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胰腺
原始研究
化疗诱导的中性粒细胞浸润通过Gas6/AXL信号轴促进胰腺癌转移
  1. 盖亚Bellomo1，
  2. 卡洛琳Rainer1，
  3. 瓦Quaranta1，
  4. Yuliana Astuti1，
  5. Meirion Raymant1，
  6. Elzbieta博伊德1，
  7. 露丝Stafferton1，
  8. 菲奥娜•坎贝尔1，
  9. Paula Ghaneh1，
  10. 克里斯托弗·米哈洛伦1，
  11. 院长E哈蒙德2，
  12. 詹妮弗·P·莫顿3.，4，
  13. 丹尼尔·帕尔默1，
  14. 戴尔Vimalachandran1，
  15. 罗伯特。琼斯1，
  16. Ainhoa Mielgo1，
  17. 迈克尔·C施密德1
  1. 1分子和临床癌症医学，利物浦大学，利物浦、英国
  2. 2分子生理学与细胞信号传导“，，利物浦大学，利物浦、英国
  3. 3.英国癌症研究比特森研究所，格拉斯哥、英国
  4. 4癌症科学研究所，格拉斯哥大学，格拉斯哥、英国
  1. 对应到Michael C Schmid教授，分子和临床癌症医学，利物浦大学，英国利物浦;mschmid在{}liverpool.ac.uk

摘要

客观的胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高度转移性疾病，细胞毒性化疗是晚期患者的标准护理治疗方法。在这里，我们研究了PDAC肝转移瘤中的微环境如何对化疗做出反应，以及它在治疗后转移疾病进展中的作用，这是一个尚不清楚的领域。

设计在实验性PDAC肝转移瘤小鼠模型中，通过流式细胞术和大细胞术结合转录和组织病理学分析，对化疗对转移性疾病进展和免疫细胞浸润的影响进行了表征。研究结果在患者源性肝转移和原位PDAC小鼠模型中得到验证。人类和小鼠原代细胞共培养和体外患者来源的肝外植体被用于获得化学疗法是否以及如何影响转移性肿瘤微环境的机制见解。

结果我们的研究表明，在体内，化疗诱导促炎巨噬细胞最初浸润到肝脏，并激活细胞毒性T细胞，只导致转移性疾病进展的暂时抑制。然而，在停止治疗后，中性粒细胞通过CXCL1和cxcl2的分泌被转移性肿瘤细胞募集到转移性肝脏。这些中性粒细胞表达生长阻滞特异性6 (Gas6)，导致肿瘤细胞上的AXL受体激活，使其再生。联合化疗破坏中性粒细胞浸润或抑制Gas6/AXL信号轴可抑制转移性生长。化疗增加转移性胰腺癌患者循环中性粒细胞中Gas6的表达，重组Gas6足以在患者转移性肝移植体中促进肿瘤细胞的体外增殖。

结论化疗联合Gas6/AXL或中性粒细胞靶向治疗可为转移性胰腺癌患者提供治疗效益。

  • 肝转移
  • 胰腺癌
  • 巨噬细胞
  • 免疫反应

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325272

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 胰腺癌是一种毁灭性的转移性疾病，迫切需要更好的治疗方法。

    • 胰腺癌经常转移到肝脏，那里的转移微环境促进了转移瘤的播撒和生长。

    • 细胞毒性化疗是所有胰腺癌患者的标准治疗，包括那些局部晚期或转移性疾病，并作为手术切除原发肿瘤患者的辅助治疗。

    • 目前尚不清楚转移性微环境对化疗的反应及其在治疗后转移性疾病进展中的作用。

    新的发现是什么?

    • 停止化疗诱导中性粒细胞聚集到肝脏，导致转移性生长增加。

    • 中性粒细胞被扩散的胰腺癌细胞通过CXCL1和cxcl2的表达招募到肝脏。

    • 化疗后募集到肝脏的中性粒细胞表达生长阻滞特异性6 (Gas6)，导致肿瘤细胞上的AXL受体激活。

    • gas6介导的肿瘤细胞上AXL受体的激活促进化疗后肿瘤细胞在体内外再生。

    • 联合化疗破坏中性粒细胞浸润或抑制Gas6/AXL信号轴可抑制转移性生长。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 化疗联合Gas6/AXL或中性粒细胞靶向治疗可能为转移性胰腺癌患者的治疗和肿瘤切除患者的辅助治疗提供了新的机会。

    背景

    转移是癌症相关死亡的主要原因。胰导管腺癌(PDAC)常转移至肝脏1 2肝转移伴随着炎症-纤维化转移微环境的形成，这种微环境支持癌细胞的定植和扩散。3 - 6髓系免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，在转移龛中大量存在，并已被证明能促进转移过程。7号到9号巨噬细胞是高度可塑性的细胞，根据它们的激活状态，可以获得肿瘤支持或肿瘤抑制功能。10 11在肝转移过程中，巨噬细胞是前转移细胞，显示免疫抑制表型，12日13和促进纤维化。3.新的证据表明，中性粒细胞在转移的早期阶段起着关键作用。14中性粒细胞可以通过释放中性粒细胞细胞外陷阱(NETs)促进远处部位的定植，15日16诱导血管生成,9日17分泌的白细胞三烯18通过免疫抑制活性。19日20然而，胰腺转移灶中的髓系免疫细胞功能是否因治疗干预而改变尚不清楚。

    系统性扩散是胰腺癌进展的早期事件1当PDAC患者被确诊时，大多数(约80%)表现为不可切除的转移性癌症。2总共15%-20%的PDAC患者符合手术切除原发肿瘤的条件。然而，临床上无法检测到的微转移病变往往在原发肿瘤切除时就已经存在，超过70%的患者在手术后24个月内复发并发生远处转移。21手术切除后复发的时间与总生存率密切相关，早期肝转移性复发与较差的预后相关。22诊断为肝转移后，全身化疗的中位生存期仅为9个月。23

    细胞毒性化疗是所有胰腺癌患者的标准治疗，包括那些局部晚期或转移性疾病，并作为手术切除原发肿瘤患者的辅助治疗。24吉西他滨、吉西他滨/卡培他滨、nab-紫杉醇和FOLFIRINOX是最常见的化疗治疗方案。25尽管化疗对原发肿瘤部位的影响是很明显的，21我们对化疗如何形成肝转移微环境以及这如何影响转移性疾病进展的理解仍然未知。对这一过程的更好理解将有助于提高目前全身化疗的疗效。

    结果

    吉西他滨治疗抑制转移进展，但当治疗停止时疾病复发

    为了在体内模拟转移性胰腺癌的化疗治疗，我们通过KPC衍生细胞脾内植入诱导小鼠PDAC肝转移，并在转移病灶建立后(移植后第12天)开始吉西他滨治疗。3.（图1一个)．而KPC癌细胞在体外对吉西他滨敏感(在线补充图S1A)，吉西他滨治疗并没有改善胰腺癌肝转移动物的总体生存期(图1一个)．活体生物发光成像分析显示，在治疗计划结束时，吉西他滨治疗动物的转移性肿瘤负担显著减少(d22) (图1 b)，但在人道终点(在第32天和第48天之间)未检测到肿瘤负担的差异(图1 c)．肝组织切片的H&E染色进一步证实，在治疗计划结束时(第22天)转移瘤病变明显减少，而在人道终点不再检测到这种减少(在线补充图S1B-E)．死后分析证实肝脏有广泛的肿瘤，而脾脏的肿瘤形成仍然很少(在线补充图S1F, G)．我们接下来评估了对照组(生理盐水治疗)和吉西他滨治疗动物肝脏中肿瘤细胞的死亡情况。我们发现，通过cleaved caspase 3 (CC3)染色评估，在治疗计划结束(第22天)时，吉西他滨治疗的动物与对照组荷瘤小鼠相比，凋亡癌细胞的百分比显著增加(图1 d, E)．然而，根据人道终点，在停用吉西他滨治疗后，最初观察到的癌细胞死亡增加消失了(在线补充图S1H, I)．辅助化疗是原发性胰腺肿瘤手术切除患者的既定护理标准。24这些患者复发转移性疾病的时间短且频率高(切除后的中位数为9个月)23)强烈提示在手术时隐匿性微转移已经确定。26为了测试化疗对微转移病灶的效果等同于辅助治疗设置，我们接下来在肿瘤植入后的第3天，在最初的播种期之后和存在微转移病灶的地方，给予单剂量吉西他滨(图1 f)．3 13与我们观察到的较大转移性病变相似，吉西他滨也能减少微转移性肿瘤负担(图1 g, H)和第4天肝脏的肿瘤病变区域(图1 i, J)，但这种效果在第14天就消失了(图1 g-j)．吉西他滨给药24小时后，与对照组相比，吉西他滨治疗动物微转移病灶中凋亡癌细胞(TUNEL+)的百分比显著增加(图1 k, L)．然而，在第14天，吉西他滨治疗组肿瘤中TUNEL +癌细胞的比率下降到与未治疗组相似的水平(在线补充图S1J, K)．巨噬细胞和树突状细胞(DCs)是来自免疫系统固有分支的吞噬细胞，在清除死亡细胞中起着关键作用，对诱导癌症中的抗肿瘤免疫反应至关重要。27为了确定巨噬细胞和树突状细胞对细胞肿瘤碎片的吞噬作用，我们用流式细胞术测量了巨噬细胞内zsGreen标记的癌细胞(CD11b)的荧光信号+F4/80+CD11c负的), CD11b+DCs (CD11c+CD11b+CD103负的F4/80负的)和CD103+DCs (CD11c+CD103+CD11b负的F4/80负的)．与对照组相比，所有三个细胞群在吉西他滨给药后均表现出显著的zsGreen信号摄取(图1米；在线补充图S1L)，表明转移病灶的固有免疫细胞在化疗的反应中被激活。综上所述，这些发现表明吉西他滨诱导PDAC转移病灶的癌细胞死亡，但在停药后肿瘤生长复发，总生存期不变。

    Gemcitabine restrains metastatic progression during treatment, but disease relapses and overall survival remain unchanged when treatment is withdrawn. (A–E) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of 1×106 KPCluc/zsGreen cells. Starting day 12, animals were treated with gemcitabine (100 mg/kg) or control (vehicle) every 3 days with four doses in total. (A) Survival analysis of gemcitabine and control-treated mice-bearing liver metastasis; log-rank (Mantel-Cox) test, p=0.2499. Median survival for control was 22 days (n=6 mice) and gemcitabine 33.5 days (n=8 mice) after treatment initiation. (B) Representative images of bioluminescence imaging (BLI) taken 1 day after last treatment dose (day 22). (C) Tumour burden assessed by BLI in gemcitabine treated group (n=8 mice) compared with control group (n=6 mice) at day 22 and humane endpoint (HEP). (D, E) Representative immunofluorescent images (D) and quantification (E) of apoptotic KPCluc/zsGreen cells staining positive for cleaved caspase 3 (CC3) at day 22 (n=5 mice /group). White arrowheads indicate apoptotic (CC3+) cancer cells. (F–L) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of 5×105 KPCluc/zsGreen cells and animals received one dose of gemcitabine (100 mg/kg) or control (vehicle) at day 3 (F). (G, H) Representative BLI images of dissected livers (G) and change in tumour burden (H) (day 4: n=5 mice/group/time point). (I, J)Representative images of H&E-stained liver sections (I) and quantification (J). (K, L)Rrepresentative immunofluorescent images of apoptotic KPCluc/zsGreen cells staining positive for TUNEL at day 4 (n=5 mice/group) (K) and quantification (L).White arrowheads indicate apoptotic (TUNEL+) cancer cells. (M) uptake of apoptotic zsGreen-labelled KPC FC1199luc/zsGreen cancer cells by dendritic cells (DC) and macrophages (MACS) was evaluated 1 day after gemcitabine treatment. Frequency of zsGreen +cells among CD103+ DC, CD11b+ DC and MACS (n=5 mice/group). Scale bar 50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01. H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    吉西他滨在治疗期间抑制转移进展，但当治疗停止时，疾病复发和总生存期不变。(A-E) 1×10脾内植入诱导肝转移6KPC卢克/zsGreen细胞。从第12天开始，动物每3天接受吉西他滨(100 mg/kg)或对照(对照)治疗，共4次。(A)吉西他滨与对照组小鼠肝转移生存率分析;log-rank (Mantel-Cox)检验，p=0.2499。对照组在治疗开始后的中位生存期为22天(n=6只老鼠)，吉西他滨为33.5天(n=8只老鼠)。(B)最后一次治疗剂量(第22天)后1天拍摄的生物发光成像(BLI)代表图像。(C)吉西他滨治疗组(n=8只)与对照组(n=6只)在第22天及人道终点(HEP)时的BLI肿瘤负荷评估。(D, E)凋亡KPC的代表性免疫荧光图像(D)和定量(E)卢克/zsGreen第22天细胞cleaved caspase 3 (CC3)染色阳性(n=5只/组)。白色箭头表示凋亡(CC3+)癌细胞。(F-L)脾内植入5×10诱导肝转移5KPC卢克/zsGreen细胞和动物在第3天接受一剂吉西他宾(100 mg/kg)或对照(对照)(F)。(G, H)解剖肝脏的代表性BLI图像(G)和肿瘤负荷的变化(H)(第4天:n=5只小鼠/组/时间点)。(I, J) h&e染色肝切片的代表性图像(I)和量化(J)。(K, L)凋亡KPC的代表性免疫荧光图像卢克/zsGreen第4天TUNEL染色阳性细胞(n=5只/组)(K)和定量(L)。白色箭头表示凋亡(TUNEL+)癌细胞。(M)凋亡细胞zsgreen标记的KPC FC1199的摄取luc / zsGreen在吉西他滨治疗后1天评估树突状细胞(DC)和巨噬细胞(MACS)对癌细胞的影响。CD103中zsGreen +细胞的频率+特区CD11b+DC和MACS (n=5只/组)。比例尺50 μ M。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验计算p值。* P < 0.05;* * p < 0.01。H,健康的肝脏;米,转移;n,不重要。

    吉西他滨治疗诱导转移性肝病变的促炎免疫反应的短期激活

    因为化疗可以促进癌症免疫反应的激活27接下来，我们更详细地研究了在吉西他滨治疗初始反应期间(第4天)和停药后(第14天)转移病灶中免疫细胞激活对基因表达水平的影响，使用小鼠胰腺癌免疫分析板(NanoString Technologies)。生成的途径评分的分层聚类显示，吉西他滨在初始反应期间诱导了明显的转录变化，这在吉西他滨组与对照组的单独聚类中得到了强调(图2一个(左)。然而，在停药后，对照组和吉西他滨治疗的转移病灶之间的明显特征消失了，这表明两组之间失去了分离(图2一个,对吧)。在最高的上调通路中，我们确定了先天免疫激活和T细胞功能，这是抗肿瘤免疫反应的特征(图2 b)．然而，在停用吉西他滨后，这些免疫刺激通路明显下调，这表明吉西他滨仅在荷瘤小鼠中触发了抗肿瘤免疫反应的暂时性激活(图2 c)．我们接下来用细胞质量和流式细胞术分析分离的转移病灶，以评估免疫细胞浸润及其激活状态。我们发现在最初的反应中，巨噬细胞数量(CD45+CD11b+Ly6G负的F4/80+)显著增加，炎症单核细胞数量(CD45+CD11b+Ly6C高Ly6G负的F4/80负的)减少(图2 d；在线补充图S2A, B)．此外,CD4+治疗后T细胞数量显著增加(在线补充图S3A, C)．然而，在化疗停止后，中性粒细胞(CD45+CD11b+F4/80负的Ly6G+)和巡逻单核细胞(pMo;CD45+CD11b+Ly6C低F4/80低/否定MHCII负的)与对照组相比，吉西他滨治疗肿瘤中增加最多，而T细胞数量显著减少(图2 e)．T细胞总数的减少最有可能是由于CD8的减少+T细胞，因为CD4较少+FoxP3+T调节细胞(T海军学校规则)相当增加的(在线补充图S3A-D)．与抗肿瘤免疫反应一致，我们发现CD8的激活显著增加+和CD4+T细胞(图2 f；在线补充图S3E, F)、DCs (图2 g)、巨噬细胞(图2 h)及NK细胞(图2我)在吉西他滨初始反应期间(在线补充图S2A, B)．同样，这种效果在停药后消失了。

    Gemcitabine administration induces a short-term activation of a proinflammatory immune response in metastatic pancreatic cancer. (A–K) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells and animals were treated with gemcitabine (100 mg/kg) or control (vehicle) at day 3. Metastatic livers were resected at initial response (day 4) and after withdrawal of treatment (day 14) for transcriptional, mass cytometry and tissue staining analysis. (A) Heatmap depicting hierarchical clustering of pathway scores (n=3 mice/group/time point). (B–C) Graph depicting top pathway scores observed in (B) metastatic livers of gemcitabine treated animals compared with control animals during initial response (day 4) and in (C) metastatic livers after gemcitabine withdrawal (day 14) compared with the initial response (day 4). (D, E) Coloured viSNE maps with each colour representing one immune cell population assessed by mass cytometry and quantification of main immune cell types among control (CTR) and gemcitabine (GEM) treated liver metastases at day 4 (A) and day 14 (B), respectively (CTR D4 n=4 mice, GEM D4 n=4 mice; CTR d14 n=3 mice; GEM d14 n=4 mice). (F–I) Quantification of metastasis infiltrating immune cells and their activation state by mass cytometry at initial treatment response (day 4) and after treatment withdrawal (day 14). (F)Cytotoxic CD8+ T cell activation (CD69+), (G) dendritic cell (DC) activation (CD86 +MHCIIhigh), (H) macrophage activation (CD86 +MHCIIhigh) and (I) natural killer (NK) cell activation (CD69+) (CTR D4 n=4 mice, GEM D4 n=4 mice; CTR d14 n=3 mice; GEM d14 n=4 mice). (J, K) Representative immunofluorescent images and quantification of iNOS+ and F4/80+ macrophages in liver tumours during initial response (n=4 mice/group) (D) and after gemcitabine withdrawal (E) (n=3 mice in CTR group; n=4 mice in GEM group). White arrowheads indicate iNOS+ macrophages. Scale bar 50 µM; M=metastases, H=healthy liver. Data are presented as mean±SEM. *P<0.05; **p<0.01; n.s., not significant, by unpaired t-test. For multiple comparisons (D, E), one-way ANOVA coupled with Dunnett’s post hoc testing was performed. ANOVA; analysis of variance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    吉西他滨在转移性胰腺癌中诱导促炎免疫反应的短期激活。(A-K)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞和动物在第3天用吉西他滨(100 mg/kg)或对照(对照)处理。在最初反应(第4天)和停止治疗(第14天)时切除转移性肝脏，进行转录、巨细胞术和组织染色分析。(A)描述路径评分分层聚类的热图(n=3只小鼠/组/时间点)。(B - C)图描述了(B)吉西他滨治疗动物与对照组动物在初始反应期间(第4天)转移性肝脏观察到的最高途径评分，以及(C)吉西他滨停药后(第14天)转移性肝脏与初始反应(第4天)观察到的最高途径评分。E)彩色viSNE图，每一种颜色代表一种免疫细胞群，分别在第4天(A)和第14天(B)对对照组(CTR)和吉西他滨(GEM)治疗肝转移瘤的主要免疫细胞类型进行定量分析(CTR D4 n=4只小鼠，GEM D4 n=4只小鼠;CTR d14 n=3只小鼠;GEM d14 n=4只小鼠)。(F-I)在最初治疗应答(第4天)和停止治疗(第14天)时，用细胞术定量检测转移浸润性免疫细胞及其激活状态。(F)细胞毒性CD8+ T细胞活化(CD69+)， (G)树突状细胞活化(CD86 +MHCII)高)， (H)巨噬细胞活化(CD86 +MHCII高)和(I)自然杀伤(NK)细胞活化(CD69+) (CTR D4 n=4只小鼠，GEM D4 n=4只小鼠;CTR d14 n=3只小鼠;GEM d14 n=4只小鼠)。(J, K)肝肿瘤中iNOS+和F4/80+巨噬细胞的代表性免疫荧光图像和定量(n=4只小鼠/组)(D)和吉西他滨停药后(E) (n=3只CTR组小鼠;GEM组n=4只)。白色箭头表示iNOS+巨噬细胞。比例尺50 μ M;M =转移,H =健康的肝脏。数据以平均值±SEM表示。* P < 0.05; **p<0.01; n.s., not significant, by unpaired t-test. For multiple comparisons (D, E), one-way ANOVA coupled with Dunnett’s post hoc testing was performed. ANOVA; analysis of variance.

    对转移性肝组织的进一步分析证实，吉西他滨治疗可诱导巨噬细胞的整体积累(F4/80+)，特别是具有促炎表型(iNOS)的巨噬细胞+) (图2 j)而具有免疫抑制表型的巨噬细胞(CD206+和YM1+)减少(在线补充图S3G-J)．然而，停药后未观察到巨噬细胞浸润或激活的显著变化(图2 k；在线补充图S3K, L)．综合这些数据表明，吉西他滨诱导转移部位的抗肿瘤免疫反应的激活，其特征是激活CD8的促炎巨噬细胞的增加+T细胞和NK细胞。然而，在停止治疗后，最初的免疫细胞激活丧失，转移性病变恢复到免疫抑制微环境，这通常在已确定的转移性PDAC肿瘤中发现。12日13

    吉西他滨治疗后巨噬细胞减少增加CD8+ T细胞浸润，但中性粒细胞减少对CD8+ T细胞数量无影响

    因为中性粒细胞和巨噬细胞都能有效抑制CD8+T细胞反应,11日14我们接下来的问题是，这两种骨髓细胞类型的耗竭是否足以阻止转移性复发并维持最初观察到的CD8+T细胞反应(图2B及F)．为了解决这个问题，我们使用靶向中性粒细胞(αLy6G)或巨噬细胞(αCSF-1)的单克隆抗体在吉西他滨治疗存在或不存在的情况下进行了两项独立的耗损研究。KPC细胞脾内植入诱导肝转移。3天后，小鼠微转移病灶用吉西他滨或生理盐水治疗(对照组)，1天后(第4天)我们开始消耗中性粒细胞(图3 a - c)或巨噬细胞(图3 d-f)使用αLy6G和αCSF-1抗体，或其对应的同型对照(IgG)。与吉西他滨/IgG治疗相比，吉西他滨治疗后中性粒细胞耗损显著降低转移性肿瘤负担(图3 b, C，在线补充图S4A、B)，但在缺乏吉西他滨的情况下中性粒细胞的耗竭对转移性肿瘤负担没有任何影响(在线补充图S4C)．相比之下，在盐水(对照)和吉西他滨治疗的小鼠中，αCSF-1消耗的巨噬细胞显著减少了转移性肿瘤负担(图3 e, F；在线补充图S4D, E)．流式细胞术分析吉西他滨治疗动物的分散转移病灶，发现巨噬细胞的减少增加了CD8+T细胞浸润，而中性粒细胞耗竭不影响CD8+T细胞浸润(图3 g)．与这些结果一致的是，我们没有检测到CD8中颗粒酶B的表达增加+吉西他滨治疗动物中性粒细胞减少的T细胞(图3 h)，但我们发现表达CD8的Granzyme B显著增加+吉西他滨治疗小鼠转移病灶中巨噬细胞减少的T细胞(图3 j, K)．我们还证实，应用巨噬细胞消耗和中性粒细胞消耗策略确实减少了转移部位的相应数量(在线补充图S4F-H)．值得注意的是，与单独吉西他滨治疗相比，吉西他滨治疗后中性粒细胞耗损或巨噬细胞耗损也增加了小鼠的总生存率(图3 l, M)．综上所述，这些数据表明吉西他滨在初始反应期间伴随巨噬细胞浸润，而在治疗停药后，中性粒细胞被招募到转移部位。停用吉西他滨后巨噬细胞或中性粒细胞的减少增强了吉西他滨的治疗效果。值得注意的是，当巨噬细胞消耗恢复CD8+T细胞浸润和活化，中性粒细胞耗竭不影响CD8+T细胞，表明中性粒细胞促进CD8的转移性复发+T细胞独立方式。

    Macrophage depletion increases CD8+ T cell infiltration, but neutrophil depletion has no effect on CD8+ T cell numbers. (A–M) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells and animals were treated with gemcitabine (100 mg/kg) or control (vehicle) at day 3. (A–C, G–I) At day 4, mice were treated with IgG control (CTR) or αLy6G antibody. Schematic illustrating experiment (A). Change in tumour burden was quantified by in vivo BLI (n=3 mice/group). Representative images (B) and quantification (C). (D–G, J, K) At day 4, mice were treated with IgG control (CTR) or αCSF-1 antibody. Schematic illustrating experiment (D). Change in tumour burden was quantified by in vivo BLI (CTR n=3 mice; αCSF-1 n=4 mice). Representative images (E) and quantification (F). (G) Change in CD8+ T cell infiltration into metastatic lesions was quantified by flow cytometry analysis in mice treated with αLy6G or αCSF-1 or their corresponding IgG controls. (H, I) Representative immunofluorescent images of CD8+GranzymeB+ T cell staining of liver sections from mice treated with IgG or αLy6G (H) and quantification (I) of CD8+GranzymeB+ T cells (GranzymeB=GzmB). (J, K) Representative immunofluorescent images of CD8+GranzymeB+ T cell staining of liver sections from mice treated with IgG or αCSF-1 (J) and quantification (K) of CD8+GranzymeB+ T cells. White arrowheads indicate CD8+GranzymeB+ T cells. (L) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of 1×106 KPCluc/zsGreen cells. At day 3, all animals were treated with gemcitabine (100 mg/kg). At day 4, mice were treated with IgG control (CTR) or αLy6G antibody. survival analysis of gemcitabine + IgG and gemcitabine + αLy6G antibody-treated mice-bearing liver metastasis; log-rank (Mantel-Cox) test, p=0.0022. Median survival for gemcitabine + IgG was 35 days (n=6 mice) and gemcitabine + αLy6G 48 days (n=6 mice). (M) same as (L), but at day 4, mice were treated with IgG control (CTR) or αCSF-1R antibody. Survival analysis of gemcitabine + IgG and gemcitabine + αCSF-1R antibody-treated mice-bearing liver metastasis; log-rank (Mantel-Cox) test, p=0.0168. Median survival for gemcitabine + IgG was 29.5 days (n=6 mice) and gemcitabine + αCSF-1R 45 days (n=6 mice). Scale bar 50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01. H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    巨噬细胞耗竭增加CD8+ T细胞浸润，但中性粒细胞耗竭对CD8+ T细胞数量无影响。(A-M)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞和动物在第3天用吉西他滨(100 mg/kg)或对照(对照)处理。(A-C, G-I)第4天，小鼠分别接种IgG control (CTR)或αLy6G抗体。图解实验(A).用体内BLI量化肿瘤负荷的变化(n=3只/组)。代表性图像(B)和定量图像(C)。(D-G, J, K)第4天，小鼠分别用IgG control (CTR)或αCSF-1抗体处理。图解实验(D)。用体内BLI量化肿瘤负荷的变化(CTR n=3只小鼠;αCSF-1 n = 4老鼠)。代表性图像(E)和定量(F)。(G)用流式细胞术分析在αLy6G或αCSF-1或相应的IgG对照小鼠中定量CD8+ T细胞浸润转移病灶的变化。(H, I) IgG或αLy6G处理小鼠肝脏切片CD8+GranzymeB+ T细胞染色的代表性免疫荧光图像和CD8+GranzymeB+ T细胞(GranzymeB=GzmB)的定量(I)。(J, K) IgG或αCSF-1处理小鼠肝脏切片CD8+GranzymeB+ T细胞染色的代表性免疫荧光图像(J)和CD8+GranzymeB+ T细胞定量(K)。白色箭头表示CD8+GranzymeB+ T细胞。 (L) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of 1×106KPC卢克/zsGreen细胞。第3天，所有动物均给予吉西他滨(100 mg/kg)治疗。第4天，小鼠分别给予IgG control (CTR)或αLy6G抗体治疗。吉西他滨+ IgG和吉西他滨+ αLy6G抗体治疗小鼠肝转移瘤的生存分析log-rank (Mantel-Cox)检验，p=0.0022。吉西他滨+ IgG组的中位生存期为35天(n=6)，吉西他滨+ αLy6G组的中位生存期为48天(n=6)。(M)与(L)相同，但在第4天，小鼠分别用IgG对照(CTR)或αCSF-1R抗体治疗。吉西他滨+ IgG和吉西他滨+ αCSF-1R抗体治疗小鼠肝转移瘤的生存分析log-rank (Mantel-Cox)检验，p=0.0168。吉西他滨+ IgG组的中位生存期为29.5天(n=6只小鼠)，吉西他滨+ αCSF-1R组的中位生存期为45天(n=6只小鼠)。 Scale bar 50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01. H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.

    停化疗触发表达gas6的中性粒细胞向肝转移瘤募集

    接下来，我们进一步探讨了中性粒细胞促进化疗停药后转移性复发的机制。吉西他滨治疗后中性粒细胞的减少减少了CD8存在和不存在的转移+T细胞(图4一；在线补充图S4I, J)，说明中性粒细胞可以直接影响癌细胞的再生。因此，我们接下来评估了吉西他滨停药后肿瘤切片中的癌细胞增殖情况(第14天)。停用吉西他滨后，转移性沉积增殖明显增加(Ki67+)癌细胞与生理盐水治疗对照组的转移性沉积(图4 b, C)．重要的是，中性粒细胞的减少只减少了与吉西他滨停用相关的癌细胞增殖，而对盐水(对照组)治疗小鼠的癌细胞增殖没有影响，提示治疗诱导中性粒细胞的生长促进功能(图4 b, C)．因此，为了验证这一假设，我们从经盐水(对照)或吉西他滨处理的小鼠转移肝中分离出转移浸润中性粒细胞，并将其与吉西他滨预处理的胰腺癌细胞在体外锚定独立生长条件下共培养。吉西他滨治疗的胰腺癌细胞无法形成菌落(图4 d；在线补充图S4K)．值得注意的是，从吉西他滨处理过的转移性肝脏中分离的中性粒细胞与吉西他滨处理过的癌细胞共培养能够使癌细胞生长并形成菌落，而从对照组(盐水处理)转移性病变中分离的中性粒细胞不能促进癌细胞增殖(图4 d)．相比之下，虽然转移来源的巨噬细胞也能够显著增加癌细胞集落的形成，但巨噬细胞的生长促进功能是gas6独立的，不受吉西他滨的影响，与吉西他滨治疗小鼠的中性粒细胞相比，其作用明显较弱(图4 d；在线补充图S4L)．与这些发现一致的是，在体内，Ki67+在巨噬细胞减少的小鼠中，癌细胞数量减少与治疗无关(在线补充图S4M, N)．综上所述，这些数据表明吉西他滨治疗使中性粒细胞获得促进癌细胞增殖的原丝分裂能力。

    Neutrophils promote cancer cells proliferation and Gas6 is highly expressed by metastatic associated neutrophils after gemcitabine treatment. (A) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells and animals were treated with gemcitabine (GEM; 100 mg/kg) at day 3. At day 4, mice were treated with αLy6G or IgG controls for 2 weeks; at day 7, mice were treated with αCD8 or IgG controls until end point (day 14). Change in tumour burden was quantified by ex vivo bioluminescence imaging (BLI) (n=5 mice/group). (B–C) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells. Mice were treated with gemcitabine or saline 3 days postcell implantation. Treatment with αLy6G or control IgG started at D4 (n=4 mice/group). Livers were resected after 14 days and assessed by Ki67 staining (proliferation marker). Representative IHC images (B) and quantification of proliferating Ki67+ tumour cell frequency in metastatic livers (C). Inset: asterisks indicate ductal structures formed by metastatic tumour cells (red arrow head). (D)Colony formation assay of gemcitabine stressed KPC cells in the presence or absence of metastasis infiltrating neutrophils (+Ly6G) or macrophages (+F4/80) isolated from tumour-bearing livers of mice at day 14 after treatment with GEM or saline treated (CTR). Bar graph shows fold upregulation of BLI signal compared with Gem-treated KPC cells alone (red shaded) (three independent experiments; mean±SEM). (E) Quantification of Gas6 mRNA levels by real time PCR in intrametastatic pancreatic cancer cells, neutrophils (Ly6G), macrophages (F4/80) and non-immune stromal cells (zsGreennegCD45neg), isolated by fluorescence activated cell sorting from established metastatic livers at day 14 after treatment with GEM or untreated (CTR). Bar graph shows relative expression of Gas6 in cells derived from GEM-treated mice and untreated mice (data are from three independent experiments; mean±SEM). (F–H) Representative images (F) of myeloperoxidase (MPO) and Gas6 staining using RNAscope in serial sections from metastatic livers derived from untreated (CTR) or GEM treated mice (n=3 mice/group). Arrowheads indicate Gas6+ staining in neutrophil-rich areas. Scoring of Gas6 signal per field of view (G) and MPO staining quantification (H). (I–K) Metastatic tumours in livers of the spontaneous mouse pancreatic cancer model KrasG12D;Trp53R172H;Pdx1-Cre (KPC mice) treated with Gemcitabine (KPC Gem) or left untreated (KPC Ctr) were isolated and analysed (n=3 mice/group). Representative images (I) of MPO and Gas6 staining using RNAscope in serial sections from metastatic tissue sections. Arrowheads indicate Gas6+ staining in neutrophil-rich areas. (J) Scoring of Gas6 signal per field of view and (K) MPO staining quantification. (L, M) Peripheral blood neutrophils were isolated from metastatic PDAC patients during their first cycle of gemcitabine treatment and GAS6 mRNA levels were assessed by real time PCR. Schematic illustration of treatment regimen and patient blood sample collection (L). Quantification of data (M) (BL=baseline, prior treatment) (n=2 patients). Scale bar=50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test or ANOVA with Bonferroni was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA; analysis of variance; H, healthy liver; IHC, immunohistochemistry; M, metastases; n.s., not significant; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    中性粒细胞促进癌细胞增殖，吉西他滨治疗后转移相关中性粒细胞高表达Gas6。(A)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen用吉西他滨(GEM;第3天服用100 mg/kg)。第4天，各组小鼠分别用αLy6G或IgG对照治疗2周;第7天，小鼠分别给予αCD8或IgG对照，直至结束时(第14天)。体外生物发光成像(BLI)量化肿瘤负荷的变化(n=5只/组)。(B-C)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞。小鼠细胞植入后3天给予吉西他滨或生理盐水治疗。αLy6G或对照IgG从D4开始治疗(n=4只/组)。14天后切除肝脏，Ki67染色(增殖标记)评估。具有代表性的IHC图像(B)和转移性肝脏中增殖的Ki67+肿瘤细胞频率的定量(C)。插图:星号表示转移性肿瘤细胞形成的导管结构(红色箭头)。(D)吉西他滨胁迫KPC细胞，在GEM或生理盐水处理(CTR)后第14天从小鼠荷瘤肝脏中分离出转移浸润性中性粒细胞(+Ly6G)或巨噬细胞(+F4/80)存在或不存在的情况下进行集落形成实验。条形图显示BLI信号与单独经gem处理的KPC细胞(红色阴影)相比上调了一倍(三个独立实验;意味着±SEM)。(E)的量化Gas6实时PCR检测转移内胰腺癌细胞、中性粒细胞(Ly6G)、巨噬细胞(F4/80)和非免疫间质细胞(zsGreen)的mRNA水平负的CD45负的)，在GEM治疗或未治疗(CTR)治疗后第14天，通过荧光激活细胞分选从已确定的转移性肝脏中分离出来。的相对表达式柱状图Gas6(数据来自三个独立的实验;意味着±SEM)。(F - h)髓过氧化物酶(MPO)和髓过氧化物酶的代表性图像(F)Gas6用RNAscope对未处理(CTR)或GEM处理小鼠(n=3只/组)转移肝的连续切片进行染色。箭头指示Gas6 +富中性粒细胞区染色。得分的Gas6每视场信号(G)和MPO染色定量(H)。(I-K)自发性小鼠胰腺癌模型Kras的肝脏转移瘤G12D; Trp53R172H分离并分析吉西他滨治疗(KPC Gem)或未治疗(KPC Ctr)的Pdx1-Cre (KPC小鼠)(n=3只/组)。MPO和的代表性图像(I)Gas6用RNAscope对转移组织切片进行连续染色。箭头指示Gas6 +富中性粒细胞区染色。(J) Gas6信号每视场评分(K) MPO染色量化。(左，中)从吉西他滨治疗第一个周期的转移性PDAC患者中分离出外周血中性粒细胞GAS6实时PCR检测mRNA水平。治疗方案和患者血样采集示意图(L)。数据量化(M) (BL=基线，既往治疗)(n=2例)。比例尺= 50µM。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验或Bonferroni方差分析计算p值。* P < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。方差分析;方差分析; H, healthy liver; IHC, immunohistochemistry; M, metastases; n.s., not significant; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.

    我们下一步的目标是了解中性粒细胞是如何促进癌细胞增殖的。为了达到这一目标，我们对从盐水处理的转移性肝脏(Ly6GCtr)和吉西他滨治疗转移性肝脏(Ly6G宝石) (在线补充图S4O)．首先过滤不同表达基因的氧化石墨烯术语细胞外和受体配体活性。在得到的n=141个基因中，我们发现生长抑制特异性蛋白6 (Gas6)是吉西他滨治疗的转移病灶与对照转移病灶相比产生的中性粒细胞中上调最多的基因之一(在线补充表S1、S2)．Gas6及其主要受体AXL在胰腺癌中过表达，其表达与不良预后相关。28 29癌细胞中的Gas6/AXL信号通路与肿瘤细胞增殖、上皮间质转变和转移有关。30 31后续的分析Gas6流式细胞术分类的中性粒细胞、非免疫间质细胞、巨噬细胞和癌细胞的表达证实，在转移性肿瘤微环境中，中性粒细胞明显上调Gas6表达对吉西他滨治疗的应答和中性粒细胞是主要来源Gas6停用吉西他滨后(图4 e；在线补充图S5A)．

    与这些发现一致的是，我们发现在吉西他滨停药后的一系列组织切片中，肿瘤细胞附近富含中性粒细胞的区域Gas6表达水平显著上调。图4 f-h；在线补充图S5B、D)和自发性肝转移病灶(图4 i (k；在线补充图S5C、D)．相反，停止化疗并没有增加中性粒细胞减少小鼠转移性肝脏中的Gas6水平(在线补充图S5E、F)．此外，我们仅在荷瘤肝脏中发现表达Gas6的中性粒细胞增加，而在无肿瘤的肺组织中没有发现，这表明表达Gas6的中性粒细胞优先聚集在转移瘤部位(在线补充图S5G、H)．

    当我们用nab-紫杉醇或FOLFIRINOX (PDAC中常用的化疗方案)治疗转移性荷瘤小鼠时，我们观察到同样的变化25（在线补充图S5I)．在所有化疗治疗后，转移性肿瘤负担暂时减轻，但随后转移性复发(在线补充图S5J)，并伴有表达gas6的中性粒细胞涌入转移病灶(在线补充图S5K-N)．这些结果提示，化疗后复发转移病灶中表达gas6的中性粒细胞积累增加是对不同化疗方案的反应，因此不是药物特异性的。我们接下来评估了转移性胰腺癌患者和小鼠转移模型中循环中性粒细胞中Gas6的表达。我们收集患者在吉西他滨第一个治疗周期(基线)之前和(第4周)之后的血液样本(图4 l)．我们发现在第一剂治疗后4周，循环中性粒细胞中Gas6表达增加(图4米；在线补充图S6A)．同样，在临床前小鼠模型中，吉西他滨停药后循环小鼠中性粒细胞中Gas6表达增加(在线补充图S6B)．由于凋亡中性粒细胞释放NETs已被证明能促进乳腺癌模型中的肺转移生长，16我们还分析了肝转移瘤中凋亡(TUNEL+)中性粒细胞的存在。然而，我们只能在肝转移瘤中检测到少量凋亡的中性粒细胞，且其数量不受吉西他滨治疗的影响(在线补充图S6C, D)．为了评估Gas6在促进转移性癌细胞再生中的生物学重要性，我们下一步从吉西他滨治疗的荷瘤小鼠(Ly6G)中分离转移浸润中性粒细胞宝石)，并在存在或不存在Gas6中和抗体的情况下，将这些中性粒细胞与吉西他滨治疗的癌细胞共培养。我们发现中性粒细胞分泌Gas6可促进癌细胞再生，事实上，加入中和性Gas6抗体可消除中性粒细胞的原丝分裂作用(图5一个)．接下来，我们测试Gas6是否足以促进吉西他滨治疗的癌细胞再生。我们用吉西他滨预处理人类Panc1细胞和小鼠来源的KPC细胞，并测量了在重组Gas6存在或不存在的情况下癌细胞的再生。重组Gas6的加入足以促进经吉西他滨治疗的人的再生(图5 b, C)及小鼠胰腺癌细胞(图5 d)．为了进一步测试Gas6在吉西他滨治疗后转移性肝脏中癌细胞再生中的作用，我们从naïve转移性PDAC患者的新鲜肝脏活检中生成精确切肝片(pcl)。接下来，在体外用吉西他滨处理PCLS 24小时，清洗，并在重组Gas6存在或不存在(图5 e)．PCLS被嵌入，我们评估转移性癌细胞(Muc1+)和增殖细胞(Ki67+)．与我们之前的菌落形成实验一致，我们发现增殖转移性癌细胞(MUC1)增加+Ki67+)与吉西他滨处理的缺乏重组Gas6的PCLS培养物相比(图5 f, G；在线补充图S6E, F)．这些实验表明，Gas6足以促进吉西他滨治疗的胰腺癌细胞的再生，不仅在体外PDAC细胞系中，而且在患者转移性肝样本的体外。综上所述，这些结果表明(1)化疗后中性粒细胞浸润转移灶导致体内转移性复发，(2)化疗后中性粒细胞中Gas6表达高度上调，(3)Gas6促进吉西他滨治疗后胰腺癌细胞再生。

    Gas6 is necessary for neutrophil-mediated cancer cell regrowth after gemcitabine treatment. (A) Quantification of colony formation assay of gemcitabine treated KPCluc/zsGreen cells in the presence or absence of Gas6 neutralising antibody (anti-Gas6) with or without metastasis infiltrating neutrophils (Ly6GGem) isolated from mice treated with gemcitabine. Bar graph shows fold upregulation of bioluminescence imaging (BLI) signal compared with gemcitabine-treated KPCluc/zsGreen cells alone (three independent experiments; mean±SEM). (B–D) Colony formation assay of gemcitabine-treated human Panc1 and murine KPCluc/zsGreen cells in the presence or absence or recombinant Gas6 (rGas6). (B) Representative images of Panc1 colonies. (C) Quantification of colony numbers (fold change compared with untreated Panc1 cells) (three independent experiment; mean±SEM). (D) Quantification of BLI signal from KPCluc/zsGreen colonies (fold change compared with untreated KPC cells) (three independent experiments; mean±SEM). (E–G) Schematic illustration of experiment (E): Human precision cut liver slices (hPCLSs) were initially treated with gemcitabine for 24 hours then cultured in the presence or absence of rGas6 for the following 24 hours. hPCLSs were assessed by MUC1 (cancer cell marker) and Ki67 immunofluorescent staining (proliferation marker). (F) Representative if images and (G) quantification of proliferating Ki67+ tumour cell frequency in ex vivo treated hPCLS (n=5 patient biopsies). Arrowheads indicate Ki67+ cancer cells. Scale bar 50 µM. data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test or ANOVA with Bonferroni was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA, analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    Gas6是吉西他滨治疗后中性粒细胞介导的癌细胞再生所必需的。(A)吉西他滨处理KPC后菌落形成的定量分析luc / zsGreen存在或不存在Gas6中和抗体(anti-Gas6)的细胞，伴或不伴转移浸润中性粒细胞(Ly6G宝石)从接受吉西他滨治疗的小鼠中分离出来。柱状图显示生物发光成像(BLI)信号与吉西他滨处理的KPC相比上调了两倍luc / zsGreen细胞单独(三个独立实验;意味着±SEM)。(B-D)吉西他滨处理的人Panc1和小鼠KPC的菌落形成测定luc / zsGreen细胞存在或不存在重组Gas6 (rGas6)。(B) Panc1菌落的代表性图像。(C)菌落数量的量化(与未处理的Panc1细胞相比的倍数变化)(三个独立实验;意味着±SEM)。(D) KPC的BLI信号量化luc / zsGreen菌落(与未处理的KPC细胞相比改变了一倍)(三个独立实验;意味着±SEM)。(E - g)实验示意图(E):人类精确切割肝脏切片(hPCLSs)最初用吉西他滨处理24小时，然后在rGas6存在或不存在的情况下培养24小时。用MUC1(癌细胞标记物)和Ki67免疫荧光染色(增殖标记物)评价hPCLSs。(F)代表性的if图像和(G)体外治疗的hPCLS中增殖的Ki67+肿瘤细胞频率的定量(n=5例患者活检)。箭头表示Ki67+癌细胞。比例尺50 μ M。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验或Bonferroni方差分析计算p值。* P < 0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA, analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.

    阻断Gas6/Axl信号轴抑制吉西他滨治疗后转移性复发

    Gas6是TAM受体家族(Tyro3, AXL, Mer)的配体，Gas6与TAM受体的结合导致其磷酸化和激活。32TAM受体AXL在胰腺癌细胞中高度表达，其激活与不良预后相关。28我们假设表达中性粒细胞的Gas6激活弥散性胰腺癌细胞上的AXL，从而使癌细胞再生。为了验证这一点，我们评估了吉西他滨或生理盐水治疗的小鼠转移病灶中的AXL磷酸化，以及中性粒细胞存在或不存在的情况。与我们的假设一致的是，我们发现在吉西他滨治疗的小鼠转移病灶中，与对照组(生理盐水治疗)转移瘤病灶相比，弥散癌细胞中AXL磷酸化(pAXL)水平显著增加。图6)．重要的是，中性粒细胞(αLy6G)的减少消除了扩散癌细胞上AXL的激活(图6 a, B)．这些数据证实，弥散性癌细胞上AXL受体的激活需要中性粒细胞的存在。我们接下来测试了使用华法林对Gas6/AXL信号通路的药理阻断在联合化疗时是否提供了治疗效益。Gas6在结构上属于血浆维生素k依赖性蛋白家族，其生物学功能依赖于ϒ-carboxylation，这一过程可以用华法林阻断33 34（图6 c)．KPC细胞脾内植入诱导肝转移。3天后，小鼠微转移病灶用吉西他滨或生理盐水治疗(对照组)，4天后，我们开始用华法林治疗(图6 d)，以避免干扰先前观察到的初步抗肿瘤免疫反应(图2)．吉西他滨或华法林作为单一治疗不影响肝转移瘤负担。然而，吉西他滨治疗后，随后的华法林给药显著减少转移病灶的再生(图6 e, F)．正如预期的那样，华法林治疗消除了之前观察到的吉西他滨治疗队列中癌细胞中AXL活化(pAXL)的增加(图6 g H)和癌细胞增殖(Ki67+)费率降低(在线补充图S7A, B)，而中性粒细胞数目维持不变(在线补充图S7C, D)．我们和其他人此前发现Gas6/AXL信号通路也抑制NK细胞激活，华法林治疗增加了NK细胞激活，减少了胰腺癌的肺转移。35 36因此，我们使用NK激活标志物NKp46评估肝转移病灶中NK细胞的浸润情况。我们发现，肝转移病灶中的NK细胞数量非常低，且华法林对其没有影响(在线补充图S7E、F)．

    Blockade of the Gas6/Axl signalling pathway via warfarin inhibits metastatic relapse after gemcitabine treatment. (A–B) Representative images of pAXL staining in liver tissue sections derived from naïve mice or metastasis bearing mice treated with saline (control) or treated with gemcitabine alone (GEM) or GEM + αLy6G (A). Quantification of pAXL+ tumour cell frequency (B) (n=3 mice/group). (C) Schematic illustrating Gas6/Axl blockade via warfarin. (D–H) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells. At day 3, mice were treated with gemcitabine (GEM) or saline control (saline), at day 7 mice were treated with warfarin (war) or left untreated (CTR). (D) Schematic illustration of the experiment. (E, F) Representative images of BLI signal detected in tumour-bearing livers ex vivo (E) and quantification of tumour burden by ex vivo bioluminescence imaging (BLI) (F) (n=3 mice/group). (G, H) Quantification of pAXL+ tumour cell frequency (G) and representative images of pAXL staining of metastatic tumour lesions (H). Arrowheads indicate metastatic cancer cells staining positive for pAXL (n=3 mice/group). (I, J) Primary tumour burden was induced by orthotopic implantation of KPCluc/zsGreen cells into the pancreas. At day 8, cohorts were treated with GEM or saline control. Treatment with warfarin started at day 12. Livers were resected at day 19 and assessed for metastatic tumour burden (n=5 mice/group). (I) Schematic illustration of the experiment. (J) Quantification of tumour burden by ex vivo BLI (n=5 mice/group). (K–P) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells. At day 3, mice were treated with GEM or saline, at day 7 mice were treated with R428 or control vehicle. (K) Schematic illustration of experiment. (L)Change in tumour burden was quantified by ex vivo BLI (n=4 mice/group). (M, N) Quantification of pAXL+ tumour cell frequency (M) and representative images (N). (O, P) Quantification of Ki67+ tumour cell frequency (O) and representative images (P). Arrowheads indicate metastatic cancer cells staining positive for pAXL (N) or Ki67 (P). (Q) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPCluc/zsGreen cells. At day 3, mice were treated with GEM, at day 4, mice were treated with αLy6G, at day 7 mice were treated with R428 or control vehicle until end point (day 14). Quantification of tumour burden by ex vivo BLI imaging (n=5 mice/group). (R) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of 1×106 KPCluc/zsGreen cells. At day 3, animals were treated with GEM or saline control (saline). From day 7, mice were treated with warfarin or left untreated. Survival analysis of gemcitabine, gemcitabine/warfarin, warfarin and saline treated mice-bearing liver metastasis; log-rank (Mantel-Cox) test, p=0.0456 (GEM vs Gem/War). Median survival for saline was 36.5 days (n=6 mice), for warfarin 32.5 days (n=6 mice), gemcitabine 32.5 days (n=6 mice) and gemcitabine/warfarin 42 days (n=6 mice). Scale bar 50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test or ANOVA with Bonferroni was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA; analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    通过华法林阻断Gas6/Axl信号通路抑制吉西他滨治疗后的转移性复发。(A - B)肝脏组织切片中pAXL染色的代表性图像，取自naïve小鼠或转移瘤小鼠经生理盐水处理(对照)或吉西他滨单独治疗(GEM)或GEM + αLy6G (A)。pAXL+肿瘤细胞频率的定量(B) (n=3只小鼠/组)。(C)华法林阻断Gas6/Axl示意图。(D-H)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞。第3天，小鼠给予吉西他滨(GEM)或生理盐水对照(saline)治疗，第7天小鼠给予华法林(war)治疗或不治疗(CTR)。(D)实验示意图。(E, F)体外荷瘤肝脏中检测到的BLI信号代表图像(E)和体外生物发光成像(BLI)量化肿瘤负荷(F) (n=3只小鼠/组)。(G, H) pAXL+肿瘤细胞频率的定量(G)和转移瘤病变pAXL染色的代表性图像(H)。箭头表示转移癌细胞pAXL染色阳性(n=3只/组)。(I, J) KPC原位植入诱导原发肿瘤负荷卢克/zsGreen细胞进入胰腺。第8天，对照组给予GEM或生理盐水治疗。第12天开始使用华法林治疗。第19天切除肝脏，评估转移瘤负担(n=5只/组)。(一)实验示意图。(J)体外BLI量化肿瘤负荷(n=5只小鼠/组)。(K-P)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞。第3天给予GEM或生理盐水治疗，第7天给予R428或对照对照剂治疗。(K)实验示意图。(L)体外BLI量化肿瘤负荷变化(n=4只/组)。(M, N) pAXL+肿瘤细胞频率的定量(M)和代表性图像的定量(N)。(O, P) Ki67+肿瘤细胞频率的定量(O)和代表性图像的定量(P)。箭头表示转移性癌细胞pAXL (N)或Ki67 (P)染色阳性。(Q)脾内植入KPC诱导肝转移卢克/zsGreen细胞。第3天给予GEM治疗，第4天给予αLy6G治疗，第7天给予R428或对照对照药治疗，直至结束(第14天)。体外BLI成像量化肿瘤负荷(n=5只小鼠/组)。(R) 1×10脾内植入诱导肝转移6KPC卢克/zsGreen细胞。第3天，给予GEM或生理盐水对照(生理盐水)。从第7天开始，小鼠接受华法林治疗或不接受治疗。吉西他滨、吉西他滨/华法林、华法林和生理盐水治疗小鼠肝转移瘤的生存分析log-rank (Mantel-Cox)检验，p=0.0456 (GEM vs GEM /War)。盐水组的中位生存期为36.5天(n=6只)，华法林组为32.5天(n=6只)，吉西他滨组为32.5天(n=6只)，吉西他滨/华法林组为42天(n=6只)。比例尺50 μ M。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验或Bonferroni方差分析计算p值。* P < 0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA; analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.

    我们接下来评估华法林是否能够抑制胰腺癌化疗后自发转移模型中扩散癌细胞的转移生长。为了验证这一点，将KPC衍生细胞原位植入胰腺。第8天，在原发性肿瘤形成后，动物分别给予吉西他滨治疗，随后给予华法林(图6我)．吉西他滨和华法林单独或作为联合治疗不影响原发肿瘤负担(在线补充图S7G, H)．与实验转移模型相似，与对照组治疗小鼠相比，吉西他滨和华法林作为单药治疗不会影响转移瘤负担。然而，吉西他滨治疗后华法林的存在显著降低了转移性肿瘤的负担(图6 j)、AXL激活(pAXL)和增殖(Ki67+)扩散癌细胞(在线补充图S7I-L)，但免疫细胞浸润在华法林作用下保持不变(在线补充图S7M-Q)．为了进一步证实Gas6通过AXL激活而不是通过它的其他TAM受体(Tyro3, Mer)介导转移性复发，我们接下来测试了AXL抑制剂R428对治疗后转移性复发的影响(图6 k)．与我们之前的研究结果一致，在吉西他滨停药后对AXL的药理抑制显著减少了转移性复发(图6 l；在线补充图S8A、B)、AXL (pAXL)激活和增殖(Ki67+)的转移性癌细胞(图6 mp)，而免疫细胞浸润则未受影响(在线补充图S8C-G)．与我们的发现相一致的是，转移相关的中性粒细胞是Gas6表达的主要来源，并且对化疗停药后AXL的激活至关重要，中性粒细胞减少小鼠的AXL抑制与单独中性粒细胞减少相比没有显示出任何额外的治疗效益(图6问)．此外，在吉西他滨治疗后，华法林对Gas6/AXL信号通路的药理抑制显著增加了肝转移小鼠的总生存率(图6 r)．

    因此，我们的研究结果提供了证据，表明靶向AXL受体足以减少吉西他滨治疗后的转移性复发。

    化疗上调表达处于受控而且2在胰腺癌细胞中，它促进中性粒细胞聚集到肿瘤部位

    化疗在患者中经常出现不良副作用，包括由药物毒性引起的免疫细胞数量的短暂减少。37因此，我们进一步分析了肝转移患者和化疗后小鼠外周血中中性粒细胞的数量。正如预期的那样，单剂量化疗药物足以引起患者和小鼠血液中中性粒细胞数量的短暂减少，而在最后一剂治疗2周后，中性粒细胞数量反弹(在线补充表S3；在线补充图S9A、B)．为了探索在化疗反弹后促进中性粒细胞在转移部位积累的机制，我们接下来测试了化疗药物治疗的胰腺癌细胞是否上调了已知的促进中性粒细胞迁移的趋化因子的表达，包括CXCL1、2、5和8(仅在人中表达)。38我们发现在人类和老鼠的胰腺癌细胞中，趋化因子处于受控而且Cxcl2在吉西他滨治疗后高度上调(图7)．的upregulation处于2通过流式细胞术进一步证实肿瘤细胞对吉西他滨治疗的反应(图7 b)．有趣的是，我们还发现在转移部位，巨噬细胞是一个重要的来源处于受控而且2但其表达水平在吉西他滨的反应中未受影响(图7 b)．由于CXCL1、2、5和8与趋化因子受体CXCR2结合，而CXCR2与中性粒细胞招募到肿瘤有关，8我们首先确认Cxcr2确实在浸润性中性粒细胞转移中高度表达(图7 c)，且吉西他滨治疗不会影响CXCR2的表达(图7 d；在线补充图S9C)．接下来，我们测试了CXCR2的药理阻断是否足以消融中性粒细胞迁移。正如预期的那样，虽然吉西他宾治疗的人和小鼠胰腺癌细胞产生的肿瘤条件培养基在体外显著增加了中性粒细胞的迁移，但与对照条件培养基相比，CXCR2抑制剂SB225002的存在抑制了中性粒细胞的迁移(图7 e, F；在线补充图S9D, E)．此外，重组CXCL2足以诱导人和小鼠中性粒细胞迁移(在线补充图S9F, G)．在体内，CXCR2的药理抑制(图7 g显著抑制吉西他滨停药后转移性复发(图7 h；在线补充图S9H)并减少转移部位中性粒细胞的积累(图7我；在线补充图S9I)．综上所述，这些结果表明中性粒细胞吸引细胞因子处于受控而且2在吉西他滨停药后的转移性肝脏中高度表达，这有利于cxcr2依赖性的中性粒细胞在肝转移部位的募集。

    Chemotherapy treatment upregulates the expression of the neutrophil chemo-attractants CXCL1 and 2 in disseminated tumour cells. (A) Heatmap depicting Cxcl1, 2, 5, 8 mRNA expression levels assessed by real time PCR in KPC (murine) and PANC-1 (human) pancreatic cancer cell lines untreated (CTR) and gemcitabine treated (GEM) (three independent experiments; mean±SEM). (B–D) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPC cells. Cohorts were treated at day three with saline (CTR) or GEM (n=3 mice/group). Cancer cells, macrophages and neutrophils were isolated from metastatic lesions at day 14 by FACS. (B) Quantification of Cxcl1 and 2 mRNA levels by real time PCR in disseminated KPC cancer cells and macrophages (three independent experiments; mean±SEM). (C) Heatmap depicting gene expression analysis of CXCR family receptors (Cxcr1,2, 3, 4) by metastasis infiltrating neutrophils. (D) Quantification of CXCR2 expression levels by flow cytometry on neutrophils isolated from tumour-free livers (naïve) and liver metastases derived from saline (CTR) or gemcitabine (GEM) treated mice (n=3 mice/group). (E, F) Quantification of murine (E) and human (F) neutrophil migration in the presence and absence of CXCR2 inhibitor SB225002 (iCXCR2) towards tumour conditioned media (TCM) generated from pancreatic cancer cells (KPC and Panc1, respectively) exposed to gemcitabine (TCMGem) or control (TCMCtr) (three independent experiments; mean±SEM). (G–I) Liver metastasis was induced by intrasplenic implantation of KPC cells. Cohorts were treated at day three with GEM or saline (CTR). From day 4 mice were treated with SB225002 (iCXCR2) until endpoint (day 14). (H) Quantification of tumour burden by ex vivo BLI (n=5 mice/group). (I) Flow cytometry quantification of neutrophil frequency in metastatic livers at endpoint. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test or ANOVA with Bonferroni was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ANOVA, analysis of variance; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    化疗可上调播散性肿瘤细胞中中性粒细胞化学吸引剂CXCL1和cxcl2的表达。(一)热图描绘Cxcl1 2 5 8通过实时PCR检测未处理(CTR)和吉西他滨处理(GEM)的KPC(小鼠)和PANC-1(人)胰腺癌细胞株的mRNA表达水平(三个独立实验;意味着±SEM)。(B-D) KPC细胞脾内植入诱导肝转移。对照组在第3天用生理盐水(CTR)或GEM治疗(n=3只/组)。第14天用流式细胞术从转移病灶中分离出癌细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。(B)的量化处于受控而且2实时PCR检测播散型KPC癌细胞和巨噬细胞mRNA水平(三个独立实验;意味着±SEM)。(C) CXCR家族受体基因表达分析的热图(Cxcr1, 2、3、4)转移浸润中性粒细胞。(D)流式细胞术定量CXCR2表达水平的中性粒细胞分离自无肿瘤的肝脏(naïve)和转移肝来自生理盐水(CTR)或吉西他滨(GEM)治疗小鼠(n=3只/组)。(E, F)在存在或不存在CXCR2抑制剂SB225002 (iCXCR2)的情况下，小鼠(E)和人(F)中性粒细胞向暴露于吉西他滨(TCM)的胰腺癌细胞(分别为KPC和Panc1)生成的肿瘤条件培养基(TCM)迁移的定量宝石)或控制(中医)Ctr)(三个独立实验;意味着±SEM)。(G-I) KPC细胞脾内植入诱导肝转移。对照组在第3天用GEM或生理盐水(CTR)治疗。从第4天开始，小鼠接受SB225002 (iCXCR2)治疗，直到结束(第14天)。(H)体外BLI量化肿瘤负荷(n=5只小鼠/组)。(I)流式细胞术定量终点转移性肝脏中的中性粒细胞频率。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验或Bonferroni方差分析计算p值。* P < 0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ANOVA, analysis of variance; n.s., not significant.

    化疗诱导IV期结直肠癌肝转移灶中表达Gas6的中性粒细胞聚集

    像胰腺癌一样，结直肠癌(CRC)经常转移到肝脏。39在胰腺癌中，肝活检只在化疗干预前进行诊断，25在结直肠癌中，化疗通常是IV期结直肠癌患者(肝转移患者)在转移肝手术切除之前的标准护理治疗。40这些患者护理上的差异为我们收集接受化疗的IV期结直肠癌患者的肝脏样本提供了机会，并分析结直肠癌患者的转移性肝肿瘤在化疗反应中是否表现出中性粒细胞浸润和Gas6表达的增加。我们分析了未治疗的IV期结直肠癌患者和接受卡培他滨或奥沙利铂治疗的IV期结直肠癌患者切除的转移性肝肿瘤。我们发现转移性肿瘤细胞(细胞角蛋白19+)在两个接受化疗的患者队列中，周围都有更多的中性粒细胞(MPO)+)与未治疗的患者队列(图8 a, B)．对一系列组织切片的分析显示，在治疗的患者中富含中性粒细胞的区域Gas6 +表达水平增加(图8 c, D；在线补充图S9J)．为了进一步证实中性粒细胞确实是化疗后人肝转移瘤中Gas6表达的主要来源，我们用酶法将化疗后CRC患者的新鲜肝脏样本分离成单细胞悬液，并通过流式细胞仪细胞分选(图8 e；在线补充图S9K)．随后的基因表达分析证实中性粒细胞是表达最高水平的细胞GAS6停止化疗后发生肝转移的患者(图8 f)．综上所述，这些发现表明化疗诱导的中性粒细胞积累和Gas6的上调也发生在结直肠癌患者的肝转移中，因此，靶向Gas6可能改善胰腺癌和结直肠癌患者的治疗干预。

    Chemotherapy treatment induces accumulation of Gas6 expressing neutrophils in liver metastases of patients with stage IV colorectal cancer. (A–D) Tissue sections from metastatic livers derived from treatment naïve patients with stage IV colorectal cancer (CRC) (n=5), and patients undergone treatment with oxaliplatin (n=3) or capecitabine (n=4) were stained for cancer cells (CK19), neutrophils (MPO) and GAS6. (A, B) Representative images of CK19 and MPO staining of serial sections (A) and quantification of data (B). (C, D) Representative images of GAS6 and MPO staining of serial sections (C) and quantification of data (D). Arrowheads indicate GAS6+ staining in neutrophil-rich areas. (E, F) Liver biopsies were collected from metastatic CRC patients post-FOLFOX treatment. Cell populations were isolate by FACS for gene expression analysis. (G) Schematic illustration of experiment and (H) quantification of GAS6 mRNA levels by real-time PCR in neutrophils, macrophages, fibroblast and cancer cells (n=3 patient samples). (G) Schematic depicting the role of neutrophil-derived Gas6 in hepatic metastatic tumour regrowth after chemotherapy in pancreatic cancer. Chemotherapy induces the expression of the neutrophil-chemoattractants CXCL1 and 2 by disseminated cancer cells. On treatment withdrawal, neutrophils are recruited to the liver and express high levels of Gas6. Neutrophil-derived Gas6 activates AXL receptors on disseminated cancer cells and promotes their regrowth after chemotherapeutic treatments. Depletion of neutrophils or inhibition of Gas6/AXL signalling axis inhibits metastatic regrowth of pancreatic cancer cells. Scale bar 50 µM. Data are presented as mean±SEM. Unpaired t-test or ANOVA with Bonferroni was used to calculate p values. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA, analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    化疗诱导IV期结直肠癌肝转移灶中表达Gas6的中性粒细胞聚集。(A-D)来自naïve期结直肠癌(CRC) (n=5)和接受奥沙利铂(n=3)或卡培他滨(n=4)治疗的患者转移性肝脏的组织切片，对癌细胞(CK19)、中性粒细胞(MPO)和GAS6．(A, B)序列切片CK19和MPO染色的代表性图像(A)和数据的量化(B)。(C, DGAS6连续切片的MPO染色(C)和数据的量化(D)。箭头指示GAS6 +富中性粒细胞区染色。(E, F)收集folfox治疗后转移性CRC患者的肝脏活检。用流式细胞仪分离细胞群进行基因表达分析。(G)实验示意图和(H)定量GAS6通过实时PCR检测中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和癌细胞中的mRNA水平(n=3例患者样本)。(G)中性粒细胞来源的Gas6在胰腺癌化疗后肝转移瘤再生中的作用示意图。化疗诱导扩散癌细胞表达中性粒细胞趋化剂CXCL1和cxcl2。在治疗停止时，中性粒细胞被招募到肝脏，并表达高水平的Gas6。中性粒细胞来源的Gas6激活扩散癌细胞上的AXL受体，促进化疗后癌细胞的再生。中性粒细胞的减少或Gas6/AXL信号轴的抑制可抑制胰腺癌细胞的转移性再生长。比例尺50 μ M。数据以平均值±SEM表示。采用非配对t检验或Bonferroni方差分析计算p值。* P < 0.05; **p<0.01; ***p<0.001. ANOVA, analysis of variance; H, healthy liver; M, metastases; n.s., not significant.

    讨论

    我们的研究结果表明，标准的细胞毒性化疗可以暂时抑制转移性PDAC的进展，但也会诱导转移性肿瘤微环境的细胞变化，从而促进转移性复发。具体来说，我们发现化疗诱导肿瘤细胞中中性粒细胞趋化剂的表达，并以cxcr2依赖的方式将随后表达Gas6的中性粒细胞招募和浸润到肝脏。中性粒细胞来源的Gas6然后激活转移性癌细胞上的受体酪氨酸激酶AXL，并促进肝脏中的转移性生长(图8 g)．在本研究中，我们还表明，药物抑制Gas6/AXL信号结合化疗可以消除转移性复发，从而为进一步评估PDAC患者的这种治疗策略提供了基础。

    原发性胰脏肿瘤大多对化疗无效，手术切除仍然是唯一的治疗选择。25其原因包括PDAC肿瘤内的间质室过度、血管减少和间质液压力增加，所有这些都是有效药物输送的障碍。41接受过手术的患者也接受辅助化疗作为标准护理。25在PDAC的临床前小鼠模型中，吉西他滨辅助治疗，在胰腺肿瘤切除后，抑制了原发肿瘤部位的局部复发，但对远处转移部位无效。42然而，化疗对转移性肿瘤和辅助环境中的微转移的影响仍然知之甚少。我们的结果提供了证据，转移性PDAC病变对化疗有反应，特别是在早期转移发展时，基质间室不太建立。3.事实上，化疗增加了癌细胞的死亡和肿瘤抗原的释放，这是产生抗肿瘤免疫反应的关键步骤。43与此一致的是，我们在我们的PDAC转移小鼠模型中观察到，化疗诱导了转移肝龛中的细胞毒性T细胞激活的初始促炎反应。尽管这种促炎反应只是短暂的，但它可能为免疫检查点抑制剂与化疗联合使用提供了一个机会窗口，以进一步促进这种初始T细胞激活。与我们在小鼠模型的肝转移部位的辅助设置中观察到的类似，在PDAC患者的新辅助设置中，化疗已被证明可以恢复原发部位的抗肿瘤免疫反应，与免疫抑制髓样细胞(T)减少相关海军学校规则、CD163+巨噬细胞。44 45免疫抑制髓系Ly6G+抑制细胞CD8+T细胞在原发性PDAC肿瘤中的功能。8 46我们的研究结果表明，在肝转移瘤中，免疫抑制m2样巨噬细胞的存在是抑制最初化疗诱导的抗肿瘤免疫反应的关键。相反，中性粒细胞对于免疫抑制转移瘤微环境的维持是可有可无的。这可能是由于肝脏中巨噬细胞的数量远远高于中性粒细胞。3.我们和其他人之前已经证明了转移相关的巨噬细胞可以抑制CD8+T细胞在肝脏中起作用。12日13与这些发现一致的是，使用CSF-1/CSF-1R抑制剂也减少了吉西他滨治疗后的转移性复发，证实巨噬细胞在控制肝转移的局部免疫反应中发挥关键作用。由于巨噬细胞在肝脏中具有很高的可塑性和异质性，未来的治疗应侧重于靶向巨噬细胞免疫抑制功能或抑制巨噬细胞向免疫抑制表型的极化。中性粒细胞与不同的转移前功能有关，主要是在转移级联的早期步骤，甚至在转移前小龛形成时。8 9 18 47在这里，我们发现了中性粒细胞在最初定植步骤后促进癌细胞转移生长的一种新的前转移功能。从机制上讲，我们发现停止化疗诱导中性粒细胞浸润，中性粒细胞通过分泌AXL受体配体Gas6激活转移性癌细胞上的AXL受体，导致癌细胞在转移性肝脏生长。AXL在胰腺癌中过表达，与转移增加和预后不良有关。28Gas6/AXL信号通路调节多种癌细胞自主和非癌细胞自主过程。48 49研究发现AXL可诱导胰腺癌细胞上皮-间质转化，从而促进癌细胞在体内的迁移、侵袭和转移扩散。此外，胰腺癌细胞中AXL基因缺失增加了其对化疗的敏感性。31日33 50在我们的研究中，我们在肝脏的初始播种和定植步骤和吉西他滨治疗后开始抑制AXL。因此，我们的数据揭示了AXL信号在化疗后促进肿瘤细胞再生方面的额外新作用，从而扩大了AXL抑制剂在对抗胰腺癌中的潜在应用。我们和其他人之前已经证明了Gas6也在巨噬细胞和成纤维细胞中表达51抑制Gas6/AXL信号通路可增加NK细胞活化，减少肺转移。35 36有趣的是，我们发现在肝转移部位，Gas6的基础表达水平非常低，但在人和小鼠的肝间质中，由于化疗的反应，Gas6的表达显著增加，并且主要由浸润的中性粒细胞表达。此外，我们发现肝脏转移病灶NK细胞浸润较差，其数量和激活状态均未因华法林或AXL抑制而改变，提示多功能Gas6/AXL信号通路调节不同器官的不同过程和细胞群，从而以多种不同方式促进PDAC转移。

    我们的研究举例说明了两种抑制转移性复发的治疗方案，即使用华法林或AXL抑制剂R428(苄森替尼)。这两种药物目前已在胰腺癌患者中进行试验(NCT03536208)和(NCT03649321),分别。因此，我们的研究结果进一步强化了靶向Gas6/AXL信号在转移性PDAC治疗中的基本原理，并结合化疗，通过预防微转移性疾病的进展，降低辅助治疗中复发的风险。需要进一步的研究来探索停化疗诱导中性粒细胞中Gas6表达的机制，并测试循环中性粒细胞中的Gas6水平是否也可以作为预测辅助治疗中转移性复发风险的生物标志物。

    我们对IV期结直肠癌患者肝转移的进一步分析表明，化疗反应中所观察到的表达gas6的中性粒细胞的增加可能不仅仅局限于胰腺癌转移，也可能发生在其他转移到肝脏的癌症中。因此，靶向已识别的中性粒细胞/Gas6/AXL轴可能也与高流行率扩散到肝脏的癌症相关，如CRC、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。39总之，我们的研究结果是重要和及时的，因为它们可以帮助在不久的将来改进肝转移癌患者的治疗方案设计。

    材料和方法

    详细的资料和方法见在线补充部分．

    数据可用性声明

    所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    使用血液和肝脏组织样本的人体研究获得了西北-大曼彻斯特国家研究伦理(NRES)服务委员会REC15/NW/0477的批准。

    致谢

    我们感谢利物浦共享研究设施和CRUK比特森研究所生物科学部门提供的设备和技术援助。我们感谢Vatshala Chandran提供的技术支持。我们还要感谢患者及其家属，以及为这些研究提供组织样本和血液的健康献血者。

    参考文献

    1. ↵
      2. Rhim广告，
      3. Mirek等，
      4. Aiello纳米，等
      ．EMT和播散先于胰腺肿瘤的形成．细胞2012；148：349- - - - - -61．doi: 10.1016 / j.cell.2011.11.025pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22265420
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    2. ↵
      2. 瑞安DP，
      3. 在香港TS，
      4. BardeesyNgydF4y2Ba
      ．胰腺腺癌．N英语J医学2014；371：1039- - - - - -49．doi: 10.1056 / NEJMra1404198pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25427123
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    3. ↵
      2. 尼尔森老，
      3. QuarantaV，
      4. Linford一个，等
      ．巨噬细胞分泌的颗粒蛋白通过诱导肝纤维化支持胰腺癌转移．Nat细胞生物2016；18：549- - - - - -60．doi: 10.1038 / ncb3340pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27088855
      OpenUrl CrossRef PubMed
    4. ↵
      2. Costa-SilvaB，
      3. Aiello纳米，
      4. 海洋AJ，等
      ．胰腺癌外泌体在肝脏中启动转移前小龛形成．Nat细胞生物2015；17：816- - - - - -26．doi: 10.1038 / ncb3169pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25985394
      OpenUrl CrossRef PubMed
    5. ↵
      2. Aiello纳米，
      3. Bajor戴斯。莱纳姆:，
      4. NorgardRJ，等
      ．转移性进展与局部微环境的动态变化有关．Nat Commun2016；7：12819．doi: 10.1038 / ncomms12819pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27628423
      OpenUrl CrossRef PubMed
    6. ↵
      2. 李JW，
      3. 石头毫升，
      4. Porrett点，等
      ．肝细胞指导肝脏中易转移龛的形成．自然2019；567：249- - - - - -52．doi: 10.1038 / s41586 - 019 - 1004 - ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30842658
      OpenUrl CrossRef PubMed
    7. ↵
      2. Kaczanowska年代，
      3. BeuryDW，
      4. 格帕兰V，等
      ．基因工程骨髓细胞重新平衡转移的核心免疫抑制程序．细胞2021；184：2033- - - - - -52．doi: 10.1016 / j.cell.2021.02.048pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33765443
      OpenUrl CrossRef PubMed
    8. ↵
      2. 斯蒂尔连续波，
      3. 卡里姆SA，
      4. 浸出张东健，等
      ．Cxcr2抑制可显著抑制胰腺导管腺癌的转移并增强免疫治疗．癌症细胞2016；29：832- - - - - -45．doi: 10.1016 / j.ccell.2016.04.014pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27265504
      OpenUrl CrossRef PubMed
    9. ↵
      2. Gordon-Weeks一个，
      3. LimSY，
      4. YuzhalinAE，等
      ．中性粒细胞通过小鼠成纤维细胞生长因子2依赖性血管生成促进肝转移生长．肝脏病学2017；65：1920- - - - - -35．doi: 10.1002 / hep.29088pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28133764
      OpenUrl CrossRef PubMed
    10. ↵
      2. KitamuraT，
      3. 钱上，
      4. 波拉德JW
      ．免疫细胞促进转移．Nat Immunol牧师2015；15：73- - - - - -86．doi: 10.1038 / nri3789pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25614318
      OpenUrl CrossRef PubMed
    11. ↵
      2. DeNardoDG，
      3. RuffellB
      ．巨噬细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的调节作用．Nat Immunol牧师2019；19：369- - - - - -82．doi: 10.1038 / s41577 - 019 - 0127 - 6pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30718830
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      2. 余J，
      3. 绿色医学博士，
      4. 李年代，等
      ．肝转移抑制通过巨噬介导的T细胞消除免疫治疗的效果．Nat地中海2021；27：152- - - - - -64．doi: 10.1038 / s41591 - 020 - 1131 - xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33398162
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      2. QuarantaV，
      3. RainerC，
      4. 尼尔森老，等
      ．在转移性胰腺癌中，巨噬源性颗粒驱动对免疫检查点抑制的抵抗．癌症Res2018；78：4253- - - - - -69．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 17 - 3876pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29789416
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    14. ↵
      2. "年代，
      3. Ponzetta一个，
      4. 迪米特里D，等
      ．中性粒细胞在肿瘤进展和治疗中的多样性和可塑性．Nat牧师癌症2020；20.：485- - - - - -503．doi: 10.1038 / s41568 - 020 - 0281 - ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32694624
      OpenUrl CrossRef PubMed
    15. ↵
      2. 公园J，
      3. 维索斯基RW，
      4. AmoozgarZ，等
      ．癌细胞诱导转移支持中性粒细胞胞外DNA陷阱．Sci Transl地中海2016；8：361年ra138．doi: 10.1126 / scitranslmed.aag1711pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27798263
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    16. ↵
      2. AlbrenguesJ，
      3. 盾牌妈，
      4. NgD，等
      ．炎症过程中产生的中性粒细胞胞外陷阱唤醒小鼠中休眠的癌细胞．科学2018；361．doi:doi: 10.1126 / science.aao4227．[打印前Epub:2018年9月28日]。pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30262472
    17. ↵
      2. ItataniY，
      3. 山本T，
      4. 钟C，等
      ．在结直肠癌遗传模型中，抑制中性粒细胞依赖性血管生成可消除对抗vegf抗体的耐药性．美国国家科学研究院2020；117：21598- - - - - -608．doi: 10.1073 / pnas.2008112117pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32817421
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    18. ↵
      2. WculekSK，
      3. Malanchi我
      ．中性粒细胞支持转移性乳腺癌细胞的肺定植．自然2015；528：413- - - - - -7．doi: 10.1038 / nature16140pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26649828
      OpenUrl CrossRef PubMed
    19. ↵
      2. Coffelt某人，
      3. KerstenK，
      4. Doornebal连续波，等
      ．产生il -17的γ - madelta T细胞和中性粒细胞共同促进乳腺癌转移．自然2015；522：345- - - - - -8．doi: 10.1038 / nature14282pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25822788
      OpenUrl CrossRef PubMed
    20. ↵
      2. Gabrilovich迪，
      3. Ostrand-Rosenberg年代，
      4. 勃朗特V
      ．肿瘤对髓样细胞的协调调节．Nat Immunol牧师2012；12：253- - - - - -68．doi: 10.1038 / nri3175pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22437938
      OpenUrl CrossRef PubMed
    21. ↵
      2. Garrido-Laguna我，
      3. 绅士米
      ．胰腺癌:从最先进的治疗方法到有前途的新疗法．Nat Rev clinin Oncol2015；12：319- - - - - -34．doi: 10.1038 / nrclinonc.2015.53pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25824606
      OpenUrl CrossRef PubMed
    22. ↵
      2. 大的副总裁，
      3. 布莱尔AB，
      4. GemenetzisG，等
      ．边缘可切除和局部晚期胰腺癌新辅助治疗和切除后复发．外科医生2019；45：1674- - - - - -83．doi: 10.1016 / j.ejso.2019.04.007pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31023560
      OpenUrl CrossRef PubMed
    23. ↵
      2. 琼斯RP，
      3. Psarellie，
      4. 杰克逊R，等
      ．胰导管腺癌切除术后复发模式:ESPAC-4随机辅助化疗试验的二次分析．JAMA杂志2019；154：1038- - - - - -48．doi: 10.1001 / jamasurg.2019.3337pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31483448
      OpenUrl PubMed
    24. ↵
      2. Nevala-PlagemannC，
      3. 绅士米，
      4. Garrido-Laguna我
      ．从最先进的治疗方法到晚期胰腺癌的新疗法．Nat Rev clinin Oncol2020；17：108- - - - - -23．doi: 10.1038 / s41571 - 019 - 0281 - 6pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31705130
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      2. MizrahiJD，
      3. SuranaR，
      4. 瓦莱JW，等
      ．胰腺癌．《柳叶刀》2020；395：2008- - - - - -20.．doi: 10.1016 / s0140 - 6736 (20) 30974 - 0pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32593337
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      2. 坂本H，
      3. Attiyeh妈，
      4. GeroldJM，等
      ．胰腺癌复发的进化起源．癌症越是加大2020；10：792- - - - - -805．doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 19 - 1508pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32193223
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    27. ↵
      2. 程ydF4y2BaDS，
      3. 人士梅尔曼我
      ．肿瘤学遇到免疫学:癌症-免疫周期．免疫力2013；39：1- - - - - -10．doi: 10.1016 / j.immuni.2013.07.012pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23890059
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    28. ↵
      2. KoorstraJ-BM，
      3. KarikariCA，
      4. FeldmannG，等
      ．Axl受体酪氨酸激酶对胰腺癌的预后有不良影响，是一种新的治疗靶点．癌症杂志其他2009；8：618- - - - - -26．doi: 10.4161 / cbt.8.7.7923pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19252414
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    29. ↵
      2. 杜W，
      3. Brekken类风湿性关节炎
      ．Axl有可能成为胰腺癌的治疗靶点吗?专家对目标发表意见2018；22：955- - - - - -66．doi: 10.1080 / 14728222.2018.1527315pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30244621
      OpenUrl CrossRef PubMed
    30. ↵
      2. 吴G，
      3. 妈Z，
      4. 胡W，等
      ．Gas6/TAM在癌症发展和治疗中的分子意义．细胞死亡说2017；8：e2700．doi: 10.1038 / cddis.2017.113pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28333143
      OpenUrl CrossRef PubMed
    31. ↵
      2. 杜W，
      3. Phinney新西兰，
      4. 黄H，等
      ．Axl是胰腺癌细胞可塑性和促进转移的关键因子．摩尔癌症Res2021；19：1412- - - - - -21．doi: 10.1158 / 1541 - 7786. - mcr - 20 - 0860pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33811159
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    32. ↵
      2. 格雷厄姆DK，
      3. DeRyckereD，
      4. 戴维斯KD，等
      ．TAM家族:癌症中磷脂酰丝氨酸传感受体酪氨酸激酶出错．Nat牧师癌症2014；14：769- - - - - -85．doi: 10.1038 / nrc3847pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25568918
      OpenUrl CrossRef PubMed
    33. ↵
      2. Kirane一个，
      3. 路德维希KF，
      4. SorrelleNgydF4y2Ba，等
      ．华法林阻断了gas6介导的Axl激活，这是胰腺癌上皮可塑性和转移所必需的．癌症Res2015；75：3699- - - - - -705．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 14 - 2887 tpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26206560
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    34. ↵
      2. 耿K，
      3. 库马尔年代，
      4. KimaniSG，等
      ．-羧基谷氨酸修饰和磷脂酰丝氨酸结合对生长抑制特异性激活TYRO3、Axl和MERTK受体的需求．前面Immunol2017；8：1521．doi: 10.3389 / fimmu.2017.01521pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29176978
      OpenUrl CrossRef PubMed
    35. ↵
      2. 爱尔兰l，
      3. 路T，
      4. 施密德MC，等
      ．阻断间质Gas6改变癌细胞可塑性，激活NK细胞，抑制胰腺癌转移．前面Immunol2020；11：297．doi: 10.3389 / fimmu.2020.00297pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32174917
      OpenUrl CrossRef PubMed
    36. ↵
      2. Paolino米，
      3. Choidas一个，
      4. Wallner年代，等
      ．E3连接酶Cbl-b和TAM受体通过自然杀伤细胞调节癌症转移．自然2014；507：508- - - - - -12．doi: 10.1038 / nature12998pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24553136
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    37. ↵
      2. 克劳福德J，
      3. 戴尔直流，
      4. 莱曼“大酒店”
      ．化疗诱导的中性粒细胞减少症:风险、后果和其管理的新方向．癌症2004；One hundred.：228- - - - - -37．doi: 10.1002 / cncr.11882pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14716755
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    38. ↵
      2. Coffelt某人，
      3. Wellenstein医学博士，
      4. 德维瑟柯
      ．癌症中的中性粒细胞:不再中性．Nat牧师癌症2016；16：431- - - - - -46．doi: 10.1038 / nrc.2016.52pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27282249
      OpenUrl CrossRef PubMed
    39. ↵
      2. Tsilimigras迪，
      3. BrodtP，
      4. Clavien便士，等
      ．肝转移．Nat Rev Dis引物2021；7：27．doi: 10.1038 / s41572 - 021 - 00261 - 6pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33859205
      OpenUrl PubMed
    40. ↵
      2. 德克E，
      3. 坦尼斯PJ，
      4. VleugelsJLA的，等
      ．结肠直肠癌．《柳叶刀》2019；394：1467- - - - - -80．doi: 10.1016 / s0140 - 6736 (19) 32319 - 0pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31631858
      OpenUrl CrossRef PubMed
    41. ↵
      2. 切尔C，
      3. Gopinathan一个，
      4. Neesse一个，等
      ．胰腺癌微环境．中国癌症Res2012；18：4266- - - - - -76．doi: 10.1158 / 1078 - 0432. - ccr - 11 - 3114pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22896693
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    42. ↵
      2. GurlevikE，
      3. Fleischmann-MundtB，
      4. 布鲁克斯J，等
      ．小鼠胰腺肿瘤切除后给予吉西他滨可诱导由自然杀伤细胞介导的抗肿瘤免疫应答．胃肠病学2016；151：338- - - - - -50．doi: 10.1053 / j.gastro.2016.05.004pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27210037
      OpenUrl CrossRef PubMed
    43. ↵
      2. 人士梅尔曼我，
      3. CoukosG，
      4. DranoffG
      ．癌症免疫疗法已经成熟．自然2011；480：480- - - - - -9．doi: 10.1038 / nature10673pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22193102
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    44. ↵
      2. MichelakosT，
      3. 蔡l，
      4. Villani公司V，等
      ．胰导管腺癌患者接受新辅助治疗的肿瘤微环境免疫反应．美国国立癌症研究所2021；113：182- - - - - -91．doi: 10.1093 / jnci / djaa073pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32497200
      OpenUrl CrossRef PubMed
    45. ↵
      2. 莫塔雷耶斯C，
      3. 出纳员年代，
      4. Muckenhuber一个，等
      ．新辅助治疗通过消耗原细胞性免疫细胞重构胰腺癌微环境．中国癌症Res2020；26：220- - - - - -31．doi: 10.1158 / 1078 - 0432. - ccr - 19 - 1864pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31585935
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    46. ↵
      2. BayneLJ，
      3. 比提GL，
      4. 哈NgydF4y2Ba，等
      ．肿瘤源性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子调节胰腺癌中的髓系炎症和T细胞免疫．癌症细胞2012；21：822- - - - - -35．doi: 10.1016 / j.ccr.2012.04.025pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22698406
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    47. ↵
      2. SzczerbaBM，
      3. Castro-GinerF，
      4. 检查者米，等
      ．中性粒细胞护送循环的肿瘤细胞，使细胞周期进展．自然2019；566：10.1038 / s41586 - 019 - 0915 - y：553- - - - - -7．doi: 10.1038 / s41586 - 019 - 0915 - ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30728496
      OpenUrl PubMed
    48. ↵
      2. 吴G，
      3. 妈Z，
      4. 程Y，等
      ．靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境中的Gas6/TAM．摩尔癌症2018；17：20.．doi: 10.1186 / s12943 - 018 - 0769 - 1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386018
      OpenUrl CrossRef PubMed
    49. ↵
      2. 迈尔斯KV，
      3. 修改老，
      4. PientaKJ
      ．靶向Tyro3, Axl和MerTK (TAM受体):肿瘤微环境中巨噬细胞的意义．摩尔癌症2019；18：94．doi: 10.1186 / s12943 - 019 - 1022 - 2pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31088471
      OpenUrl CrossRef PubMed
    50. ↵
      2. 路德维希KF，
      3. 杜W，
      4. Sorrelle注，等
      ．小分子抑制Axl靶向肿瘤免疫抑制和增强胰腺癌化疗．癌症Res2018；78：246- - - - - -55．doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 17 - 1973pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180468
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    51. ↵
      2. 逻各斯年代，
      3. 施密特T，
      4. Tjwa米，等
      ．恶性细胞通过诱导浸润的白细胞产生丝裂原Gas6来促进肿瘤生长．血2010；115：10.1182 / - 2009 - 06 - 228684血：2264- - - - - -73．doi: 10.1182 / - 2009 - 06 - 228684血pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19965679
      OpenUrl PubMed

    补充材料

    脚注

    • GB和CR贡献相当。

    • 贡献者GB和CR设计并执行了大部分实验，分析和解释了数据，并对手稿的准备做出了贡献。VQ和YA有助于体内实验，MR和EB有助于体外研究。DHP进行生物信息分析。FC有助于肿瘤活检的分析和解释。DHP、RPJ、DV、PG、CMH和RS提供患者样本。JPM提供了KPC小鼠和KPC衍生的组织样本。AM提供概念性建议，解读数据并撰写稿件。MCS整体构思和监督项目，解读数据，撰写手稿。所有作者都对稿件进行了严格的分析和认可。

    • 资金这些研究得到了英国癌症研究中心(A25607, A26978, A26979)，医学研究委员会(MR/P018920/1)和MCS胰腺癌研究基金，威康信托基金(102521/Z/13/Z)和西北癌症研究基金(a.m.)，英国癌症研究中心A17196, A2996和A25233的资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。