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客观的乙型肝炎病毒(HBV)特殊T细胞是主要效应细胞的控制HBV感染和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)建议受损的免疫反应的关键因素,慢性乙型肝炎病毒感染的一个特点。除了HBsAg,乙型肝炎等病毒标记core-related抗原(HBcrAg)可用,但他们的潜在联系HBV-specific免疫反应尚未定义,这将是重要的如果这些标记用于患者分层新的治疗方法旨在功能乙肝病毒治疗。
设计我们分析了T细胞反应在92年乙型肝炎e抗原阴性患者慢性乙型肝炎病毒感染与不同表面和HBcrAg水平。重叠的肽用于体外反应分析(n = 57),和乙肝病毒核心18特殊技能和聚合酶(pol)455年特殊技能CD8+T细胞是评估患者人类白细胞抗原(HLA) - a * 02 (n = 35)。此外,在体外反应anti-programmed细胞death-ligand 1 (anti-PD-L1)调查。
结果HBV-specific T细胞反应不受HBsAg的水平,而是以年龄和CD4细胞+患者的T细胞反应最高HBcrAg水平低。乙型肝炎病毒核心的表型和功能18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+T细胞不同,但HBsAg和HBcrAg水平没有影响他们的配置文件。阻塞anti-PD-L1可以恢复HBV-specific T细胞,但效果明显高于T细胞分离低HBsAg,特别是低HBcrAg患者。
结论我们的数据表明,年龄和HBcrAg HBsAg,而是与HBV-specific T细胞反应。最后,非常低的抗原水平表示HBsAg,特别是HBcrAg可能影响检查点抑制T细胞反应。
- 乙型肝炎
- 细胞免疫学
- 慢性肝炎
- 免疫反应
- T淋巴细胞
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
乙型肝炎病毒(HBV)特殊T细胞后,在慢性乙型肝炎病毒感染患者受损。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)期间曝光(病人的年龄),而不是表面的数量,与anti-HBV免疫反应的水平,特别是乙型肝炎surface-specific T细胞反应。
HBV-specific CD8+与不同的目标特异性T细胞(乙肝病毒核心抗原决定基与HBV聚合酶(pol)抗原决定基)的特点是独特的表型和功能配置。
检查点(体外封锁anti-programmed抑制细胞死亡蛋白1 (anti-PD-1)或anti-programmed细胞death-ligand 1 (anti-PD-L1)可以恢复体外HBV-specific T细胞反应的响应能力。
有什么新发现吗?
HBV-specific T细胞反应(HBV core-specific和乙肝病毒pol-specific T细胞)不受HBsAg的水平,而是通过病人的年龄,尤其是CD4细胞+T细胞的反应。
乙肝患者低core-related HBV-specific CD4抗原(HBcrAg)级别显示高+T细胞反应(独立于年龄),特别是乙肝病毒core-specific和HBV pol-specific T细胞反应。
乙肝病毒的不同表型和功能概要core-specific和乙肝病毒pol-specific CD8+T细胞反应不受不同的表面或HBcrAg水平的影响。
CD4+和CD8+患者T细胞与低水平的HBsAg(< 100国际单位/毫升),特别是低水平的HBcrAg(< 3日志U /毫升)更有响应PD-L1封锁体外。这是独立于年龄。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
结果强调年龄作为持续感染的指标是一个重要的因素HBV-specific CD8的功能+和CD4+T细胞,不仅对HBV surface-specific T细胞也对乙肝病毒core-specific pol-specific T细胞,它是独立于HBsAg的水平。这个数据是很重要的考虑年轻患者小说旨在功能治愈乙肝病毒免疫疗法。
我们的研究结果也强调HBcrAg可能比HBsAg歧视乙肝病毒标记e抗原阴性的患者保留HBV-specific (CD4细胞+)T细胞反应,因此可以认为分层患者新的治疗方法旨在HBsAg的损失。
数据还表明,低表面和/或低HBcrAg患者更好的候选免疫疗法(如抑制检查站)无论年龄、支持抗原降低的假设,例如,RNA干扰。
总的来说,我们的数据提供了新的见解,对病人很重要分层考虑旨在功能治疗乙肝病毒的新的治疗方法。
介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一个主要的全球卫生问题,全球大约有2.57亿人慢性感染,导致每年887 000人的死亡由于进步的肝脏疾病和肝细胞癌(HCC)。1治疗与干扰素有ide (t)类似物(NA)或干扰素(IFN)阿尔法导致HBV DNA抑制和减缓疾病进展的慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者。2然而,功能性治愈慢性乙型肝炎病毒感染,定义为持续乙型肝炎表面抗原(HBsAg)损失,乙肝病毒治疗的主要目标,很少取得目前的疗法。3一些新颖的治疗策略旨在功能治疗包括抗病毒和免疫调节治疗方法正在开发中。3病人的选择是非常重要的早期临床试验与新的研究化合物因为慢性乙型肝炎病毒感染是非常变量和慢性乙型肝炎病毒感染的不同阶段也可能不同的免疫反应。4一方面,重要的是要确保治疗组平衡,否则,异构反应是可能的,另一方面,重要的是为每个治疗方案选择最合适的病人为了证明高功效。3
同意,量化HBsAg分层的一个重要标志是患者临床试验新的治疗药物3;另一方面,它可能需要首先降低表面直接与RNA干扰(如)通过免疫调节疗法产生影响。5
HBV-infected肝细胞分泌大量的非传染性subviral粒子只包含表面6能够对宿主免疫系统产生影响的方式是有益的病毒。有人提议,HBsAg可以充当诱饵饱和anti-HBs病毒中和抗体,从而降低。7此外,持续的高抗原刺激患者的慢性乙肝与受损的细胞免疫反应有关。8 - 11HBV-specific T细胞被认为是一个主要的效应细胞控制HBV感染和受损和疲惫的T细胞反应是慢性乙型肝炎病毒感染(回顾的一个特点8 - 11)。然而,循环HBsAg对T细胞反应的影响是有争议的。最近,这是表明HBV-specific T细胞反应没有与血清HBsAg水平相关,但病人的年龄,可能反映了感染,持续时间是决定性因素对HBs-specific T细胞的频率。12相比之下,另一项研究表明,HBV-specific CD4细胞+患者的T细胞反应显著高于HBsAg < 500国际单位/毫升,体外的封锁程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)途径可以改善患者T细胞的抗病毒能力只有在低HBsAg的水平。13符合上述假设HBsAg需要减少到确保免疫调节疗法的疗效,减少RNAi-based HBsAg的治疗增加小鼠模型的治疗性疫苗的功效。5相比之下,另一项研究表明,HBsAg清除并不是增加抗病毒T细胞反应后interleukin-2-based免疫治疗干预。14
了解病毒和宿主因素与HBV-specific免疫反应,识别是非常重要的生物标记物,可以用来选择和分层患者临床试验研究小说旨在功能治疗的治疗策略。除了HBsAg,其他病毒蛋白质可能影响免疫应答。最近,有能力来确定乙肝core-related抗原(HBcrAg)使用商业分析,另一个乙肝病毒标志物已成为普遍可用,可能与慢性乙肝患者的免疫反应。HBcrAg结合抗原反应性变性导致乙型肝炎e抗原(e抗原),乙肝病毒核心抗原和人造core-related蛋白质(p22cr)。15日16HBcrAg可能是一个更好的替代标记肝内共价闭合环状DNA (cccDNA)及其与HBsAg转录活动。17HBcrAg也有助于预测响应抗病毒治疗和NA停药后复发,以及在预测疾病发展为肝硬化和肝癌的发展和复发。15日16然而,到目前为止没有数据如果HBcrAg水平与HBV-specific免疫反应有关。
因此,本研究的目的是分析频率和表型以及函数和响应性定义良好的体外免疫调节T细胞的慢性乙型肝炎病毒感染患者对不同表面和HBcrAg水平。
患者和方法
病人和样品制备
92 e抗原阴性的患者慢性乙型肝炎病毒感染了。57例,总T细胞的表型以及HBV-specific T细胞的表型和功能进行分析(表1,在线补充图S1A)和35抗原* 02阳性患者的核心18特殊技能和聚合酶(pol)455年特殊技能CD8+分析了T细胞(表2,在线补充图印地)。患者分类根据其表面抗原水平(< 100;100 - 1000;1000年10月000;≥10 000国际单位/毫升)或HBcrAg水平(< 3,3 - 3.87≥3.87日志U /毫升)(在线补充图S1)。HBcrAg < 3的截止值低和≥3.87日志U /毫升高HBcrAg是基于一项研究群体与慢性乙型肝炎病毒感染的不同阶段。18
总CD4的描述+和CD8+与不同程度的慢性乙肝患者的T细胞表面抗原和HBcrAg。(一)连接t-SNE CD4的情节+和CD8+T细胞亚群(上部面板)和强度的表示标记(较低的面板)49慢性乙肝患者可以根据HBsAg和HBcrAg水平分类。(c) CD4的频率+和CD8+以及CD4记忆T细胞效应子集+和CD8+T细胞表达激活和疲惫标记分组根据HBsAg (B)和HBcrAg (C)水平。统计学意义之间的两组测试Mann-Whitney测试为非参数数据和未配对t检验参数数据(c)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。慢性乙肝、慢性乙型肝炎;HBcrAg、乙肝core-related抗原;表面抗原、乙型肝炎表面抗原;T厘米,中央记忆T细胞;T新兴市场效应记忆T细胞;TEMRA终末分化效应记忆T细胞;HLA-DR、人类白细胞抗原-博士;G1 KLRG1,杀伤细胞凝集素受体;PD-1,程序性细胞死亡蛋白1;t-SNE, t-distributed随机邻居嵌入。
外周血单核细胞(PBMCs)隔离病人使用标准聚蔗糖密度梯度离心法和冻存于液氮中延期使用。19
水平的丙氨酸转氨酶(ALT)、HBV DNA, HBsAg和HBcrAg决定如前所述。18
所有实验进行了符合赫尔辛基宣言所信奉的原则。汉诺威医学院的当地伦理委员会确保这个项目。书面知情同意了所有人都参与了这项研究。
乙型肝炎病毒重叠肽、单肽和HLA类我dextramers
HBV-specific基因型D重叠肽(OLPs) (ProImmune,牛津大学,英国)是由15个氨基酸,重叠的10个氨基酸,横跨整个HBV核心(两个池),表面(四池)和聚合酶(八池)(在线补充表S1)。19
于* 02-restricted HBV-specific多肽抗原表位的核心18-27(FLPSDFFPSV)和聚合酶455 - 463(GLSRYVARL)被ProImmune合成。于* 02-specific dextramers买来Immudex(丹麦哥本哈根)。
表现型的T细胞亚群和HBV-specific T细胞反应与HBV-specific肽在体外刺激后
体外表现型总T细胞和HBV-specific T细胞功能的分析如前所述(抗体在线补充材料和方法)。19
短暂,PBMCs扩大了10天,刺激HBV-specific OLPs或抗原* 02-restricted肽。由此产生的T细胞反应的计算是通过添加相应的肽池后减去媒介控制。
分析T细胞修复,anti-programmed细胞死亡配体1 (anti-PD-L1、克隆M1H1 eBioscience)被添加到文化与HBV-specific肽。所有样本获得的BD LSRFortessa流式细胞分析仪(BD生物科学)。
pMHCI multimer-based磁富集
隔离HBV-specific CD8+T细胞是由使用multimer-based磁珠富集如前所述。20 21丰富和pre-enriched细胞染色表面和胞内标记。
统计分析
流式细胞仪数据分析使用FlowJo软件(V.9.9.4和V.10.6.2)。香料V.6.0被用来显示多功能流式细胞仪数据(简化的极其复杂的评估,美国国立卫生研究院(NIH))。为消除年龄的影响,使用R V.3.6.3 semi-partial相关性进行修补(2020-04-28,https://www.r-project.org)。统计分析使用GraphPad棱镜8 (GraphPad软件)。统计学意义是由Mann-Whitney测试,测试Wilcoxon配对,克鲁斯卡尔-沃利斯检验,为非参数数据和斯皮尔曼相关学生的配对t检验,单向方差分析、皮尔森相关参数数据。重要的p值考虑如下:* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。酒吧图想象中值和误差表示平均数标准误差。
结果
HBsAg和HBcrAg水平对总T细胞的影响
我们第一次筛选CD4总额的比例+和CD8+T细胞和他们的记忆效应子集,γδT细胞、粘膜相关不变的T细胞(MAIT细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)体外不同级别的HBsAg患者和49年HBcrAg (表1,在线补充图S1A)。流式细胞仪是用来识别T的表达特异性分化、激活和监管标记(在线补充图S2A)。t-SNE情节描述没有CD4的主要聚类的差异+和CD8+T细胞亚群(图1一个)。此外,Granzyme B的表达模式,HLA-DR ki - 67和PD-1总T细胞保持类似的患者组之间。天真的比例,中央记忆,记忆效应和终末分化效应CD4记忆+T细胞与不同级别的组中没有改变HBsAg或HBcrAg (图1 b, C)。然而,HBsAg≥10 000国际单位/毫升患者和患者HBcrAg≥3.87的日志U /毫升的频率有显著降低的中部和效应器CD8记忆+T细胞亚群(图1 b)。天真的频率,中央内存和内存CD8效应+T细胞与表面抗原水平显著相关(在线补充图开通)。之间显著负相关只是观察HBcrAg水平和效应器CD8记忆+T细胞(在线补充图S2C)。HBsAg的相关性与CD4 HBcrAg水平+慢性乙肝患者的T细胞显示没有联系(图开通在线补充,C)。γδT细胞的比例,MAIT细胞和Treg细胞并没有改变在病人组与不同程度的表面或HBcrAg (在线补充图S2D)。
HBV-specific CD4+和CD8+患者的T细胞反应不同级别的HBsAg HBcrAg。HBV-specific CD4+和CD8+体外刺激T细胞反应后10天与乙型肝炎病毒重叠肽池。流式细胞术(A)代表HBV-specific CD4的情节+从患者T细胞反应不同级别的HBsAg HBcrAg。(c) HBV-specific IFN-γ+CD4+和IFN-γ+CD8+来自57个慢性乙肝患者的T细胞可以根据他们的HBsAg (B)和HBcrAg分类(C)水平(total-specific T细胞反应:14肽池)的总和。统计学意义之间的两组测试Mann-Whitney测试为非参数数据和未配对t检验参数数据(c)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。慢性乙肝、慢性乙型肝炎;HBcrAg、乙肝core-related抗原;表面抗原、乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子。
HBsAg和HBcrAg水平影响HBV-specific T细胞的功能
HBV-specific 57 e抗原阴性患者的T细胞反应评估通过测量细胞因子反应(如IFN-γ和IFN-γ/肿瘤坏死因子(TNF)在为期10天的扩张和re-stimulation与特定OLPs覆盖HBV核心,表面和聚合酶体外抗原(在线补充图S1A)。流式细胞术块CD4代表+T细胞反应进行描述图2一个。
一般来说,IFN-γ+CD4+T细胞反应比IFN-γ更频繁地检测到+CD8+T细胞反应(图2 b, C)。乙肝病毒core-specific pol-specific细胞因子+T细胞是主要与surface-specific T细胞(图2 b, C)。重要的是,在乙肝病毒核心没有明显差异,表面和pol-specific T细胞反应患者中观察到不同的等离子体表面抗原水平(图2 b)和HBsAg HBV-specific CD4没有任何关联+和CD8+T细胞反应(在线补充图S3)。如果,有一个趋势IFN-γ的频率的增加+CD4+和CD8+患者的T细胞表面抗原≥10 000国际单位/毫升(图2 b)。相比之下,不同患者的显著差异被认为HBcrAg水平。HBV-specific CD4+核心的T细胞反应和聚合酶肽显著降低患者高HBcrAg(≥3.87日志U /毫升)患者比低(< 3日志U /毫升)或中级(3 - 3.87日志U /毫升)HBcrAg水平(图2 c)。乙肝病毒core-specific CD4+T细胞反应显示与血浆HBcrAg水平显著负相关(在线补充图S3B)。
HBV-specific CD4+和CD8+在不同的年龄段T细胞反应。HBV-specific CD4+和CD8+体外刺激T细胞反应后10天与乙型肝炎病毒重叠肽(OLP)池根据病人的年龄分组。流式细胞术(A)代表块HBV core-specific IFN-γ+/肿瘤坏死因子+CD4+两个病人的T细胞反应。(B)热量地图总细胞因子的平均频率+HBV-specific CD4+和CD8+T细胞(年龄组:18-39,n = 25;40至49,n = 17;≥50岁,n = 15)。(C) IFN-γ+HBV-specific CD4+和CD8+不同年龄组的T细胞。(D)相关性分析年龄与总IFN-γ的频率+CD4+和CD8+T细胞。(E)的意思是多功能CD4的百分比+和CD8+T细胞反应与总HBV体外扩张后OLPs (14 OLP池之和)。统计学意义之间的两组测试Mann-Whitney测试为非参数数据和未配对t检验参数数据(c)。* p < 0.05;* * p < 0.01。干扰素干扰素;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子。
值得注意的是,18例在队列接收抽样(NA治疗的时候表1,在线补充表2),但这并没有显著影响HBV-specific CD4+和CD8+T细胞反应(在线补充图S4A)。
乙型肝炎病毒核心功能和表型特征18特殊技能和乙肝病毒波尔455年特殊技能CD8+慢性乙肝患者的T细胞。HBV-specific CD8+T细胞反应后10天体外刺激与核心18或者波尔455年多肽抗原* 02积极的慢性乙肝患者。(一)HBV-specific IFN-γ+CD8+T细胞反应分类基于HBsAg或HBcrAg水平。(B)丰富体外频率的天真,T厘米T新兴市场和TEMRA人口和表达PD-1、KLRG1 CD39,加工,Tbet, PD-1 CD127和TCF1乙肝病毒核心18和波尔455年特殊技能CD8+T细胞。(C)雷达情节描绘的平均百分比来自体内的乙肝病毒核心18和波尔455年特殊技能CD8+慢性乙肝患者T细胞表达不同的标记可以基于HBsAg和HBcrAg水平分类。统计学意义是由Wilcoxon测试测试和Mann-Whitney测试为非参数数据和未配对t检验参数数据(a - c)。ns,不重要;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。慢性乙肝、慢性乙型肝炎;DCM,死细胞标记;FSC,向前散射;HBcrAg、乙肝core-related抗原; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HLA, human leukocyte antigen; IFN, interferon; PD-1, programmed cell death protein 1; pol, polymerase; SSC, side scatter; TCF1, transcription factor 1; T厘米,中央记忆T细胞;T新兴市场效应记忆T细胞;TEMRA终末分化效应记忆T细胞;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子;。
我们也分析了慢性乙型肝炎病毒感染的阶段是否有影响和病人分配给四个不同类别根据乙肝病毒(<或≥2000国际单位/毫升)和ALT(正常或升高)(在线补充表3)。患者HBV DNA≥2000国际单位/毫升和ALT升高(e抗原阴性肝炎)CD4有显著降低+T细胞反应(在线补充图S4B)。值得注意的是,5个五个病人在这组HBcrAg水平≥3.87日志/毫升。没有与HBV-specific CD4 ALT水平+或CD8+T细胞反应(斯皮尔曼r =−0.05, p = 0.7;斯皮尔曼r = 0.21, p = 0.11)。
年龄对HBV-specific T细胞反应的影响
鉴于量化HBsAg随着年龄的显著负相关6日12(在线补充图S5A),我们检查HBV-specific T细胞反应在三个不同的年龄组(18-39,40至49和≥50年)。总IFN-γ的频率+CD4+(乙肝病毒核心,表面和聚合酶)明显高于年轻患者(< 40年)比老年患者(≥50年)(图3 a、B和C)。特别是,之间未发现显著负相关的总数HBV-specific IFN-γ+CD4+T细胞和年龄(图3 d)。乙肝病毒pol-specific T细胞的效果更加明显。值得注意的是,患者NA是均匀分布在不同年龄组(18-39年:n = 8/25(32%), 40至49年:6/17(35%),≥50年:4/15 (27%))。
的影响对HBV-specific PD-L1封锁在慢性乙肝患者T细胞反应。HBV-specific CD4+和CD8+体外刺激T细胞反应后10天与乙型肝炎病毒重叠肽(OLP)池有或没有添加anti-PD-L1抗体。(一)由HBV-specific CD4 IFN-γ表达式+和CD8+不同患者T细胞的表面抗原水平。打开圆圈标记三个患者1000 - 10 000国际单位/毫升HBsAg最高的T细胞反应了所有HBcrAg < 3日志U /毫升。(B)的HBsAg残差相关性分析HBV-specific CD4或log2褶皱变化的差异+和CD8+T细胞反应后扩张anti-PD-L1的存在。(C)由HBV-specific CD4 IFN-γ表达式+和CD8+T细胞的患者不同程度的HBcrAg。Total-specific T细胞反应:所有14 OLP池。统计学意义是由Wilcoxon测试非参数测试数据和配对t检验的参数数据(A、C)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。慢性乙肝、慢性乙型肝炎;HBcrAg、乙肝core-related抗原;表面抗原、乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素;PD-L1,细胞程序性死亡配体1。
此外,HBV-specific T细胞的能力,尤其是CD4细胞+T细胞,产生多种细胞因子在刺激减少年龄(图3 e)。
HBsAg和HBcrAg水平在核心的影响18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+慢性乙肝患者T细胞抗原* 02积极
最近的研究表明,HBV-specific CD8的表型和功能配置文件+慢性乙肝患者的T细胞是不同的根据有针对性的HBV抗原决定基,22日23日但HBsAg HBcrAg水平并没有评估的影响。因此,我们研究的核心18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+在35 T细胞抗原* 02积极的慢性乙肝患者不同程度的HBsAg(< 100 > 10 000国际单位/毫升)和HBcrAg(< 3和≥3日志U /毫升)(表2,在线补充图印地)。符合先前的研究,22日23日我们证实,CD8+T细胞针对乙肝病毒核心18显示更高IFN-γ表达式与同源乙肝病毒多肽体外刺激后而波尔455年特殊技能CD8+T细胞但这是独立于HBsAg和HBcrAg (图4一)。我们随后选择24抗原* 02积极的慢性乙肝患者评估HBsAg和HBcrAg水平的影响表型的核心18特殊技能和波尔455年——具体CD8+T细胞通过使用基于peptide-MHC dextramers浓缩(图4 b,在线补充图印地)。分析内存分化的模式基于CD45RA和CCR7的表达表明naive-like CD8的频率+T细胞针对波尔455年明显高于目标核心18。相比之下,核心18特殊技能CD8+T细胞显示更高频率的效应比波尔内存表型455年特殊技能CD8+T细胞(图4 b)。表达CD39 KLRG1,加工和核心之间Tbet没有显著的不同18特殊技能和波尔455年特殊T细胞。然而,核心18特殊技能CD8+T细胞表达PD-1高于波尔显示455年特殊技能CD8+T细胞(频率所示图4 b;意思是小额信贷机构的核心18与波尔455年:375 vs 166, p值< 0.0001,分别)。我们还记录了一个更高的PD-1 co-expression CD127在核心18您对波尔455年特殊技能CD8+T细胞(图4 b),但是没有差别表达的转录因子1 (TCF1)核心之一18——具体和波尔455年特殊的T细胞(图4 b)。重要的是,没有重大分歧CD8的表型+T细胞针对核心18或者波尔455年患者不同程度的表面或HBcrAg除了KLRG-1表达显著增加在核心18特殊技能CD8+患者的T细胞表面抗原> 10 000国际单位/毫升(图4 c)。
影响HBV-specific CD4 anti-PD-L1阻塞+和CD8+T细胞
慢性乙型肝炎病毒感染的T细胞在功能上是疲惫和功能可以恢复通过阻断PD-1 / PD-L1交互(综述10 - 26)。因此,我们质疑如果换向功能受损HBV-specific T细胞通过瞄准co-regulatory通路影响等离子体表面或HBcrAg的数量。有趣的是,刺激的PBMC HBV-specific OLPs一起封锁PD-1 / PD-L1途径导致显著提高IFN-γ+CD4+患者的T细胞表面抗原< 100国际单位/毫升,HBsAg患者1000 - 10 000国际单位/毫升(图5一个)。确保年龄并不影响因素的相关性HBsAg与T细胞的功能恢复,我们年龄的影响通过执行semi-partial相关性(图5 b)。随后,分析显示显著的负相关,与IFN-γHBsAg残差+CD4+和IFN-γ+CD8+T细胞恢复通过阻断PD-1 / PD-L1通路。
当我们分析T细胞修复患者的不同级别的HBcrAg,我们观察到显著增加IFN-γCD4的表达+和CD8+患者T细胞低HBcrAg(< 3日志U /毫升)和CD8+中间组T细胞(3 - 3.87日志U /毫升)(图5 c)。没有明显影响患者高HBcrAg anti-PD-L1封锁。值得注意的是,这三个患者CD4数量增加最多的+和CD8+T细胞反应HBsAg群1000 - 000,占该组的重要价值,显示所有HBcrAg水平低的< 3日志U /毫升。
anti-PD-L1阻塞于核心的影响18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+T细胞
最后,我们评估的影响等离子体表面和HBcrAg水平响应能力的核心18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+T细胞在体外的封锁PD-1 / PD-L1通路。代表流式细胞术情节从慢性乙肝患者不同程度的HBsAg HBcrAg刺激后乙肝病毒核心18和波尔455年肽的存在与否anti-PD-L1抗体所示图6。Anti-PD-L1 IFN-γ响应影响只有当HBsAg, HBcrAg较低(< 100国际单位/毫升和<分别为3日志U /毫升),但这是重要的只对HBV波尔455年特殊技能CD8+T细胞。
对乙肝病毒核心PD-L1封锁的影响18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+T细胞反应。HBV-specific CD8+T细胞反应后体外刺激与核心18特殊技能或波尔455年特殊肽anti-PD-L1抗体的存在与否。(一)慢性乙肝患者HBsAg < 100或≥10 000国际单位/毫升和(B)慢性乙肝患者HBcrAg < 3 > 3日志U /毫升。统计学意义是由Wilcoxon测试测试。ns,不重要;* p < 0.05;* * p < 0.01。慢性乙肝、慢性乙型肝炎;HBcrAg、乙肝core-related抗原;表面抗原、乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素; PD-L1, programmed cell death ligand 1; pol, polymerase; TNF, tumour necrosis factor.
讨论
功能性治愈慢性乙型肝炎病毒感染,定义为持续HBsAg损失,是乙肝病毒治疗的首选目标,很少实现慢性乙肝患者。2 3因此,正在开发新的抗病毒和免疫调节疗法改善这一目标。定义最合适的候选人对这些疗法,它可能是重要的,例如,对于免疫调节疗法来识别标记与HBV-specific免疫反应。定量HBsAg特别是被认为受损的免疫反应中发挥重要作用,无法清除乙肝病毒。6在这项研究中,我们调查了患者的T细胞反应不同HBsAg的水平,但也被认为是另一个新的HBV标记,HBcrAg,没有数据的免疫反应。
首先,我们的数据显示,总体包括CD4 T细胞组成+和CD8+γδT细胞,T细胞MAIT细胞和Treg细胞保持几乎不变的病人与慢性乙肝表面抗原水平的关系,证实了之前的研究。12
值得注意的是,我们观察到显著正相关的HBsAg和幼稚的CD8水平+T细胞和显著负相关的量化HBsAg和中央内存和内存CD8效应+T细胞。由于HBsAg数量和年龄之间的负相关,这些T细胞数量的差异很可能归因于病人年龄。27 28
接下来,我们在这里展示HBV-specific T细胞的功能,以体外反应肽刺激,也与HBsAg的数量无关。这与最初从最近的一项研究,记录明显高于HBV-specific多重的CD4细胞+患者的T细胞表面抗原水平低(< 500国际单位/毫升)的患者相比HBsAg水平高(> 50 000国际单位/毫升)13但年龄的影响没有考虑T细胞反应。观察到这里,也在其他的研究中,6日12HBsAg随着年龄的增长水平是负相关,因此HBV-specific T细胞反应,尤其是波尔CD4细胞+反应,在我们的研究随着年龄增长负相关。最近的一项研究由勒伯特等是第一个表明它不是HBsAg的数量在给定的时间点,而是感染和抗原暴露的持续时间相关的T细胞反应特定的表面抗原。12然而,勒伯特等在他们的研究表明,T细胞特定的乙肝病毒核心和乙肝病毒波尔没有随着年龄增长而减少。应该注意的是,他们的群体更多的异构和包括一个混合的年轻HBeAg-positive HBeAg-negative来自亚洲和欧洲(英国)的患者。12我们组只包括成人HBeAg-negative病人来自欧洲、和surface-specific T细胞反应已经几乎缺席。此外,约有32%的患者接受了NA治疗,但患者NA年龄组之间均匀分布。
然而,我们工作的重点是分析与HBcrAg免疫反应水平,因为表面可能不是最合适的标志cccDNA转录活动,特别是在HBeAg-negative病人16日17因为综合HBV DNA可能是HBsAg在这个人口的主要来源。6 29尽管HBeAg-negative患者HBV DNA水平较低,胞浆内表达的核心可以高。30.HBcrAg占e抗原和核心,从而可以使不同的独立的表面抗原水平与core-specific和pol-specific成人HBeAg-negative人群的免疫反应;和我们确实表明,低HBcrAg患者(< 3.87日志U HBV-specific CD4 /毫升)有显著提高+T细胞反应,特别是对核心和波尔。重要的是在这种背景下,HBV-specific CD4+比CD8 T细胞显示了强烈的反应+T细胞。HBV-specific CD4越强+T细胞反应已经被我们观察到其他项目。19有一些潜在CD8的可能性+由于刺激T细胞反应没有检测到的细胞与15 - m抗议OLPs。31日然而,重要的是,CD4细胞+T细胞似乎更耐比CD8与年龄相关的表型和功能的变化+T细胞。32这可能有助于解释为什么CD4的年龄相关性+T细胞反应是强和CD8年龄相关的意义+T细胞已经失去了在我们成人群体。
能获得更多的洞察HBV-specific CD8的表型和功能+T细胞,我们使用MHC I dextramer-based浓缩检测HBV-specific CD8的低频+T细胞针对两个已知抗原* 02-restricted抗原表位,乙肝病毒核心18和乙肝病毒波尔455年在抗原* 02-positive慢性乙肝患者。与最近的报道一致,22日23日我们确认这两个epitope-specific CD8+T细胞表现出不同的表型PD-1更高的功能和更高的表达式+和PD-1+/ CD127+(存储器像表型)的核心18特殊技能与波尔455年特殊技能CD8+T细胞。在这里,我们表明,这些核心之间的区别18特殊技能和波尔455年特殊技能CD8+T细胞没有明显影响的表面或HBcrAg测量个别病人的血液中。因为surface-specific CD8的检出率极低+在慢性乙型肝炎病毒感染患者T细胞,我们无法调查HBsAg的影响和HBcrAg CD8在表型上的状况+目标T细胞表面抗原的表位。更全面的研究分析HBV-specific CD8+T细胞受到其他HLA分子和HBV-specific CD4类+T细胞HLA二类限制分子仍然是需要的。这也将是有趣的关联与肝内T细胞反应病毒标记,在我们的研究中这是不可能的。
HBV-specific T细胞显示疲惫的慢性乙肝患者的表型,和T细胞功能的恢复可能是一个有用的治疗乙肝病毒的控制策略。9尽管HBsAg水平并不影响HBV-specific T细胞反应,我们证明患者T细胞与降低HBsAg PD-L1封锁的反应也就比较大。与以前的报告相符13我们观察到HBV-specific CD4 PD-1封锁的强大影响+比HBV-specific CD8 T细胞+T细胞。有趣的是,除去年龄的影响后,我们发现HBsAg残差和CD4之间显著负相关+以及CD8+T细胞复苏后PD-L1封锁。这证实了假设HBsAg减少可能是一个治疗目标增加功能和免疫疗法治疗。5重要的是,PD-L1封锁的影响的差异更加明显的患者人群分层HBcrAg比群体分层表面。因此,HBsAg程度更高的患者(1000 - 10 000国际单位/毫升)谁有最好的回应检查点封锁水平极低HBcrAg < 3日志U /毫升,这表明这些患者中可能来源于综合HBV DNA。此外,值得注意的是PD-L1封锁的影响更明显的core-specific pol-specific免疫反应,再次,通过类比勒伯特的研究等,12可能表明暴露于表面的时间已经太久,HBs-specific T细胞更难以恢复。这些数据可能因此表明cccDNA转录活动的程度和持续时间可能在复苏发挥了重要作用的T细胞的能力。同样,在抗原* 02-positive患者的队列中,我们观察到一群PD-L1封锁效应只在较低的HBsAg, HBcrAg低。有趣的是,只有波尔455年特殊技能CD8+t细胞的反应明显恢复了PD-L1封锁。它已被证明和波尔的讨论455年特殊技能和核心18特殊技能CD8+T细胞有不同的表现型和core-specific T细胞的扩张与PD-1呈正相关+/ CD127+T细胞,而波尔455年特殊T细胞则没有表现出这样的相关性。22我们还证实PD-1就越高+/ CD127+表情的核心18特殊的T细胞在我们的研究中。因此,我们假设这一核心18特殊技能CD8+T细胞是不像波尔受损455年特殊的T细胞,所以额外的免疫检查点封锁可能不会产生重大影响的扩张能力和最终的核心功能18特殊的T细胞,而波尔455年特殊T细胞可以通过检查点恢复封锁如果HBsAg HBcrAg很低。然而,PD-L1封锁的微分效应在不同的抗原决定基反应需要进一步调查和可能发展的重要免疫疗法。基于我们的研究结果,我们建议降低抗原水平(HBsAg水平低于一个阈值< 100国际单位/毫升,特别是HBcrAg水平低于3日志U /毫升)可能会增加体外免疫调节反应。重要的是,这种效果不是年龄相关的。一些临床研究表明,HBsAg水平非常低的阈值< 100国际单位/毫升表明提高免疫力。的确,HBsAg水平< 100国际单位/毫升可以标记来识别患者自发或治疗诱导的高概率HBsAg清除。6此外,一些回顾性研究显示,一些患者HBsAg水平很低(< 100国际单位/毫升)6或低HBcrAg水平33能够保持控制乙肝病毒长期抗病毒治疗终止后NA。也符合在小鼠模型的研究结果表明,HBsAg清除单克隆抗体的部分减少HBV-induced宽容和提高B细胞和CD4细胞+随后的治疗性疫苗接种的T细胞反应34,HBsAg减少使用小型干扰RNA改善后续的治疗性疫苗的反应,分别。5
可能会限制我们的研究是,它是在成人患者的横断面队列进行年龄超过18年。的影响可能在儿童和青少年患者更为明显。12由于大多数发达的慢性感染慢性乙肝患者的童年,35进一步的数据收集与慢性乙型肝炎病毒感染是儿童和青少年需要评估不同HBV病毒的长期影响标志的功能和表型资料HBV-specific T细胞。
我们还需要讨论,肝脏炎症,ALT水平升高表示,也可能有助于改变和受损HBV-specific T细胞反应,因为它已被证明,例如,缺乏精氨酸的肝脏发炎可能是CD8 T细胞缺陷信号的机制和功能。36然而,ALT水平在我们组升高只在少数的患者和没有显示T细胞反应的相关性。
总之,我们的数据表明,HBsAg本身的数量不会影响总成分的免疫细胞的表型和功能HBV-specific T细胞在成年HBeAg-negative病人。然而,年龄,这可能反映了抗原暴露的持续时间,和HBcrAg,这是建议cccDNA转录活动的更好的指标,可能对T细胞的反应有重要的影响,因此应被视为重要的病人选择分层。重要的是,非常低的抗原水平可能会影响T细胞反应免疫调节治疗(如检查点抑制)。因此,降低抗原负载的组合(HBsAg特别是HBcrAg)一起检查点抑制剂如PD-1 / PD-L1封锁或其他免疫干预治疗可能是一种很有前途的选择在未来治疗慢性乙型肝炎病毒感染。
数据可用性声明
所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。要求审稿人2我们删除一些多余的suplemnetary图。Howeverm,总是可以请求的数据。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
这项研究是汉诺威医学院伦理委员会批准的(道德官方数字:3374 - 2016)。
确认
补充图1创建了BioRender.com。
引用
补充材料
脚注
ARMK和MC是联合的资深作者。
贡献者EA, ARMK和MC负责的概念和设计研究。EA和MU-Q进行实验和数据分析。BM和BB乙型肝炎core-related抗原分析。MG和YL支持统计分析。岑提供病人的临床资料。所有作者的数据解释。EA, MU-Q ARMK、HW和MC写的手稿。ARMK和MC负责整个内容。所有作者批判修订后的手稿。
资金这项工作由德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、德国研究基金会)在德国的卓越战略- EXC 2155 - 390874280项目数字德国感染研究中心,DZIF(将地理TTU 05年高701 TTU必经05年高702 TTU - iich - 07 - 808)。埃尔迈拉Aliabadi和梅勒妮Urbanek-Quaing汉诺威支持的生物医学研究学院(哈佛商业评论)和感染生物学中心(ZIB)。
相互竞争的利益没有宣布。
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