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  • PD-L1封锁释放内在antitumourigenic糖酵解巨噬细胞在肝细胞癌的属性

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肝脏病学
原始研究
PD-L1封锁释放内在antitumourigenic糖酵解巨噬细胞在肝细胞癌的属性
  1. 指导陆1,
  2. Zhi-Ling周1,
  3. Xu-Yan王1,
  4. Bo-Yuan刘2,3,
  5. 复合陆2,3,
  6. 帅刘2,3,
  7. Guang-Bo张4,
  8. Mei-Xiao詹1,
  9. Yun陈2,3
  1. 1介入放射学中心、珠海精密医学中心、珠海市人民医院、珠海市医院隶属于济南大学,珠海,广东,中国
  2. 2免疫学、江苏省人类功能基因组学重点实验室,姑苏学校,南京医科大学,南京,江苏,中国
  3. 3江苏癌症生物标记物的关键实验室,预防和治疗,为癌症个性化医疗协同创新中心,南京,江苏,中国
  4. 4江苏临床免疫学研究所、苏州大学第一附属医院,苏州,江苏,中国
  1. 对应到Yun博士陈、南京医科大学、南京,中国;陈云在}{njmu.edu.cn;詹博士Mei-Xiao、珠海市人民医院、珠海,中国;zhanmeixiao1987 {126.} com;张Guang-Bo博士,苏州大学第一附属医院,苏州,中国;zhanggbsuzhou在}{hotmail.com;陆指导博士、珠海市人民医院、珠海,中国;luligong1969在}{jnu.edu.cn

文摘

客观的增加患者PD-L1+宿主细胞在肿瘤更强有力的受益于antiprogrammed死亡1 /编程死亡ligand-1 (PD-L1)治疗,但潜在的机制尚不清楚。我们的目标是阐明自然、监管和功能PD-L1的重要性+宿主细胞在肝细胞癌(HCC)。

设计共治疗184名肝癌患者随机。给出C57BL / 6小鼠注射Hepa1-6细胞形成自体肝细胞瘤。ELISpot、流式细胞术和实时PCR应用于分析PD-L1的表型特征+直接从肝癌标本细胞分离与血液样本配对或生成从体外和体外培养系统。免疫荧光和免疫组织化学检测执行上的免疫细胞石蜡包埋和formalin-fixed样本。代谢转换的基本调节机制评估在体外和体内研究。

结果我们证明PD-L1+宿主巨噬细胞,建设性地代表PD-L1主要细胞来源的肝细胞癌肿瘤,显示一个HLA-DR高CD86高糖酵解的表现型,明显产生antitumourigenic IL-12p70和两极分化的内在的糖酵解代谢。从力学上看,糖酵解的关键酶——PKM2引发肝癌细胞纤连蛋白1,通过HIF-1α-dependent方式,同时控制antitumourigenic属性和inflammation-mediated PD-L1在糖酵解巨噬细胞表达。重要的是,尽管PKM2增加+巨噬细胞糖酵解预测预后不良的患者,在这些细胞消除阻塞PD-L1 PD-L1-dominant免疫抑制和释放内在antitumourigenic属性。

结论选择性地调节糖酵解的“上下文”巨噬细胞在肝细胞癌肿瘤可能恢复antitumourigenic属性和提供一个精确的抗癌治疗的策略。

  • 巨噬细胞
  • 葡萄糖代谢
  • 肝癌
  • 癌症免疫生物学
  • 免疫疗法

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 326350

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见癌症,极其不良预后。

    • 增加患者PD-L1+宿主细胞在肿瘤更强有力的受益于antiprogrammed死亡1 /编程死亡ligand-1 (PD-L1)治疗。

    • 白细胞浸润的巨噬细胞构成一个主要组件在肝细胞癌(HCC)肿瘤基质。

    • 巨噬细胞分化与细胞代谢的变化密切相关的项目。

    有什么新发现吗?

    • PD-L1+宿主巨噬细胞显示一个HLA-DR高CD86高表型和明显产生antitumourigenic IL-12p70肝癌。

    • 内在的糖酵解代谢PD-L1形状+巨噬细胞在肝癌antitumourigenic属性。

    • PKM2 / HIF-1α轴,引起肝癌细胞衍生纤连蛋白1,触发多能分化的巨噬细胞。

    • PD-L1封锁消除PD-L1-dominant免疫抑制和糖酵解巨噬细胞释放内在的抗肿瘤能力。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 增加PKM2+巨噬细胞糖酵解预测预后不良的病人,封锁了这些细胞释放内在PD-L1 antitumourigenic潜力。

    • 选择性地调节糖酵解的“上下文”巨噬细胞在肝细胞癌肿瘤可能提供一个精确的抗癌治疗的策略。

    介绍

    程序性死亡ligand-1 (PD-L1)是一种有前途的治疗目标在侵略性的癌症。1 - 4PD-L1主要在上皮组织发炎,发现癌细胞或主机基质细胞;其表达式是假定的预测生物标志物从anti-PD-1 / PD-L1治疗中获益。5 - 7然而,一些患者临床研究强调PD-L1增加+宿主细胞更有可能受益于anti-PD-1 PD-L1 / PD-L1治疗比增加+癌细胞。8 - 10目前,自然,监管和PD-L1的函数+宿主细胞在人类癌症确实不清楚。

    巨噬细胞构成的重要组成部分肿瘤间质中的白细胞浸润。11为了应对环境信号,这些细胞获得特殊的表型特征与不同的功能。12日13值得注意的是,巨噬细胞的分化是细胞代谢的变化密切相关。14日15在老鼠和人类,糖酵解代谢参与经典活化的巨噬细胞(M1),而线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)仅限于替代激活的巨噬细胞(M2)。16直到现在,不知道是否和如何可能发生代谢变化和调节巨噬细胞的表型和功能在肿瘤环境。

    肝细胞癌(HCC)是全球第五大常见癌症,极其不良预后。17 18利用肝细胞癌作为模型系统,目前的研究表明,PD-L1+宿主巨噬细胞,建设性地代表PD-L1主要细胞来源的肝细胞癌肿瘤,显示一个HLA-DR高CD86高糖酵解的表现型,明显产生antitumourigenic IL-12p70和两极分化的内在的糖酵解代谢。从力学上看,糖酵解的关键酶——PKM2引发肝癌细胞衍生纤连蛋白1 (FN1),通过HIF-1α-dependent方式,同时控制antitumourigenic属性和inflammation-mediated PD-L1在糖酵解巨噬细胞表达。更重要的是,尽管PKM2增加+巨噬细胞糖酵解预测预后不良的患者,在这些细胞消除阻塞PD-L1 PD-L1-dominant免疫抑制和释放内在antitumourigenic属性。

    材料和方法

    病人和标本

    组织和血液样本配对获得病人治疗切除在南京医科大学第一附属医院(在线补充表1)。所有的病人都接受抗癌治疗在抽样之前,和那些并发自身免疫性疾病,艾滋病和梅毒被排除在外。九十一名患者完成后续的数据被用于免疫组织化学和免疫荧光分析和/或评估的无病生存期(队列1;在线补充表1)。搭配新鲜的血液和肿瘤组织样本从93年肝癌病人手术切除2018年12月至2021年12月被用于隔离外围和tissue-infiltrating白细胞(队列2;在线补充表1)。临床阶段分类根据国际抗癌联盟的指导方针。

    动物、细胞系、试剂和引物

    野生型C57BL / 6 j小鼠(6 - 8周大,女)购自南京南京大学的生物医学研究所。人类肝细胞(L02), HEK293T Huh7细胞系得到来自美国文化集合类型。抗体用于fluorescence-activated细胞排序/分析所示在线补充表2。中使用的抗体免疫印迹和免疫组织化学/免疫荧光所示在线补充表3。列出了用于实时PCR引物在线补充表4,归纳了所有其他试剂在线补充表5除非在文本表示。

    统计分析

    结果意味着±SEM。没有数据被排除在外。所有统计测试进行双面。数据正态分布,我们学生的学习任务,应用和非参数精确Wilcoxon符号秩检验是用于比较数据不是正态分布。为多个比较,方差分析Bonferroni调整是应用紧随其后。皮尔逊R值计算分析的基础上的相关性。所有统计测试进行GraphPad棱镜(v)软件。被认为具有统计显著性差异,p < 0.05。

    额外的方法

    其他方法详细在网上补充材料和方法。

    结果

    内在的糖酵解代谢两极化PD-L1+巨噬细胞在人类肝细胞瘤

    我们用共焦显微镜检查表达式模式PD-L1 (n = 10)在肝细胞癌标本,发现PD-L1主要是由CD68表示+巨噬细胞和其他只是弱表达的基质和肝癌细胞(图1一个)。进一步证实PD-L1的来源,我们准备好的单一细胞悬浮液从肝细胞癌肿瘤和配对non-tumoural肝脏和血液(n = 9;在线补充图1 a, B)。PD-L1弱表达在血液单核细胞(图1 b)。尽管PD-L1的百分比+巨噬细胞(CD14+ /暗细胞)也增加peritumoural肝组织,PD-L1强度表达式很低(图1 b)。正如预期的那样,大多数肿瘤组织包含PD-L1比例大大增强+ /高巨噬细胞(图1 b)。相比之下,PD-L1几乎没有或者只有弱表达的其他基质细胞,包括B细胞、T细胞、NK细胞和中性粒细胞,以及CD45- - - - - -non-haematopoietic肝癌肿瘤细胞(在线补充图1 c, D)。因此,宿主巨噬细胞是PD-L1在肝细胞癌肿瘤的主要来源。

    Glycolysis triggers PD-L1 on macrophages in human HCC tumours. (A) Confocal microscopy analysis of CD68+PD-L1+ cells in HCC tumours (n=10). Scale bar=100 µm. (B) FACS analysis of PD-L1 on monocytes/macrophages from HCC samples paired with blood samples (n=9). (C–H) Analysis of metabolic gene expression (C and D, n=3 for each), extracellular acidification rate (ECAR) (E, n=4), GLUT-1 expression (F, n=5), 2NBDG incorporation (G, n=5) and 20-hour lactate production (H, n=6) in PD-L1+ and PD-L1− macrophages purified from human HCC tumours. (I) Effects of metabolic inhibitors 2-deoxyglucose (2-DG), etomoxir (ETO) and oligomycin (Oym) on ex vivo PD-L1 expression in macrophages from human HCC tumours (n=5). (J and K) Mice bearing Hepa1-6 hepatoma for 15 days were injected with PBS or 2-DG intraperitoneally as described (J). PD-L1 expression on tumour macrophages was determined by FACS (K, n=6). *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. HCC, hepatocellular carcinoma; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    糖酵解触发PD-L1巨噬细胞在人类肝细胞癌肿瘤。(一)CD68的共焦显微镜分析+PD-L1+肝细胞癌肿瘤细胞(n = 10)。酒吧= 100µm规模。(B)流式细胞仪分析PD-L1从肝癌样本中单核细胞/巨噬细胞与血液样本配对(n = 9)。(碳氢键)的代谢基因表达分析(C和D, n = 3),细胞外的酸化速率(ECAR) (E, n = 4), GLUT-1表达式(F, n = 5), 2 nbdg合并(G, n = 5)和20小时乳酸生产PD-L1 (H, n = 6)+和PD-L1−巨噬细胞纯化从人类肝细胞癌肿瘤。(我)的影响代谢抑制剂2-deoxyglucose (2 dg) etomoxir (ETO)和寡霉素(Oym)体外PD-L1表达巨噬细胞从人类肝癌肿瘤(n = 5)。(J和K)小鼠轴承Hepa1-6肝癌15天注射PBS或2 dg腹腔内(J)。所述PD-L1表情肿瘤巨噬细胞是由流式细胞仪(K, n = 6)。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。肝癌,肝细胞癌;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    值得注意的是巨噬细胞分化与细胞代谢的变化密切相关的项目。14 - 16检查是否巨噬细胞代谢过程确定PD-L1表达式,我们应用实时PCR比较PD-L1代谢酶的转录概况+和PD-L1- - - - - -巨噬细胞与肝细胞癌肿瘤(n = 3;在线补充图1 e)。一般来说,PD-L1- - - - - -巨噬细胞主要代谢酶表达与线粒体OXPHOS (图1 c),揭示代谢静止状态。有趣的是,PD-L1+巨噬细胞显著表达关键病原糖酵解酶(图1 c, D和在线补充图1 f)。我们评估细胞外酸化率,量化质子生产乳酸的代理,从而反映出整体的糖酵解通量。19在支持,PD-L1+巨噬细胞表现出更高的基底和最大糖酵解率与PD-L1相比- - - - - -巨噬细胞(图1 e)。我们也发现一个明显的葡萄糖转运体Glut1 PD-L1 upregulation+巨噬细胞(图1 f),表明葡萄糖结合的增强。因此,PD-L1+巨噬细胞体外培养,显示更大的容量将荧光葡萄糖模拟2 - (N - [7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl]氨基)2-deoxyglucose (2-NBDG) (图1 g)和产生更多的乳酸(图1 h)。

    前面描述的结果表明,糖酵解代谢可能参与PD-L1 upregulation巨噬细胞在肿瘤。为了验证这一点,我们使用特定抑制剂让巨噬细胞的代谢过程从人类分离体外肝细胞癌肿瘤。与我们的假设一致,大幅下滑的PD-L1表达式在暴露后巨噬细胞2-deoxyglucose (2 dg),葡萄糖抑制葡萄糖结合模拟,观察(图1我)。相比之下,PD-L1表情略受孵化与etomoxir巨噬细胞(ETO),一种广泛使用的小分子抑制剂的脂肪酸氧化,20.或寡霉素,ATP合酶抑制剂(图1我)。21此外,在PD-L1糖酵解代谢的作用+巨噬细胞诱导了体内(图1 j)。一致,2 dg腹腔注射Hepa1-6 hepatoma-bearing老鼠在最后2天的实验很大程度上减少PD-L1的表达在肿瘤巨噬细胞(图1 k)。

    PD-L1封锁解放antitumourigenic糖酵解巨噬细胞的活性

    我们接下来问是否抑制肿瘤巨噬细胞的糖酵解代谢废除PD-L1-elicited免疫特权。为了解决这种可能性,我们纯化PD-L1+和PD-L1- - - - - -巨噬细胞,以及自体肝细胞癌肿瘤组织浸润T细胞,然后有关酶联免疫斑点试验进行(在线补充图2)。肿瘤T细胞与PD-L1 cocultured+巨噬细胞,但不是PD-L1- - - - - -巨噬细胞,表现出一个受损的生产IFN-γ(图2一个)。与我们的假设一致,抑制PD-L1言论pre-exposing PD-L1+巨噬细胞的糖酵解抑制剂2 dg 1天(图1我)明显恢复能力的肿瘤T细胞产生IFN-γ水平比得上,未经治疗的肿瘤产生的T细胞(图2一个)。值得注意的是,我们还封锁了PD-L1 PD-L1的预孵化+巨噬细胞的单克隆抗体(mAb) MIH1平行。值得注意的是,这种疗法消除显著免疫诱导巨噬细胞PD-L1和特权,另外增强生产IFN-γT细胞(图2一个)。因此,这些数据表明,PD-L1+巨噬细胞包含内在antitumourigenic属性,这可能是靠糖酵解代谢但被PD-L1信号。

    Glycolytic macrophages show intrinsic antitumourigenic properties. (A) IFN-γ detection by ELISpot in HCC tumour-derived T cells cultured alone or with PD-L1− or PD-L1+ macrophages (Mφ), or with those cells pre-treated with 2-DG, anti-PD-L1 antibody, or IgG1 as shown in online supplemental figure 2A (n=5). (B) cytotoxic effects of tumour T cells on CFSE-labelled autologous mouse Hepa1-6 hepatoma cells in the presence or absence of tumour Mφ that were left untreated or pre-treated with 2-DG, anti-PD-L1 antibody, or IgG1 as shown in online supplemental figure 2B (n=6). propidium iodide+ Hepa1-6 cells were measured by FACS. results are expressed as mean±SEM of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    糖酵解巨噬细胞显示内在antitumourigenic属性。(一)IFN-γ有关酶联免疫斑点在HCC肿瘤提取的检测T细胞培养与PD-L1单独或−或PD-L1+巨噬细胞(Mφ),或与这些细胞预处理与2 dg anti-PD-L1抗体,或IgG1见在线补充图2(n = 5)。(B)肿瘤细胞毒性效应T细胞在CFSE-labelled自体鼠标Hepa1-6肝癌细胞的肿瘤Mφ存在与否与2 dg左未经处理或预处理,anti-PD-L1抗体,或IgG1见在线补充图2 b(n = 6)。propidium碘化+Hepa1-6细胞流式细胞仪测定。结果表示为均值±SEM的三个独立的实验。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。

    之后我们建立了体外使用肿瘤特异的T细胞来源于自体的细胞毒性系统Hepa1-6 hepatoma-bearing老鼠(在线补充图2 b)。正如所料,肿瘤T细胞体外培养有效地杀死了自体Hepa1-6细胞,这个过程被添加自体F4/80阻碍+巨噬细胞肿瘤,但进一步提高通过添加这些巨噬细胞+特定的抗体对小鼠PD-L1 (图2 b)。支持我们的假设,肿瘤T细胞体外培养的巨噬细胞与肿瘤pre-exposed 2 dg只显示基底能力杀死自体Hepa1-6细胞,但不是一个增强细胞毒性效应(图2 b),这表明抑制巨噬细胞的糖酵解代谢也会损害他们的能力来刺激特异性T细胞的反应。

    糖酵解代谢控制antitumourigenic属性和inflammation-elicited PD-L1表达式同时在巨噬细胞

    考虑到内在antitumourigenic PD-L1的属性+巨噬细胞在人类肝细胞癌(图2),我们接下来对这些细胞活化状态和细胞因子生产的状况。有趣的是,PD-L1+巨噬细胞显著表达MHC II级分子HLA-DR和costimulatory CD86, PD-L1相比- - - - - -同行(图3一);强度之间的显著相关性PD-L1和HLA-DR中发现巨噬细胞与肝细胞癌肿瘤(n = 11) (图3 b)。HLA-DR的共存和PD-L1对巨噬细胞进一步证实了通过检查这些蛋白的表达在串行部分肝细胞癌肿瘤样本(n = 8)。大多数HLA-DR高PD-L1+CD68入侵的边缘细胞中积累,也代表了CD8的主要网站+细胞毒性T细胞(图3 c)。符合这些发现,我们进一步证明PD-L1+巨噬细胞肿瘤,但不是他们的PD-L1- - - - - -同行,有效地表达了促炎IL-1β、il - 6和TNF-α,以及antitumourigenic IL-12p70 (图3 d, E),一个著名的诱导物的Th1反应在人类和老鼠。22日23日相应地,我们证明了,尽管anti-PD-L1 Ab另外增强生产IFN-γ有关酶联免疫斑点检测系统肿瘤的T细胞,这一过程可以通过额外的中和IL-12p70显著废除(在线补充图3 a, B)。类似地,独自IL-12p70明显增加了生产的IFN-γ肿瘤T细胞体外,大大减毒通过添加PD-L1+HEK293T转染子,但不是控制转染子(在线补充图3 c, D)。

    PD-L1+ macrophages show a proinflammatory activated phenotype. (A) FACS analysis of CD86 and HLA-DR on PD-L1+ and PD-L1− macrophages from HCC tumours (n=11). (B) Correlation between PD-L1 and HLA-DR expression in macrophages from human HCC tumours (n=11). (C) Immunohistochemistry analysis of CD68, PD-L1, HLA-DR and CD8 expression in HCC tumours (n=8). (D and E) Analysis of transcriptional and translational levels of IL-1β, IL-6, IL-12 and TNF-α in PD-L1+ and PD-L1− macrophages from HCC tumours (n=7). (F–I) Analysis of glut-1 expression (F), 2NBDG incorporation (G), ECAR (H) and 20-hour lactate production (I) in HLA-DRhigh and HLA-DRlow macrophages purified from human HCC tumours (n=5). (J and K) Effects of 2-DG on CD86, HLA-DR, CD206, CD23 and CD163 expression (J), as well as cytokine production (K), in macrophages from HCC tumours (n=4). (L and M) Mice (n=6) bearing Hepa1-6 hepatoma were injected with PBS or 2-DG as described in figure 1J. CD86 and I-A/I-E expression (L), as well as cytokine expression (M), in tumour macrophages were determined by FACS and real-time PCR, respectively. Results are expressed as mean±SEM of at least three independent experiments. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 2-DG, 2-deoxyglucose; ECAR, extracellular acidification rate; HCC, hepatocellular carcinoma; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    PD-L1+巨噬细胞炎性表型激活。(一)流式细胞仪分析CD86和HLA-DR PD-L1+和PD-L1−巨噬细胞与肝细胞癌肿瘤(n = 11)。(B) PD-L1和HLA-DR表达之间的相关性在巨噬细胞从人类肝细胞癌肿瘤(n = 11)。(C) CD68免疫组织化学分析,PD-L1 HLA-DR和CD8表达(n = 8)在肝细胞癌肿瘤。(D和E)分析转录和转译IL-1β、il - 6、il - 12和TNF-αPD-L1+和PD-L1−巨噬细胞与肝细胞癌肿瘤(n = 7)。(外)分析glut-1表达式(F), 2 nbdg合并(G), ECAR (H)和20小时在HLA-DR乳酸生产(I)高和HLA-DR低巨噬细胞纯化从人类肝细胞癌肿瘤(n = 5)。(J和K)的影响2 dg CD86, HLA-DR, CD206, CD23和CD163表达(J),以及细胞因子的生产(K),巨噬细胞在肝细胞癌肿瘤(n = 4)。(L和M)小鼠(n = 6)轴承Hepa1-6肝癌被注射了PBS或2 dg中描述图1 j。CD86和我/我表达式(左),以及细胞因子表达(M),在肿瘤巨噬细胞流式细胞仪和实时PCR测定,分别。结果表示为均值±SEM至少有三个独立的实验。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。2 dg 2-deoxyglucose;ECAR,细胞外酸化率;肝癌,肝细胞癌;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    鉴于对PD-L1糖酵解代谢是至关重要的+巨噬细胞诱导(图1),我们评估了这种机制是否也负责巨噬细胞激活。事实上,HLA-DR高巨噬细胞与肝细胞癌肿瘤组织更有效的整合和利用葡萄糖(图3 f, G),这些细胞表现出更高的基底和最大糖酵解率和产生更多的乳酸,HLA-DR相比低/ -巨噬细胞(图3 h,我)。因此,抑制巨噬细胞的糖酵解代谢从肝细胞癌肿瘤组织2 dg有效受损HLA-DR和CD86的表达,以及生产IL-1β,IL-12p70和TNF-α(图3 j, K)。相比之下,这样的治疗不影响巨噬细胞的表达M2制造商CD23 CD206但弱CD163的表达增加(图3 j)。类似的结果在Hepa1-6 hepatoma-bearing老鼠:抑制糖酵解代谢的期间,2 dg的最后两天实验明显减毒IA-IE的表达,CD86和巨噬细胞炎性细胞因子在肿瘤(图3 l, M)。

    然后,我们调查是否PD-L1表达式和巨噬细胞的促炎细胞因子生产是相互关联的。事实上,阻止PD-L1 PD-L1马伯的+巨噬细胞并不影响IL-12p70的生产,以及促炎IL-1β,il - 6和TNF-α(在线补充图4)。相反,表达PD-L1巨噬细胞在肿瘤抑制40% -50%通过阻断IL-1βTNF-α但并没有减少通过阻断il - 6或IL-12p70 (图4一和在线补充图4 b)。同样,重组IL-1β有效诱导upregulation PD-L1血液单核细胞。尽管重组TNF-α单独有一个边际效应,它表现为协同作用增加IL-1β-mediated PD-L1表达式(图4 b)。这些发现表明,IL-1β信号有助于PD-L1感应激活巨噬细胞居多,这与最近在肝癌的观察是一致的。24一致,中和IL-1β+ TNF-αHepa1-6 hepatoma-bearing老鼠(图4 c)成功地抑制巨噬细胞PD-L1表达式(图4 d、抑制肿瘤生长图4 e)和增加功能CD8的渗透+T细胞(图4 f),但这样的待遇并不影响IL-12p70表达式(图4 g)。因此,巨噬细胞糖酵解代谢同时有助于inflammation-mediated PD-L1镇压和IL-12-dominant antitumourigenic活动。

    Inflammatory cytokines induce PD-L1 in tumour macrophages. (A) Twenty-four-hour blockade of IL-1β or TNF-α reduced PD-L1 expression in macrophages from human HCC tumours (n=5). (B) Exposure of blood CD14+ cells to IL-1β and/or TNF-α for 24 hours led to PD-L1 upregulation (n=5). (C–G) Mice bearing Hepa1-6 hepatoma were injected intraperitoneally with PBS or anti-IL-1β antibody plus anti-TNF-α antibody as shown (C, each n=6). Tumour macrophage PD-L1 expression (D), tumour size (E), CD8+ cell infiltration and function (F) and tumour macrophage Il12a expression (G) were determined. Results are expressed as mean±SEM of at least three independent experiments. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. HCC, hepatocellular carcinoma; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    巨噬细胞炎性细胞因子诱导PD-L1在肿瘤。(A) 24小时的封锁IL-1β或TNF-αPD-L1表达减少巨噬细胞从人类肝细胞癌肿瘤(n = 5)。(B) CD14的血+细胞IL-1β和/或TNF-α24小时导致PD-L1 upregulation (n = 5)。老鼠(C g)轴承Hepa1-6肝癌是腹腔内注射PBS或者anti-IL-1β抗体+ anti-TNF-α抗体如图所示(C、n = 6)。肿瘤巨噬细胞PD-L1表达式(D),肿瘤大小(E)、CD8+肿瘤细胞浸润和函数(F)和巨噬细胞Il12a表达式(G)测定。结果表示为均值±SEM至少有三个独立的实验。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。肝癌,肝细胞癌;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    角色在糖酵解metabolism-elicited巨噬细胞分化的肝癌环境

    调查的机制参与糖酵解metabolism-elicited巨噬细胞分化的肿瘤环境,我们首先着手建立条件可以可靠的体外复制这个过程。人类单核细胞与上层清液从孵化文化原发性肝癌细胞(HCC-SN)或正常肝L02细胞(Liver-SN)。HCC-SN暴露于20%,但不是Liver-SN, 24小时并导致明显upregulation的主要病原糖酵解酶GLUT1,HK2,PFKFB3,PFKL,PKM2和LDHA在单核细胞,但3天后回到正常水平(图5 a, B)。与此一致的是,相比于单核细胞与HCC-SN孵化3天,24小时的细胞暴露HCC-SN显示至少三倍最大糖酵解率和乳酸产生更多更高(图5 c, D)。这些数据意味着积极的糖酵解代谢主要发生在巨噬细胞在肿瘤的早期分化阶段的环境。符合这一点,我们观察到的表达HLA-DR和PD-L1显著调节单核细胞接触HCC-SN后24小时,但减少3天(图5 e, F)。也获得了类似的细胞因子的模式制作HCC-SN-exposed单核细胞,包括促炎的累积IL-1βTNF-α,以及antitumourigenic IL-12p70,在文化媒体在其早期分化阶段,随后下降3天(图5克)。此外,支持结论前面所提到的,糖酵解metabolism-mediated促炎反应触发PD-L1表达式在巨噬细胞(图4),使用一个竞争性抑制剂2 dg阻止HCC-SN-exposed单核细胞的糖酵解代谢在其早期分化阶段(图5 h)有效地生产IL-1β受损,IL-12p70和TNF-α(图5我)和抑制HLA-DR PD-L1表达式(图5 j)。

    Hepatoma environments facilitate glycolysis and PD-L1 expression in macrophages. (A–G) Exposure of blood CD14+ cells to primary HCC-SN, but not liver-SN, led to marked increases of glycolytic metabolic enzymes (A and B), ECAR (C), lactate production (D), HLA-DR expression (E), PD-L1 expression (F) and inflammatory cytokine production (G) after 24 hours but returned to a normal level after 3 days (n=7 for each). (H–J) Treatment of 2-DG for 24 hours suppressed HCC-SN-mediated upregulation of lactate production (H), inflammatory cytokine production (I) and HLA-DR and PD-L1 expression (J) in CD14+ cells (n=7 for each). Results are expressed as mean±SEM of three independent experiments. *P<0.05, **p<0.01. 2-DG, 2-deoxyglucose; ECAR, extracellular acidification rate; HCC-SN, supernatants from cultures of primary HCC cells; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    肝癌环境促进糖酵解和PD-L1巨噬细胞中表达。(g) CD14的血+细胞主要HCC-SN,但不是liver-SN,导致显著增加糖酵解代谢酶(A和B), ECAR (C),乳酸生产(D), HLA-DR表达式(E), PD-L1表达式(F)和炎性细胞因子的生产(G) 24小时后但回到正常水平后3天(n = 7为每个)。24小时(H-J)治疗2 dg抑制HCC-SN-mediated upregulation乳酸生产(H)、炎性细胞因子的生产(I)和HLA-DR PD-L1 (J) CD14表达+为每个)细胞(n = 7。结果表示为均值±SEM的三个独立的实验。* * * P < 0.05, P < 0.01。2 dg 2-deoxyglucose;ECAR,细胞外酸化率;HCC-SN,上层清液从文化原发性肝癌细胞;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    PKM2 / HIF-1α轴巨噬细胞的多能分化HCC是至关重要的

    我们进一步探讨了信号通路参与糖酵解metabolism-elicited巨噬细胞分化。考虑到发现的关键病原糖酵解酶HK2, PFKFB3和PKM2在HCC-SN-exposed单核细胞明显升高(图5 b),我们使用特定抑制剂废除这些蛋白质的活动期间在其早期分化阶段(图6和在线补充图5)。结果表明,抑制PKM2活动使用ml - 265明显减少了生产IL-1β,IL-12p70 TNF-α,以及HLA-DR的表达和PD-L1 HCC-SN-exposed单核细胞,尽管3-BP抑制HK2的活动或PFKFB3 3 po(轻微影响图6罪犯)。我们进一步用siRNA确认PKM2蛋白质的作用在调节多能分化的巨噬细胞(图6 e),并证明了这种治疗有效受损发炎活动,以及HLA-DR PD-L1表达式,在HCC-SN-exposed单核细胞(图6 f, G)。符合这个体外观察,共焦显微镜表明,在人类肝细胞癌肿瘤组织,PKM2被PD-L1选择性和高度表达+巨噬细胞,只有弱PD-L1所表达的- - - - - -基质和肝癌细胞(图6 h)。

    Glycolysis upregulates PD-L1 on macrophages via PKM2/HIF-1α axis-dependent manner. (A–D) Effects of 3-BP (an hK2 inhibitor), 3-PO (a PFKEB3 inhibitor) or ML-265 (a PKM2 inhibitor) (A) on inflammatory cytokine production (B), HLA-DR expression (C) and PD-L1 expression (D) by CD14+ cells exposing to primary HCC-SN for 24 hours (n=5). (E–G) Transfection of siPKM2 (E) suppressed cytokine production (F), as well as HLA-DR and PD-L1 expression (G), by CD14+ cells exposing to primary HCC-SN for 24 hours (n=5). (H) Confocal microscopy analysis of CD68, PKM2 and PD-L1 distribution in HCC tumours (n=5). Scale bar=100 µm. (I) Transfection of siPKM2 suppressed STAT3 activation and HIF-1α expression by CD14+ cells exposing to primary HCC-SN (n=5). (J and K) Effects of STAT3 and HIF-1α inhibition on HLA-DR and PD-L1 expression (J), as well as inflammatory cytokine production (K), by CD14+ cells exposing to primary HCC-SN for 24 hours (n=5). (L and M) Immunohistochemical analysis of PKM2+CD68+ cell distribution in HCC tumours (L, n=91). Patients were further divided into two groups according to the median value of the PKM2+CD68+ cell density in the tumour regions (less PKM2high macrophages, ≤90 cells (n=46); more PKM2high macrophages, >90 cells (n=45)). The disease-free survival rate of these patients was analysed with the Kaplan-Meier method and log-rank test (M). Scale bar=100 µm. Results are expressed as mean±SEM of at least four experiments. *P<0.05, **p<0.01. HCC, hepatocellular carcinoma; HCC-SN, supernatants from cultures of primary HCC cells; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    在巨噬细胞通过糖酵解上调PD-L1 PKM2 / HIF-1αaxis-dependent方式。(模拟)的影响3-BP (hK2抑制剂),3 po (PFKEB3抑制剂)或ml - 265 (PKM2抑制剂)(a)炎性细胞因子的生产(B), HLA-DR表达式(C)和PD-L1 CD14表达(D)+细胞暴露主要HCC-SN 24小时(n = 5)。si (eg)转染PKM2(E)抑制细胞因子的生产(F),以及HLA-DR PD-L1表达式(G), CD14+细胞暴露主要HCC-SN 24小时(n = 5)。CD68 (H)共焦显微镜分析,PKM2和PD-L1分布在肝细胞癌肿瘤(n = 5)。酒吧= 100µm规模。(我)如果转染PKM2抑制STAT3激活和HIF-1αCD14表达+细胞暴露主要HCC-SN (n = 5)。(J和K)抑制STAT3和HIF-1αHLA-DR和PD-L1表达式(J),以及炎性细胞因子的生产(K), CD14+细胞暴露主要HCC-SN 24小时(n = 5)。(L和M) PKM2的免疫组织化学分析+CD68+在肝细胞癌肿瘤细胞分布(L, n = 91)。患者进一步分为两组根据PKM2的中值+CD68+肿瘤细胞密度的区域(PKM2较少高巨噬细胞,≤90个细胞(n = 46);更多PKM2高巨噬细胞,> 90个细胞(n = 45))。这些患者的无病生存率与kaplan meier分析方法和生存率较(M),酒吧= 100µm规模。结果表示为均值±SEM至少四个实验。* * * P < 0.05, P < 0.01。肝癌,肝细胞癌;HCC-SN,上层清液从文化原发性肝癌细胞;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    值得注意的是,除了作为一个关键病原糖酵解酶,PKM2可以把原子核保持HIF-1α稳定和STAT3磷酸化。25日- 27日事实上,沉默PKM2表达HCC-SN-exposed单核细胞在很大程度上抑制HIF-1α和STAT3的活动(图6我)。的稳定支持,抑制HIF-1α肿瘤抑制剂α-ketoglutarate大大得罪多能分化的巨噬细胞(图6 j, K),与PKM2抑制效果相当。相比之下,取消激活STAT3信号没有影响(图6 j, K)。这些数据表明,PKM2 / HIF-1α轴参与多能分化的肿瘤巨噬细胞。

    调查PKM2的影响+巨噬细胞在人类肝细胞癌的临床特征,我们收集并分析了91例肝细胞癌患者临床资料(在线补充表1),这些受试者分为两组根据双重免疫组织化学染色PKM2的中值+CD68+细胞密度(图6 l)。我们发现一个惊人的逆PKM2之间的联系+CD68+在肝细胞癌肿瘤细胞密度和无病生存期(p = 0.019;图6米)。PKM2的密度+CD68+细胞也与肿瘤大小有关(p = 0.045),肿瘤,节点,转移阶段(p = 0.009)和肝硬化(p = 0.021;在线补充表6)。在多变量分析中,PKM2的数量+CD68+细胞是一个无病生存的独立预后因素(p = 0.048;在线补充表7)。

    FN1协调来自肝癌细胞糖酵解metabolism-elicited巨噬细胞分化

    在一些癌症患者,高水平的FN1与不良预后有关。28 - 30我们检测到非常高的表达FN1在肝细胞癌肿瘤组织与配对non-tumoural肝组织(图7)。类似地,增加水平FN1 HCC-SN中发现,相比与liver-SN (图7 b)。这些发现促使我们调查是否FN1导致HCC-SN-induced代谢重编程和巨噬细胞的多能分化。刺激24小时与重组FN1引起upregulation关键的病原糖酵解酶PKM2在单核细胞(图7 c),这些细胞将增加活动,利用葡萄糖(图7 d, E)。同样,重组FN1模仿IL-1βHCC-SN诱导生产的影响,IL-12p70 TNF-α和表达HLA-DR PD-L1单核细胞(图7 f, G)。

    Tumour-derived FN1 facilitated sequential glycolysis, inflammatory cytokine production and PD-L1 expression in macrophages. (A) Relative expression of FN1 in tumour tissue and paired non-tumoural liver tissue (n=33). (B) FN1 concentrations in liver-SN and HCC-SN (n=5). (C–G) Treatment of FN1 led to increases of PKM2 expression (C), 2-NBDG incorporation (D), lactate production (E), inflammatory cytokine production (F), as well as CD86, HLA-DR and PD-L1 expression (G), in blood CD14+ cells. (H–K) Effect of TLR4 blockade on FN1-elicited or HCC-SN-elicited lactate production (H), cytokine production (I), HLA-DR expression (J) and PD-L1 expression (K) in blood CD14+ cells (each n=4). (L–O) Knock-down of Fn1 (L) in Hepa1-6 hepatoma suppressed glycolytic enzyme expression (M), inflammatory cytokine expression (N), as well as CD86, IA-IE and PD-L1 expressions (O), in tumour macrophages (each n=5). Results are expressed as the mean±SEM. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 2-NBDG, 2-(N-[7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl] amino)-2-deoxyglucose; FN1, fibronectin 1; HCC-SN, supernatants from cultures of primary HCC cells; PD-L1, programmed death ligand-1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    肿瘤提取FN1促进顺序糖酵解,炎性细胞因子的生产和PD-L1巨噬细胞中表达。(一)相对的表达FN1在肿瘤组织和配对non-tumoural肝组织(n = 33)。(B) FN1 liver-SN浓度和HCC-SN (n = 5)。(C G)治疗FN1导致增加PKM2表达式(C), 2-NBDG公司(D),乳酸生产(E)、炎性细胞因子的生产(F),以及CD86 HLA-DR PD-L1表达式(G),血液中CD14+细胞。(H-K)对FN1-elicited TLR4封锁效应或HCC-SN-elicited乳酸生产(H)、细胞因子的生产(I), HLA-DR表达式(J)和PD-L1 (K)血液中CD14表达+细胞(每个n = 4)。(L-O)的混战Fn1(左)在Hepa1-6肝癌抑制糖酵解酶表达(M),炎症细胞因子表达(N),以及CD86 IA-IE和PD-L1表达式(O)、巨噬细胞在肿瘤(N = 5)。结果表示为均值±SEM。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。2-NBDG, 2 - (N - [7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl]氨基)2-deoxyglucose;FN1,纤连蛋白1;HCC-SN,上层清液从文化原发性肝癌细胞;PD-L1, ligand-1程序性死亡。

    值得注意的是TLR4是一个重要的生理FN1受体。33节因此,我们使用一种抗体专门保护TLR4信号重组FN1或HCC-SN的存在。正如所料,预处理的单核细胞anti-TLR4马伯有效抑制糖酵解代谢,细胞因子的生产和HLA-DR和PD-L1表达刺激这些细胞暴露于HCC-SN或重组FN1 (图7 h-k)。此外,我们撞倒了FN1基因在人类肝癌细胞Huh7和鼠标Hepa1-6肝癌(图7 l和在线补充图6)。这些疗法明显受损的糖酵解和细胞因子生产的能力,以及CD86的表达,HLA-DR PD-L1,巨噬细胞在体外和hepatoma-bearing老鼠(图7 m-o和在线补充图6罪犯)。因此,FN1源自肝癌细胞可能代表一个重要因素导致糖酵解metabolism-elicited巨噬细胞分化。

    讨论

    我们目前的研究提供了证据表明宿主巨噬细胞表达的PD-L1代表一种机制参与肿瘤免疫特权和反映了经典的存在先天antitumourigenic免疫力。PD-L1封锁解放antitumourigenic巨噬细胞的活性。

    值得注意的是PD-L1导致肿瘤特异的T细胞的疲惫。9 34因此,它是合理的假设PD-L1表达可能与anti-PD-1 / PD-L1治疗的临床反应。然而,一些临床研究已经表明,尽管潜在的机制仍不清楚,PD-L1表达的肿瘤细胞和宿主基质细胞代表不同的生理和临床意义。8 9事实上,PD-L1表达的癌细胞可以由许多生物过程,包括染色体重组、拷贝数改变,致癌通路失调和表观遗传调制。35-37然而,PD-L1表达的宿主细胞诱导肿瘤主要由当地的环境。8 10在这项研究中,我们表明,PD-L1+宿主巨噬细胞,代表PD-L1在肝细胞癌肿瘤的主要来源,表现出糖酵解表型。我们表明,抑制糖酵解代谢的体外废除PD-L1表达肿瘤巨噬细胞。有趣的是,由特定的Ab废除PD-L1-dominant免疫抑制PD-L1特权和另外增强糖酵解macrophage-mediated特异性T细胞的细胞毒性。它是可信的,它不是PD-L1本身,而是细胞表达PD-L1,确定anti-PD-1 / PD-L1治疗的治疗效率。38这个概念是PD-L1支持我们的观察+糖酵解巨噬细胞表现出一个HLA-DR高CD86高表型和生产重要antitumourigenic IL-12p70。

    尽管最近的成功证明糖酵解的重要性在维持古典激活巨噬细胞的分化(M1)和OXPHOS调节选择激活的巨噬细胞(M2),13直接代谢机制tumour-infiltrating巨噬细胞在肿瘤进展仍不清楚。我们的数据表明,在肝细胞癌肿瘤组织内,糖酵解代谢参与PD-L1+巨噬细胞分化,而OXPHOS仅限于PD-L1的能源需求- - - - - -巨噬细胞。更重要的是,我们表明,糖酵解代谢同时控制antitumourigenic protumourigenic PD-L1活动+巨噬细胞。一方面,抑制糖酵解代谢减少肿瘤表达的PD-L1巨噬细胞,从而恢复能力的肿瘤T细胞产生IFN-γ和杀死自体肝细胞瘤细胞。另一方面,抑制糖酵解代谢也会降低的表达MHC II级分子HLA-DR和costimulatory CD86,以及生产antitumourigenic IL-12p70,巨噬细胞的肿瘤。因此,尽管针对巨噬细胞的糖酵解代谢废除PD-L1-mediated免疫特权,这种策略也会抑制antitumourigenic先天免疫。这个假说是兼容以前的研究表明,糖酵解代谢也会导致细胞毒性T细胞和NK细胞的效应函数。39 40

    除了它的角色在糖酵解,PKM2支持转录因子的功能包括HIF-1α和统计数据。25日- 27日我们的研究表明,PKM2 / HIF-1α轴有一个重要的角色在调节PD-L1表达肿瘤巨噬细胞。与此一致的是,PKM2的密度+CD68+细胞在肿瘤组织是与先进的疾病阶段,可怜的肝细胞癌患者的生存期。应该强调,尽管PKM2的增加+CD68+细胞在肿瘤组织预测预后不良,这种情况可以作为预测生物标志物的从anti-PD-1 / PD-L1治疗中获益,因为阻塞PD-L1信号释放PKM2的antitumourigenic活动+CD68+细胞。因此,研究机制,可以选择性地调节或逆转糖酵解巨噬细胞的表型可能提供一个精确的抗癌治疗的策略。

    在癌症患者,FN-1表达式在恶性肿瘤通常是高于相应的良性或正常组织。28 - 30实验研究表明,FN-1不仅促进肿瘤生长和转移,而且还调节免疫细胞的功能。33节支持这些发现,三组实验的结果在我们的调查提供证据表明FN-1肝癌细胞所产生的一个重要的因素是引发糖酵解metabolism-mediated多能分化的巨噬细胞。首先,重组FN-1能够模仿的能力HCC-SN诱导巨噬细胞的多能分化。第二,预处理anti-TLR4马伯与FN-1及其受体之间的交互部分抑制促炎反应和后续PD-L1 HCC-SN-exposed单核细胞中表达。第三,沉默的FN-1 Hepa1-6 hepatoma-bearing老鼠减糖酵解,细胞因子的生产和PD-L1表达肿瘤体内巨噬细胞。因此,FN-1肝癌环境中生成的可能构成的一个重要中介糖酵解metabolism-elicited多能分化的巨噬细胞。值得注意的是,除了生产FN-1,肝癌细胞还分泌分子(如透明质酸片段),这也导致了PD-L1在巨噬细胞的表达。41学习的机制,可以选择性地调节巨噬细胞的功能活动可能会提供抗癌治疗的新策略。

    在最近的研究中,FN-1源自癌症细胞促进糖酵解激活巨噬细胞的触发TLR4,从而诱导巨噬细胞表达大量PD-L1,进而削弱内在antitumourigenic糖酵解巨噬细胞的活动。我们的研究结果提供了重要的见解意义如何糖酵解巨噬细胞在肿瘤可能通过刺激PD-L1表达式进行抑制的作用,这将有利于合理设计新颖的免疫抗癌疗法。

    数据可用性声明

    所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    所有的人类样本匿名编码按照当地伦理指南(赫尔辛基宣言规定的)。从每个病人获得书面知情同意,研究协议审查委员会批准南京医科大学第一附属医院(GZR2020/09)。参与者给知情同意参与这项研究之前的部分。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • L-GL, Z-LZ和X-YW共同第一作者。

    • 噢,G-BZ MZ和YC联合高级作者。

    • 贡献者所有作者都完全访问所有数据用于研究和负责数据的完整性和数据分析的准确性。L-GL、Z-LZ X-YW、B-YL J-YL、SL和G-BZ获得实验数据。L-GL、Z-LZ和YC提供行政、技术或材料的支持。L-GL、G-BZ M-XZ和YC参与研究设计和获得资金。

    • 资金这项工作是支持的项目资助中国国家重点研究和发展项目的(2017 yfa0205200),中国国家自然科学基金(82071767,81772602,91742105,91942309),中国的江苏省重点研究发展项目(BE2018750)、紧急和创伤的重点实验室,教育部(klet - 201913),珠海人民医院的研究开始项目(No.2020ycqd001)和科技发展基金,澳门特别行政区(0011/2019 / AKP)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

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