 3’UTR of RELA (p65) mRNA. (C) Scheme showing the design of primers for MeRIP-qPCR to validate m6A modifications on p65 mRNA. Potential m6A sites were highlighted in red (upper). MeRIP-qPCR primers are indicated by arrows. MeRIP-qPCR validated m6A modification with primers #2 and #3 (lower). (D) RNA immunoprecipitation sequencing with anti-YTHDF1 antibody (YTHDF1-RIP) showing the enrichment of p65 mRNA compared with IgG control (left). YTHDF1-RIP-qPCR with primers specific to murine p65 mRNA (right). (E) Western blot of key effectors of TNF/NF-κB signalling pathway on knockout of Ythdf1. (F) Western blot analysis performed with indicated human CRC cells overexpressing wild-type (WT) or mutant (mut) YTHDF1, or YTHDF1 knockdown with shRNA. Non-targeted shRNA (shNC) were used as control. (G) YTHDF1-RIP-qPCR with primers specific to human p65 mRNA. (H) Expression of p65 and phospho-p65 was determined by western blot in colon tumours from the intestine-specific Ythdf1 knockin mice and wildtype littermates. cKI: conditional knockin (two tailed t-test (C, D, G)).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    YTH N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (YTHDF1)促进肿瘤坏死因子/ NF-kB信号在通过促进CRCRELA(p65) mRNA的翻译。(A) CT26细胞之间的差异表达基因有或没有击倒Ythdf1富集在肿瘤坏死因子信号通路识别Ribo-seq (左)。热图肿瘤坏死因子信号通路上的基因(正确的)。(B)甲基化RNA免疫沉淀反应(MeRIP)测序CT26细胞,显示m6最后一个外显子或3 'utr修改RELA(p65) mRNA。(C)方案设计的引物对MeRIP-qPCR验证6p65 mRNA的修改。潜在的米6一个网站是用红色突出显示(上)。MeRIP-qPCR引物用箭头表示。MeRIP-qPCR验证米6修改与引物# 2和# 3(低)。(D) RNA与anti-YTHDF1抗体免疫沉淀反应测序(YTHDF1-RIP)显示p65 mRNA的浓缩与免疫球蛋白控制(左)。YTHDF1-RIP-qPCR与引物特定于小鼠p65 mRNA (正确的)。(E)免疫印迹TNF的关键效应物/ NF-κB信号通路的淘汰赛Ythdf1。与执行(F)免疫印迹分析表明人类CRC细胞overexpressing野生型(WT)或突变体(傻瓜)YTHDF1,或YTHDF1可拆卸的shRNA。一道成分(shNC)被用作控制。(G) YTHDF1-RIP-qPCR与引物特定人类p65 mRNA。(H)的表达p65 phospho-p65是由从intestine-specific免疫印迹在结肠肿瘤Ythdf1兄弟小鼠和野生型的同胞。长江基建:有条件的兄弟(正反t (C、D、G))。

    Loss of YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (Ythdf1) promotes reduction of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) by decreasing CXCL1 secretion. (A) Multiplex mouse cytokine immunoassay assessing levels of 23 cytokines in cell culture supernatants from MC38 and CT26 cell culture, and tumour lysates and sera from MC38 and CT26 syngeneic tumour models. (B) ELISA validation of levels of CXCL1 in the indicated materials as in (A) (n=4 each group). (C) MDSC migration was assessed in vitro with transwell migration assay using conditional medium derived from the indicated cells. CXCR2 inhibitor SB265610 was used at 5 µM. (D) RT-qPCR determination of Cxcl1 mRNA expression in the indicated cells. (E) Flow chart of T cell suppression assay. (F) Representative images of flow cytometry assessing the proliferation of CFSE-labelled T cells cocultured with MDSCs isolated as (E). (G) Quantification of (F) (two tailed t-test (C, D, E, G)).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    从技术上说,云天化N损失6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (Ythdf1)促进减少myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)通过减少处于分泌。(A)多路复用老鼠细胞因子免疫测定评估23细胞培养上清液中细胞因子水平从MC38 CT26细胞培养、肿瘤溶解产物和血清从MC38 CT26同源的肿瘤模型。(B) ELISA的验证水平处于指定的材料(A)每组(n = 4)。(C) MDSC迁移与transwell评估体外迁移试验使用条件中来自指定的细胞。CXCR2抑制剂SB265610µM 5点。(D) RT-qPCR的决心处于受控在指定的细胞信使rna表达。(E) T细胞抑制实验的流程图。流式细胞术(F)代表图像评估CFSE-labelled T细胞的增殖与MDSCs孤立cocultured (E)。(G)的量化(F)(正反T (C, D, E, G))。

    通过p65-CXCL1轴YTHDF1促进MDSC迁移

    理解之间的联系YTHDF1-induced p65及其免疫抑制,我们执行一个细胞因子多路检测的免疫测定23 CRC细胞条件培养基,不同小鼠细胞因子肿瘤溶解产物,从小鼠血清轴承同源的肿瘤。在这些细胞因子中,处于持续减少Ythdf1ko (图6证实了),减少处于ELISA试验(图6 b)。处于被报道为转录NF-κB信号的目标,20 21它促进MDSC趋化作用通过与其受体CXCR2交互。22 - 24考虑到Ythdf1ko减少MDSC渗透在CRC的时间,我们被问及YTHDF1调节MDSC迁移。因此,体外MDSC迁移进行了分析。我们发现,从野生型CRC细胞条件培养液增强MDSC迁移,受损的淘汰赛Ythdf1(图6 c)。由CXCR2抑制剂SB265610消除阻塞CXCL1-CXCR2交互控制和之间的区别Ythdf1在调节MDSC迁移(ko文化上层清液图6 c)。因此,YTHDF1促进MDSC迁移通过处于受控/ CXCR2轴。我们接下来问YTHDF1是否能调节处于受控信使rna表达。正如所料,Ythdf1淘汰赛显著抑制处于受控小鼠(mRNA水平图6 d)和人类的CRC细胞系(在线补充图S7A)。相反,野生型的超表达YTHDF1,但不是其功能失调的突变,升高处于受控人类CRC细胞的转录和蛋白质水平(在线补充图S7A)。NF-κB活化剂,比如TNF-αIL-1β,已报告诱导处于受控表达式。25我们这样对待MC38 TNF-α和测量处于mRNA和分泌细胞。TNF-α刺激处于受控信使rna和分泌,废除的损失产生影响Ythdf1(在线补充图S7B)。确认YTHDF1之间的联系和处于人类的CRC,我们检查了之间的关系YTHDF1和处于受控表达,TCGA CRC队列。一致地,YTHDF1- CRC证明高处于受控表达式(在线补充图S7C)。除了处于受控,CXCL2也呈正相关YTHDF1(在线补充图S7C)。相比之下,CXCL5和CXCL8表达与负相关YTHDF1(在线补充图S7C)。考虑在促进MSDC YTHDF1渗透的作用,我们接下来进行CRC TMA CD33, G-MDSCs的标志。26日27日我们发现YTHDF1蛋白质含量与intratumoural CD33的比例呈正相关+细胞(在线补充图S8)。因此我们的研究结果支持YTHDF1-p65-CXCL1 / CXCR2轴调节MDSC CRC的迁移。

    Targeting YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1 (YTHDF1) augmented anti-PD1 blockade therapy in both microsatellite instability-high (MSI-H) and microsatellite stable colorectal cancer (CRC). (A) MC38 cells with or without Ythdf1 knockout were implanted into C57BL/6 mice and treated with IgG or anti-PD1 (αPD1; n=5 per group). Tumour volume (left) and mice survival (right) were presented. Euthanasia was applied when tumour burden was greater than or equal to 1500 mm3 or when the mouse was moribund. (B) Growth curve of subcutaneous tumours from C57BL/6 injected with MC38 and treated with the indicated treatments. Vesicle-like nanoparticle (VNP)-siRNAs were given intratumorally. And αPD1 was given with intraperitoneal injection. (C) Images and weight of the tumours from (B). (D) The indicated CT26 cells were subcutaneously injected in BALB/c mice. The mice were treated with control or αPD1 (n=8 each group). Tumours removed from the mice at sacrifice were shown. (E) Tumour growth curve (left) and tumour weight (right) in (D). (F) Flow cytometry performed with the tumours in (D). (G) Top panel: flow cytometry assessing the proportion of MDSCs, CD4+ T cells, and CD8+ T cells in total CD45+ cells in tumours in (B). Lower panel: flow cytometry assessing functional CD8+ T cells in tumours in (B). (H) Schematic of the m6A-YTHDF1-p65-CXCL1 axis inducing MDSC accumulation and hence suppressing T cell function in CRC (two tailed t-test (C, D, F, G, H); analysis of variance test (A, C, F); long-rank test (A)). siY1: siYTHDF1. GrB: granzyme B.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    从技术上说针对云天化N6-methyladenosine RNA结合蛋白1 (YTHDF1)增强anti-PD1封锁疗法在微卫星instability-high (MSI-H)和微卫星稳定的结直肠癌(CRC)。(一)MC38细胞有或没有Ythdf1基因敲除是植入C57BL / 6小鼠和接受免疫球蛋白或anti-PD1(αPD1;每组(n = 5)。肿瘤体积(左和老鼠的生存正确的)。安乐死时应用肿瘤负担是大于或等于1500毫米3或者当鼠标是垂死挣扎。(B)的皮下肿瘤生长曲线C57BL / 6注射MC38和处理指定的治疗。Vesicle-like纳米颗粒(VNP) sirnas瘤内。并与腹腔内注射αPD1得到。(C)图像和(B)肿瘤的重量。(D)表示CT26细胞在BALB / C小鼠皮下注射。老鼠接受控制或αPD1每组(n = 8)。肿瘤的老鼠在牺牲。(E)肿瘤生长曲线(左)和肿瘤重量(正确的)(D)。(F)流式细胞术表现与肿瘤(D) (G)上面板:流式细胞术评估MDSCs的比例,CD4细胞+T细胞、CD8+在总CD45 T细胞+在肿瘤细胞(B)。较低的面板:流式细胞术评估功能CD8+T细胞在肿瘤(B)。(H) m的示意图6A-YTHDF1-p65-CXCL1轴诱导MDSC积累,因此抑制T细胞功能在CRC(正反T (C, D, F, G, H);方差分析测试(A、C、F);long-rank测试(A))。siY1:如果YTHDF1。伽马线暴:granzyme B。

    我们下一个调查如果YTHDF1影响MDSC的功能。CD11b+Gr-1+MDSCs被隔绝MC38同源的肿瘤,然后与T细胞体外cocultured (图6 e)。MDSCs隔离控制肿瘤抑制T细胞增殖;然而,MDSCs从Ythdf1ko肿瘤表现出显著减少对CD8的增殖抑制活性+T细胞和CD4+从控制(T细胞与MDSCs相比图6 f, G)。支持这个,MDSCs隔绝Ythdf1ko肿瘤减少了表达MDSC的功能标记Nos2,__arg1,Cd274相比之下,Ythdf1wt肿瘤(在线补充图S9A)。流式细胞术证实,进气阀打开+MDSCs是减毒Ythdf1ko肿瘤(在线补充图S9B)。这些数据验证报告MDSCs的免疫抑制功能的主要效应细胞,包括CD8+T细胞和CD4+T细胞,28和支持,YTHDF1表达功能MDSCs CRC新兵。

    YTHDF1 CRC免疫疗法是一个潜在的治疗目标

    考虑到减少渗透MDSCs被报道与增强免疫治疗功效不同癌症类型,22日29 30我们试图测试如果针对YTHDF1增强anti-PD1 CRC的疗法。正如预期的那样,我们发现的淘汰赛Ythdf1提高疗效的anti-PD1 MC38 (MSI-H)同源的tumour-bearing老鼠的肿瘤和长期生存(图7)。我们进一步利用VNPs系统具体送货Ythdf1核成肿瘤。当MC38同源的肿瘤达到50 ~ 100毫米3,我们对待VNP-si的老鼠Ythdf1(或VNP-siNC)和anti-PD1治疗(或免疫球蛋白)。VNP-siYthdf1显著抑制MC38肿瘤生长与VNP-siNC (图7 b, C)。值得注意的是,VNP-si的结合Ythdf1加上anti-PD1发挥最强的对肿瘤生长的抑制作用(图7 b, C)。

    我们进一步解决如果针对YTHDF1能克服anti-PD1阻力在海量存储系统(MSS)中基于同源的CRC CT26 (MSS CRC)肿瘤模型。CT26细胞Ythdf1淘汰赛因此注入到同源的老鼠和anti-PD1对待。我们发现,基因敲除的Ythdf1显著增强anti-PD1治疗功效CT26同源的肿瘤,否则是没有响应请疗法(图7 d, E)。

    流式细胞术分析进一步表明,组合Ythdf1沉默和anti-PD1 tumour-infiltrating功能CD8显著增加+T细胞,包括IFN-γ+CD8+T细胞和Granzyme B+CD8+T细胞在CT26和MC38同源的模型(图7 f, G)。此外,组合治疗强烈MDSCs积累减少,而CD4细胞+T细胞、CD8+T细胞诱导(图7 g)。因此,针对YTHDF1不仅强化银行独立委员会MSI-H CRC的治疗效果,而且还克服了银行独立委员会的阻力在海量存储系统(MSS)中CRC通过抑制招聘MDSCs CD8和改善功能+T细胞。

    讨论

    YTHDF1是一个米6CRC的读者经常调节,但其抗肿瘤免疫作用在很大程度上是未知的。在这里,我们的研究首次表明,高YTHDF1表达CRC驱动器免疫抑制。单细胞分析显示,YTHDF1 MDSCs招聘的至关重要,进而在CRC减毒T细胞浸润和功能。这种现象一直存在于同源的肿瘤,intestine-specificYTHDF1兄弟老鼠和CD34+人性化的小鼠。综上所述,我们的数据表明,YTHDF1促进促进CRC tumourigenesis免疫抑制肿瘤微环境。

    一系列的体内模型验证在招募MDSCs YTHDF1 CRC的角色。在CRC同源的模型中,Ythdf1淘汰赛抑制MDSC积累。相反,intestine-specificYthdf1兄弟在急性中耳炎/ DSS和结直肠tumourigenesis加速Apc分钟/ +模型,同时增加intratumoural MDSCs。此外,YTHDF1沉默在CD34也渗透人类MDSCs受损+人性化的小鼠。MDSCs是高度多样化的人口不成熟的骨髓细胞,包括粒细胞MDSCs和单核细胞的MDSCs。他们两人,尤其是G-MDSCs,拥有强力的免疫抑制活性。31日体外MDSC迁移分析直接验证YTHDF1在MDSC趋化作用中扮演了至关重要的作用。我们的研究结果支持YTHDF1促进结直肠tumourigenesis通过MDSC-mediated免疫抑制。

    MDSCs主要发挥他们的免疫抑制效应通过抑制主要效应细胞增殖和活化。28事实上,我们发现Ythdf1淘汰赛诱发CD4的渗透+CD8 t细胞,+T细胞和NK细胞在结肠肿瘤和CD34+人性化的小鼠,增加表达的细胞毒性标记granzyme B, INF-γ和TNF-α而intestine-specificYthdf1兄弟与抑制了这些效应细胞的渗透和活动状态。体外研究也表明MDSCs隔绝Ythdf1零肿瘤有抑制T细胞增殖能力受损。在一起,我们的数据支持,YTHDF1-driven功能MDSC积累产生抗肿瘤免疫细胞的抑制作用,促进CRC的免疫逃避。

    我们下一个破译的分子基础YTHDF1-driven MDSC CRC的积累。YTHDF1功能如m6读者,我们执行综合RNA-seq Ribo-seq和MeRIP-seq YTHDF1的CRC识别候选目标。尽管几个信号通路被发现在海量存储系统(MSS)中(CT26)和MSI-H (MC38) CRC, TNF / NF-κB信号通路由YTHDF1顶部一般途径诱导模型。我们进一步揭开p65亚基的NF-κB YTHDF1的直接目标。YTHDF1,但不是其功能失调的突变体,结合m6修改p65 mRNA p65蛋白水平增加而不影响其mRNA表达,暗示YTHDF1促进p65翻译在m6依赖的方式。肿瘤坏死因子/ NF-κB信号通常是在肿瘤细胞激活,和诱导表达的促炎细胞因子和趋化因子基因编码。32通过细胞因子分析,我们发现,处于mRNA表达和分泌被基因抑制一致压抑Ythdf1在老鼠和人类CRC细胞系,同系的小鼠和转基因小鼠。处于扮演一个关键的角色在促进MDSCs趋化作用的时间通过与CXCR2的交互。33符合这一点,我们发现YTHDF1介导的迁移MDSCs通过CXCL1-CXCR2轴,废除CXCR2的抑制剂产生影响。在一起,YTHDF1-mediated p65信号通过处于分泌促进MDSCs。除了处于受控,替代NF-κB下游目标也被下调Ythdf1淘汰赛。这将是进一步探索感兴趣的抵押品YTHDF1 NF-κB-dependent表达的细胞因子和趋化因子的影响在CRC的免疫抑制时间。

    MDSCs已报告在关键效应细胞发挥免疫抑制作用,包括CD8+T细胞CD4+T细胞和NK细胞。28MDSCs发挥他们的拮抗效应近年T细胞通过各种机制,包括损耗intratumoural通过Arginase-1精氨酸,通过进气阀打开诱导氧化应激,TGF-β等免疫抑制分子的分泌。31日在这里,我们表明,耗尽Ythdf1在肿瘤细胞抑制intratumoural MDSCs和减轻MDSCs在效应细胞的免疫抑制作用。MDSCs和T细胞coculture研究表明MDSCsYthdf1ko肿瘤有抑制能力受损CD8细胞增殖+T细胞和CD4 T+细胞相比,控制肿瘤。因此我们的研究结果支持YTHDF1介导的招聘功能MSDCs,抑制函数和扩散效应T细胞在CRC,导致免疫监视(图7 h)。

    在诊所,ICI疗法只显示有利影响一小部分患者MMR或MSI-H转移CRC,而大多数的CRC MSS状态在很大程度上是没有响应。34这可以部分归因于MDSCs和免疫抑制肿瘤微环境的形成。鉴于基因敲除的Ythdf1减少MDSC渗透CRC组织恢复免疫抑制,因此我们针对YTHDF1探索治疗的影响在两个MC38 (MSI-H)和CT26 (MSS)同源的CRC模型。Ythdf1沉默了MC38 anti-PD1功效的同系的模型。更重要的是,针对CT26 YTHDF1逆转anti-PD1抵抗(MSS)同源的模式,强调YTHDF1-targeting方法的广泛的实用程序在促进银行独立委员会功效不仅在MSI-H CRC,而且MSS CRC,否则是对银行独立委员会疗法。

    作为YTHDF1目前没有药物,我们开发了一个nanoparticle-based交付系统35交付YTHDF1可以阻止体内。同基因的小鼠模型和人性化的小鼠模型的CRC,我们观察VNP-si的强大效果YTHDF1非常高的渗透功能的T细胞和增强的肿瘤反应anti-PD1疗法。针对YTHDF1因此代表了CRC的有前途的免疫治疗的目标。

    总之,YTHDF1表达CRC新兵通过激活免疫抑制MDSCs m6A-p65-CXCL1轴抑制T细胞,从而促进儿童权利公约。针对YTHDF1 + anti-PD1治疗演示了对CRC有前途的抗肿瘤功效,确凿的CRC YTHDF1是一个潜在的治疗目标。

    数据可用性声明

    合理的请求数据。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    本研究通过临床研究伦理委员会的香港中文大学和北京癌症医院。

    引用

    1. ↵
      2. 比勒韩,
      3. 施拉格D
      。转移性结直肠癌的诊断和治疗:审查。《美国医学会杂志》2021年;325年:669年- - - - - -85年。doi: 10.1001 / jama.2021.0106
      OpenUrl CrossRef PubMed
    2. ↵
      2. 安德烈T,
      3. 萧若元k次方,
      4. 金太瓦,等
      。Pembrolizumab microsatellite-instability-high先进结肠直肠癌。N拉米夫地中海2020年;383年:2207年- - - - - -18。doi: 10.1056 / NEJMoa2017699
      OpenUrl CrossRef PubMed
    3. ↵
      2. 德劳内年代,
      3. 弗莱米
      。Rna修改调节细胞命运的癌症。Nat细胞生物2019年;21:552年- - - - - -9。doi: 10.1038 / s41556 - 019 - 0319 - 0
      OpenUrl CrossRef
    4. ↵
      2. 林X,
      3. 柴G,
      4. 吴Y,等
      。RNA米6一个甲基化调节肿瘤细胞上皮间充质转变和翻译的蜗牛。Nat Commun2019年;10:2065年。doi: 10.1038 / s41467 - 019 - 09865 - 9
    5. ↵
      2. πJ,
      3. 王W,
      4. 霁米,等
      。通过控制翻译FZD7 YTHDF1促进胃致癌作用癌症Res2021年;81年:2651年- - - - - -65年。doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 20 - 0066
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    6. ↵
      2. 刘T,
      3. 魏问,
      4. 金J,等
      。通过增加M6a读者YTHDF1促进卵巢癌进展eIF3c翻译。核酸Res2020年;48:3816年- - - - - -31日。doi: 10.1093 / nar / gkaa048
      OpenUrl CrossRef
    7. ↵
      2. 斯拉米E,
      3. 高J,
      4. DogrusozU,等
      。门户cbio癌症基因组学:一个开放的平台,探索多维癌症基因组学数据。癌症越是加大2012年;2:401年- - - - - -4。doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 12 - 0095
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    8. ↵
      2. 高J,
      3. Aksoy英航,
      4. DogrusozU,等
      。综合分析复杂的使用cbioportal癌症基因组学和临床资料。Sci的信号2013年;6:pl1。doi: 10.1126 / scisignal.2004088
    9. ↵
      2. 萨勃拉曼尼亚一个,
      3. TamayoP,
      4. 而VK,等
      。基因集富集分析:基于知识的方法解释全基因组表达谱。《美国国家科学院刊年代2005年;102年:15545年- - - - - -50。doi: 10.1073 / pnas.0506580102
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    10. ↵
      2. Tigano米,
      3. 巴尔加斯直流,
      4. Tremblay-Belzile年代,等
      。核感应线粒体DNA的断裂增强免疫监视。自然2021年;591年:477年- - - - - -81年。doi: 10.1038 / s41586 - 021 - 03269 - w
      OpenUrl CrossRef
    11. ↵
      2. 太阳l,
      3. KeesT,
      4. 阿尔梅达作为,等
      。激活一个协作innate-adaptive控制转移的免疫反应。癌症细胞2021年;39:1361年- - - - - -74年。doi: 10.1016 / j.ccell.2021.08.005
      OpenUrl
    12. ↵
      2. 高J,
      3. 史楼主的,
      4. 赵H,等
      。失去IFN-γ通路基因在肿瘤细胞的机制抵抗anti-CTLA-4疗法。细胞2016年;167年:397年- - - - - -404年。doi: 10.1016 / j.cell.2016.08.069
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      2. 沙玛P,
      3. Hu-Lieskovan年代,
      4. 沃戈晶澳,等
      。主、适应性和获得性耐药癌症免疫疗法。细胞2017年;168年:707年- - - - - -23。doi: 10.1016 / j.cell.2017.01.017
      OpenUrl CrossRef PubMed
    14. ↵
      2. 艾尔斯米,
      3. LuncefordJ,
      4. Nebozhyn米,等
      。IFN-γ-related mrna剖面预测临床应对PD-1封锁。中国投资2017年;127年:2930年- - - - - -40。doi: 10.1172 / JCI91190
      OpenUrl CrossRef PubMed
    15. ↵
      2. CristescuR,
      3. 亚塔R,
      4. 艾尔斯米,等
      。Pan-tumor基因组生物标志物PD-1检查点blockade-based免疫疗法。科学2018年;362年:eaar3593。doi: 10.1126 / science.aar3593
    16. ↵
      2. 王W,
      3. 绿色米,
      4. 崔我,等
      。Cd8 + T细胞调节肿瘤ferroptosis在癌症免疫疗法。自然2019年;569年:270年- - - - - -4。doi: 10.1038 / s41586 - 019 - 1170 - y
      OpenUrl PubMed
    17. ↵
      2. 页面F,
      3. MlecnikB,
      4. MarliotF,等
      。国际共识的验证immunoscore结肠癌的分类:预后和准确性的研究。《柳叶刀》2018年;391年:2128年- - - - - -39。doi: 10.1016 / s0140 - 6736 (18) 30789 - x
      OpenUrl CrossRef PubMed
    18. ↵
      2. 崔Y,
      3. 李年代,
      4. 金K,等
      。研究癌症免疫疗法使用patient-derived异种移植(pdx)人性化的老鼠。地中海Exp摩尔2018年;50:99年。doi: 10.1038 / s12276 - 018 - 0115 - 0
    19. ↵
      2. Rezvantalab年代,
      3. 柯克倪,
      4. Moraveji可,等
      。PLGA-based纳米颗粒在癌症治疗。前药物杂志2018年;9:1260年。doi: 10.3389 / fphar.2018.01260
    20. ↵
      2. Scortegagna米,
      3. CataissonC,
      4. 马丁RJ,等
      。Hif-1Alpha调节上皮炎症细胞自治NFkappaB激活和旁分泌基质重塑。血2008年;111年:3343年- - - - - -54。doi: 10.1182 /血液- 2007 - 10 - 115758
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    21. ↵
      2. 坎普某人,
      3. 卡彭特西文,
      4. 斯蒂尔NG,等
      。载脂蛋白E促进免疫抑制在胰腺癌NF-κB-mediated生产处于受控。癌症Res2021年;81年:4305年- - - - - -18。doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 20 - 3929
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    22. ↵
      2. HighfillSL,
      3. 崔Y,
      4. 贾尔斯AJ,等
      。中断CXCR2-mediated MDSC肿瘤贩卖增强anti-PD1功效。Sci Transl地中海2014年;6:237年ra67。doi: 10.1126 / scitranslmed.3007974
    23. ↵
      2. 王D,
      3. 太阳H,
      4. 魏J,等
      。处于对premetastatic利基的形成至关重要,在结直肠癌转移。癌症Res2017年;77年:3655年- - - - - -65年。doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 16 - 3199
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    24. ↵
      2. 张问,
      3. 马C,
      4. 段Y,等
      。肠道微生物组指导肝细胞招募mdscs,促进胆管癌。癌症越是加大2021年;11:1248年- - - - - -67年。doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 20 - 0304
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    25. ↵
      2. 奥利维拉我,
      3. Sanz-PamplonaR,
      4. 极限E,等
      。一个在治疗上可操作的protumoral轴涉及引发的细胞因子,TNFα,IL-1β。癌症越是加大2022年;12:2140年- - - - - -57。doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 21 - 1115
      OpenUrl
    26. ↵
      2. 勃朗特V,
      3. Brandau年代,
      4. 陈h,等
      。建议myeloid-derived抑制细胞命名和描述的标准。Nat Commun2016年;7:12150年。doi: 10.1038 / ncomms12150
    27. ↵
      2. Cassettal,
      3. Baekkevold西文,
      4. Brandau年代,等
      。破译myeloid-derived抑制细胞:隔离和标记在人类、老鼠和非人类的灵长类动物。癌症Immunol Immunother2019年;68年:687年- - - - - -97年。doi: 10.1007 / s00262 - 019 - 02302 - 2
      OpenUrl CrossRef PubMed
    28. ↵
      2. VegliaF,
      3. SansevieroE,
      4. Gabrilovich迪
      。Myeloid-Derived抑制细胞增加骨髓细胞多样性的时代。Nat Immunol牧师2021年;21:485年- - - - - -98年。doi: 10.1038 / s41577 - 020 - 00490 - y
      OpenUrl PubMed
    29. ↵
      2. 斯蒂尔连续波,
      3. 卡里姆SA,
      4. 浸出张东健,等
      。CXCR2抑制严重抑制转移和增强免疫治疗胰腺导管腺癌。癌症细胞2016年;29日:832年- - - - - -45。doi: 10.1016 / j.ccell.2016.04.014
      OpenUrl CrossRef PubMed
    30. ↵
      2. 格林年代,
      3. 罗宾斯Y,
      4. Mydlarz周,等
      。抑制MDSC贩运和sx - 682, CXCR1/2抑制剂,提高天然杀伤细胞免疫治疗在头部和颈部癌症模型。中国癌症Res2020年;26:1420年- - - - - -31日。doi: 10.1158 / 1078 - 0432. - ccr - 19 - 2625
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    31. ↵
      2. Gabrilovich迪,
      3. Nagaraj年代
      。Myeloid-Derived抑制细胞免疫系统的调节。Nat Immunol牧师2009年;9:162年- - - - - -74年。doi: 10.1038 / nri2506
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    32. ↵
      2. HoeselB,
      3. 施密德晶澳
      。NF-κB信号在炎症和癌症的复杂性。摩尔癌症2013年;12:86年。doi: 10.1186 / 1476-4598-12-86
    33. ↵
      2. 库马尔V,
      3. 帕特尔年代,
      4. TcyganovE,等
      。的本质myeloid-derived抑制细胞肿瘤微环境。趋势Immunol2016年;37:208年- - - - - -20.。doi: 10.1016 / j.it.2016.01.004
      OpenUrl CrossRef PubMed
    34. ↵
      2. 工头乔丹,
      3. Lonardi年代,
      4. 黄KYM,等
      。持久的临床效益与nivolumab + ipilimumab DNA错配repair-deficient /微卫星instability-high转移性结直肠癌。中华肿瘤防治杂志2018年;36:773年- - - - - -9。doi: 10.1200 / JCO.2017.76.9901
      OpenUrl CrossRef PubMed
    35. ↵
      2. 米切尔乔丹,
      3. 首度登场毫米,
      4. 哈雷RM,等
      。纳米药物输送技术工程精度。Nat牧师药物越是加大2021年;20.:101年- - - - - -24。doi: 10.1038 / s41573 - 020 - 0090 - 8
      OpenUrl CrossRef

    补充材料

    脚注

    • YB和生理改变同样起到了推波助澜的作用。

    • 贡献者YB和生理改变进行了实验,分析数据,并起草了手稿。HC和CCW评论研究和修订。CL进行动物实验。码和DH进行生物信息学分析。HG特区和YP进行实验。执行工作和KFT组织学染色和评估。司法院设计和监督研究和修订后的手稿。司法院作为担保人。

    • 资金本研究支持RGC合作研究基金(C4039-19GF),中国国家自然科学基金(81972576),RGC-GRF (14110819, 14110819), RGC研究影响基金香港(R4032-21F),中大校长的可自由支配的基金。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。