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菜单条gydF4y2Ba
肝脏病学gydF4y2Ba
原始研究gydF4y2Ba
基于海量细胞术的外周血分析作为实体肿瘤早期检测的新工具:一项多中心研究gydF4y2Ba
  1. 七张gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
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  30. Tingbo梁gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba肝胆胰外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江大学医学院附属第一医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba浙江省胰腺疾病重点实验室gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江大学医学院附属第一医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba浙江省肝胆胰疾病临床研究中心gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  4. 4gydF4y2Ba浙江省胰腺疾病研究创新中心gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  5. 5gydF4y2Ba癌症中心gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江大学gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  6. 6gydF4y2Ba阿里浙江大学未来数字医疗联合研究中心gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  7. 7gydF4y2Ba浙江普洛特健康科技有限公司gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  8. 8gydF4y2Ba肝胆胰外科及微创外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江省人民医院，杭州医学院附属人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  9. 9gydF4y2Ba肝胆胰外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba温州大学医学院附属第一医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba温州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  10. 10gydF4y2Ba肝胆胰外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba中国科学院大学肿瘤医院(浙江省肿瘤医院)，中国科学院基础医学与癌症研究所gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  11. 11gydF4y2Ba肿瘤内科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba三门人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba台州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  12. 12gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江大学医学院湖州市中心医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba湖州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  13. 13gydF4y2Ba外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba长兴人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba湖州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  14. 14gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba宁波市医疗中心丽汇丽东方医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba宁波gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  15. 15gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba嵊州市人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba嵊州市gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  16. 16gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba海宁市人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba海宁gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  17. 17gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba嘉兴市第二人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba嘉兴gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  18. 18gydF4y2Ba肝胆胰外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba南昌大学第二附属医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba南昌gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  19. 19gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba绍兴市上虞市人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba上虞gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  20. 20.gydF4y2Ba肝胆胰外科“，gydF4y2Ba，gydF4y2Ba河北医科大学第二医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba石家庄gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  21. 21gydF4y2Ba普通外科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba鸡西县人民医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba鸡西gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  22. 22gydF4y2Ba消化内科gydF4y2Ba，gydF4y2Ba浙江大学医学院附属第一医院gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杭州gydF4y2Ba,中国gydF4y2Ba
  1. 对应到gydF4y2Ba梁廷波教授，浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科，浙江杭州庆春路79号，310003;gydF4y2Baliangtingbo在}{zju.edu.cngydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

客观的gydF4y2Ba肿瘤的早期发现仍然是一个未满足的医疗需求，迫切需要具有高敏感性和特异性的方法。大规模细胞飞行时间(CyTOF)是一种强大的免疫细胞分析技术，可应用于肿瘤检测。我们试图建立肝细胞癌(HCC)和胰导管腺癌(PDAC)的诊断模型。gydF4y2Ba

设计gydF4y2Ba我们对来自15个中心的2348名参与者进行了CyTOF分析，其中包括1131名患有肝脏疾病的参与者，584名患有胰腺疾病的参与者和633名健康志愿者。通过随机森林算法构建诊断模型，并在子组中进行验证。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba我们测定了HCC和PDAC引起的全身免疫紊乱，并根据所构建的模型计算了外周血免疫评分(PBIScore)。PBIScore在检测HCC和PDAC方面表现良好，在验证队列中敏感性和特异性均在80%左右。我们进一步将PBIScore与甲胎蛋白或碳水化合物抗原19-9结合，构建了整合型PBIScore (iPBIScore)。在训练组、内部验证组和外部验证组中，用于HCC的iPBIScore的曲线下面积(AUC)分别为0.99、0.97和0.96。同样，PDAC的iPBIScore在训练组、内部验证组和外部验证组的AUC分别为0.99、0.98和0.97。在早期和肿瘤标志物阴性患者中，我们基于ipbiscore的模型也显示AUC分别为0.95-0.96和0.81-0.92。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba我们的研究证明了外周血免疫细胞亚群的改变可以辅助肿瘤检测，并为HCC和PDAC提供了一个现成的检测模型。gydF4y2Ba

  • 肿瘤标记物gydF4y2Ba
  • 肝细胞癌gydF4y2Ba
  • 胰腺癌gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

如有合理要求，可提供资料。gydF4y2Ba

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/gydF4y2Ba

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2022-327496gydF4y2Ba

数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    关于这个话题我们已经知道了什么gydF4y2Ba

    • 癌症的早期发现有助于患者及时接受治疗，改善预后。gydF4y2Ba

    • 肿瘤负荷小鼠模型证明了肿瘤的存在与免疫大环境的系统性功能障碍之间的关系。gydF4y2Ba

    • 细胞飞行时间(CyTOF)技术作为一种新型技术，可以在高维平面上反映免疫细胞的组成和数量。gydF4y2Ba

    这项研究补充了什么gydF4y2Ba

    • 我们的研究通过外周血CyTOF分析，确定了人肝细胞癌(HCC)或胰导管腺癌(PDAC)引起的外周免疫细胞亚群的改变。gydF4y2Ba

    • 基于CyTOF和随机森林算法获得的细胞标记物和亚群构建的模型在检测恶性肿瘤患者方面表现出优异的性能。gydF4y2Ba

    这项研究如何影响研究、实践或政策gydF4y2Ba

    • CyTOF作为辅助检测HCC和PDAC的潜在工具，也表明CyTOF因其对系统免疫的更高维度描述，有可能成为多癌筛查的新工具方法。gydF4y2Ba

    简介gydF4y2Ba

    恶性肿瘤，如肝细胞癌(HCC)和胰腺导管腺癌(PDAC)，其特点是发病隐匿，导致诊断和治疗的延误。目前临床上使用的常规血清学检测因其低敏感性或低特异性而受到限制。例如，甲胎蛋白(AFP)的敏感性低于50%，急性肝病和妊娠常伴有甲胎蛋白升高。gydF4y2Ba1 - 3gydF4y2Ba同样，大约20%的PDAC患者癌抗原19-9 (CA19-9)呈阴性，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而良性胆管梗阻和肾功能损害常引起CA19-9水平升高。gydF4y2Ba5 - 7gydF4y2Ba因此，迫切需要新的肿瘤筛查和早期检测工具。gydF4y2Ba

    新兴的液体活检技术主要涉及检测循环肿瘤DNA (ctDNA)、无细胞rna(如信使rna、microRNAs)、循环肿瘤细胞(CTCs)和外泌体，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba尝试取代传统的血清学筛查方法或组织活检。例如，在HCC中，血清代谢组，5-羟甲基胞嘧啶和ctDNA，在检测患者的HCC时表现出良好的性能，曲线下面积(AUC)范围为0.8至0.9。gydF4y2Ba9 - 11gydF4y2Ba这些策略在肿瘤检测领域已经证明了它们的优势和潜力。然而，目前还没有被广泛接受的用于肿瘤检测的液体活检策略。gydF4y2Ba

    在过去的十年中，免疫疗法的发展已经改变了癌症治疗的决策，并在许多类型的癌症中取得了成功。gydF4y2Ba12 - 14gydF4y2Ba免疫疗法的快速发展加深了我们对癌症与免疫系统之间关系的认识。最近一项使用小鼠模型的研究发现，肿瘤诱导的免疫宏观环境的系统功能障碍可以通过肿瘤切除来恢复。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba此外，个体免疫是跨组织协调的，局部抗肿瘤免疫反应依赖于与外周血的持续通信。gydF4y2Ba16日17gydF4y2Ba例如，肿瘤中相当比例的调节性T细胞(treg)来源于自然发生的胸腺treg。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba免疫细胞的频率和状态在肿瘤进展过程中动态变化。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba此外，胃癌和肺癌患者外周血中调节B细胞数量增加，乳腺癌患者外周血中自然杀伤细胞抑制性受体(NK)表达增加。gydF4y2Ba月19 - 21日gydF4y2Ba越来越多的证据支持这样的观点，即肿瘤的发生和发展伴随着全身免疫紊乱和周围免疫细胞的改变。gydF4y2Ba15 -gydF4y2Ba因此，循环的免疫分析可能有助于检测肿瘤;然而，迄今为止还没有这样成功的尝试。gydF4y2Ba

    CyTOF是一种检测免疫细胞组成和数量的新技术。gydF4y2Ba25日- 27日gydF4y2Ba为了检验外周血免疫细胞在肿瘤检测中的价值，我们开展了一项大容量、多中心的研究，利用CyTOF获得了外周血免疫细胞组成、表型和功能的全面信息。本研究的目的是利用CyTOF建立HCC和PDAC的诊断模型，并试图了解模型背后的逻辑，以便更好地应用于临床。gydF4y2Ba

    材料与方法gydF4y2Ba

    参与者军团gydF4y2Ba

    这是一项多中心前瞻性研究，从2019年10月至2022年7月，从中国15个中心共招募了2348名参与者。培训队列和内部验证队列来自领导中心(浙江大学医学院附属第一医院)。我们采用年龄分层随机抽样的方法，分别选取其中900名和500名，构建肝脏组和胰腺组的训练队列。来自领先中心的其余参与者被用于内部验证。外部验证队列包括来自4个省的其他14个中心的参与者(gydF4y2Ba在线补充表S1gydF4y2Ba)．对于内部验证组和外部验证组，实验者和分析人员对所有参与者的信息和诊断进行了盲法处理。通过超声、CT或MRI确诊。其中，HCC由病理或临床诊断确定，PDAC由病理根据临床指南确定。接受手术切除的患者的诊断经组织病理学进一步证实。肝脏良性疾病包括但不限于血管瘤(164例)、囊肿(66例)和局灶性结节增生(71例)。胰腺良性疾病包括但不限于神经内分泌肿瘤(28例)、囊性肿瘤(120例)、自身免疫性胰腺炎(9例)和慢性胰腺炎(18例)。在常规体检中采集健康志愿者的外周血样本。通过查阅体检结果和病史确定其健康状况。排除标准如下:有癌症相关治疗史; acute infections; blood transfusion within the past 6 months; use of drugs affecting the composition of peripheral blood, such as recombinant human erythropoietin and interleukins, within the past 2 weeks; recurrent tumours; decompensated dysfunction of organs; immune deficiency syndrome; haematological precancerous diseases; receiving immunosuppressive therapy; and confirmed coagulopathy.

    样品采集与处理gydF4y2Ba

    在任何抗肿瘤治疗前采集每个参与者的外周血样本(每人5毫升)。采集的样品在室温下12小时内或在4℃左右48小时内运到实验室处理。所有样本都没有冷冻保存，所有分析都是在新鲜血液样本上进行的。采用密度梯度离心法从外周血中分离外周血单个核细胞(pmcs)。细胞沉淀重悬于5ml预冷荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(1×phosphate缓冲盐水(PBS)，添加0.5%牛血清白蛋白)中，400×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下加热5分钟。丢弃上清液，细胞沉淀再次悬浮于FACS缓冲液中。计数细胞数，后续分析样品质量应满足以下要求:细胞数不少于3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba存活率应高于85%。gydF4y2Ba

    CyTOF染色及数据采集gydF4y2Ba

    本研究中使用的每个抗体的提供者、克隆号和质量标签显示在gydF4y2Ba在线补充表S2gydF4y2Ba．使用Maxpar抗体偶联试剂盒(Fluidigm)进行带有质量标签的抗体标记。用NanoDrop检测抗体的质量标记浓度。使用抗体稳定剂缓冲液将标记抗体的浓度调整为200 mg/mL。应对偶联抗体进行滴定，以获得最佳使用浓度。用PBS清洗获得的细胞，用100µL 250 nM顺铂(Fluidigm, South San Francisco, California, USA)在冰上染色5分钟以排除死亡细胞，并在Fc受体阻断溶液中孵育，然后用表面抗体鸡尾酒在冰上染色30分钟。PBS洗涤后，我们使用独特的条形码同位素组合标记单个细胞样本30分钟。细胞用FACS缓冲液清洗两次，并固定在200µL插层溶液(Maxpar Fix和Perm buffer含250 nM 191/193Ir, Fluidigm)中过夜。固定后，用FACS缓冲液清洗细胞，然后用Perm缓冲液(eBioscience, San Diego, California, USA)清洗细胞，并用细胞内抗体鸡尾酒在冰上染色30分钟。细胞被清洗并在去离子水中重悬，加入20% EQ珠(Fluidigm)并应用于大规模细胞仪(Helios, Fluidigm)。 The CyTOF experiments were performed by PLTTECH (Hangzhou, China). Before each batch of samples were loaded, the instrument adjusted the signal strength of each channel according to the same beads signal (140Ce,151Eu,153Eu,165Ho,175Lu). All samples were standardised to avoid batch effect before analysis.

    CyTOF数据分析gydF4y2Ba

    每个样本的数据使用带有唯一质量标记条形码的双重过滤方案从原始数据中去条形码。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba每一个。不同批次生成的FCS文件采用珠子归一化方法归一化。gydF4y2Ba29gydF4y2Ba我们使用FlowJo软件(FlowJo, Ashland, Oregon, USA)从手动门控数据中排除碎片、死亡细胞和双胞体，只留下活的单个免疫细胞。我们将X-shift聚类算法应用于所有细胞，根据标记表达水平将细胞划分为不同的表型，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba然后根据每个簇的标记物表达模式在簇和标记物热图上标注其细胞类型。采用降维算法t分布随机邻域嵌入，对高维数据进行二维可视化，显示每个聚类和标记表达的分布，以及组间或不同样本类型之间的差异。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba对标注细胞群的频率进行学生t检验统计分析。gydF4y2Ba

    模型建设gydF4y2Ba

    数据集分为三个部分:训练集、内部验证集和外部验证集。标记物阴性比例和亚组比例作为建模特征。由于特征数量过多，可能存在一些共线性和不显著的特征，因此需要进行特征筛选，筛选出重要有用的特征。然后使用训练集和内部验证集来选择特征。模型是用随机森林算法构建的。简而言之，根据特征的最高分选择特征，分别从阴性和阳性样本中随机抽取300个样本，建立随机森林模型。采用10倍交叉验证法得到各特征的平均重要度。如果这个过程重复1000次，每个特征将有1000个特征重要性值。我们计算每个特征的重要性大于0.01的特征的数量。如果数量大于400，则选择该特性。 Subsequently, the selected features were used as required features for modelling. Based on the screened features, the random forest model was constructed again after standardised processing of the training set, and the 10-fold cross-validation method was adopted to make each sample participate in modelling and testing, so as to eliminate the influence of sample differences on the model and find the optimal hyperparameter of the model. Then, the generalisation abilities of the constructed models were evaluated in internal validation set and external validation set, to further prove the robustness of the models. The peripheral blood immune score (PBIScore) of each participant was obtained from the models. For instance, a new sample was put into the well-trained model, and the probability of this sample belonging to malignancy was judged by each decision tree in the random forest model. The average probability obtained by all decision trees was recorded as the PBIScore of this sample, ranging from 0 to 1. We discretised the data of AFP and CA19-9. In the hepatic group, if the AFP level was higher than 20 ng/mL (the upper limit of normal level), the value was assigned to 0; otherwise, the value was assigned to 1. We set the normal upper limit of CA19-9 at 37 U/mL and performed a similar assignment strategy. The discrete index was added to the corresponding model as a feature, and the random forest model was established again. Similarly, the score of the new sample was calculated as above method according to the new random forest model, which was denoted as integrated peripheral blood immune score (iPBIScore).

    统计分析gydF4y2Ba

    数据以均数±标准差或SEM表示。根据情况采用学生t检验、Wilcoxon秩和检验或Z检验进行统计分析。采用SPSS软件(V.24;IBM, Armonk，纽约，美国)。p值<0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    队列的基线特征gydF4y2Ba

    本研究共纳入2348名受试者，其中肝脏疾病患者1131例，胰腺疾病患者584例，健康志愿者633例作为对照组。肝组由790例HCC患者和341例良性肝病患者组成。胰腺组包括376例PDAC患者和208例良性胰腺疾病患者。健康对照组由两组共享。所有参与者的人口学和临床病理特征均在gydF4y2Ba在线补充表S3-S6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

    肿瘤与周围免疫细胞亚群的改变有关gydF4y2Ba

    在先前的研究中，未成熟中性粒细胞和单核细胞在荷瘤模型中增殖增加的现象已被广泛回顾，gydF4y2Ba32 33gydF4y2Ba提示外周血免疫细胞的变化可能反映了潜伏性肿瘤的存在。因此，我们推测在HCC或PDAC患者中存在类似的系统免疫紊乱，这可以作为新的肿瘤筛查标志物。为了揭示外周免疫的特征，我们对所有收集的PBMC样本进行了CyTOF分析。所有的CyTOF数据都是经过预处理的活的单细胞免疫细胞(CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)在门控后被保留以作进一步分析。为了表现不同免疫细胞中不同标志物的表达，但限于细胞数量过大，我们从每组随机抽取病例，包括81例HCC、50例良性肝病、50例PDAC、50例良性胰腺疾病和50例健康志愿者。然后，我们根据他们的CyTOF分析结果绘制了热图。基于典型的细胞表面标志物，我们定义了32个主要的细胞簇，其中包括9个CD4簇gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， 8簇CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， 3簇B细胞(CD3 .gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， 2簇单核细胞(CD3gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和其他亚群的10个簇，如树突状细胞(DCs, CD3gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba−gydF4y2BaHLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和NK细胞(CD3gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD56gydF4y2Ba+gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba图1 a, BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

    Profile of peripheral immune status. The CyTOF data from randomly selected cases that are representative of each cohort (including 81 HCC, 50 liver benign diseases, 50 pancreatic cancer, 50 pancreatic benign diseases and 50 healthy people) are shown. (A) Heatmap of normalised expression for markers expressed in peripheral immune cells. Types and proportions of various immune cells are presented in left and right of heatmap, respectively. (B) Visualised t-SNE map of definition of peripheral immune cells from CyTOF data of 281 selected cases and part selected classical cell surface markers used for annotation of various immune cells. (C) Frequency diagram of immune cell subsets in the different groups. Benign-liver, hepatic benign diseases; Benign-pancreas, pancreatic benign diseases; CyTOF, cytometry time-of-flight; DNT, double negative T cells; DPT, double positive T cells; double positive T cells; HD, healthy donor; HCC, hepatocellular carcinoma; mDC, myeloid dendritic cells; NK, natural killer; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; gdTCR: γδ T cells; pDC, plasmacytoid dendritic cells; t-SNE, t-distributed stochastic neighbour embedding.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1gydF4y2Ba
    图1gydF4y2Ba

    外周免疫状态概况。显示了每个队列(包括81例HCC, 50例肝脏良性疾病，50例胰腺癌，50例胰腺良性疾病和50例健康人)中随机选择的具有代表性的病例的CyTOF数据。(A)外周免疫细胞中表达的标记物正常化表达的热图。热图左、右分别显示各种免疫细胞的种类和比例。(B)从281例选定病例的CyTOF数据和部分选定的用于注释各种免疫细胞的经典细胞表面标记物中可视化的外周免疫细胞定义t-SNE图。(C)各组免疫细胞亚群频率图。良性肝，肝脏良性疾病;良性胰腺，胰腺良性疾病;CyTOF，细胞计数飞行时间;DNT，双阴性T细胞; DPT, double positive T cells; double positive T cells; HD, healthy donor; HCC, hepatocellular carcinoma; mDC, myeloid dendritic cells; NK, natural killer; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; gdTCR: γδ T cells; pDC, plasmacytoid dendritic cells; t-SNE, t-distributed stochastic neighbour embedding.

    然后，我们分别分析了肝脏组和胰腺组中患有或没有恶性肿瘤的参与者的差异，并发现在这两种情况下，一些细胞亚群存在显著差异(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．与无恶性肿瘤的参与者(称为“非HCC”，包括健康志愿者和肝脏良性疾病队列)相比，HCC参与者naïve CD4水平下降gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C02, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， naïve CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C04, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，效应子CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C16, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和记忆B细胞(C25, CD19gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD27gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，而CD39gydF4y2Ba+gydF4y2Ba天真的CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C06, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD39gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，中央存储器CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C09, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba)，双阳性T细胞(C15, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，浆细胞(C23, CD19gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD27gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和单核细胞(C27和C28, CD3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)增加(gydF4y2Ba在线补充图S1gydF4y2Ba)．有趣的是，一些亚组表现出从早期到晚期肿瘤的加重相关变化(gydF4y2Ba在线补充图S2gydF4y2Ba)．例如，从0期到C期，NK细胞(C17)的增加在HCC中更为显著，而CCR4的一个子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaB细胞(C23)随着巴塞罗那临床肝癌分期的进展逐渐减少。gydF4y2Ba

    Workflow chart. A total of 2348 peripheral blood samples were collected prospectively from 15 centres. Healthy controls and patients with benign diseases were assigned as the non-malignant group. Marker selection was performed based on the differences between participants with or without malignancies. Healthy controls were shared with the hepatic and pancreatic groups. Random forest analysis was used to generate detection models for HCC and PDAC, respectively. The models were validated using internal and external validation cohorts. HCC, hepatocellular carcinoma; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2gydF4y2Ba
    图2gydF4y2Ba

    工作流图表。从15个中心前瞻性地收集了2348个外周血样本。健康对照组和良性疾病患者为良性组。标记物的选择是基于有或没有恶性肿瘤的参与者之间的差异。健康对照组与肝脏组和胰腺组共享。采用随机森林分析分别生成HCC和PDAC的检测模型。使用内部和外部验证队列对模型进行验证。肝细胞癌;PDAC，胰腺导管腺癌。gydF4y2Ba

    在胰腺组观察到类似的现象。与无PDAC的参与者(包括健康志愿者和胰腺良性疾病队列)相比，naïve CD4水平较低gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C02, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， naïve CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C04, CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)， naïve B细胞(C24, CD19gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD27gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)和记忆B细胞(C25, CD19gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD27gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，而中央记忆CD4水平gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(C03, CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)，浆细胞样dc (C32, CD3gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD20gydF4y2Ba−gydF4y2BaHLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD123gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和单核细胞(C27和C28, CD3gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)的比例较高(gydF4y2Ba在线补充图S3gydF4y2Ba)．还对PDAC不同阶段之间的细胞亚群进行了分析(gydF4y2Ba在线补充图S4gydF4y2Ba)．C03亚群频率随着PDAC分期的推进而增加，C12、C13亚群频率随着PDAC分期的推进而逐渐降低。这些结果表明，荷瘤宿主周围的免疫细胞亚群确实发生了改变，这可能用于筛查恶性肿瘤。gydF4y2Ba

    Development and validation of the HCC detection models. (A) The PBIScore and iPBIScore of participants with or without HCC in the training cohort, internal validation cohort and external validation cohort. (B) The ROC curves of AFP, PBIScore and iPBIScore for HCC detection in the training cohort, internal validation cohort and external validation cohort. Table showing the sensitivity, specificity and AUC value of the three strategies for HCC in different cohorts. ***, p< 0.001. AFP, alpha-fetoprotein; AUC, area under the curve; HCC, hepatocellular carcinoma; iPBIScore, integrated peripheral blood immune score; PBIScore, peripheral blood immune score; ROC, receiver operating characteristic.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3gydF4y2Ba
    图3gydF4y2Ba

    HCC检测模型的开发和验证。(A)训练队列、内部验证队列和外部验证队列中有或没有HCC的参与者的PBIScore和iPBIScore。(B)训练队列、内部验证队列和外部验证队列中AFP、PBIScore和iPBIScore用于HCC检测的ROC曲线。表中显示了三种策略在不同队列中对HCC的敏感性、特异性和AUC值。*** p< 0.001。据法新社,甲胎蛋白;AUC，曲线下面积;肝细胞癌;iPBIScore，综合外周血免疫评分;PBIScore，外周血免疫评分; ROC, receiver operating characteristic.

    Development and validation of PDAC detection models. (A) The PBIScores and iPBIScore of participants with or without PDAC in the training cohort, internal validation cohort and external validation cohort. (B) The ROC curves of CA19-9, PBIScore and iPBIScore for PDAC detection in the training cohort, internal validation cohort and external validation cohort. Table showing the sensitivity, specificity and AUC value of the three strategies for PDAC in different cohorts. ***, P< 0.0001. AUC, area under the curve; CA19-9, carcinoma antigen 19-9; iPBIScore, integrated peripheral blood immune score; PBIScore, peripheral blood immune score; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; ROC, receiver operating characteristic.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4gydF4y2Ba
    图4gydF4y2Ba

    PDAC检测模型的开发和验证。(A)训练队列、内部验证队列和外部验证队列中有无PDAC的参与者的pbiscore和iPBIScore。(B)训练队列、内部验证队列和外部验证队列中CA19-9、PBIScore和iPBIScore用于PDAC检测的ROC曲线。表中显示了三种策略在不同队列中对PDAC的敏感性、特异性和AUC值。***， p < 0.0001。AUC，曲线下面积;CA19-9，癌抗原19-9;iPBIScore，综合外周血免疫评分;PBIScore，外周血免疫评分;PDAC，胰导管腺癌; ROC, receiver operating characteristic.

    用于模型构建的潜在标记物和免疫细胞亚群gydF4y2Ba

    对于HCC诊断模型，训练队列包括450名HCC患者，150名良性肝病患者和300名健康对照。其余199例HCC患者和71例肝脏疾病参与者以及来自领先中心的302名健康对照者被定义为内部验证队列，以验证模型的有效性。来自14个合作中心的另外141名HCC患者、120名良性肝病参与者和31名健康志愿者组成了外部验证队列，用于确认模型的泛化能力(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．胰腺组的参与者同样被分组来构建和验证PDAC的诊断模型。gydF4y2Ba

    假设恶性肿瘤患者的血液循环中有不同的免疫谱，我们首先尝试确定用于肿瘤检测的潜在参数(如标记物或免疫细胞亚群)。我们使用完善的随机森林算法分别从HCC和PDAC训练组中发现相应的特征。在肝脏组中，我们确定了7个标记物和16个细胞亚群，它们具有区分HCC与非HCC参与者的潜力(gydF4y2Ba在线补充表S7gydF4y2Ba)．在胰腺组，我们获得了8个标记物和11个细胞亚群用于PDAC筛选(gydF4y2Ba在线补充表S8gydF4y2Ba)．这些细胞亚群包括单核细胞、B细胞和T细胞。然后应用这些标记物和细胞亚群构建诊断模型。gydF4y2Ba

    基于PBIScore的模型的诊断和鉴别诊断效果gydF4y2Ba

    在肝脏组的训练队列中，HCC参与者的PBIScore明显高于非HCC受试者(0.753 vs 0.247;gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)．在内部验证和外部验证队列中观察到类似的结果。仅基于PBIScore的诊断模型的灵敏度为90.2%，特异性为92.0%，受试者工作特征曲线下面积为0.98 (gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)．在内部验证队列中，敏感性为80.9%，特异性为86.9% (AUC=0.91)，而在外部验证队列中，敏感性和特异性分别达到83.0%和78.2%。然后，我们将AFP水平和PBIScore结合在一起(命名为iPBIScore)以生成一个新模型，该模型在同一训练队列中具有更高的敏感性93.1%和特异性98.7%，AUC为0.99。同样，与单独PBIScore相比，两个验证队列的敏感性和特异性进一步提高。iPBIScore在内部验证队列和外部验证队列中的AUC值分别为0.97和0.96，优于AFP单独的AUC值(AUC为0.84-0.83)。gydF4y2Ba

    为了检验我们在胰腺癌方面的策略，我们进行了类似的研究。在所有测试队列中，PDAC参与者的PBIScore显著高于非PDAC参与者(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)．仅使用PBIScore筛查PDAC的模型获得了92.4%的敏感性和91.2%的特异性，在训练队列中AUC为0.98 (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．我们的模型在内部验证队列(AUC=0.89)和外部验证队列(AUC=0.89)中也显示出良好的辨别能力。CA19-9是临床最常用的肿瘤标志物，其AUC为0.92 ~ 0.86，而PBIScore和CA19-9联合模型在训练队列、内部验证队列和外部验证队列中的AUC分别为0.99、0.98和0.97。gydF4y2Ba

    虽然我们研究的最初目的是开发一种肿瘤诊断工具，但我们想知道基于pbiscore的模型在鉴别诊断中的有效性。我们将内部和外部验证队列结合在一起，并从中排除健康志愿者，分别创建HCC和PDAC的鉴别诊断队列。基于ipbiscore的模型显示，HCC与其他肝脏良性疾病的AUC值为0.97,PDAC与其他胰腺良性疾病的AUC值为0.92 (gydF4y2Ba在线补充图S5gydF4y2Ba)．因此，我们的策略在肝脏和胰腺病变的鉴别诊断场景中也有令人满意的效果。gydF4y2Ba

    基于pbiscore的模型在早期和肿瘤标志物阴性肿瘤中的表现gydF4y2Ba

    在临床实践中，早期肿瘤和肿瘤标志物阴性肿瘤的检测更具挑战性。为了测试我们的模型在这些场景中的作用，我们首先分析了模型在HCC和PDAC不同阶段的表现。总的来说，癌症和非癌症之间的差异比HCC和PDAC之间的差异更显著，尽管在一些队列中，晚期肿瘤比早期肿瘤表现出更明显的特征(gydF4y2Ba在线补充图S6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

    然后，我们在0期或a期HCC患者中测试了基于PBIScore的模型。与AFP的AUC为0.81相比，PBIScore模型和iPBIScore模型的AUC值分别为0.90和0.96 (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)．在可切除PDAC患者中，CA19-9的AUC为0.88;而PBIScore模型和iPBIScore模型的AUC值分别为0.89和0.95 (gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)．这些结果验证了模型在检测早期肿瘤方面的良好性能。gydF4y2Ba

    Performance of the tumour detection models in patients with early-stage disease or those with a normal level of tumour markers. (A) The ROC curves of AFP, PBIScore and iPBIScore for tumour detection in patients with HCC stage 0–A stage, showing an AUC of 0.81, 0.90 and 0.96, respectively. (B) The ROC curves of CA19-9, PBIScore and iPBIScore for tumour detection in patients with resectable pancreatic cancer, showing an AUC of 0.88, 0.89 and 0.95, respectively. (C) The ROC curves of PBIScore and iPBIScore for tumour detection in AFP-negative HCC, showing an AUC of 0.91 and 0.92, respectively. (D) The ROC curves of PBIScore and iPBIScore for tumour detection in CA19-9-negative PDAC, showing an AUC of 0.86 and 0.81, respectively. AFP, alpha-fetoprotein; AUC, area under the curve; CA19-9, carcinoma antigen 19-9; HCC, hepatocellular carcinoma iPBIScore, integrated peripheral blood immune score; PBIScore, peripheral blood immune score; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; ROC, receiver operating characteristic.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5gydF4y2Ba
    图5gydF4y2Ba

    肿瘤检测模型在早期疾病患者或肿瘤标志物水平正常患者中的表现。(A) AFP、PBIScore和iPBIScore用于肝癌0-A期患者肿瘤检测的ROC曲线，AUC分别为0.81、0.90和0.96。(B) CA19-9、PBIScore和iPBIScore用于可切除胰腺癌患者肿瘤检测的ROC曲线，AUC分别为0.88、0.89和0.95。(C) PBIScore和iPBIScore用于afp阴性HCC肿瘤检测的ROC曲线，AUC分别为0.91和0.92。(D) PBIScore和iPBIScore用于ca19 -9阴性PDAC肿瘤检测的ROC曲线，AUC分别为0.86和0.81。据法新社,甲胎蛋白;AUC，曲线下面积;CA19-9，癌抗原19-9;肝癌、肝细胞癌iPBIScore、综合外周血免疫评分;PBIScore，外周血免疫评分; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; ROC, receiver operating characteristic.

    AFP和CA19-9分别是HCC和PDAC最常用的肿瘤标志物;因此，这些肿瘤标志物呈阴性的患者很容易被忽视。我们收集了验证队列中所有afp阴性的HCC和ca19 -9阴性的PDAC，并用它们来测试PBIScore模型的性能。我们的模型显示，HCC和PDAC的AUC分别为0.91和0.86 (gydF4y2Ba图5 c, DgydF4y2Ba)．因此，PBIScore可以作为传统肿瘤标志物的良好补充。gydF4y2Ba

    临床病理特征与周围免疫状态的关系gydF4y2Ba

    鉴于基于pbiscore的模型表现令人满意，我们调查了肿瘤患者的潜在亚型。分析肿瘤标志物、肿瘤分化程度、疾病分期等重要临床病理参数。我们重新聚类了pbiscore模型中包含的细胞亚群，并比较了它们在这些临床病理参数中的比例(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．在790名HCC患者中，外周非经典单核细胞(CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和中央记忆体CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(CCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD45RAgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba)在afp阳性参与者中显著低于afp阴性参与者(gydF4y2Ba在线补充表S9gydF4y2Ba)．值得注意的是,CD3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞和HLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞富集而CD33细胞富集gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba乙型肝炎病毒(HBV)感染患者淋巴细胞减少。中央存储器CD8的比例gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在中度或高分化HCC患者中高于低分化HCC患者。有趣的是，晚期HCC与包括单核细胞、HLA-DR在内的7个细胞亚群比例显著较高相关gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，CD85jgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，CXCR5gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，中央记忆CD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，骨髓源性抑制细胞(MDSCs, CD33)gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaHLA-DRgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)和CD33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba淋巴细胞。在不同微血管侵犯状态的HCC患者中未发现特征性细胞亚群。gydF4y2Ba

    The relationship between the cell subsets used for model construction and the tumour features. (A) Heatmap depicting the relationship between the abundance of characteristic subgroups used to construct models and the various clinicopathological features of HCC. (B) Heatmap depicting the relationship between the abundance of characteristic subgroups used to construct the models and the various clinicopathological features of PDAC. AFP, alpha-fetoprotein; BCLC, Barcelona Clinic Liver Cancer; CA19-9, carcinoma antigen 19-9; HBV, Hepatitis B Virus; HCC, hepatocellular carcinoma; MVI, microvascular invasion; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6gydF4y2Ba
    图6gydF4y2Ba

    用于模型构建的细胞亚群与肿瘤特征之间的关系。(A)热图描绘了用于构建模型的特征亚群的丰度与HCC的各种临床病理特征之间的关系。(B)热图描绘了用于构建模型的特征亚群的丰度与PDAC的各种临床病理特征之间的关系。据法新社,甲胎蛋白;BCLC，巴塞罗那临床肝癌;CA19-9，癌抗原19-9;乙型肝炎病毒;肝细胞癌;MVI，微血管侵犯;PDAC，胰腺导管腺癌。gydF4y2Ba

    在376名PDAC患者中，我们注意到肿瘤位置和疾病阶段与我们模型中包括的许多关键细胞亚群显著相关(gydF4y2Ba在线补充表S10gydF4y2Ba)．PDAC位于胰腺体或尾部的患者HLA-DR表现较多gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和HLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2Ba外周血中的T细胞。与HCC相比，PDAC的分化程度不影响循环中的这些免疫亚群;而晚期PDAC的淋巴细胞HLA-DR水平较高gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞，MDSCs和CD3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与早期PDAC的单核细胞相比。我们的结果确定了原发肿瘤与外周免疫状态之间的免疫细胞亚群的相关性，并确定了一些可能对外周免疫失衡有重要影响的细胞亚群。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    肿瘤的发生、发展和转移都与抗肿瘤免疫密切相关。gydF4y2Ba34gydF4y2Ba虽然我们对肿瘤微环境的局部免疫有很多了解，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba肿瘤与全身免疫之间的关系鲜有研究。从理论上讲，肿瘤和身体免疫系统之间的战斗应该反映在外周血中，外周血不断地与肿瘤沟通。例如，当载瘤宿主的造血功能被广泛破坏时，外周血中未成熟的中性粒细胞和单核细胞异常扩张，其中一些转移到肿瘤微环境中，导致局部免疫抑制。gydF4y2Ba32 33gydF4y2Ba

    据我们所知，这是迄今为止在人类外周血中使用CyTOF分析的最大研究，也是第一个使用CyTOF作为肿瘤诊断工具的多中心报告。在本研究中，我们利用CyTOF的高维分析能力发现外周血免疫细胞群的差异，并在此过程中选择参数，生成具有较高敏感性和特异性的肿瘤检测模型。我们的策略在早期HCC和PDAC中的成功表明，在肿瘤开始后不久，外周血中可能存在肿瘤的迹象，这支持了分析系统免疫以早期肿瘤检测的概念。此外，我们对两种类型的肿瘤使用了相同的面板和策略，并获得了相对相似的结果，不仅是检测模型的性能，而且在用于模型构建的细胞亚群及其潜在的临床相关性方面也是如此。因此，这些发现意味着我们基于pbiscore的策略可能适用于其他肿瘤。然而，与ctDNA和CTC等其他液体活检策略相比，我们的方法对样本采集的要求较低，仅需要5 mL样本，不需要分离稀有细胞或富集低丰度核苷酸。因此，它对客户更友好，更容易概括。然而，在CyTOF技术应用于临床之前，还需要克服一些重要的问题。例如，虽然CyTOF是高度敏感的，但污染的可能性，特别是重金属污染的可能性很高。gydF4y2Ba36gydF4y2Ba虽然CyTOF已被验证与临床使用的流式细胞仪相当，但最佳的CyTOF面板至关重要。gydF4y2Ba37gydF4y2Ba抗体标记的金属应根据生物标志物的表达强度仔细选择，以避免信号“溢出”。gydF4y2Ba37gydF4y2BaCyTOF的数据分析具有挑战性，目前在许多组中存在差异。本文设计了一种自动门控算法。临床标准需要包括样本和数据管理在内的统一流程。此外，CyTOF的采集时间相对较长，限制了每天可以检测的样本数量。gydF4y2Ba

    我们的检测模型具有较高的AUC值，这表明了良好的性能。敏感性和特异性之间的权衡取决于不同的临床情况。尽管与大多数诊断工具相比，灵敏度较低，特异性为99%，但作为一种专注于肿瘤筛查的液体活检方法，我们认为90%左右的灵敏度和特异性都是可以接受的。尽管PBIScore本身优于AFP或CA19-9，但它们的组合进一步提高了AUC值。值得注意的是，PBIScore与这些传统的肿瘤标志物是相互补充的，这导致了iPBIScore检测模型的出色性能。像AFP和CA19-9这样的肿瘤标志物直接来源于肿瘤细胞。而PBIScore反映了人体与肿瘤的相互作用，为肿瘤追踪提供了另一个角度。人们对这种相互作用的价值表示关注，因为它可能受到许多生理和病理生理因素的影响，如昼夜节律，因此是不稳定的。令人惊讶的是，我们的研究结果表明，这种担忧可能是错误的。至少某些关键细胞标记物或亚群的改变足够稳定，可以检测出肿瘤。 Further in-depth researches are needed to understand why patients with negative tumour markers have more significant changes in their peripheral immune cells.

    本研究还确定了几个关键细胞亚群，这些细胞亚群可能与模型的功效有关。naïve CD4的数量gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞和naïve CD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba荷瘤参与者外周血中的T细胞减少，这限制了肿瘤微环境中抗肿瘤T细胞的来源。CD39的频率gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞在HCC或PDAC患者中显著增加(C27和C28)gydF4y2Ba在线补充数字S1和S3gydF4y2Ba)．CD39被认为是一种代谢检查点，是一种参与腺苷产生的限速酶，在肿瘤微环境中起着重要的免疫抑制作用。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba有趣的是，HLA-DR的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2Ba晚期HCC患者T细胞显著增加(gydF4y2Ba在线补充表S9gydF4y2Ba)，表明这种细胞亚群是循环中肿瘤进展的生物标志物。事实上，HLA-DR和CD38在CD8上的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Ba外周血中的T细胞被报道与晚期肿瘤相关。gydF4y2Ba39gydF4y2BaHLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD38gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞是被激活的表型，可能在肿瘤微环境和外周血抗肿瘤免疫中发挥关键作用。gydF4y2Ba40 41gydF4y2Ba此外，在HCC和PDAC患者中，单核细胞的比例随着病程的进展逐渐增加，这与既往研究发现这类患者外周血单核细胞水平较高，与预后不良有关。gydF4y2Ba42-44gydF4y2Ba总的来说，这些发现扩大了我们对外周血可以反映肿瘤存在的潜在原因的理解。然而，模型相关关键细胞亚群与患者临床病理参数之间的相关性仅基于统计学，与科学因果关系相距甚远。gydF4y2Ba

    我们的研究有一些局限性。首先，所有参与者都来自中国，不具有国际代表性;然而，我们相信，鉴于我们的战略性质，目前的方法可以在全球不同的民族和地区实施，尽管模型的参数将在一定程度上进行修改。其次，血液系统疾病患者和近期出血或输血的患者被排除在研究之外，这限制了我们模型的目标人群。第三，我们仅针对HCC和PDAC开发了肿瘤类型特异性模型，该策略是否可用于泛癌筛查尚不清楚。第四，我们的验证队列中有很高比例的参与者患有恶性疾病，这与现实世界中的肿瘤检测情况不同。为了在临床实践中进一步评估我们的模型，需要一个基于自然人群或高危人群的队列研究。我们的非hcc队列中缺乏肝炎或肝硬化患者，这使我们无法在这些人群中验证模型的有效性，这是另一个缺点，因为应该更多地关注高危组。此外，我们对AFP和CA19-9的分析是基于离散方式，而不是使用连续变量，因为在一些健康参与者中无法获得正常范围内的准确值。使用它们作为连续变量可能会确定最佳阈值，以最大限度地提高模型的灵敏度和特异性。 However, dealing with them as discrete variables also have advantages, for example, it will not change the current clinical practice too much and will be easier to be accepted by physicians. Last but not least, the age and gender were not always balanced in different groups, which could introduce biases and affect the performance of our model in certain cohorts. However, malignant tumours and benign diseases naturally have distinct age and gender tendencies. Age-related or gender-related alterations of immune cells are also features of tumour, no matter they are caused by the tumour or just companied with it. The purpose of our study was to develop an efficient tool to diagnose cancer, and our multicentre external validation confirmed the performance of our models.

    总之，我们验证了实体肿瘤患者系统免疫的差异，并使用大容量、多中心队列来证明基于pbiscore的模型在肿瘤检测方面表现出高性能。因此，我们为HCC和PDAC筛查提供了一种现成的工具，作为液体活检的扩展。我们的策略也为未来基于全身免疫的泛癌症检测方法奠定了基础。gydF4y2Ba

    数据可用性声明gydF4y2Ba

    如有合理要求，可提供资料。gydF4y2Ba

    伦理语句gydF4y2Ba

    患者发表同意书gydF4y2Ba

    伦理批准gydF4y2Ba

    浙江大学医学院第一附属医院人体研究伦理委员会，中国杭州(2019-1445- 1,2020 -835);浙江省人民医院，杭州医学院附属人民医院，浙江杭州(2021KY027);温州大学医学院附属第一医院，温州(2021-075);中国科学院基础医学与癌症研究所，中国科学院大学肿瘤医院(浙江省肿瘤医院)，中国杭州(IRB-2021-206);台州市三门人民医院(2020-121);浙江大学医学院湖州市中心医院，湖州(2021206-01);湖州长兴市人民医院(2020-057);宁波市医疗中心丽汇丽东方医院(KY2020SL178);嵊州市人民医院，嵊州(2022-001);海宁市人民医院，中国海宁(2021-11); Jiaxing Second People’s Hospital, Jiaxing, China (JXEY-WYZF009); The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang, China (waived, accepting ethics approval of the leading institute); Shangyu Hospital of Chinese Medicine, Shaoxing, China (2021-02-06); The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, China (2021-R135); Jixi County People’s Hospital, Xuancheng, China (2021-01). Informed consent was obtained from all participants before collecting peripheral blood samples.

    致谢gydF4y2Ba

    我们衷心感谢参与本次研究的医院同事对样本收集和讨论的帮助。感谢中国传染病诊疗国家重点实验室吴杰博士在统计学方面的技术支持。gydF4y2Ba

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      OpenUrlgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba

    补充材料gydF4y2Ba

    脚注gydF4y2Ba

    • QZ、YM和CL的贡献相当。gydF4y2Ba

    • 贡献者gydF4y2BaTL和QZ构思并设计了该研究。TL监督了整个研究。采集样品QZ、YM、MH、YW、YL、JZ、JL、YZ、TY、XS、WY、YH、HH、MX、XW、XY、WT、RL、YG、TW、JW、XW、JW。CL和TW提供金属偶联抗体并进行样品处理。QZ, YM, CL, QK和TW对数据进行了分析。TL、QZ、XB、CY、CZ和ZY对结果进行了解释。QZ和YM起草了手稿。所有作者对最终版本的稿件进行了修改和批准。TL是担保人。gydF4y2Ba

    • 资金gydF4y2Ba国家重点研发计划项目(No. 2020YFA0804300/2020YFA0804301, 2019YFC1315800/2019YFC1315802)，国家自然科学基金项目(No. 82188102, U20A20378)，浙江省重点研发计划项目(No. 2021C03063, 2019C03019)，浙江省自然科学基金项目(No. 2020yfc1315802)资助。浙江省自然科学基金联合基金项目(No. LR20H160002);HDMD22H319373)，浙江省重点科研项目(No. 2022ND0AC01)。这项工作也得到了阿里云的支持。gydF4y2Ba

    • 相互竞争的利益gydF4y2Ba没有宣布。gydF4y2Ba

    • 患者和公众参与gydF4y2Ba患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。gydF4y2Ba

    • 出处和同行评审gydF4y2Ba不是委托;外部同行评审。gydF4y2Ba

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