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  • 蛋氨酸缺乏通过改变免疫检查点转录物的m6A甲基化促进抗肿瘤免疫

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菜单条
胃肠道癌症
原始研究
蛋氨酸缺乏通过改变m促进抗肿瘤免疫6免疫检查点转录物的甲基化
  1. 挺李1，2，
  2. Yue-Tao谭1，
  3. Yan-Xing陈1，
  4. 晓君郑3.，
  5. 文王4，
  6. 库恩廖1，
  7. 于莫1，
  8. Junzhong林1，5，
  9. 杨魏6，
  10. Hai-Long朴4，
  11. 瑞华徐1，7，
  12. Huai-Qiang居1，7
  1. 1华南肿瘤国家重点实验室，中山大学肿瘤中心肿瘤医学协同创新中心，广州，广东,中国
  2. 2消化科和泌尿科，湖南肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，长沙，湖南,中国
  3. 3.医学科学研究部，广东省人民医院，广东省医学科学院，广州，广东,中国
  4. 4中国科学院大连化学物理研究所中国科学院分析化学分离科学重点实验室，大连，辽宁,中国
  5. 5结直肠外科，中山大学癌症中心，广州，广东,中国
  6. 6南方医科大学广东省分子肿瘤病理学重点实验室，广州，广东,中国
  7. 7中国医学科学院胃肠癌精准诊疗研究单位，广州，广东,中国
  1. 对应到鞠怀强教授，中山大学癌症中心，广东广州;juhq在}{sysucc.org.cn；徐瑞华教授，中山大学癌症中心，广东广州;xurh在}{sysucc.org.cn；漂海龙教授，中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连;hpiao在}{dicp.ac.cn

摘要

客观的蛋氨酸代谢参与许多细胞功能，包括甲基化反应和氧化还原维持。然而，目前尚不清楚蛋氨酸代谢、RNA甲基化和抗肿瘤免疫是否在分子上相互交织。

设计在小鼠模型中评估了蛋氨酸限制饲料(MRD)的抗肿瘤免疫效果。研究了甲硫氨酸和含YTH域家族蛋白1 (YTHDF1)在体外和体内的肿瘤免疫逃逸机制。还研究了MRD或YTHDF1耗竭与PD-1阻断的协同效应。

结果我们发现，饮食中限制蛋氨酸可以减少肿瘤生长，并通过增加肿瘤浸润CD8的数量和细胞毒性来增强抗肿瘤免疫+不同小鼠模型的T细胞。机制上，蛋氨酸代谢衍生的s -腺苷甲硫氨酸促进N6-methyladenosine (m6A)肿瘤细胞中免疫检查点的甲基化和翻译，包括PD-L1和v域T细胞激活Ig抑制因子(VISTA)。此外，MRD或m6a特异性结合蛋白YTHDF1的缺失通过恢复CD8的浸润抑制肿瘤生长+T细胞，并与PD-1封锁协同更好地控制肿瘤。临床上，YTHDF1表达与癌症患者预后不良及免疫治疗效果相关。

结论蛋氨酸和YTHDF1通过调节T细胞的功能在抗癌免疫中发挥关键作用。靶向蛋氨酸代谢或YTHDF1可能是一种潜在的癌症免疫治疗新策略。

  • 免疫疗法
  • 甲基化
  • 结肠直肠癌

数据可用性声明

数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。根据合理的要求提供数据。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。RNA-seq数据和RIP-seq数据可在序列读取档案(SRA) PRJCA006189 (http://bigd.big.ac.cn/gsa-human/)．

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款授权他们的衍生作品，前提是原创作品被正确引用，给予适当的荣誉，任何更改都被注明，且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2022-326928

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    关于这个话题我们已经知道了什么

    • 蛋氨酸代谢参与许多细胞功能，蛋氨酸限制会阻碍肿瘤生长。

    • RNA N6-methyladenosine (m6A)修饰已被报道参与多种肿瘤的肿瘤进展和抗肿瘤免疫。

    • 免疫系统的稳态由免疫检查点控制，肿瘤劫持这些分子以逃避免疫监视和治疗耐药性。

    这项研究补充了什么

    • 蛋氨酸为RNA m提供甲基供体，在抗癌免疫和T细胞功能中起着至关重要的作用6一个修改。

    • YTHDF1和蛋氨酸代谢通过表观遗传调控机制参与调节免疫检查点分子的表达，包括PD-L1和v域Ig抑制因子的T细胞活化(VISTA)。

    • 蛋氨酸限制饮食或YTHDF1消耗抑制肿瘤生长，并与PD-1阻断协同作用，以更好地控制肿瘤。

    • YTHDF1高表达与免疫治疗效果差相关。

    这项研究将如何影响研究、实践或政策

    • 膳食蛋氨酸干预可能为癌症免疫治疗的新策略提供启示。

    • YTHDF1是免疫治疗结果的一种新的潜在生物标志物，有潜力区分哪些患者可以从免疫检查点封锁疗法中获得更大的益处。

    简介

    目前的免疫检查点封锁(ICB)疗法，包括靶向程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)或程序性死亡配体1 (PD-L1)的抗体，在治疗黑色素瘤和其他恶性肿瘤方面显示出前所未有的临床疗效。1然而，只有15%-20%的患者表现出临床反应，其余患者由于免疫逃避和治疗耐药而无反应。2因此，我们迫切需要结合ICB和疗效预测标记的新型联合疗法，并在临床前和临床研究中进行了广泛的研究。1 2例如，我们最近的临床试验显示PD-1阻断联合化疗(紫杉醇和顺铂)显著提高晚期食管癌患者的总生存期(OS)。3.我们还确定了ICB治疗的几个阳性预测标记物，包括微卫星不稳定性、肿瘤突变负担和DNA聚合酶epsilon突变。4个5此外，阐明免疫检查点的潜在调控机制对于制定有效的肿瘤免疫治疗策略至关重要。

    营养对健康有很大的影响，饮食干预是治疗代谢性疾病的常用手段。越来越多的证据表明，限制特定必需氨基酸的饮食可以改变癌症的发展和治疗结果。6 - 8蛋氨酸是一种必需氨基酸，也是人血浆中最易变的代谢物。9蛋氨酸代谢参与许多细胞功能，包括甲基化反应，氧化还原维持和叶酸代谢。10最近的一项研究表明，在荷瘤小鼠体内注射额外的蛋氨酸可以延缓肿瘤生长，并观察到与抗pd - l1阻断剂的协同抗肿瘤作用。11然而，膳食蛋氨酸限制是否会影响ICB的治疗结果还没有调查。

    甲硫氨酸在甲基转移酶的催化下转化为s -腺苷甲硫氨酸(SAM)，产生甲基化底物，参与组蛋白甲基化、5-甲基胞嘧啶(5-mC) DNA甲基化和N6-methyladenosine (m6核糖核酸甲基化。9RNA米6在各种细胞过程的表观遗传调控的另一个关键层中发现了一种修饰。然而，免疫抑制分子和ICB治疗结果是否受蛋氨酸代谢和RNA m的影响6修改方案在很大程度上仍是未知的。

    在这项研究中，我们发现蛋氨酸代谢通过调节PD-L1和v域Ig抑制T细胞激活(VISTA)的表达来影响免疫治疗反应6依赖的方式。我们揭示了蛋氨酸代谢之间的一个新的机制联系6甲基化与抗肿瘤免疫在肿瘤进展中的作用，建议蛋氨酸膳食干预或靶向治疗6特异性结合蛋白YTH结构域家族蛋白1 (YTHDF1)是一种潜在的抗肿瘤免疫治疗方法。

    材料和方法

    详情见在线补充材料和方法．

    结果

    蛋氨酸对抗肿瘤免疫至关重要

    为了研究从饮食中限制蛋氨酸是否通过激活肿瘤免疫抑制肿瘤生长，我们将CT26细胞皮下接种到免疫正常的同基因小鼠(BALB/c)和免疫缺陷小鼠Rag2-/-小鼠分别饲喂对照日粮(CD)和蛋氨酸限制日粮(MRD)。MRD饲喂5 d后，两株小鼠血清蛋氨酸显著降低(在线补充图S1A)．MRD饲喂对两组CT26细胞和MC38细胞的肿瘤生长均有抑制作用，但在具有免疫能力的同基因小鼠(BALB/c和C57BL/6J)中抑制作用更明显，提示MRD饲喂通过适应性免疫发挥抗肿瘤作用(图1 a, B，在线补充图S1B,C)．如前所述，蛋氨酸限制培养基抑制肿瘤细胞生长，增加细胞死亡和内源性乳酸脱氢酶释放(在线补充图S1D-F)．考虑到Rag2-/-小鼠具有正常功能的树突状细胞(dc)、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和缺乏CD8+我们假设肿瘤生长抑制的差异不是由树突状细胞，巨噬细胞和NK细胞引起的，而是由T细胞引起的。免疫组化(IHC)显示CD8浸润增强+CT26肿瘤组织中的T细胞来自MRD组(图1 c，在线补充图S2B)．接下来，我们评估肿瘤浸润CD8的功能+通过流式细胞术分析(在线补充图S2A)．与CD组相比，MRD组CD8增强+肿瘤中GZMB和IFN-γ信号均较强，CD8信号差异不大+T细胞浸润脾脏，引流淋巴结和血液(图1 d，在线补充图S2C-F)．细胞因子的产生和CD8的肿瘤浸润没有差异+但在MRD组和CD组之间细胞毒性增加(在线补充图S3A-C)．

    Methionine is critical for antitumour immunity. (A, B) Subcutaneous tumour models established in BALB/c mice and Rag2-/- mice showing the tumour growth rate (A) and growth rate change (B) after implantation of CT26 cells with control diet (CD) or methionine-restricted diet (MRD) feeding (n=6 mice per group). (C) Quantification of CD8 staining in subcutaneous tumour model mice implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (D) Flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells, CD8+ GZMB+ T cells and CD8+ IFN-γ+ T cells in subcutaneous tumour model mice implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (E) Pathway alterations in subcutaneous tumour model mice implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding. (F) Gene set enrichment analysis of the effector CD8+ T cell signature in subcutaneous tumour implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding. (G) Experimental design for the AOM-DSS induced mouse colon cancer model with CD or MRD feeding. (H, I) Representative images (H), tumour number (left) and tumour size (right) (I) of spontaneous colon tumours with CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (J) Quantification of CD8 staining in the spontaneous mouse colon cancer model with CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (K) Heatmap of changed metabolites in subcutaneous tumour model mice implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (L) Normalised intensities of LCYH, SAM, MTA, SAH, Met, GSH and homoserine in subcutaneous tumour model mice implanted with CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (M) Immunoblotting of H3K4me3, H3K9me3 and H3K27me3 from subcutaneous CT26 and MC38 tumours subjected to CD or MRD feeding. H3 was included as a loading control. (N) DNA dot blot assays of 5-mC in subcutaneous CT26 and MC38 tumours subjected to CD or MRD feeding. Methylene blue staining served as a loading control. (O) RNA m6A dot blot assays in subcutaneous CT26 and MC38 tumours subjected to CD or MRD feeding. Methylene blue staining served as a loading control. (P) RNA m6A dot blot assays in spontaneous mouse colon cancer model with CD or MRD feeding (300 ng). Methylene blue staining served as a loading control. The data in A–D, I, J and L are presented as the means±SDs. P values were determined by two-way ANOVA (A), one-way ANOVA (B) and two-tailed unpaired Student’s t-test (C, D, I-L). *P<0.05; **P<0.01. ANOVA, analysis of variance; AOM, azoxymethane; CD, control diet; DSS, dextran sulfate sodium; GSH, glutathione; LCYH, L-cystathionine; MRD, methionine-restricted diet; 5-mC, 5-methylcytosine; MTA, 5'-methylthioadenosine; SAM, S-adenosylmethionine; SAH, S-adenosyl-l-homocysteine.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    蛋氨酸对抗肿瘤免疫至关重要。(A, B) BALB/c小鼠皮下肿瘤模型Rag2-/-CT26细胞植入后肿瘤生长速率(A)和生长速率变化(B)小鼠，对照组饲粮(CD)或蛋氨酸限制饲粮(MRD)喂养(每组n=6只)。(C)皮下肿瘤模型小鼠植入CT26细胞并进行CD或MRD喂养(n=6只/组)的CD8染色定量。(D)流式细胞术分析CD8数目+CD8 T细胞,+GZMB+T细胞和CD8+干扰素-γ+皮下肿瘤模型小鼠植入CT26细胞并给予CD或MRD喂养(每组6只)。(E)皮下肿瘤模型小鼠植入CT26细胞并接受CD或MRD喂养的通路改变。(F)效应子CD8的基因集富集分析+皮下肿瘤植入CT26细胞并接受CD或MRD喂养的T细胞信号。(G)采用CD或MRD喂养的AOM-DSS诱导小鼠结肠癌模型的实验设计。(H, I)喂养CD或MRD的自发性结肠肿瘤的代表性图像(H)、肿瘤数量(左)和肿瘤大小(右)(I)(每组n=6只)。(J) CD或MRD喂养的自发性小鼠结肠癌模型(n=6只/组)中CD8染色的量化。(K)皮下肿瘤模型小鼠植入CT26细胞并进行CD或MRD喂养(每组n=6只)代谢产物变化的热图。(L)皮下肿瘤模型小鼠植入CT26细胞并给予CD或MRD喂养(每组6只)后LCYH、SAM、MTA、SAH、Met、GSH和高丝氨酸的归一化强度。(M)从CD或MRD喂养的皮下CT26和MC38肿瘤中免疫印迹H3K4me3, H3K9me3和H3K27me3。H3作为加载控制项。(N) CD或MRD喂养后皮下CT26和MC38肿瘤中5-mC的DNA点印迹分析。亚甲基蓝染色作为加载对照。 (O) RNA m6在皮下CT26和MC38肿瘤中进行点印迹试验。亚甲基蓝染色作为加载对照。(P) m RNA6用点印迹法测定CD或MRD喂养(300 ng)的自发性小鼠结肠癌模型。亚甲基蓝染色作为加载对照。A-D、I、J、L的数据以均值±SDs表示。P值采用双向方差分析(A)、单向方差分析(B)和双尾无配对Student 's t检验(C, D, I-L)确定。* P < 0.05;* * P < 0.01。方差分析，方差分析;急性中耳炎,azoxymethane;CD,控制饮食;DSS:葡聚糖硫酸钠; GSH, glutathione; LCYH, L-cystathionine; MRD, methionine-restricted diet; 5-mC, 5-methylcytosine; MTA, 5'-methylthioadenosine; SAM, S-adenosylmethionine; SAH, S-adenosyl-l-homocysteine.

    Methionine restriction enhances antitumour immunity via YTHDF1. (A) RNA m6A dot blot assays of GFP+ CT26 cells (left) and GFP+ MC38 cells (right) from subcutaneous tumours subjected to CD or MRD feeding. Methylene blue staining served as a loading control. (B, C) Gene set enrichment analysis of the interferon-γ response (B) and effector CD8+ T cell signature (C) in CRC with high or low expression of YTHDF1 in TCGA. (D) TCR shannon entropy in data from TCGA for CRC with high or low expression of YTHDF1. (E) Representative images (left) and quantification (right) showing the correlation between YTHDF1 and CD8 in CRC microarray specimens (n=200, scale bar: 100 µm). (F) Correlations of the CD8+ T cell infiltration or CTL score with YTHDF1 in other TCGA cancer types. (G) Subcutaneous tumour models showing the tumour growth rate after implantation of YTHDF1-knockdown or control CT26 cells with CD (left) or MRD (right) feeding in BALB/c mice (n=6 mice per group). (H) Subcutaneous tumour models showing the tumour growth rate after implantation of YTHDF1-knockdown or control cells in Rag2-/- mice (n=6 mice per group). (I, J) Flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells, CD8+ GZMB+ T cells and CD8+ IFN-γ+ T cells in subcutaneous tumour model mice implanted with YTHDF1-knockdown or control CT26 cells and subjected to CD or MRD feeding (n=6 mice per group). (K) Experimental design for the AOM-DSS induced mouse colon cancer model established in Ythdf1fl/fl and Ythdf1iKO mice. (L, M) Representative images (L), tumour number and tumour size (M) of spontaneous tumours in Ythdf1fl/fl and Ythdf1iKO mice. (N) Representative images (left) and quantification of H&E and CD8 staining (right) in a spontaneous mouse colon cancer model established in Ythdf1fl/fl and Ythdf1iKO mice (scale bar: 100 µm) (n=6 mice per group). The data in G–J, M and N are presented as the means±SDs. P values were determined by Pearson’s χ2 test (E), two-way ANOVA (G–H), one-way ANOVA (I–J) and two-tailed unpaired Student’s t-test (M N). *P<0.05; **P<0.01; ANOVA, analysis of variance; AOM, azoxymethane; CD, control diet; CRC, colorectal cancer; CTL, cytotoxic T lymphocyte; DSS, dextran sodium sulfate; n.s, not significant; TCGA,The Cancer Genome Atlas.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    蛋氨酸限制通过YTHDF1增强抗肿瘤免疫。(一)m RNA6绿色荧光蛋白的点印迹分析+CT26细胞(左)和GFP+MC38细胞(右)来自皮下肿瘤经过CD或MRD喂养。亚甲基蓝染色作为加载对照。(B, C)干扰素-γ反应(B)和效应子CD8的基因集富集分析+CRC中的T细胞特征(C)， TCGA中YTHDF1的高表达或低表达。(D) YTHDF1高表达或低表达CRC的TCGA数据中的TCR shannon熵。(E)显示CRC微阵列样品中YTHDF1和CD8相关性的代表性图像(左)和定量图像(右)(n=200，比例尺:100µm)。(F) CD8的相关性+T细胞浸润或CTL评分与YTHDF1在其他TCGA癌症类型。(G)皮下肿瘤模型，显示BALB/c小鼠(n=6只/组)植入ythdf1敲除或对照CT26细胞(左)和CD(右)喂养的肿瘤生长速率。(H)皮下肿瘤模型显示ythdf1基因敲除或对照细胞植入后的肿瘤生长速率Rag2-/-小鼠(n=6只/组)。(I, J)流式细胞术分析CD8数目+CD8 T细胞,+GZMB+T细胞和CD8+干扰素-γ+皮下肿瘤模型小鼠植入ythdf1敲除或对照CT26细胞，并给予CD或MRD喂养(每组6只)。(K)建立的AOM-DSS诱导小鼠结肠癌模型的实验设计Ythdf1fl / fl而且Ythdf1都老鼠。(L, M)自发性肿瘤的代表性图像(L)、肿瘤数量和肿瘤大小(M)Ythdf1fl / fl而且Ythdf1都老鼠。(N)小鼠自发结肠癌模型的代表性图像(左)和H&E和CD8染色定量(右)Ythdf1fl / fl而且Ythdf1都小鼠(比例尺:100 μ m) (n=6只/组)。G-J、M和N的数据以均值±SDs表示。P值用Pearson χ测定2检验(E)、双向方差分析(G-H)、单向方差分析(I-J)和双尾无配对Student 's t检验(M N)。*P<0.05;* * P < 0.01;方差分析，方差分析;急性中耳炎,azoxymethane;CD,控制饮食;CRC,结直肠癌;CTL，细胞毒性T淋巴细胞;DSS，葡聚糖硫酸钠;n,不重要;TCGA，癌症基因组图谱。

    Methionine and YTHDF1 promote the translation of PD-L1 and VISTA. (A) Metagene plot of the density of YTHDF1 binding sites in HCT116 cells. (B) Venn diagram showing the shared genes between T cell function suppressors in gastrointestinal (GI) cancer and YTHDF1 target genes. (C) RIP assays in CRC cells showing the direct binding between the YTHDF1 protein and PD-L1, VISTA, EGFR, PVR, MDM2 and NFE2L2 transcripts. (D) Immunoblotting of PD-L1 and VISTA after YTHDF1 inhibition (left) or overexpression (right) in CRC cells. GAPDH was included as a loading control. (E) Flow cytometric analysis of PD-L1 and VISTA after YTHDF1 inhibition (left) or overexpression (right) in CRC cells. (F) Immunoblotting of PD-L1 and VISTA after METTL3 (left) or METTL14 (right) inhibition in CRC cells. GAPDH was included as a loading control. (G) Flow cytometric analysis of PD-L1 and VISTA after MTC inhibition in CT26 cells. (H) RNA m6A dot blot assays and immunoblotting of PD-L1 and VISTA in CRC cells subjected to methionine restriction. Methylene blue staining and GAPDH served as a loading control. (I) Immunoblotting (left) and flow cytometric analyses (right) of PD-L1 after methionine restriction (MR) or YTHDF1 inhibition with IFN-γ stimulation in CRC cells. GAPDH was included as a loading control. (J) qPCR analysis of PD-L1 expression after MR or YTHDF1 inhibition with IFN-γ stimulation in CT26 cells. (K) Polysome profiles and qPCR analysis of YTHDF1-knockdown or control CT26 cells on a 5%–50% sucrose gradient. The data in C, E, G, I, J and K are presented as the means±SDs. P values were determined by two-tailed unpaired Student’s t-test (C, HCT116 in E and G) and one-way ANOVA (CT26 in E, I, and J). **P<0.01; n.s, not significant. ANOVA, analysis of variance; CRC, colorectal cancer; MFI, mean fluorence intensity; MTC, methyltransferase complex; RIP, RNA immunoprecipitation.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    蛋氨酸和YTHDF1促进PD-L1和VISTA的翻译。(A) HCT116细胞中YTHDF1结合位点密度的超基因图。(B)胃肠道(GI)癌中T细胞功能抑制因子与YTHDF1靶基因共享基因的维恩图。(C) CRC细胞中RIP检测显示YTHDF1蛋白与PD-L1、VISTA、EGFR、PVR、MDM2和NFE2L2转录本直接结合。(D) CRC细胞中YTHDF1抑制(左)或过表达(右)后PD-L1和VISTA的免疫印迹。GAPDH被作为加载控制。(E)在CRC细胞中抑制YTHDF1(左)或过表达YTHDF1(右)后PD-L1和VISTA的流式细胞术分析。(F) CRC细胞中METTL3(左)或METTL14(右)抑制后PD-L1和VISTA的免疫印迹。GAPDH被作为加载控制。(G) CT26细胞中MTC抑制后PD-L1和VISTA的流式细胞术分析。 (H) RNA m6在受蛋氨酸限制的CRC细胞中进行PD-L1和VISTA的点印迹分析和免疫印迹。亚甲基蓝染色和GAPDH作为加载对照。(I) CRC细胞中蛋氨酸限制(MR)或YTHDF1抑制(IFN-γ刺激)后PD-L1的免疫印迹(左)和流式细胞术分析(右)。GAPDH被作为加载控制。(J)用IFN-γ刺激抑制CT26细胞中MR或YTHDF1后PD-L1表达的qPCR分析。(K) ythdf1敲除或对照CT26细胞在5%-50%蔗糖梯度上的多聚体图谱和qPCR分析。C、E、G、I、J、K的数据以均值±SDs表示。P值采用双尾无配对Student 's t检验(C, E和G中HCT116)和单因素方差分析(E, I和J中CT26)确定。**P<0.01;n,不重要。方差分析，方差分析; CRC, colorectal cancer; MFI, mean fluorence intensity; MTC, methyltransferase complex; RIP, RNA immunoprecipitation.

    基因集富集分析表明，与免疫反应相关的途径，如IFN-γ反应和IFN-α反应，受到蛋氨酸限制饲粮的影响(图1 e)．此外，效应子CD8+在缺乏蛋氨酸的情况下，T细胞信号明显增强(图1 f)，表明适应性免疫反应参与了mrd介导的肿瘤发生阻断。因此，这些结果表明，蛋氨酸缺乏在免疫能力强的同基因小鼠中通过增强肿瘤浸润性T细胞在一定程度上抑制肿瘤生长。

    为了进一步确定MRD是否通过加强T细胞反应来影响宿主的抗肿瘤免疫，我们使用明确的氮氧甲烷和右旋糖酐硫酸钠(AOM-DSS)小鼠模型来发展结肠炎相关结肠癌(图1 g)．两组均观察到中分化结肠腺癌(图1 h)．值得注意的是，与CD小鼠相比，MRD小鼠的肿瘤数量和大小都显著减少(图1我)．此外，MRD喂养显著提高了CD8水平+结肠肿瘤中的T淋巴细胞(图1 j，在线补充图S4A)．为了进一步探索我们发现的适用性，我们使用了疾病的异种移植抗宿主模型，在该模型中，将人外周血单个核细胞注入NOG小鼠的循环系统，其中人CD45+细胞、CD8+T细胞和功能性CD8+干扰素-γ+可成功检测到T细胞，且这些细胞在脾脏的浸润不受MRD喂养的影响(在线补充图S4B,C)．然后，我们将HCT116和HT29结肠癌细胞皮下移植到我们的人源化小鼠模型中，观察到肿瘤生长速度和肿瘤重量在MRD喂养的背景下显著控制(在线补充图S4D,E)．不出所料，CD8的浸润+MRD组肿瘤中T细胞显著增加(在线补充图S4F)．因此，这些数据进一步证实了MRD通过抗肿瘤免疫介导的抑制肿瘤发展的作用。

    蛋氨酸参与许多细胞功能。代谢物分析显示，MRD组肿瘤组织中存在显著的半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径相关代谢物(图1 k，在线补充图S5A)．MRD喂养显著降低肿瘤组织中l -胱氨酸(LCYH)、SAM、s -腺苷同型半胱氨酸(SAH)、谷胱甘肽(GSH)和l -蛋氨酸(Met)的水平(图1 l)．细胞内蛋氨酸在甲基转移后先转化为SAM，再转化为SAH，这可能与组蛋白、DNA 5-mC和RNA m的甲基化水平有关6A在大块肿瘤中(在线补充图S5B)．如我们所料，MRD的饲养影响了上述甲基化反应，其中5-mC和m6甲基化在大块肿瘤细胞中明显减少(图1 m-o，在线补充图S5C)．另外，MRD的饲喂也降低了RNA m6甲基化水平在AOM-DSS诱导的结肠肿瘤(图1 p)．综上所述，这些结果表明MRD的喂养降低了肿瘤组织中甲基供体SAM的水平，并可能间接破坏肿瘤浸润T细胞的效应功能。

    蛋氨酸限制通过YTHDF1增强抗肿瘤免疫

    近年来的研究表明，DNA 5-mC修饰和RNA m6一种修饰是由一系列分别作为甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白的调节剂调节的。12日13通过对癌症基因组图谱(TCGA)数据库的相关分析，14日15我们发现了CD8+T细胞浸润与一些调控因子的表达呈负相关，其中m6a特异性结合蛋白YTHDF1呈最显著的负相关(在线补充图S6A)．RNA米6点印迹分析也表明，MRD的饲喂降低了RNA m6GFP中的甲基化水平+流式细胞术对肿瘤细胞进行分类(图2一个)．IFN-γ反应下调及效应子CD8+YTHDF1高表达的结直肠癌(CRC)肿瘤中的T细胞标记进一步支持了CD8与肿瘤的负相关+T细胞介导的抗肿瘤免疫与YTHDF1的表达(图2 b, C)．此外，YTHDF1的表达与TCR多样性呈负相关，由TCR shannon熵(图2 d)．免疫组化分析证实YTHDF1表达与CD8浸润呈负相关+蛋白水平的T细胞(图2 e)．通过分析TCGA中其他类型癌症的RNA-seq数据，我们进一步验证了在各种肿瘤中存在类似的负相关关系(图2 f)，这表明YTHDF1可能是一种免疫抑制分子，在各种肿瘤中对T细胞功能起作用。

    为了测试MRD是否通过YTHDF1影响T细胞介导的抗肿瘤功能，我们在CT26和MC38细胞中敲除YTHDF1 (shYTHDF1# 1，# 2)，通过免疫印迹(在线补充图S6B)．我们初步比较了细胞的体外生长，观察到ythdf1敲除细胞和载体控制细胞之间的增殖差异很小(在线补充图S6C)．然后我们将这些细胞皮下接种到小鼠体内，给小鼠喂食CD或MRD，观察肿瘤的生长速度。在乳糜泻喂养背景下，抑制YTHDF1表达分别显著抑制BALB/c和C57BL/6J小鼠CT26细胞和MC38细胞的肿瘤生长(图2 g，在线补充图S6D,E)．然而，YTHDF1的抑制作用在MRD喂养的环境中被抵消(图2 g，在线补充图S6D,E)，暗示YTHDF1参与了mrd介导的肿瘤发生中断。此外，我们观察到免疫缺陷患者中ythdf1基因敲除和对照组肿瘤生长几乎没有差异Rag2−−/老鼠(图2 h，在线补充图S6F,G)，提示YTHDF1参与了适应性免疫反应。流式细胞术分析显示CD8增强+T细胞浸润和功能性CD8增加+将ythdf1 -敲除肿瘤组织中的T细胞接种于喂养CD的小鼠与喂养MRD的小鼠(图2 i, J，在线补充图S6H-J)．总之，这些数据不仅证明了YTHDF1作为免疫抑制分子的功能，而且还强调了YTHDF1通过限制T细胞激活和增加细胞毒性潜能在mrd介导的抗肿瘤效率中发挥的潜在作用。

    为了确定YTHDF1在T细胞应答和抗肿瘤免疫中的抑制作用，我们生成了条件肠Ythdf1基因敲除小鼠(在线补充图S7A,B的floxed等位基因的小鼠Ythdf1在控制之下pVillin-Cre-ERT2司机。16日17为了确定YTHDF1在肿瘤起始后是否持续需要肿瘤进展，我们在最终DSS治疗后给予他莫西芬(图2 k)．在五次他莫西芬治疗后，Ythdf1在肠上皮细胞中诱导消耗(在线补充图S7C)．值得注意的是，条件消耗Ythdf1在AOM-DSS小鼠模型的晚期，显著减少了大腺瘤的多样性和总腺瘤的负荷，与WT小鼠相比，肿瘤数量和体积都减少了50% (图2 l, M)．H&E和IHC染色也显示Ythdf1-/-小鼠的结肠炎症较轻，CD8含量较高+T细胞比WT小鼠(图2 n)．总的来说，我们的数据显示肠道Ythdf1-缺陷小鼠在接受AOM-DSS挑战时，结肠肿瘤的形成减少。

    蛋氨酸和YTHDF1促进PD-L1和VISTA的翻译

    肿瘤和免疫系统之间的相互作用驱动了一个动态的免疫编辑过程，促进了癌症免疫逃避。18随后，我们进行RNA免疫沉淀(RIP)-seq分析YTHDF1的识别靶点。结果表明，大多数YTHDF1结合位点位于蛋白质编码序列(CDSs)中，在停止密码子附近和3 '非翻译区高度富集(图3一)．通过将目标基因与胃肠道肿瘤中的T细胞抑制分子交叉，19我们收集了6个可能介导YTHDF1免疫抑制功能的分子(图3 b)．结合这些结果与RIP-qPCR分析，我们确定免疫抑制分子PD-L1和VISTA是YTHDF1的重要靶基因(图3 c)．免疫印迹分析和流式细胞术分析显示，PD-L1和VISTA的表达随YTHDF1的下调或过表达而改变(图3 d, E，在线补充图S8A-C)．这些结果表明YTHDF1可能调控PD-L1和VISTA的表达6依赖的方式。

    甲基转移酶样蛋白(mettl3)和METTL14是甲基转移酶复合体的两个重要组成部分，催化N6腺苷。13与YTHDF1的数据一致，通过免疫印迹分析，METTL3和METTL14的表达下调了HCT116和CT26细胞中PD-L1和VISTA的表达(图3 f，在线补充图S8D,E)．此外，METTL3/METTL14复合物衰竭后，细胞膜上PD-L1和VISTA的表达显著降低(图3 g)．进一步研究表明，蛋氨酸限制培养基也降低了PD-L1和VISTA的表达水平(图3 h，在线补充图S8F,G)．因为IFN-γ是肿瘤微环境中通过IFN-γ- stat1 -PD-L1信号通路促进PD-L1表达的主要刺激物，20.我们进行了IFN-γ刺激试验，发现IFN-γ刺激后CRC细胞中PD-L1蛋白水平增加;这些水平可通过敲除YTHDF1或限制蛋氨酸而降低(图3我，在线补充图S8H)．然而，mRNA水平无法挽救(图3 j)．YTHDF1,米6一种解读蛋白，直接促进甲基化mrna的翻译。21因此，我们评估了mRNA水平，发现YTHDF1敲低和蛋氨酸限制都不会影响PD-L1和VISTA的转录水平(在线补充图S8I,J)．最后，多聚体分析表明，YTHDF1敲低导致多聚体部分减少，PD-L1和VISTA mRNA向非多聚体部分适度转移，导致PD-L1和VISTA mRNA的翻译效率降低(图3 k)．这些结果表明YTHDF1促进PD-L1和VISTA的蛋白合成。

    YTHDF1调节PD-L1和VISTA的表达6依赖的方式

    然后，使用YTHDF1特异性抗体的RIP-qPCR显示，在HCT116细胞和CT26细胞中，YTHDF1与PD-L1或VISTA mRNA之间有很强的结合，可以被蛋氨酸限制或METTL3/METTL14复合体敲除显著抑制(图4 a, B)．通过对RIP-seq数据的分析，预测了m6使用SRAMP工具的PD-L1和VISTA转录本(http://www.cuilab.cn/sramp)，我们选取了三个电位为m的潜在结合区域6PD-L1 (P1, P2, P3)和VISTA (V1, V2, V3)转录本中的一个位点(图4 c)进行MeRIP-qPCR和CLIP-qPCR进一步验证。米6PD-L1主要在P1和P3位点发生并被YTHDF1识别，而VISTA主要发生在V2和V3位点(图4 d, E，在线补充图S9A)．此外，降低培养液中蛋氨酸的浓度显著地消除了YTHDF1与这些结合位点之间的相互作用(图4 f, G)．最后，我们进行了体外和体内RNA下拉实验，以验证反向结合的方式。体外实验显示PD-L1和VISTA RNA寡核苷酸与m6合成过程中对一致位点的修饰可以结合YTHDF1 (图4 h，在线补充图S9B)．此外，在m6PD-L1和VISTA RNA探针的一个位点(A到T)在体内显著地取消了YTHDF1蛋白与这些RNA探针之间的结合(图4我)．综合起来，我们的数据确定了具体的m6PD-L1和VISTA mRNA转录本上的一个结合位点被YTHDF1识别。

    YTHDF1 regulates PD-L1 and VISTA expression in an m6A-dependent manner. (A, B) RIP enrichment of PD-L1 and VISTA mRNAs after MR (A) or MTC inhibition (B) in CRC cells. (C) Distribution of YTHDF1 binding peaks and m6A motif prediction across PD-L1 and VISTA transcripts in HCT116 cells. (D) MeRIP-qPCR analysis of specific m6A motif enrichment in PD-L1 (left) and VISTA (right) mRNAs in HCT116 cells. (E) CLIP-qPCR analysis of specific YTHDF1 binding enrichment in PD-L1 (left) and VISTA (right) mRNAs in HCT116 cells. (F) MeRIP-qPCR analysis of specific m6A motif enrichment in PD-L1 (left) and VISTA (right) mRNAs after methionine restriction in HCT116 cells. (G) CLIP-qPCR analysis of specific YTHDF1 binding enrichment in PD-L1 (left) and VISTA (right) mRNAs after methionine restriction in HCT116 cells. (H, I) In vitro and in vivo RNA pull-down assays for YTHDF1 binding to biotinylated PD-L1 (left) probes or biotinylated VISTA (right) probes in HCT116 cells. GAPDH was included as a loading control. The data in A, B, D–G are presented as means±SDs. P values were determined by two-tailed unpaired Student’s t-test (A, B, D–G). *P<0.05, **P<0.01. CRC, colorectal cancer; MTC, methyltransferase complex.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    YTHDF1调节PD-L1和VISTA的表达6依赖的方式。(A, B) CRC细胞中MR (A)或MTC抑制(B)后PD-L1和VISTA mrna的RIP富集。(C) YTHDF1结合峰和m的分布6HCT116细胞中PD-L1和VISTA转录本的基序预测。(D)特异性m6HCT116细胞中PD-L1(左)和VISTA(右)mrna中的基序富集。(E) HCT116细胞中PD-L1(左)和VISTA(右)mrna特异性YTHDF1结合富集的CLIP-qPCR分析。(F)特异性m6HCT116细胞中蛋氨酸限制后PD-L1(左)和VISTA(右)mrna中的基序富集。(G) HCT116细胞中蛋氨酸限制后PD-L1(左)和VISTA(右)mrna特异性YTHDF1结合富集的CLIP-qPCR分析。(H, I) HCT116细胞中YTHDF1与生物素化PD-L1(左)探针或生物素化VISTA(右)探针结合的体外和体内RNA下拉试验。GAPDH被作为加载控制。A、B、D-G中的数据以平均值±SDs表示。P值由双尾无配对学生t检验(A, B, D-G)确定。* * * P < 0.05, P < 0.01。CRC,结直肠癌;申请者甲基转移酶复杂。

    MRD或YTHDF1衰竭与PD-1阻断协同作用

    在上述研究结果的基础上，我们进一步研究了在小鼠模型中限制饲粮中蛋氨酸或消耗YTHDF1是否会增强ICB治疗的抗肿瘤活性。我们首先测试了蛋氨酸限制是否与PD-1封锁协同作用。携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠在触及肿瘤时给予CD或MRD喂养，然后用对照IgG或抗pd -1抗体治疗。与对照抗体IgG相比，抗pd -1抗体对CT26肿瘤生长的影响有限(图5一个)，与先前的研究结果一致。22有趣的是，饮食中限制蛋氨酸与抗pd -1治疗协同作用，导致肿瘤生长明显抑制和肿瘤重量显著下降(图5一个，在线补充图S10A)．这些影响伴随着CD8的增加+肿瘤内的T细胞浸润(图5一个)．然后将ythdf1敲除细胞和对照CT26细胞分别皮下注射给BALB/c小鼠，并处理对照IgG或抗pd -1抗体。与对照组相比，ythdf1敲除CT26的小鼠肿瘤生长较慢，肿瘤重量降低，CD8增加+T细胞浸润(图5 b，在线补充图S10B)．使用MC38皮下肿瘤模型，无论是饮食中蛋氨酸限制还是YTHDF1敲除，也观察到类似的结果(图5 c, D，在线补充图S10C,D)．此外，与单一治疗组相比，联合治疗组小鼠的OS显著延长(图5 e, F)．

    MRD feeding or YTHDF1 depletion synergises with PD-1 blockade and has clinical implications. (A) CT26 subcutaneous tumour growth and flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells with CD or MRD feeding treated with IgG or αPD-1 (n=6 mice per group). (B) Subcutaneous tumour growth and flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells with YTHDF1-knockdown or control CT26 cells treated with IgG or αPD-1 (n=6 mice per group). (C) MC38 subcutaneous tumour growth and flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells with CD or MRD feeding treated with IgG or αPD-1 (n=6 mice per group). (D) Subcutaneous tumour growth and flow cytometric analysis of the number of CD8+ T cells with YTHDF1-knockdown or control MC38 cells treated with IgG or αPD-1 (n=6 mice per group). (E, F) Kaplan-Meier analysis of the survival of C57BL/6J mice in the indicated groups (n=6 mice per group). (G) qPCR analysis of YTHDF1 expression in CRC tissues from paired adjacent normal tissues (N, n=78) and primary tumour samples (T, n=78), and from patients without recurrence (R−, n=48) and with recurrence (R+, n=48) at SYSUCC. (H) Representative IHC images and quantification of YTHDF1 in CRC-adjacent normal tissues vs CRC tumour tissues (scale bar: 100 µm, n=383). (I) MeRIP-qPCR assays of the m6A enrichment of PD-L1 and VISTA mRNAs in 24 paired CRC primary tumour samples and adjacent normal tissue samples. (J) Kaplan-Meier analysis of overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) based on YTHDF1 expression in the SYSUCC cohort. (K) Kaplan-Meier analysis of OS or DFS based on YTHDF1 expression in published ICI treatment cohorts. (L) Working model of the proposed mechanism in this study. The data in A–D are presented as the means±SDs. The data in E, F, J and K were determined by Kaplan-Meier analysis with the log-rank test. The data in G–I are presented as a box-and-whisker graph (min-max), and the horizontal line across the box indicates the median. P value was determined by two-way ANOVA (tumour volume in A–D), one-way ANOVA (NO. of CD8+ T cells / g (×103) in A–D) and two-tailed unpaired Student’s t-test (G–I). *P<0.05; **P<0.01; n.s, not significant. ANOVA, analysis of variance; ICI, immune checkpoint inhibitor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    MRD喂养或YTHDF1耗竭与PD-1阻断协同作用，具有临床意义。(A) CT26皮下肿瘤生长及流式细胞术分析CD8数目+用IgG或αPD-1处理CD或MRD的T细胞(每组6只)。(B)皮下肿瘤生长及流式细胞术分析CD8数目+ythdf1敲除的T细胞或IgG或αPD-1处理的对照CT26细胞(每组6只)。(C) MC38皮下肿瘤生长及流式细胞术分析CD8数目+用IgG或αPD-1处理CD或MRD的T细胞(每组6只)。(D)皮下肿瘤生长及流式细胞术分析CD8数目+ythdf1敲除的T细胞和IgG或αPD-1处理的MC38细胞(每组6只)。(E, F) C57BL/6J小鼠在指定组(n=6只/组)的生存Kaplan-Meier分析。(G) YTHDF1在结直肠癌组织中表达的qPCR分析，这些组织来自SYSUCC配对的相邻正常组织(N, N =78)和原发肿瘤样本(T, N =78)，以及无复发(R−，N =48)和复发(R+， N =48)的结直肠癌组织。(H)癌旁正常组织与癌旁肿瘤组织中YTHDF1的代表性IHC图像和定量(标尺:100µm, n=383)。(I) m6PD-L1和VISTA mrna在24对CRC原发肿瘤样本和相邻正常组织样本中的富集。(J)基于SYSUCC队列中YTHDF1表达的总生存率(OS)和无病生存率(DFS) Kaplan-Meier分析。(K)基于已发表的ICI治疗队列中YTHDF1表达的OS或DFS Kaplan-Meier分析。(L)本研究提出的机制的工作模型。A-D中的数据以均值±SDs表示。E、F、J、K的数据采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验确定。G-I中的数据以框须图(min-max)的形式表示，横过框的水平线表示中值。P值采用双因素方差分析(A-D肿瘤体积)、单因素方差分析(NO。CD8的+T细胞/ g (×103.)和双尾无配对学生t检验(G-I)。* P < 0.05;* * P < 0.01;n,不重要。方差分析，方差分析;ICI，免疫检查点抑制剂。

    YTHDF1与不良预后和免疫治疗结果相关

    最后，我们检查了YTHDF1表达与CRC患者临床结果之间的潜在关系。基于现有的TCGA数据，我们发现YTHDF1转录本在几种肿瘤组织中高于匹配的正常组织(在线补充图S10E)．接下来，我们通过RT-qPCR和IHC检测了我院(中山大学肿瘤中心)CRC组织队列中YTHDF1的表达。结果表明，YTHDF1不仅在结直肠癌组织中表达上调，而且在复发性结直肠癌组织中表达上调(图5 g, H)．MeRIP-qPCR也证实了m6PD-L1和VISTA转录本的修饰水平在CRC组织中显著增加(图5我)．值得注意的是，Kaplan-Meier生存分析表明，YTHDF1高表达水平患者的OS和无病生存期(DFS)较短(图5 j)．多因素分析也表明YTHDF1的表达是CRC患者的一个独立预后因素，提示YTHDF1是一个潜在的预后生物标志物(在线补充表S1)．考虑到YTHDF1和抗肿瘤免疫之间的联系，我们还从三个已发表的免疫治疗RNA-seq队列中检查了YTHDF1表达与接受免疫治疗的患者的临床结果之间的相关性。第23 - 25正如预期的那样，在预处理样本中表现出高YTHDF1表达水平的患者中观察到明显较短的OS (图5 k)．此外，在治疗样本中YTHDF1表达水平较高的患者仍然表现出较差的OS (图5 k)．因此，YTHDF1表达水平有可能区分哪些患者可以从ICB中获得更大的益处。

    讨论

    新的证据表明，癌症代谢不仅在肿瘤的发生和进展中起着至关重要的作用，而且在调节抗肿瘤免疫反应方面具有更广泛的意义。癌细胞可以通过与肿瘤浸润的免疫细胞竞争必需的营养物质来抑制抗肿瘤免疫反应。26日27日另一方面，癌症代谢的异常中间体也对微环境中的免疫细胞产生深远的影响。28-31卞之前的一项研究等肿瘤细胞破坏了CD8中的蛋氨酸代谢+T细胞，从而降低细胞内蛋氨酸水平，并导致T细胞免疫功能受损。此外，补充蛋氨酸增加了荷瘤小鼠和结肠癌患者的T细胞免疫力。11我们现在发现，饮食中蛋氨酸的限制会导致癌细胞中一系列代谢物的减少，包括SAM，它控制着m的通量6一个甲基化反应。通过控制免疫检查点抑制剂(ICIs) PD-L1和VISTA的表达，这些变化提高了抗肿瘤效率，改善了ICB治疗的临床疗效6依赖的方式。我们的工作也与其他报道一致，MRD抑制肿瘤生长。8尺码本研究中所采用的蛋氨酸限制饲粮不同于汴的完全缺乏蛋氨酸或瘤内注射补充蛋氨酸的饲粮等这可能是我们研究结果不同的原因。我们的研究结果突出了蛋氨酸在调节抗肿瘤免疫反应中的新作用6A是主要因素，进一步表明代谢干预有望提高免疫疗法的有效性。超越蛋氨酸限制和m的基本作用6A在抗肿瘤免疫中，肿瘤抑制可能参与了其他机制，如蛋氨酸限制效应中的免疫成分的改变和组蛋白K4/9/27me3甲基化，这些都值得深入研究。

    肿瘤劫持了抑制检查点以逃避免疫介导的根除。最近的研究发现了几种癌症中的免疫检查点分子，包括PD-1、PD-L1、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)、VISTA和淋巴细胞激活3 (LAG3)。35 36其中，PD-1/PD-L1这两种最知名的集成电路已经实现了从实验室到临床应用的转变。3 37VISTA是一种新兴的ICI，是一种新的B7家族成员，在几种具有pd -1独立免疫逃避机制的人类癌症中抑制T细胞的免疫逃避和肿瘤进展，使其成为癌症联合免疫治疗的一个有前途的靶点。38 39有趣的是，一些研究表明，VISTA的免疫抑制作用可能是使用抗pd -1抗体治疗的黑色素瘤患者获得性耐药的潜在机制。40 41在我们的数据中，MRD或YTHDF1的缺失都降低了PD-L1和VISTA的表达，所以即使抗PD-1治疗阻断了PD-1/PD-L1通路，VISTA仍然发挥着重要的免疫抑制作用。这一发现在一定程度上解释了为什么MRD中PD-1阻断或YTHDF1缺失联合治疗可以逆转CT26冷肿瘤的免疫治疗耐受，并增强MC38热肿瘤的免疫治疗反应。

    显然，阐明这些ICIs的功能和调控机制有助于制定有效的肿瘤免疫治疗策略。根据文献，PD-L1和VISTA的表达受多种转录和翻译后机制的调控。35 42此外，VISTA的表达受到转录因子叉头盒D3 (FOXD3)和缺氧诱导因子1α (HIF-1α)的转录上调。43 44我们的研究为YTHDF1识别m提供了一种新的调控机制6PD-L1和VISTA中含有a的mRNA转录本，提高了它们的翻译效率。此外，我们从表观遗传RNA修饰和转录后调控的角度阐明了PD-L1和VISTA的调控机制，为理解免疫检查点分子的调控增加了新的科学内容。

    尽管近年来ICB治疗取得了可喜的成果，但在某些特定肿瘤类型和癌症患者中，ICB治疗的总体有效率仍不理想。迫切需要验证有效的标记来区分哪些患者实际上可以从ICB治疗中获益。对RNA m的不断加深的理解6肿瘤免疫微环境的改变促进了免疫疗法的发展和ICB治疗的新预测标记的识别。45最近的研究表明，m6甲基转移酶METTL3是巨噬细胞激活的阳性调节因子46个47肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的METTL14促进CD8+T细胞功能障碍与肿瘤进展。48除了这些关于巨噬细胞的研究，最近的研究也报道了m6甲基化程序通过调节肿瘤细胞、树突状细胞、NK细胞和其他细胞的功能来协调癌症生长和免疫逃逸。49此外,米6a相关分子，如METTL3、METTL14和ALKBH5，参与调节对抗pd -1治疗的反应，22日50作为免疫治疗的潜在预测生物标志物。我们的研究不仅揭示了RNA m的一种新的调控机制6一项涉及到抗肿瘤免疫的修饰，但也强调了基于YTHDF1表达差异进行患者选择的蛋氨酸限制与抗pd -1治疗的组合策略可以产生有前景的生存效益。

    从我们工作模型的数据可以看出(图5 l)，我们的研究丰富了我们对蛋氨酸代谢、RNA和RNA之间的机制联系的认识6甲基化与肿瘤进展中的抗肿瘤免疫。首先，蛋氨酸通过为RNA m提供甲基供体，在抗癌免疫和T细胞功能中发挥关键作用6一个修改。其次，YTHDF1的表观遗传调控机制涉及调节免疫检查点分子的表达，这表明YTHDF1是一种新的潜在的免疫治疗结果的生物标志物。鉴于在不同的小鼠模型中，膳食蛋氨酸限制与PD-1阻断具有协同作用，进一步研究膳食蛋氨酸干预可能为癌症免疫治疗的新策略提供启示。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。根据合理的要求提供数据。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为在线补充信息上传。RNA-seq数据和RIP-seq数据可在序列读取档案(SRA) PRJCA006189 (http://bigd.big.ac.cn/gsa-human/)．

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    所有组织切片均经SYSUCC机构研究伦理委员会批准。所有的动物研究都是按照SYSUCC临床研究和动物试验机构伦理委员会批准的方案进行的。伦理批准ID为GZR2020-189。

    致谢

    我们感谢人类代谢组技术公司(日本HMT)和安捷伦技术公司(美国)的技术支持。

    参考文献

    1. ↵
      1. TopalianSL，
      2. TaubeJM，
      3. PardollDM
      ．新辅助检查点封锁用于癌症免疫治疗．科学2020；367：eaax0182．doi: 10.1126 / science.aax0182pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32001626
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    2. ↵
      1. 对冲基金PS，
      2. 陈DS
      ．癌症免疫治疗的十大挑战．免疫力2020；52：17- - - - - -35．doi: 10.1016 / j.immuni.2019.12.011
      OpenUrl CrossRef PubMed
    3. ↵
      1. 罗H，
      2. 陆J，
      3. 白Y，等
      ．Camrelizumab与安慰剂联合化疗对晚期或转移性食管鳞癌患者生存期和无进展生存期的影响．《美国医学会杂志》2021；326：916- - - - - -25．doi: 10.1001 / jama.2021.12836
      OpenUrl CrossRef PubMed
    4. ↵
      1. SamsteinRM，
      2. 李碳氢键，
      3. Shoushtari一个，等
      ．肿瘤突变负荷预测多种癌症免疫治疗后的生存．Nat麝猫2019；51：202- - - - - -6．doi: 10.1038 / s41588 - 018 - 0312 - 8pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30643254
      OpenUrl CrossRef PubMed
    5. ↵
      1. 王F，
      2. 赵问，
      3. 王y n，等
      ．评价POLE和POLD1突变作为多种癌症免疫治疗结果的生物标志物．JAMA杂志2019；5：1504- - - - - -6．doi: 10.1001 / jamaoncol.2019.2963
      OpenUrl PubMed
    6. ↵
      1. MuthusamyT，
      2. CordesT，
      3. Handzlik可，等
      ．丝氨酸限制改变鞘脂多样性以抑制肿瘤生长．自然2020；586：790- - - - - -5．doi: 10.1038 / s41586 - 020 - 2609 - xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32788725
      OpenUrl CrossRef PubMed
    7. ↵
      1. 梅多斯GG，
      2. 皮尔森高频，
      3. 阿卜杜拉RM，等
      ．膳食中酪氨酸和苯丙氨酸对B16黑素瘤对卡比多巴-左旋多巴甲酯化疗反应的影响．癌症Res1982；42：3056- - - - - -63．pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7093952
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    8. ↵
      1. 高X，
      2. 桑德森SM，
      3. 戴Z，等
      ．膳食蛋氨酸影响小鼠癌症模型的治疗，并改变人体代谢．自然2019；572：397- - - - - -401．doi: 10.1038 / s41586 - 019 - 1437 - 3
      OpenUrl CrossRef PubMed
    9. ↵
      1. MentchSJ，
      2. Mehrmohamadi米，
      3. 黄l，等
      ．组蛋白甲基化动态和基因调控通过感知单碳代谢发生．细胞金属底座2015；22：861- - - - - -73．doi: 10.1016 / j.cmet.2015.08.024pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26411344
      OpenUrl CrossRef PubMed
    10. ↵
      1. 桑德森SM，
      2. 高X，
      3. 戴Z，等
      ．健康和癌症中的蛋氨酸代谢:饮食和精准医疗的联系．Nat牧师癌症2019；19：625- - - - - -37．doi: 10.1038 / s41568 - 019 - 0187 - 8
      OpenUrl CrossRef PubMed
    11. ↵
      1. 扁Y，
      2. 李W，
      3. 克雷默DM，等
      ．癌症SLC43A2改变了T细胞的蛋氨酸代谢和组蛋白甲基化．自然2020；585：277- - - - - -82．doi: 10.1038 / s41586 - 020 - 2682 - 1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32879489
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      1. 的旧事新兴市场，
      2. 毛刺毫升，
      3. 班尼斯特AJ，等
      ．DNA、RNA和组蛋白甲基化在衰老和癌症中的作用．Nat Rev Mol细胞生物学2019；20.：573- - - - - -89．doi: 10.1038 / s41580 - 019 - 0143 - 1
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      1. 黄H，
      2. 翁H，
      3. 陈J
      ．编码和非编码rna中的M6A修饰:在癌症中的作用和治疗意义．癌症细胞2020；37：270- - - - - -88．doi: 10.1016 / j.ccell.2020.02.004
      OpenUrl CrossRef PubMed
    14. ↵
      1. 癌症基因组图谱研究网络，
      2. 温斯坦约，
      3. CollissonEA，等
      ．癌症基因组图谱泛癌症分析项目．Nat麝猫2013；45：1113- - - - - -20.．doi: 10.1038 / ng.2764pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24071849
      OpenUrl CrossRef PubMed
    15. ↵
      1. 纽曼我，
      2. SteenCB，
      3. 刘CL，等
      ．用数字细胞术测定大块组织的细胞类型丰度和表达．生物科技Nat》2019；37：773- - - - - -82．doi: 10.1038 / s41587 - 019 - 0114 - 2pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31061481
      OpenUrl PubMed
    16. ↵
      1. 麦迪逊BB，
      2. 邓巴l，
      3. 乔XT，等
      ．绒毛基因的顺式元件控制肠垂直(隐窝)和水平(十二指肠，盲肠)轴的限制性区域的表达．J临床生物化学2002；277：33275- - - - - -83．doi: 10.1074 / jbc.M204935200pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12065599
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    17. ↵
      1. el MarjouF，
      2. 詹森kp)，
      3. 常BH-J，等
      ．肠道上皮组织特异性和可诱导的cre介导重组．《创世纪》2004；39：186- - - - - -93．doi: 10.1002 / gene.20042pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15282745
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    18. ↵
      1. Wellenstein医学博士，
      2. 德维瑟柯
      ．形成肿瘤免疫景观的癌细胞固有机制．免疫力2018；48：399- - - - - -416．doi: 10.1016 / j.immuni.2018.03.004
      OpenUrl CrossRef PubMed
    19. ↵
      1. 俄文B，
      2. 黄CN，
      3. 通Y，等
      ．TISIDB:肿瘤-免疫系统相互作用的集成资源库门户．生物信息学2019；35：4200- - - - - -2．doi: 10.1093 /生物信息学/ btz210pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30903160
      OpenUrl CrossRef PubMed
    20. ↵
      1. LvH，
      2. LvG，
      3. 陈C，等
      ．河畔+代谢维持诱导PD-L1表达驱动肿瘤免疫逃避．细胞金属底座2021；33：110- - - - - -27．doi: 10.1016 / j.cmet.2020.10.021pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33171124
      OpenUrl PubMed
    21. ↵
      1. 王X，
      2. 赵废话，
      3. 山地白杨IA，等
      ．N(6)-甲基腺苷调节信使RNA的翻译效率．细胞2015；161：1388- - - - - -99．doi: 10.1016 / j.cell.2015.05.014pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26046440
      OpenUrl CrossRef PubMed
    22. ↵
      1. 王l，
      2. 回族H，
      3. AgrawalK，等
      ．米6一种RNA甲基转移酶METTL3/14调节抗pd -1治疗的免疫应答．Embo J2020；39：e104514．doi: 10.15252 / embj.2020104514pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32964498
      OpenUrl PubMed
    23. ↵
      1. 雨果W，
      2. ZaretskyJM，
      3. 太阳l，等
      ．转移性黑色素瘤患者抗pd -1治疗反应的基因组和转录组特征．细胞2016；165：35- - - - - -44．doi: 10.1016 / j.cell.2016.02.065pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26997480
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      1. RiazN，
      2. 哈维尔JJ，
      3. 马卡洛夫V，等
      ．nivolumab免疫治疗过程中肿瘤和微环境的变化．细胞2017；171：934- - - - - -49．doi: 10.1016 / j.cell.2017.09.028pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29033130
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      1. 赵J，
      2. 陈斧头，
      3. 加特雷尔理查德·道金斯，等
      ．胶质母细胞瘤抗pd -1免疫治疗反应的免疫和基因组相关性．Nat地中海2019；25：462- - - - - -9．doi: 10.1038 / s41591 - 019 - 0349 - ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30742119
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      1. Sukumar米，
      2. RoychoudhuriR，
      3. RestifoNP
      ．营养竞争:肿瘤免疫抑制的新轴心．细胞2015；162：1206- - - - - -8．doi: 10.1016 / j.cell.2015.08.064pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26359979
      OpenUrl CrossRef PubMed
    27. ↵
      1. 夏l，
      2. Oyangl，
      3. 林J，等
      ．癌症代谢重编程和免疫反应．摩尔癌症2021；20.：28．doi: 10.1186 / s12943 - 021 - 01316 - 8
    28. ↵
      1. 瑞安DG，
      2. 墨菲国会议员，
      3. FrezzaC，等
      ．克雷布斯循环代谢物与免疫和癌症信号的耦合．Nat金属底座2019；1：16- - - - - -33．doi: 10.1038 / s42255 - 018 - 0014 - 7pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31032474
      OpenUrl PubMed
    29. ↵
      1. DodardG，
      2. 塔塔一个，
      3. 埃里克TK，等
      ．炎症诱导乳酸导致肝组织内NK细胞的快速流失．细胞代表2020；32：107855．doi: 10.1016 / j.celrep.2020.107855
    30. ↵
      1. 品牌一个，
      2. 歌手K，
      3. Koehl通用电气，等
      ．ldha相关乳酸的产生减弱了T细胞和NK细胞对肿瘤免疫的监视．细胞金属底座2016；24：657- - - - - -71．doi: 10.1016 / j.cmet.2016.08.011pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27641098
      OpenUrl CrossRef PubMed
    31. ↵
      1. 刘N，
      2. 罗J，
      3. 旷D，等
      ．乳酸抑制肿瘤相关巨噬细胞中Atp6v0d2的表达，促进hif -2α介导的肿瘤进展．中国投资2019；129：631- - - - - -46．doi: 10.1172 / JCI123027
      OpenUrl
    32. ↵
      1. 游荡D，
      2. 霍布森K，
      3. 霁X
      ．蛋氨酸限制与癌症生物学．营养物质2020；12：684．doi: 10.3390 / nu12030684
    33. ↵
      1. StrekalovaE，
      2. 马林D，
      3. 好DM，等
      ．蛋氨酸缺失通过增强TRAIL受体-2的表达诱导三阴性乳腺癌细胞的靶向易感性．中国癌症Res2015；21：2780- - - - - -91．doi: 10.1158 / 1078 - 0432. - ccr - 14 - 2792pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25724522
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    34. ↵
      1. 母鸡小，
      2. Sinha我，
      3. PerodinF，等
      ．蛋氨酸限制饮食通过增加无腺裸鼠细胞周期抑制剂抑制mcf10at1来源的乳腺肿瘤的生长．BMC癌症2016；16：349．doi: 10.1186 / s12885 - 016 - 2367 - 1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27255182
      OpenUrl CrossRef PubMed
    35. ↵
      1. 他X，
      2. 徐C
      ．免疫检查点信号与癌症免疫治疗．细胞Res2020；30.：660- - - - - -9．doi: 10.1038 / s41422 - 020 - 0343 - 4pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32467592
      OpenUrl PubMed
    36. ↵
      1. 秦年代，
      2. 徐l，
      3. 易米，等
      ．新的免疫检查点目标:超越PD-1和CTLA-4．摩尔癌症2019；18：155．doi: 10.1186 / s12943 - 019 - 1091 - 2pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31690319
      OpenUrl CrossRef PubMed
    37. ↵
      1. 刘B，
      2. 首歌Y，
      3. 刘D
      ．PD-1和PD-L1抗体在癌症免疫治疗中的临床应用进展．中华内科杂志杂志2017；10：174．doi: 10.1186 / s13045 - 017 - 0541 - 9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29195503
      OpenUrl PubMed
    38. ↵
      1. 元l，
      2. TatineniJ，
      3. 马奥尼公里，等
      ．Vista:肿瘤免疫治疗中一个很有前途的靶点．趋势Immunol2021；42：209- - - - - -27．doi: 10.1016 / j.it.2020.12.008
      OpenUrl CrossRef PubMed
    39. ↵
      1. 黄X，
      2. 张X，
      3. 李E，等
      ．在癌症免疫治疗中检测肿瘤和免疫细胞的免疫调节蛋白．中华内科杂志杂志2020；13：83．doi: 10.1186 / s13045 - 020 - 00917 - ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32600443
      OpenUrl CrossRef PubMed
    40. ↵
      1. KakavandH，
      2. Jackett拉，
      3. 孟席斯我，等
      ．vista对阴性免疫检查点的调控:转移性黑色素瘤患者获得性抵抗pd -1治疗的机制．国防部分册2017；30.：1666- - - - - -76．doi: 10.1038 / modpathol.2017.89
      OpenUrl PubMed
    41. ↵
      1. 刘J，
      2. 元Y，
      3. 陈W，等
      ．免疫检查点蛋白vista和PD-1非冗余调节小鼠t细胞反应．美国国家科学研究院2015；112：6682- - - - - -7．doi: 10.1073 / pnas.1420370112pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25964334
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    42. ↵
      1. Lim年代，
      2. 李北京市建筑，
      3. 夏W，等
      ．CSN5对PD-L1的去泛素化和稳定作用．癌症细胞2016；30.：925- - - - - -39．doi: 10.1016 / j.ccell.2016.10.010pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27866850
      OpenUrl CrossRef PubMed
    43. ↵
      1. 邓J，
      2. 李J，
      3. Sarde一个，等
      ．缺氧诱导远景促进肿瘤微环境中骨髓源性抑制细胞的抑制功能．癌症Immunol Res2019；7：1079- - - - - -90．doi: 10.1158 / 2326 - 6066. -新闻- 18 - 0507
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    44. ↵
      1. 罗森鲍姆老，
      2. Knecht米，
      3. Mollaee米，等
      ．FOXD3调节黑色素瘤中vista的表达．细胞代表2020；30.：510- - - - - -24．doi: 10.1016 / j.celrep.2019.12.036
      OpenUrl CrossRef
    45. ↵
      1. 陈H，
      2. 姚J，
      3. 保R，等
      ．四种类型的RNA修饰作者的交叉对话定义了结直肠癌的肿瘤微环境和药物基因组景观．摩尔癌症2021；20.：29．doi: 10.1186 / s12943 - 021 - 01322 - w
    46. ↵
      1. 通J，
      2. 王X，
      3. 刘Y，等
      ．混合CRISPR筛选识别m6A作为巨噬细胞激活的阳性调节因子．Sci副词2021；7：eabd4742．doi: 10.1126 / sciadv.abd4742pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33910903
      OpenUrl 免费的全文
    47. ↵
      1. 阴H，
      2. 张X，
      3. 杨P，等
      ．Rna M6a甲基化通过巨噬细胞重编程协调癌症生长和转移．Nat Commun2021；12：1394．doi: 10.1038 / s41467 - 021 - 21514 - 8
    48. ↵
      1. 越南盾l，
      2. 陈C，
      3. 张Y，等
      ．肿瘤相关巨噬细胞中RNA n6 -腺苷甲基转移酶metttl14的丢失促进CD8+ T细胞功能障碍和肿瘤生长．癌症细胞2021；39：945- - - - - -57．doi: 10.1016 / j.ccell.2021.04.016
      OpenUrl
    49. ↵
      1. 妈年代，
      2. 杨ydF4y2BaJ，
      3. 巴尔T，等
      ．RNA M6a读子YTHDF2控制NK细胞抗肿瘤和抗病毒免疫．J Exp地中海2021；218：e20210279．doi: 10.1084 / jem.20210279
      OpenUrl
    50. ↵
      1. 李N，
      2. 康Y，
      3. 王l，等
      ．Alkbh5通过调节肿瘤微环境中的乳酸和抑制免疫细胞积累来调节抗pd -1治疗反应．美国国家科学研究院2020；117：20159- - - - - -70．doi: 10.1073 / pnas.1918986117pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32747553
      OpenUrl 摘要/免费的全文

    补充材料

    脚注

    • TL、Y-TT、Y-XC和X-JZ贡献相当。

    • 贡献者H-QJ和R-HX设计了这项研究。TL、Y-TT、Y-XC、X-JZ、KL、WW、H-YM和JL采集数据。H-QJ、TL、Y-TT和Y-XC对数据进行了分析和解释。TL、Y-TT、Y-XC进行统计学分析。H-QJ、TL和Y-TT撰写了手稿。H-LP和WY参与了讨论和数据解释。H-QJ、R-HX、H-LP、TL、Y-TT、X-JZ对原稿进行了修改。H-QJ作为担保人监督并承担全部工作责任。所有作者审阅了手稿并批准了最终版本。The findings of this study are available from the corresponding authors on reasonable request.

    • 资金本研究得到国家自然科学基金(82022052,81871951)、广东省自然科学基金(2019A1515010233)、广州市科技计划项目(201904020046)、北京市科技创新医学发展基金(KC2021-JX-0186-65)和中国科学院医学科学创新基金(2019- i2d -5-036)资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 患者和公众的参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。