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胃肠道癌症
原始研究
阻断白介素10增强人结直肠癌肝转移的抗肿瘤免疫功能
  1. 凯文·M·沙利文1，
  2. Xiuyun江1，
  3. 般若古哈2，3.，
  4. 克里斯托弗Lausted4，
  5. 杰森·卡特1，
  6. 辛西娅·许1，
  7. 凯文·P·拉巴迪1，
  8. 克里卡兰1，5，
  9. 海蒂·L·肯森1，
  10. 莎拉·丹尼尔1，
  11. 小燕4，
  12. 长汀的孟4，
  13. Arezou Abbasi1，
  14. 玛丽娜陈6，
  15. Y David Seo1，
  16. 詹姆斯·欧·帕克1，
  17. 伊恩·尼古拉斯·克里斯普7，
  18. 杨绍昌1，
  19. 特蕾莎·金1，
  20. Taranjit S Gujral6，
  21. 羌族田4，8，
  22. 史蒂文·C·卡茨2，3.，
  23. Venu G Pillarisetty1，5
  1. 1外科，华盛顿大学，西雅图，华盛顿美国
  2. 2免疫肿瘤研究所和医学系，罗杰威廉姆斯医疗中心，普罗维登斯，罗德岛州美国
  3. 3.外科，波士顿大学医学院，波士顿，麻萨诸塞州美国
  4. 4系统生物学研究所，西雅图，华盛顿美国
  5. 5布罗特曼巴蒂精确医学研究所，西雅图，华盛顿美国
  6. 6人类生物学部，弗雷德哈钦森癌症研究中心，西雅图，华盛顿美国
  7. 7病理科，华盛顿大学，西雅图，华盛顿美国
  8. 8国家转化医学研究中心，上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海,中国
  1. 对应到Venu G Pillarisetty博士，外科，华盛顿大学，西雅图，华盛顿州98195;虚地磁极在}{uw.edu；田强博士，上海市瑞金二路197号，邮编200025;tq12221在}{rjh.com.cn

摘要

客观的程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)检查点抑制和过继细胞治疗在微卫星稳定型结直肠癌肝转移(CRLM)患者中取得了有限的成功。我们试图在CRLM切片培养中评估白细胞介素10 (IL-10)阻断对内源性T细胞和嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞抗肿瘤功能的影响。

设计我们从人CRLM (n=38例患者的肿瘤)中创建了有机型切片培养，并测试了对抗IL-10 (αIL-10)的中和抗体单独作为治疗和与外源施用的癌胚抗原(CEA)特异性CAR-T细胞联合使用的抗肿瘤作用。我们用单一和多重免疫组化、原位杂交、单细胞RNA测序、反相蛋白阵列和延时荧光显微镜评估切片培养。

结果αIL-10在人CRLM切片培养中使T细胞介导的癌细胞死亡增加1.8倍。αIL-10显著增加CD8的比例+T细胞无衰竭转录改变，巨噬细胞人白细胞抗原-DR同型(HLA-DR)表达增加。αIL-10的抗肿瘤作用被主要组织相容性复合体I或II类(MHC-I或MHC-II)阻断逆转，证实了抗原提呈细胞的重要作用。中断IL-10信号通路也能从骨髓细胞介导的免疫抑制中拯救小鼠CAR-T细胞增殖和细胞毒性。在人类CRLM切片中，αIL-10增加了cea特异性CAR-T细胞的活化和CAR-T细胞介导的细胞毒性，在多种人类肿瘤中近70%的癌细胞凋亡。IL-10受体阻断抗体预处理也增强了CAR-T功能。

结论中和IL-10在人CRLM中的作用具有作为独立治疗的治疗潜力，并增强过继转移CAR-T细胞的功能。

  • 免疫学
  • 大肠癌转移
  • 白细胞介素
  • 免疫疗法
  • 肝转移

数据可用性声明

数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。我们的RNA测序和单细胞RNAseq的数据已经保存，可在https://doi.org/10.5061/dryad.0cfxpnw54．

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325808

数据来自Altmetric.com

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    关于这个话题我们已经知道了什么

    • 尽管有证据表明免疫系统在肿瘤发展和进展中发挥作用，但免疫治疗尚未证明对转移性微卫星稳定型(MSS)结直肠癌患者有实质性的益处。虽然白介素10 (IL-10)主要被认为是一种免疫抑制细胞因子，但其在晚期胃肠道恶性肿瘤中的作用尚不清楚。人类肿瘤切片培养模型可作为治疗药物对肿瘤微环境(TME)影响的准确预测指标。在结直肠癌肝转移(CRLM)小鼠模型中，骨髓细胞具有免疫抑制作用，并抑制抗癌胚胎抗原嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞的活性。

    这项研究补充了什么

    • 在CRLM中，IL-10由巨噬细胞、T细胞和肿瘤细胞产生。在人类CRLM模型中，IL-10阻断剂克服了免疫抑制性TME，并重新激活内源性抗肿瘤免疫，产生了近两倍的癌细胞死亡。IL-10阻断显著增强CAR-T细胞体外和人CRLM切片培养的细胞毒性。

    这项研究如何影响研究、实践或政策

    • IL-10是CRLM患者需要克服的主要免疫抑制信号。靶向IL-10/IL-10受体信号转导有很大的潜力被纳入免疫检查点阻塞抵抗(MSS CRLM)患者的全身治疗。CAR-T细胞对抗IL-10的抑制，可能为对目前可用的手术和药物治疗无效的MSS CRLM患者提供更有效的过继细胞治疗铺平道路。

    简介

    结直肠癌(CRC)是美国癌症相关死亡的第三大常见原因。125%-30%的CRC患者发生肝转移，切除组的5年总生存率(OS)为49%，而姑息性化疗组仅为2.2%。CRC肝转移(CRLM)的深远影响被以下事实所突出:患有孤立性肝转移的CRC患者的生存期明显低于患有孤立性肺转移的CRC患者。2

    程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)阻断免疫检查点抑制(ICI)在微卫星不稳定性高(MSI-H) CRC患者中是有效的，但这只代表了不到5%的局部晚期或转移性CRC患者。3.在所有结直肠癌患者中，检查点阻断的客观有效率低于5%。4 - 7而肿瘤浸润淋巴细胞与预后相关。免疫评分，对CD3进行分级+和CD8+CRLM内T细胞密度与更好的预后相关，8高调节性T细胞(Treg细胞)浸润与较短的OS相关。9肿瘤相关巨噬细胞(tam)的密度和形态与CRLM患者的生存相关。10 11尽管目前批准的免疫疗法缺乏成功，但调节免疫细胞浸润CRLM仍然是一种引人注目的潜在治疗方法。

    另一种免疫治疗方法是过继转移嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞，但CRLM肿瘤微环境(TME)的几个方面限制了CAR-T细胞的疗效。12在一项抗癌胚胎抗原(CEA) CAR-T细胞用于其他治疗进展的CRLM患者的I期临床试验中，10例患者中有7例表现出稳定的疾病，没有严重的不良反应。13经肝动脉输注的抗cea CAR-T I期试验显示，6例患者中有1例病情稳定，6例患者中有4例肿瘤坏死或纤维化，无3级或4级不良事件。14在小鼠肝脏免疫TME的研究中，骨髓细胞通过信号传感器和转录因子3激活剂(STAT3)介导的吲哚胺2,3-脱氧酶(IDO)和程序性死亡配体1 (PD-L1)的表达抑制抗肿瘤免疫，当小鼠骨髓细胞耗尽时，CAR-T的疗效可以恢复。15日16特定器官TME对肿瘤免疫功能的影响可以通过以下发现得到证明:肝转移灶中的骨髓细胞比从肺转移灶中分离出来的骨髓细胞具有更强的免疫抑制作用。17重要的是，肝脏特异性骨髓细胞功能程序在转移到肺组织时是可逆的，这表明免疫抑制肝TAMs的再极化是一种新的治疗方法。

    白介素10 (IL-10)通过与其同源受体(IL-10R)相互作用和下游激活STAT3途径具有广泛的免疫抑制功能。通常，IL-10抑制抗原呈递细胞(APCs)导致T细胞抑制，除了直接导致CD4+T细胞无能。18包括IL-10在内的多种免疫抑制信号支持肝脏中的免疫耐受偏向，这允许对食物中抗原的免疫沉默。19在包括CRC在内的非血液学恶性肿瘤中，血清IL-10水平高与晚期、生存率差或复发率高相关。20 21在小鼠乳腺癌模型中，巨噬细胞中的IL-10抑制树突状细胞(DC) IL-12的分泌以消除CD8+T细胞反应。22在小鼠CRC模型中，瘤内注射编码il -10沉默短发夹RNA (shRNA)的慢病毒载体可降低肿瘤生长。23相反，一些研究表明IL-10的有益作用包括增加CD8+细胞浸润和TME中干扰素释放增加。能力然而，使用聚乙二醇化IL-10治疗的临床试验并没有显示出对患者的益处。31日32最近对IL-10配体/受体活性结构的定义提出了以细胞类型特异性的方式靶向IL-10/IL-10R轴的新方法。33

    肿瘤切片培养(TSC)允许在原生三维(3D)实体肿瘤结构和细胞群的背景下评估免疫细胞功能。我们的实验室已经证明TME在人TSC中保持完整并可存活1-2周34-36在免疫排除的实体肿瘤如胰腺腺癌中，抗肿瘤免疫可以增强。37值得注意的是，在TSC中，联合抑制CXCR4/PD-1可以改善细胞毒性T细胞向癌细胞的迁移，在这些疗法的临床试验中，这种效果反映在患者的肿瘤中。38由于IL-10对抗肿瘤免疫功能的影响仍存在争议，我们利用人类TSC系统来研究IL-10在人类CRLM中的作用。我们证实了IL-10的抑制作用，并证明IL-10阻断显著增强了异质人群CRLM肿瘤内源性和过继转移T细胞的抗肿瘤功能。

    材料与方法

    道德声明

    所有调查都是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的。切片培养的样本来自接受CRLM肝切除术的患者，这些患者根据研究方案(no. 2)提供了事先书面知情同意。1852年)由华盛顿大学机构审查委员会批准。

    患者和公众参与

    患者自愿同意使用他们的肿瘤标本。患者未参与研究设计、实施、报告或传播计划。

    癌症基因组图谱(TCGA)分析

    IL10使用UCSC Xena网络工具导出TCGA泛癌症队列的RNA表达和疾病特异性生存(DSS)数据。39仅结肠腺癌(COAD)原发肿瘤被纳入生存分析，重复样本被排除。使用Python生命线(v0.26.0)包生成68% ci的Kaplan-Meier DSS曲线。

    肿瘤切片培养

    如前所述，对新切除的人CRLM肿瘤进行切片培养。35-37 40更多细节和治疗抗体数据可在在线补充表S1．切片培养用每个处理抗体20µg/mL处理。

    原位杂交(ISH)和多色免疫组化(mIHC)

    详细描述的ISH和mIHC，试剂和抗体使用在线补充表S2．玻片用Leica SP8X共聚焦显微镜(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)成像。图像上的核重叠区域使用IMARIS (Bitplane USA)和Flowjo (Beckton Dickinson)进行分析。

    反相蛋白阵列(RPPA)

    蛋白质微阵列如前所述被打印和处理。41 42用Licor Odyssey CLX扫描仪(Licor)扫描载玻片。总信号强度归一化为总β -肌动蛋白(Sigma，目录号A1978)，并使用Array-Pro分析软件包(Media Cybernetics, Maryland, USA)进行量化。

    末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记

    clickit Plus TUNEL Assay for In Situ Apoptosis Alexa Fluor 488染色试剂盒(C10617, ThermoFisher)根据制造商说明使用。切片用Leica SP8X共聚焦显微镜成像。在背景强度相减后，利用斑点共定位功能在IMARIS中自动计数总核和共定位。

    免疫组织化学(包含IHC)

    免疫组化步骤的详细描述，使用的试剂和主要的免疫组化抗体可在在线补充表S3．横切切片以20倍成像，以显示切片的整个厚度。将切片数字扫描至NanoZoomer Digital Pathology (Hamamatsu)图像查看软件。使用Fiji ImageJ软件，在每个患者肿瘤的每次治疗的至少两个不同切片的至少两个高倍场(hpf)上，可视化地计数带有苏木素染色细胞核的3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB)阳性细胞。

    RNA序列

    切片处理和RNA提取使用Qiagen RNeasy试剂盒根据制造商的协议。在样品通过质量控制后，使用西北基因组学中心的下一代测序核心设备进行RNA测序。样本作为标准化的细胞计数提供给管家基因。这些数据已被保存，并向公众开放。43

    单细胞RNA测序(scRNAseq)

    ScRNAseq首先从新鲜肿瘤组织中分离未经处理的切片。接下来，用对照或IL-10阻断抗体处理的切片分离。去除死细胞，制备单细胞悬液后，进行10×液滴测序。每个步骤的详细信息和统计分析可在在线补充资料．scRNAseq数据已经保存，也可以使用。43

    小鼠肝转移(LM)体内模型和骨髓细胞分离

    从杰克逊实验室获得的C57BL/6雄性小鼠(6 - 8周龄)在罗杰威廉姆斯医学中心(RWMC)动物设施中在无病原体条件下繁殖和饲养。所有的外科手术都得到了RWMC机构动物护理和使用委员会第19-2904号议定书的批准。为了产生LM，小鼠被麻醉并注射2.5×106细胞经脾，然后脾切除术。如前所述，从LM中分离出肿瘤生成后4天的肝脏非实质细胞。15抗CD11b的免疫磁珠被用于纯化肝髓细胞(Miltenyi Biotech)。详情见在线补充资料．

    CAR-T生成、增殖和细胞毒性试验

    使用Sorrento和TNK Therapeutics提供的结构，如前所述，从小鼠脾细胞中生成CAR-T细胞44MC38CEA细胞作为靶细胞。从LM荷瘤小鼠肝脏中分离骨髓细胞。CAR-T细胞采用羧荧光素二乙酸丁二酰酯(CFSE, Life Technologies)，按照制造商的方案进行标记。MC38CEA细胞镀于2×104以骨髓细胞和CAR-T细胞以1:1:1的比例作为对照。用100、200或400 ng/mL的抗il -10抗体(JES5-2A5, bilegend)处理细胞。按照制造商的规程(Promega)收集上清液并分析乳酸脱氢酶。用于流式细胞术的抗体在在线补充表S4．使用Cytoflex LX (Beckman Coulter)收集细胞进行分析，采集后使用FlowJo软件进行分析。

    实时成像

    CAR-T细胞用CFSE染色。将100万个未转导的对照或抗cea CAR-T细胞加入与IgG抗体对照或抗IL-10抗体(IL-10)培养的切片中，并在成像前孵育1天。或者，将CAR-T细胞解冻并与20µg/mL对照或抗IL-10R抗体(IL-10R)孵育过夜。然后将预处理过的CAR-T细胞染色，直接放入CRLM组织切片培养基中，不进行额外处理，在成像前孵育1天。在徕卡SP8X共聚焦显微镜上进行活荧光显微镜。37个40采用徕卡LAS X软件和IMARIS软件进行图像处理和数据分析。所有EpCAM+, CFSE+, SR-FLICA+在每个位置成像的整个时间内人工计数细胞。

    流式细胞术

    CAR-T细胞用CFSE染色。然后用对照或抗原特异性CAR-T细胞(含或不含IL-10)处理TSC切片，并在培养后处理1天，将切片消化成细胞悬液。然后用荧光团标记的CD69和CD25 (在线补充表S4)，流式细胞仪检测。在LSR2和Symphony流式细胞仪(Beckton Dickinson)上进行流式分析。

    统计分析

    第1、4项TCGA分析有统计学意义IL10表达式四分位数计算使用Xena网络工具的实现对数秩检验。数据输入和分析使用Prism (GraphPad, La Jolla, California, USA)。所有其他实验均采用学生t检验、配对t检验或单因素方差分析与多重比较。p<0.05为有统计学意义。详情见在线补充资料．

    结果

    患者与肿瘤特征

    我们从38例CRLM患者个体中生成TSC (表1)．在31例病例中进行了微卫星不稳定性测试，在所有可用病例中发现肿瘤为微卫星稳定(MSS)。所有使用抗CEA CAR-T细胞治疗的肿瘤均来自血清CEA大于2 ng/mL的患者。

    查看该表:
    表1

    研究患者和肿瘤样本的特征(n=38)

    IL-10阻断可诱导对PD-1阻断无效的人CRLM切片培养的癌细胞死亡

    TCGA Pan-Cancer数据集分析显示其升高IL10COAD患者5年DSS较差(在线补充图S1)．相比之下，转录水平PDCD1而且HACVR2,分别编码t细胞共抑制受体PD-1和t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3 (TIM-3)，与DSS无关(在线补充图S1)．为了确定在CRLM中产生IL-10并对其产生反应的细胞类型，我们对来自三个不同患者的新鲜、未经处理的CRLM样本进行了单细胞RNA测序(scRNAseq)。免疫细胞，定义为高表达的群集PTPRC编码CD45的细胞平均占所有细胞的11.1%(3个病例的范围为4.2%-31.4%)。这种免疫细胞群主要由巨噬细胞组成，两者都有一个高簇CD68而且CD163表达(5.5%的所有细胞，56.7%的免疫细胞)，和CD3表达T细胞(占所有细胞的3.3%，占免疫细胞的33.9%)(图1一个)．在CRLM肿瘤中发现的T细胞中，大多数是辅助性T细胞(Th)或细胞毒性T细胞，少数是Treg细胞(图1 b)．B细胞表达CD79A和树突状细胞加起来占所有细胞的比例不到0.3%，占免疫细胞的比例不到3.4% (图1一个)．

    Interleukin 10 (IL-10) is produced by carcinoma cells, macrophages and T cells. (A) UMAP plots of all cell clusters of single cell RNA sequencing (scRNAseq) data from n=3 colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumours. TAM, tumour-associated macrophages (purple); CAF, cancer-associated fibroblasts (orange); B cells (blue); liver-like cells (green); T cells (red); tumour cells (brown). IL10 and IL10RA expression highlighted in red/orange. (B) UMAP plots of T cell cluster of scRNAseq data from n=3 CRCLM tumours. Th, helper T cells (blue); Ttox, cytotoxic T cells (green); Treg, regulatory T cells (orange). IL10 and IL10RA expression highlighted in red/orange. (C) Multiplex immunohistochemistry was performed for T cells (CD3, green), macrophages (CD68/CD163, pink) and nuclei (DAPI, blue) with additional in situ hybridisation for IL10 (red) and IL10RA (white). A representative image with IL10+ IL10RA+macrophage (white arrowhead) and IL10+ IL10RA+T cell (white arrow) is shown. Quantification of the proportion of IL10+ and IL10+ cells within each cell type is also shown (n=5 patient tumours). Scale bar=30 µm. Data points represent each human tumour sample.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    白细胞介素10 (IL-10)由癌细胞、巨噬细胞和T细胞产生。(A) n=3个结直肠癌肝转移瘤(CRLM)的单细胞RNA测序(scRNAseq)数据的所有细胞簇的UMAP图。TAM，肿瘤相关巨噬细胞(紫色);CAF，癌症相关成纤维细胞(橙色);B细胞(蓝色);肝样细胞(绿色);T细胞(红色);肿瘤细胞(棕色)。IL10而且IL10RA用红色/橙色突出显示的表达式。(B)来自n=3个CRCLM肿瘤的scRNAseq数据的T细胞集群UMAP图。Th，辅助T细胞(蓝色);Ttox，细胞毒性T细胞(绿色);Treg，调节性T细胞(橙色)。IL10而且IL10RA用红色/橙色突出显示的表达式。(C)对T细胞(CD3，绿色)、巨噬细胞(CD68/CD163，粉红色)和细胞核(DAPI，蓝色)进行多重免疫组化，并进行原位杂交IL10(红色)和IL10RA(白色)。具有代表性的图像IL10+IL10RA+巨噬细胞(白色箭头)和IL10+IL10RA+T细胞(白色箭头)。量化的比例IL10+而且IL10+每种细胞类型内的细胞也显示出来(n=5例患者肿瘤)。比例尺=30µm。数据点代表每个人类肿瘤样本。

    对scRNAseq数据集的分析表明，虽然IL-10的可检测RNA表达主要局限于TAM簇，但IL-10的表达较少，但仍可检测到IL10在Th簇中，IL-10受体基因(IL10RA)在T细胞和TAMs中均高表达(图1 a, B)．考虑到通过scRNAseq可靠地识别转录本所需的相对较高的表达，我们接下来试图使用更敏感的多路原位杂交(mISH)平台来确认这些结果。我们检查了IL10而且IL10RA癌细胞(EpCAM)、T细胞(CD3)和巨噬细胞(CD68/CD163)同时染色的CRLM切片中基因表达(n=6)。这个mISH确认的表达IL10在30.9%的巨噬细胞中，除了在25.6%的T细胞和19.3%的癌细胞中相对低水平的转录物表达外(图1 c)．与单细胞数据一样，通过mISHIL10RA在TAM细胞(25.0%)和T细胞(14.9%)中均有稳定表达，在癌细胞(3.1%)中很少有表达。图1 c)．

    利用我们的人类TSC实验系统，我们接下来的目标是研究IL-10和PD-1阻断在CRLM中的作用。与临床试验结果一致，45与对照组相比，抗pd -1在四个单独的人CRLM切片培养中没有增加肿瘤凋亡(图2 a, B)．给定之间的逆相关IL10我们推测瘤内IL-10抑制有效的抗肿瘤免疫反应。我们首次证实，添加IL-10中和单克隆抗体(αIL-10)可以显著降低CRLM切片培养上清液中IL-10蛋白的含量，从8.5 pg/mL降至0.39 pg/mL (n=5，在线补充图S2A)．在32例独特的CRLM患者的TSCs中，αIL-10引起了剧烈的肿瘤坏死(图2一个)，导致凋亡比对照组增加1.8倍(中位数为51.3% vs 29.1%的Caspase-3裂解+细胞,p < 0.0001;图2 c)．Cleaved Caspase-3与EpCAM(一种上皮标记物)共定位，证实凋亡主要发生在癌细胞中，癌细胞构成了CRLM内的大部分细胞(在线补充图S2B)．当我们通过RPPA评估αIL-10和对照处理的肿瘤切片中切割Caspase-3蛋白表达时，我们发现αIL-10诱导的肿瘤凋亡的幅度相似(平均相对信号强度2.1 vs 1.1 a.u。， n=3例，p=0.015;图2 d)和TUNEL(中位数38.8% vs TUNEL 20.3%+总核数n=4例，p<0.001;图2 e)．总之，这些结果证明了IL-10阻断剂在人CRLM TSC模型中诱导肿瘤特异性凋亡的能力。

    Interleukin 10 (IL-10) blockade facilitates significantly increased apoptosis of carcinoma cells. (A) Immunohistochemistry (IHC) for cleaved Caspase-3 was performed on tumour slice culture (TSC) after 6 days of treatment with immunomodulating agents. Representative images at 20x magnification from day 0, and then day 6 of antibody control, anti-programmed cell death protein-1 (anti-PD-1) antibody and ⍺IL-10 treated slices. Black arrows denote apoptotic cells positive for cleaved Caspase-3 (brown). Scale bar=50 µm. (B) Quantification of percentage of cleaved Caspase-3+ cells in slices treated with control or anti-PD-1 antibody (n=4 separate human cases with at least two slices per case). (C) Quantification of percentage of cleaved Caspase-3+ cells in slices treated with control or ⍺IL-10 (n=32 separate human cases with at least two slices per case). Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple high-powered fields (hpf) in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. Student’s t-test. ****p<0.0001. (D) Reverse phase protein array with relative signal intensity of total cleaved Caspase-3 in colorectal cancer liver metastases TSC after 6 days in culture with αIL-10 (n=4 cases). Student’s t-test. *p<0.05. (E) Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining with fluorescent microscopy demonstrating TUNEL+ cells (green) after 6 days of αIL-10 (n=4 separate human cases). Scale bar=30 µm. Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple hpf in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. Student’s t-test. ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    白细胞介素10 (IL-10)阻断可显著促进癌细胞凋亡。(A)用免疫调节剂治疗6天后，在肿瘤切片培养(TSC)上进行裂解Caspase-3的免疫组化(IHC)。第0天和第6天的抗体对照、抗程序性细胞死亡蛋白-1(抗pd -1)抗体和⍺IL-10处理切片的代表图像，放大20倍。黑色箭头表示裂解Caspase-3阳性的凋亡细胞(棕色)。比例尺=50µm。(B) Caspase-3裂解百分比的定量+用对照或抗pd -1抗体处理的切片细胞(n=4个独立的人类病例，每个病例至少两片)。(C) Caspase-3裂解百分比的定量+用对照或⍺IL-10处理的切片细胞(n=32个独立的人类病例，每个病例至少两片)。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个高能场(hpf)计数组成，以说明瘤内异质性。学生的学习任务。* * * * p < 0.0001。(D)与αIL-10培养6天后，结直肠癌肝转移性TSC中总裂解Caspase-3相对信号强度的反相蛋白阵列(n=4例)。学生的学习任务。* p < 0.05。(E)末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)荧光显微镜染色显示TUNEL+细胞(绿色)后6天αIL-10 (n=4个独立的人类病例)。比例尺=30µm。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个hpf计数组成，以说明瘤内异质性。学生的学习任务。* * * p < 0.001。

    IL-10阻断介导的人CRLM细胞死亡是免疫激活的结果

    鉴于IL-10阻断剂在我们的人类CRLM TSC模型中特异性增加肿瘤细胞死亡的能力，我们假设在CRLM中IL-10阻断剂促进了TME中炎性抗肿瘤免疫反应的转变。为了进一步探索这一假设，我们首先量化了每个用对照抗体或IL-10阻断剂处理的TSC中免疫细胞的存在。我们发现CD163的频率+巨噬细胞无明显差异(p＝0.17)对照组与αIL-10治疗肿瘤(图3一)，但HLA-DR的数量有所增加+细胞(中位数19.5% vs 11.5%， n=5例，p=0.02;图3 b)．

    Increased CD8+ T-cell population and inflammatory immune microenvironment occurs after interleukin 10 (IL-10) blockade. (A) Representative images at 20x magnification from IHC staining for CD163 of fixed TSC treated with control or αIL-10 after 4 days and quantification by cell count of CD163+ cells (n=5 separate human tumours). Scale bar=50 µm. Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple hpf in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. Not significant by Student’s t-test. (B) Representative images at 20x magnification from IHC of fixed TSC treated with control or αIL-10 after 4 days, with black arrows denoting HLA-DR+ cells, and quantification by cell count of HLA-DR+ cells (n=5 separate human tumours). Scale bar=50 µm. Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple hpf in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. Student’s t-test. *p<0.05. (C) Representative images at 20x magnification from IHC of fixed TSC treated with control or αIL-10 after 4 days, with black arrows denoting CD4+ cells, and quantification by cell count of CD4+ cells (n=7 separate human tumours). Scale bar=50 µm. Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple hpf in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. (D) Representative images at 20x magnification from IHC of fixed TSC treated with control or αIL-10 after 4 days, with black arrows denoting CD8+ cells. Quantification by cell count of CD8+ cells (n=5 separate human tumours). Scale bar=50 µm. Data points represent each human tumour sample which consists of counts over multiple hpf in multiple slices to account for intratumoral heterogeneity. Student’s t-test. *p<0.05. (E) Multiplex IHC was performed for T cells (CD3, red), carcinoma cells (EpCAM, green) and nuclei (DAPI, blue) with additional in situ hybridisation for IFNG (white). Quantification of proportion of IFNG+ per total number of cells by ISH and by IHC are also shown (n=6 patient tumours). Scale bar=50 µm. Data points represent each human tumour sample. Student’s t-test. *p<0.05. (F) RPPA data from slices treated with antibody control or IL-10 blockade showing downregulation of various molecular pathways. (G) Quantification of percentage of cleaved Caspase-3+ cells following αIL-10 with or without MHC blockade shows that while αIL-10 alone increases apoptotic cell proportion, the effect is reversible with MHC blockade back to below baseline levels of cell death. Representative data with data points representing a slice from one human tumour experiment, repeated in a total of three human tumour samples with similar results. Error bars display SEM. ANOVA with multiple comparisons. **p<0.01, ****p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    增加CD8+白细胞介素10 (IL-10)阻断后，t细胞群体和炎症免疫微环境发生变化。(A)用对照组或αIL-10处理的固定TSC 4天后免疫组化染色CD163的20倍放大的代表性图像，并通过CD163的细胞计数进行量化+细胞(n=5个独立的人类肿瘤)。比例尺=50µm。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个hpf计数组成，以说明瘤内异质性。学生t检验不显著。(B) 4天后用对照或αIL-10处理的固定TSC的IHC 20倍放大代表性图像，黑色箭头表示HLA-DR+HLA-DR细胞计数定量+细胞(n=5个独立的人类肿瘤)。比例尺=50µm。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个hpf计数组成，以说明瘤内异质性。学生的学习任务。* p < 0.05。(C) 4天后用对照或αIL-10处理的固定TSC的IHC 20倍放大代表性图像，黑色箭头表示CD4+细胞计数，CD4细胞计数定量+细胞(n=7个独立的人类肿瘤)。比例尺=50µm。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个hpf计数组成，以说明瘤内异质性。(D) 4天后用对照或αIL-10处理的固定TSC的IHC 20倍放大代表性图像，黑色箭头表示CD8+细胞。CD8细胞计数定量+细胞(n=5个独立的人类肿瘤)。比例尺=50µm。数据点代表每个人类肿瘤样本，由多个切片上的多个hpf计数组成，以说明瘤内异质性。学生的学习任务。* p < 0.05。(E)对T细胞(CD3，红色)、癌细胞(EpCAM，绿色)和细胞核(DAPI，蓝色)进行多重免疫组化，并进行原位杂交IFNG(白色)。的比例量化IFNG+ISH和IHC也显示了每总细胞数(n=6例患者肿瘤)。比例尺=50µm。数据点代表每个人类肿瘤样本。学生的学习任务。* p < 0.05。(F)抗体对照或IL-10阻断处理切片的RPPA数据显示各种分子通路下调。(G) Caspase-3裂解百分比的定量+在MHC阻断或不阻断αIL-10后的细胞中，虽然αIL-10单独增加了细胞凋亡比例，但MHC阻断后细胞死亡水平恢复到基线以下时，该效应是可逆的。代表性数据，数据点代表来自一个人类肿瘤实验的切片，在总共三个人类肿瘤样本中重复，得到类似的结果。误差条显示SEM。多重比较的方差分析。* * * * * p < 0.01, p < 0.0001。

    而αIL-10对CD4无明显影响+小区频率(图3 c)， αIL-10使肿瘤内CD8的频率增加了一倍+细胞与对照组比较(中位数17.8% vs 7.0%， n=5, p=0.02;图3 d)．同样，αIL-10增加了免疫刺激细胞因子干扰素γ的基因表达，IFNG，归一化为第2-5天的总细胞数(中位数分别为2.9% vs 2.3% p<0.05, n=6;图3 e)和总颗粒酶B无统计学意义的增加(平均2.3%颗粒酶B阳性组织面积vs 1.2%， n=6, p=0.13;在线补充图S2D)．虽然PD-1确实可以作为t细胞在长时间(大于1周)抗原刺激后衰竭的标志，46我们在TSC模型中检测了其2-5天后的表达，以识别可能正在进行克隆扩增的早期激活T细胞。47 48我们发现CD3有非统计学意义的增加+α il -10处理的切片中PD-1的t细胞表达(p=0.08;在线补充图S2D)，表明向激活或克隆扩展表型的转变。

    为了进一步了解IL-10阻断对免疫TME的影响，我们在连续三个时间点(第1、2和3天)对两个个体患者的αIL-10和对照处理的人CRLM TSCs进行scRNAseq。我们在总共6个生物重复中捕获了大约7300个细胞。虽然不显著，但我们发现激活签名(CD69，FASLG，CD27，CD28，TNFRSF9，TNFRSF4，LAMP1，加工，TBX21) CD4和+和CD8+在三个检测时间点，α il -10处理的样本中T细胞含量高于对照组(在线补充图S3A,B)．重要的是，T细胞衰竭特征没有观察到这种趋势(PDCD1，CTLA4，HAVCR2，TIGIT，LAG3)处理过的和未处理的样本(在线补充图S3C)．我们还观察到TAMs中MHC-II表达反应组通路基因的无显著上调(在线补充图S3D)，这与我们之前的免疫组化研究结果(图3 a, B)．在连续IHC染色中，HLA-DR和CD163共定位(n=4;在线补充图S2C)，这些结果共同强烈表明IL-10阻断增加巨噬细胞MHC-II的表达，从而激活巨噬细胞。这些发现提示IL-10阻断诱导的抗肿瘤免疫反应是由CD8频率的增加介导的+细胞毒性T细胞和同步免疫刺激极化TAMs。

    接下来，我们试图确认这两种直接CD8的作用+细胞毒性T细胞活性和间接CD4+αIL-10抗肿瘤反应中的辅助T细胞和TAM活性。为此，我们在存在或不存在抗体介导的MHC I类或II类阻断的情况下，用αIL-10治疗CRLM肿瘤。我们发现阻断细胞毒性T细胞抗原识别所需的MHC-I可以逆转IL-10阻断癌细胞凋亡的作用，这证实了我们的假设。此外，CD4还需要阻断MHC-II+T细胞和TAM抗原的呈递，同样完全独立地消除了αIL-10的影响(图3 g)．也就是说，这些结果直接证明了MHC-I和MHC-II通路对于IL-10阻断介导的抗肿瘤免疫应答是必要的，但不一定是充分的。总之，我们的研究结果表明，IL-10阻断人类CRLM TSC诱导并需要经典的抗肿瘤免疫反应，包括细胞毒性T细胞和apc的激活。

    小鼠骨髓细胞来源的IL-10可逆地抑制CAR-T细胞增殖

    我们先前在CRLM小鼠模型中证明，髓系细胞以stat -3依赖的方式抑制炎症和CAR-T细胞功能。15日16基于我们目前关于⍺IL-10对CRLM TME中原生免疫细胞的影响的研究结果，我们假设肿瘤相关的髓系细胞通过分泌IL-10并在邻近的CAR-T细胞中引起下游IL-10R/STAT3信号通路来抑制CAR-T细胞。通过流式细胞术，我们发现37.4%的小鼠髓系细胞表达IL-10，而很少有T细胞产生IL-10 (图4一)．此外，多重免疫荧光成像证实了IL-10的存在+CD11b+GR1一起+骨髓来源的抑制细胞和IL-10RA+CD3+T细胞(图4 b)．加入髓系细胞共培养抗cea CAR-T细胞和表达cea的癌细胞后，CAR-T细胞的增殖能力显著降低，从50.3%降至29.3% (图4 c)．然而，当CAR-T细胞、癌细胞和髓系细胞共培养时，CAR-T细胞的增殖以剂量依赖的方式恢复(增殖39.7%-45.9%，n=4, p<0.01;图4 c)．髓细胞还具有抑制CAR-T细胞的细胞毒活性的能力。重要的是，与其对CAR-T增殖的影响一样，在共培养体系中加入αIL-10可以逆转髓系细胞对肿瘤细胞毒性的抑制作用(p<0.001;图4 d)．因此，我们的研究结果表明，骨髓细胞对抗cea CAR-T细胞增殖和细胞毒性的抑制可以通过IL-10的抗体中和而逆转。

    Treatment with interleukin 10 (IL-10) antibody reverses murine myeloid cell suppressive activity of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells. (A) Phenotypic characterisation of CAR-T cells and CD11b+ cells isolated 4 days post-tumour generation was performed as per the gating strategy. Representative flow cytometry plots showing expression of IL-10 and IL-10R for myeloid cells (n=7) and CAR-T (n=4). (B) Immunofluorescence performed on CAR-T and myeloid cells confirmed expression of IL-10 (green) in myeloid cells and IL-10R (green) on CAR-T cells. (C) Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)-labelled CAR-T (C) cells were cocultured with myeloid cells (M) isolated from liver metastases (LM) tumour-bearing mice and MC38CEA tumour cells (T) in 1:1:1 ratio. Cells were treated with 100 ng/mL or 200 ng/mL or 400 ng/mL anti-IL-10 antibody for 24 hours. *p<0.005 versus untreated (T+C), **p<0.01 versus untreated (T+C+M). (D) The in vitro cytotoxic activity of CAR-T (C) cells was evaluated by incubating MC38CEA (T) cells with myeloid cells (M) treated with at a 1:1:1 ratio as shown in C. Corresponding tumour and CAR-T controls were used for the assay. *p<0.0001 versus T+C, **p<0.001 versus untreated T+C+M. All data were analysed by one-way analysis of variance and Tukey’s test or two-sided Student’s t-test.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    用白细胞介素10 (IL-10)抗体治疗逆转嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞的小鼠骨髓细胞抑制活性。(A) CAR-T细胞和CD11b的表型特征+按照门控策略，在肿瘤生成后4天分离细胞。典型的流式细胞术图显示髓系细胞(n=7)和CAR-T细胞(n=4)中IL-10和IL-10R的表达。(B)对CAR-T和髓细胞进行免疫荧光检测，证实髓细胞中IL-10(绿色)和CAR-T细胞中IL-10R(绿色)的表达。(C)羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚酯(CFSE)标记的CAR-T (C)细胞与分离自肝转移瘤(LM)小鼠的髓样细胞(M)和MC38CEA肿瘤细胞(T)以1:1:1的比例共培养。分别用100 ng/mL或200 ng/mL或400 ng/mL抗il -10抗体处理细胞24小时。*p<0.005 (T+C)， **p<0.01 (T+C+M)。(D) CAR-T (C)细胞的体外细胞毒活性通过将MC38CEA (T)细胞与髓系细胞(M)按1:1:1的比例孵育来评估，如C所示。*p<0.0001与T+C相比，**p<0.001与未经治疗的T+C+M相比。所有数据均采用单向方差分析和Tukey检验或双侧Student 's t检验进行分析。

    IL-10阻断促进car - t介导的肿瘤细胞死亡

    基于我们在小鼠CRLM中的结果，我们假设αIL-10也可以增强cea特异性CAR-T细胞在人CRLM中的细胞毒性。我们之前证明了活体共聚焦显微镜在人PDA切片培养中显示T细胞靶向治疗早期效果的能力。37我们首先证实CAR-T细胞在1天后充分迁移到肿瘤切片(图5一个)．然后，我们使用实时成像来评估αIL-10或对照存在时CAR-T的功能。cea特异性CAR-T细胞表现出低(平均30.1%)的基础迁移到靶细胞(由EpCAM定义)+CFSE电池+CAR-T细胞在20µm范围内)，添加αIL-10后增强(平均82.5%，n=3个单独的CRLM肿瘤，p<0.001;图5 b)．此外，与αIL-10相比，对照组或抗原特异性CAR-T细胞的抗肿瘤活性较低(67.2% vs 15.6%-26.6% SR-FLICA)+EpCAM+细胞，n=3例，p<0.03;图5 c)．为了确定癌细胞死亡的增加是否由CAR-T细胞介导，而不是其他类型的细胞，我们专门评估了与CAR-T细胞相邻的癌细胞亚群。我们发现了58.2%的EpCAM+与cea CAR-T细胞相邻的细胞为SR-FLICA+而在EpCAM中只有18.7%的细胞有这种反应+在缺乏αIL-10的情况下，用抗cea CAR-T细胞处理的细胞(p=0.007, n=3个独立的人CRLM肿瘤;图5 d)．此外，SR-FLICA的比例无差异+EpCAM+不与CFSE相邻的单元格+CAR-T细胞。总之，这些结果表明IL-10在人和小鼠的CRLM中都抑制肿瘤特异性CAR-T功能。

    Interleukin 10 (IL-10) blockade enhances chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell migration and tumour apoptosis. (A) Live staining and fluorescent microscopy of colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumour slice culture (TSC) treated with untransduced CAR-T with control, untransduced CAR-T with ⍺IL-10, anti-carcinoembryonic antigen (CEA) CAR-T with control, and anti-CEA CAR-T with ⍺IL-10 show CFSE+ CAR-T cells (green) within the tumour and near epithelial carcinoma cells (red) when antigen-specific CAR-T are used in combination with αIL-10. Apoptotic cells are shown when activated cleaved Caspases are present and positive for the SR-FLICA reagent (cyan). Tumour slices were imaged after 1 day of treatment. Scale bar=100 µm. (B) Quantification of the carcinoma cells with a CAR-T cell nearby (defined as within 20 µm) with untransduced control CAR-T cells and anti-CEA CAR-T cells treated concurrently with or without αIL-10. Data points represent each high-powered fields (hpf) area imaged, with 3 hpf imaged in each tumour (n=3 separate human tumour samples). Analysis of variance with multiple comparisons. ***p<0.001. (C,D) Quantification of the percentage of total carcinoma cells that are SR-FLICA+, and SR-FLICA+ carcinoma cells with a CAR-T cell nearby (defined as within 20 µm) after untransduced control CAR-T and anti-CEA CAR-T cells are treated concurrently with or without αIL-10. Data points represent each hpf area imaged, with 3 hpf imaged in each tumour (n=3 separate human tumour samples). Analysis of variance with multiple comparisons. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    白细胞介素10 (IL-10)阻断剂增强嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞迁移和肿瘤凋亡。(A)用未转导CAR-T处理的结直肠癌肝转移(CRLM)肿瘤切片培养(TSC)与对照、未转导CAR-T与⍺IL-10、抗癌胚抗原(CEA) CAR-T与对照、抗CEA CAR-T与⍺IL-10的活体染色和荧光显微镜显示CFSE+当抗原特异性CAR-T与αIL-10联合使用时，肿瘤内的CAR-T细胞(绿色)和附近的上皮癌细胞(红色)。当激活的裂解Caspases存在并且SR-FLICA试剂(青色)呈阳性时，凋亡细胞显示。治疗1天后，对肿瘤切片进行成像。比例尺bar=100µm。(B)用未转导的对照CAR-T细胞和anti-CEA CAR-T细胞与αIL-10同时或不同时处理，对附近有CAR-T细胞(定义为20µm内)的癌细胞进行定量。数据点代表每个成像的高功率场(hpf)区域，每个肿瘤中有3个高功率场成像(n=3个独立的人类肿瘤样本)。多重比较方差分析。* * * p < 0.001。(C,D) SR-FLICA占总癌细胞百分比的量化+，以及SR-FLICA+在未转导的对照CAR-T和anti-CEA CAR-T细胞与αIL-10同时或不同时处理后，附近有CAR-T细胞的癌细胞(定义为在20µm内)。数据点代表每个hpf成像区域，每个肿瘤中有3个hpf成像(n=3个独立的人类肿瘤样本)。多重比较方差分析。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。

    为了更好地描述IL-10阻断对人类CRLM中抗原特异性CAR-T细胞的下游作用，我们在1天后对治疗后的人类肿瘤切片进行了RNA测序。我们特别发现与细胞溶解功能相关的基因(gn，GZMA，PRF1)、炎症(IFNG，5英镑，49NOS2)和T细胞迁移/趋化性(CXCL9，CXCL10，CXCL11，50CCL7，CCL8)在抗原特异性CAR-T细胞经αIL-10处理后相对上调(图6)．然后，我们对抗cea CAR-T细胞和αIL-10处理的样本与抗cea CAR-T细胞和对照IgG处理的样本中上调的基因进行了基因本体分析。与对照抗体处理的CAR-T细胞相比，αIL-10处理的抗原特异性CAR-T细胞的转录途径包括细胞对干扰素γ的反应、炎症反应、细胞对IL-1的反应、淋巴细胞趋化性和T细胞迁移均上调。图6 b)．此外，CAR-T细胞切片共培养后的流式细胞仪显示活化标志物CD25和CD69的表达增加(图6 c；在线补充图S5)．

    Interleukin 10 (IL-10) blockade increases antigen-specific chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell activation through a mechanism that requires intact IL-10R on CAR-T cells. Human colorectal cancer liver metastases (CRLM) slices were treated with control or carcinoembryonic antigen (CEA)-specific CAR-T cells, plus control or αIL-10, for 1 day. (A) Tumour slices were analysed by bulk RNA sequencing with heatmap demonstrating expression of genes related to T cell cytolytic functioning, activation and migration/chemotaxis for each treatment group (n=2 tumours). Dark red denotes high expression of the listed gene and dark blue denotes comparably low expression normalised to housekeeping genes. (B) Gene expression pathways increased with anti-CEA CAR-T cells are treated with αIL-10 versus control. Untd, untransduced control CAR-T cells. (C) Representative case of flow cytometry performed on CAR-T cells after treatment with control or IL-10 blocking antibody demonstrating expression of CD25 and CD69 (n=2 tumours). (D) Reverse phase protein array showing expression of pS6, Stat1, nuclear factor kappa B (NF-κB) and cleaved Caspase-7 protein of slices treated with anti-CEA CAR-T cells and either control or αIL-10 at 6, 22 and 48 hours. After 6 hours, cleaved Caspase-7 expression is increased in the slices treated with the CAR-T in addition to αIL-10, and at 22 hours pS6 expression is decreased. After 48 hours, Stat1 and cleaved Caspase-7 are decreased with an increase in NF-κB. Each data point represents a replicate from n=2 cases. Student’s t-test. *p<0.05; **p<0.01. (E–G) Following treatment of either untransduced control or anti-CEA CAR-T cells with either control or ⍺IL-10R, the CAR-T cells alone were incubated with tumour slice culture and live imaging was performed. Again, quantification of the carcinoma cells with a CAR-T cell adjacent (defined as within 20 µm), total SR-FLICA+ carcinoma cells and SR-FLICA+ carcinoma cells with a CAR-T cell adjacent. Data points represent each high-powered fields (hpf) area imaged, with 3 hpf imaged in each tumour (n=3 separate human tumour samples). Analysis of variance with multiple comparisons. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    白介素10 (IL-10)阻断剂通过一种需要CAR-T细胞上完整的IL-10R的机制增加抗原特异性嵌合抗原受体T (CAR-T)细胞的激活。人结直肠癌肝转移(CRLM)切片用对照或癌胚抗原(CEA)特异性CAR-T细胞，加上对照或αIL-10处理1天。(A)通过体块RNA测序分析肿瘤切片，热图显示每个治疗组(n=2个肿瘤)与T细胞溶解功能、激活和迁移/趋化性相关的基因表达。暗红色表示所列基因的高表达，深蓝色表示归一化为管家基因的相对低表达。(B)与对照相比，抗cea CAR-T细胞用αIL-10处理基因表达途径增加。未转导的对照CAR-T细胞。(C) CAR-T细胞经对照抗体或IL-10阻断抗体处理后，经流式细胞仪检测显示CD25和CD69表达的代表性病例(n=2个肿瘤)。(D)反相蛋白阵列显示抗cea CAR-T细胞、对照或αIL-10处理的切片在6、22和48小时时pS6、Stat1、核因子κB (NF-κB)和裂解的Caspase-7蛋白的表达。6小时后，CAR-T处理的切片中Caspase-7的表达增加，αIL-10的表达增加，22小时时pS6的表达降低。48小时后，Stat1和cleaved Caspase-7水平下降，NF-κB水平升高。 Each data point represents a replicate from n=2 cases. Student’s t-test. *p<0.05; **p<0.01. (E–G) Following treatment of either untransduced control or anti-CEA CAR-T cells with either control or ⍺IL-10R, the CAR-T cells alone were incubated with tumour slice culture and live imaging was performed. Again, quantification of the carcinoma cells with a CAR-T cell adjacent (defined as within 20 µm), total SR-FLICA+癌细胞和SR-FLICA+癌细胞与CAR-T细胞相邻。数据点代表每个成像的高功率场(hpf)区域，每个肿瘤中有3个高功率场成像(n=3个独立的人类肿瘤样本)。多重比较方差分析。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。

    为了确定CAR-T细胞内的分子机制，我们使用RPPA来评估抗cea CAR-T细胞和αIL-10处理的切片中>20蛋白状态和活性的变化，包括主要的致癌信号通路(RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT, RTK信号通路和STATs)。我们发现pS6核糖体蛋白表达在24小时内下降，随后STAT1在48小时内下降(图6 d)．裂解的Caspase-7在抗cea CAR-T和α il -10处理的切片中在6小时内增加，在48小时后降低。在48小时，我们注意到核因子κB (NF-κB)表达增加。NF-κB在死亡肿瘤细胞中不太可能上调，因此这种变化可能代表CAR-T细胞是下一个最丰富的细胞类型，在抗肿瘤t细胞反应中已经证明了NF-κB的高活性。51-53cleaved Caspase增加的时间过程与我们之前在荧光成像中描述的大约1天内细胞死亡增加的发现一致，随后的下降可能是由于早期明显的细胞死亡导致Caspase在后期时间点活性降低。此外，我们注意到24-48小时后NF-κB活性较高，这与我们发现的抗原特异性CAR-T细胞在2天内抗肿瘤活性增加一致。

    鉴于αIL-10对CAR-T功能的快速作用，我们假设这是由于IL-10对CAR-T细胞的直接抑制作用的缓解，而不是由于骨髓细胞调节的继发性作用。为了验证这一假设，我们在将CAR-T细胞单独添加到CRLM TSC之前，用拮抗il -10受体α (IL-10R)抗体预处理CAR-T细胞。αIL-10R预处理的CAR-T细胞与对照处理的CAR-T细胞相比，表现出更接近癌细胞的趋势(图6 e)．此外，αIL-10R预处理可增加CAR-T的细胞毒性，这可以通过增加癌细胞总凋亡和相邻CAR-T细胞的凋亡来证明(p<0.05;图6 f, G)．这些数据表明，IL-10阻断剂部分通过直接抑制CAR-T细胞中的IL-10R信号通路激活CAR-T细胞功能。

    讨论

    定义肿瘤特异性的免疫逃避机制对于开发针对ici耐药癌症的新免疫疗法至关重要，并且在准确的临床前模型中测试这些策略对于未来的临床成功至关重要。利用一种独特的基于人类肿瘤的转移性CRC模型，我们证明了免疫抑制细胞因子IL-10是人类CRLM免疫逃避的关键机制。在38例独特肿瘤患者的异质队列中，IL-10阻断剂几乎使肿瘤凋亡加倍(图2汉英)通过依赖于MHC I类和II类抗原呈递的免疫介导机制(图3 g)．CAR-T细胞实验进一步强调了CRLM中IL-10与抗原特异性t细胞功能的相关性，在小鼠细胞共培养系统中，αIL-10显著增加了cea特异性CAR-T细胞的增殖和细胞毒性(图4)和人类CRLM切片培养(图5及6)．

    综上所述，我们的数据确定IL-10是人类CRLM中需要克服的主要免疫检查点，并支持一个模型，即IL-10在CRLM TME中维持MHC ii类低TAMs，具有较差的抗原提呈能力，导致肿瘤抗原特异性T细胞无效的细胞毒性。我们发现，在TME中阻断IL-10的作用会导致蛋白激酶B (AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路磷酸化减少，随后巨噬细胞mhc - ii依赖性抗原表达增加，导致CD8+T细胞增殖和活化，导致肿瘤细胞死亡。这可能是由于治疗时间相对较短(1周)或CD4的存在和帮助+T细胞在CD8上+T细胞和短的培养时间，尽管T细胞激活，我们没有看到T细胞衰竭的转录组证据。54为了测试IL-10和IL-10阻断对人CRLM环境中抗原特异性T细胞的影响，我们修改了TSC系统，包括过继转移对照或cea特异性CAR-T细胞。尽管CAR-T通过不同于原生t细胞受体/肽/MHC复合物的机制识别表面抗原，过继CAR-T转移在我们的异质性人类肿瘤中是最可行的方法。在这个改进的系统中，我们发现IL-10配体或受体的拮抗导致TME中抗原特异性CAR-T细胞的快速激活，同时伴有反映细胞毒功能的转录和蛋白质组学变化(增加的表达5英镑，NOS2，CXCL9，CXCL10而且CCL8)和t细胞活化(NF-κB表达升高，CD25升高+CD69+人口)。总的来说，这些数据表明，在CRLM中，IL-10通过IL-10R信号在髓系和t细胞区室中直接作用，抑制IL-10导致IL-10靶细胞中基因和蛋白质表达的快速变化，最终导致免疫介导的肿瘤杀伤。

    我们的结果为大量详细介绍IL-10对APC和t细胞功能的直接抑制作用的文献提供了人类癌症的背景。18在肝脏介导耐受性的背景下，19我们假设IL-10也可能抑制肝脏TME中的APC和t细胞功能。我们的发现证实了其他人在初级小鼠TME中所证明的。一个乳腺癌小鼠模型表明，巨噬细胞来源的IL-10抑制了IL-12的DC产生，这是最大CD8所必需的+T细胞功能和化疗反应。22在肺癌侧翼肿瘤模型中，过度表达转基因小鼠的肿瘤生长增强Il10，这是可逆的抗体介导的IL-10阻断。55肿瘤单核细胞来源的IL-10在原位CRC小鼠模型中直接抑制t细胞增殖。56在临床方面，一项涵盖10种不同癌症类型的1788例患者的荟萃分析显示，血清IL-10浓度与较差的生存率之间存在相关性。21总之，这些研究描述了IL-10的免疫抑制作用。

    然而，也有证据表明IL-10自相矛盾地激活抗原经历的T细胞并诱导免疫介导的肿瘤消退。聚乙二醇化的IL-10 (pegilodecakin, AM0010)已被证明可诱导CD8+鳞状细胞癌小鼠侧翼模型中T细胞依赖性肿瘤消退。26在晚期实体癌的I期试验中，5/24例患者出现消退。27在有反应的患者中，激活的T细胞在外周血和肿瘤中都有扩增，而外周血克隆T细胞的扩增与延迟的肿瘤反应同时发生。28IL-10体外增加活化人外周血CD8颗粒酶B效应分子的表达+与靶向人白血病细胞共培养的肿瘤特异性CAR-T细胞的细胞毒性增加。57IL-10融合蛋白IL-10- fc通过代谢重编程在小鼠黑色素瘤和CRC中扩增和拯救最终耗尽的T细胞。58总之，这些数据为IL-10潜在的免疫激活和抗肿瘤作用提供了论据。然而，在胰腺癌的两项临床试验34非小细胞肺癌35没有达到预定的终点。

    IL-10悖论的关键可能与背景有关，包括化学计量学、配体/受体相互作用的动力学和器官特异性免疫环境因素。值得注意的是，活性IL-10/IL-10RA/IL-10RB六聚体复合物的三维结构最近被确定。这种具有不同受体亚型亲和力的IL-10变体的设计，允许细胞类型特异性的骨髓细胞诱导，而不是T细胞IL-10R信号。33目前研究的一个局限性是αIL-10的细胞类型不分皂白效应。MHC I类和II类对最大αIL-10效应的要求(图3 g)表明内源性T细胞和APC都是最佳反应所必需的，这表明更精确的髓系细胞靶向可以进一步增强免疫反应。新型IL-10R拮抗剂的开发和其他基于rna的基因敲低方法将增强TSC平台，并帮助解决这些下一阶问题。

    TSC模型的另一个局限性是缺乏循环血液或引流淋巴结成分。体内小鼠模型是研究全身或区域淋巴细胞作用的一种潜在策略，但必须谨慎解释，考虑到致癌物来源的移植侧翼模型的局限性，这些模型通常比人类癌症模型更具免疫原性。59 60例如，一项关于IL-10的研究-/-使用MC38小鼠结肠癌细胞的小鼠实验表明，IL-10抑制炎症细胞因子并导致肿瘤生长减少。61具体来说，MC38小鼠模型已被证明具有msi -高CRC，62在临床上，这与人类的高肿瘤突变负担(TMB)和对ICI的反应有关。然而，大多数转移性CRC患者有低TMB的MSS肿瘤，对ICI无反应;因此，为MSS CRC患者建模和设计新的免疫治疗方法是一项重大的临床需求。考虑到完全依赖于6毫米diameter×250微米厚的肿瘤切片中的免疫细胞，αIL-10能够诱导免疫介导的肿瘤消退是值得注意的。我们的发现建立在肿瘤内T细胞轮廓的基础上63年8骨髓细胞，10证实了T细胞和APC能够共同产生抗肿瘤反应。未来的工作将研究IL-10阻断是否会导致CD8克隆+和/或CD4+t细胞扩增和平行研究将确定基线和α il -10诱导的TAMs极化。在CRLM切片中，巨噬细胞是IL-10的主要来源(图1 b)，但IL-10阻断显著增加MHC II类表达(图3 b；在线补充图S3D)．因此，IL-10阻断可能是一种重新极化CRLM中抑制性巨噬细胞的新方法。

    鉴于CAR-T疗法在人类临床试验中的安全性，13日14还需要加强过继细胞治疗的策略。在这里，我们发现αIL-10显著增加CAR-T在CRLM中的迁移、增殖和细胞毒性(图4 - 6)．我们的研究结果表明，例如，通过转基因表达中和性IL-10抗体，“武装”CAR-T细胞对抗IL-10，可以实现增强CAR-T功能和作为IL-10阻断剂的新型传递载体的双重好处。有趣的是，在过继转移之前阻断IL-10R导致类似的结果，表明IL-10对CAR-T细胞有直接的机制作用(图6 eg)．未来的工作将定义CAR-T细胞对αIL-10快速(<24小时)反应的分子机制，如STAT3磷酸化和表达的下游变化。考虑到IL-10在体外白血病特异性CAR-T细胞中观察到的矛盾效应，57重要的是要确定在哪些情况下，例如，肝转移，最佳的t细胞激活是由阻断而不是额外的IL-10/IL-10R信号传导引起的。

    IL-10在癌症中的争议性作用强调了在准确的临床前模型中研究这种细胞因子的重要性，这些模型忠实地概括了人类癌症。在这里，我们提出了IL-10在人CRLM中抑制抗肿瘤免疫的证据，并且针对IL-10的中和抗体可以逆转这一效应，诱导戏剧性的免疫介导的肿瘤死亡。我们之前证明了TSC准确地概括了多种GI癌的肿瘤和间质成分35 37并预测患者对两种标准化疗的反应34以及新的免疫疗法组合。38尽管人类TSC存在局限性，但值得注意的是，我们在超过三分之二的患者肿瘤中观察到反应，尽管肿瘤突变状态和术前化疗反应存在差异。我们认为IL-10是CRLM中需要克服的主要免疫检查点。未来的工作将研究IL-10阻断与其他原发性和继发性肝肿瘤以及其他抵抗ICI的免疫浸润性肿瘤的相关性。

    数据可用性声明

    数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。我们的RNA测序和单细胞RNAseq的数据已经保存，可在https://doi.org/10.5061/dryad.0cfxpnw54．

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    这项研究涉及人类参与者，并由华盛顿大学机构审查委员会批准。1852)。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。

    致谢

    这项研究也得到了Fred Hutch/华盛顿大学癌症联盟的实验组织病理学共享资源(P30 CA015704)的支持。我们感谢美国国立卫生研究院(S10 OD016240)对W. M.凯克神经信号高级研究中心的支持，以及凯克中心经理Nathaniel Peters博士的协助。我们感谢Stella Shin和CB Lim提供RPPA样品的帮助。我们也感谢Jeffrey Schlom博士慷慨地赠送MC38CEA细胞株。作者还感谢Sorrento和TNK Therapeutics慷慨地准备和提供抗cea CAR-T细胞和CEA-Fc检测试剂。

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    补充材料

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    脚注

    • 推特@kmsullivanmd， @TeresaKimMD， @pancsurg

    • KMS和XJ的贡献相当。

    • 调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。作者姓名强天已被更正。

    • 贡献者概念化:KMS, XJ, CL, HLK, VGP。方法学:KMS, XJ, PG, CL, JAC, CH, KK, SKD, HLK, XY, CM, MC, YDS, TSK, TSG, RSY, QT, SCK, VGP。调查:KMS, XJ, PG, CL, CH, KPL, SKD, KK, CM, MC, HLK, AA。可视化:KMS, XJ, PG, CL, CH, KPL, SCK, KK, MC, HLK, AA, SKD, TSG, TSK, VGP。资金获取:KMS, RSY, SCK, TSK, TSG, QT, SCK, VGP。项目管理:KMS, XJ, PG, CL, HLK, JOP, TSG, QT, SCK, VGP。监督:TSG, TSK, JOP, INC, RSY, SCK, VGP。写作-初稿:KMS, PG, SCK, VGP。撰写和编辑:KMS, XJ, PG, KPL, KK, CH, HLK, SKD, AA, YDS, TSG, TSK, JOP, INC, RSY, SCK, VGP。担保人:KMS, VGP。

    • 资金KMS获得了纤维层状癌症基金会和癌症研究所(FCF/CRI博士后奖学金)的资助。TSG获得了美国癌症协会(RSG-19-197-01)的资助。TSK获得了来自华盛顿大学/Fred Hutchinson癌症中心支持基金(CCSG)， P30 CA015704，新研究者奖的资助。QT获得了USAMRAA (CA150370P1)和NIH (NCI R01 CA190122)的资助。VGP和SCK获得了美国陆军医学研究采办活动(USAMRAA;CA150370P2)。RSY获得USAMRAA资助(CA150370)。VGP获得了西雅图转化肿瘤研究所、Brotman Baty精确医学研究所和默克研究员研究计划的资助。

    • 相互竞争的利益VGP是TriSalus生命科学公司的科学顾问委员会成员。他曾担任Merck & Company(2018年)、GlaxoSmithKline(2019年)、Imvax(2019年)、Takeda(2020年)和Umoja(2022年)的顾问。他获得了阿斯利康(AstraZeneca)、易普森(Ipsen)、默克(Merck)、OncoResponse和NGM的研究资助。资助者在概念化、设计、数据收集、分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。抗cea CAR载体由TNK Therapeutics提供，该公司在概念化、设计、数据收集、分析或手稿准备中没有任何作用。SCK一直担任TNK Therapeutics的顾问，直到2019年12月，目前是TriSalus生命科学的首席医疗官，Nkarta, Takeda和Sentibio的SAB成员，并获得了Takeda和Nkata的研究资助。

    • 患者和公众参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。