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2007年11月15日出版gydF4y2Ba更多信息gydF4y2Ba
细菌产物对TLRs的激活导致基因的快速激活,这些基因编码的产物旨在保护宿主免受干扰微生物的侵害。在由大量多样的共生细菌定殖的肠道中,TLR信号可能不是以简单的开/关模式起作用。在这里,我们表明鞭毛蛋白受体TLR5在保护肠道免受肠道微生物侵害方面具有必要的和非冗余的作用。缺乏TLR5的小鼠(TLR5KO小鼠)发生自发性结肠炎,通过明确的临床、血清学和组织病理学指标评估这种疾病。与WT同窝小鼠相比,尚未发生严重结肠炎的TLR5KO小鼠尽管结肠中的细菌负担增加,但其肠道中tlr5调节的宿主防御基因表达减少。相比之下,TLR5KO小鼠的造血源性促炎细胞因子的结肠表达显著增加,这表明细菌产物水平的升高可能导致TLR5KO小鼠中其他驱动结肠炎的TLRs的激活。因此,TLR4的缺失挽救了TLR5KO小鼠的结肠炎,因为同时缺乏TLR4和TLR5的小鼠结肠中的细菌负荷也升高了,但缺乏结肠炎的免疫学、组织病理学和临床证据。工程性先天免疫缺陷最终导致自发性肠道炎症,这支持了先天免疫缺陷可能是某些炎症性肠病的基础这一观点。gydF4y2Ba
通过先天免疫系统的种系编码受体检测细菌产物,特别是TLRs,导致基因表达的快速激活,旨在保护宿主免受干扰微生物的侵害。表达被TLR信号激活的基因包括那些具有直接抗菌作用的基因和驱动免疫细胞募集和/或激活的细胞因子。这种趋化因子表达导致的免疫细胞,特别是中性粒细胞募集到粘膜表面,被认为在防止细菌传播中发挥重要作用,但也可能是与炎症及其组织损伤相关的临床表现的基础。在肠道中,通常由大量不同种类的共生细菌定殖,TLR信号可能不是以简单的开/关模式起作用,而是似乎也在稳态中发挥作用(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),可能是通过位于肠上皮顶端表面的TLR2或TLR9专用池(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).由于信号适配器MyD88的丢失而导致TLR信号广泛缺失的小鼠不表现出明显的肠道表型,但在结肠炎模型中表现出明显的表型差异。具体来说,MyD88KO小鼠暴露于右旋糖酐硫酸钠后损伤加重(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).相反,MyD88的缺乏保护小鼠免受发生在缺乏IL-10基因的小鼠身上的自发性结肠炎(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).总之,这些结果表明,TLR信号通常可以在免疫失调时驱动肠道炎症,但通常可能用于保护肠道免受某些挑战。gydF4y2Ba
虽然肠道共生菌群是各种TLR配体的潜在大来源,但许多观察表明TLR5配体鞭毛蛋白具有特别重要的作用。来自多种来源(即细胞系)的肠道上皮细胞(迄今为止肠道中数量最多的细胞类型)一致表现出对鞭毛蛋白反应的强促炎基因表达,而这些细胞大多被观察到对典型的TLR激动剂LPS反应相对较低(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),并对TLR2配体产生非经典反应(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).鞭毛蛋白被认为是克罗恩病先天免疫和适应性免疫的主要靶点,在一些种族中,显性负TLR5等位基因的杂合携带与克罗恩病的保护有关(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).因此,我们假设缺乏鞭毛蛋白受体TLR5的小鼠可能表现出较低的发生肠道炎症的倾向。相反,我们观察到tlr5介导的基因表达缺失导致小鼠无法管理其共生菌群和自发性结肠炎的发展。这些结果表明TLR5在保护肠道免受正常共生细菌的侵害中起着重要作用。gydF4y2Ba
TLR5KO小鼠发生自发性结肠炎。gydF4y2Ba在日本大阪Suita微生物疾病研究所,TLR5靶向缺失小鼠在混合C57BL/6 × 129/Sv背景下生成(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba).这样的小鼠看起来总体健康,对小肠的研究没有发现明显的表型改变。TLR5无杂合子的小鼠在查尔斯河实验室进行检疫,被运送到埃默里大学进一步回交到C57BL/6,然后繁殖成TLR5无杂合子的小鼠(TLR5KO)和WT窝友。TLR5基因的两个拷贝的缺失导致TLR5功能的丧失,这是通过观察血清细胞因子在系统给予鞭毛蛋白反应中的损失来验证的。具体而言,正如预期的那样,TLR5KO小鼠在系统给予纯化鞭毛蛋白后,表现出显著降低血清细胞因子的诱导,如角质形成细胞来源的趋化因子(KC) (IL-8的小鼠同源物)和IL-6(补充图1;本文可在网上获得补充材料;doi:10.1172/JCI33084DS1)根据最近的研究(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba).有趣的是,鞭毛蛋白在C57BL/6小鼠中诱导的KC水平高于LPS诱导的KC水平,尽管鞭毛蛋白与LPS不同,未能诱导TNF-α(在WT或TLR5KO小鼠中)(补充图2)。gydF4y2Ba
大多数TLR5KO小鼠看起来总体健康,尽管它们往往比年龄、性别匹配的WT同窝小鼠要小(4周龄雌性的体重[g]: WT vs. KO, 16.3±0.38 vs. 15.1±0.24;男性:WT vs. KO, 19.2±0.41 vs. 17.6±0.57;gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。然而,这些小鼠表现出的最显著的表型特征是直肠脱垂的频率。具体而言,我们观察到,在回交的3个水平(N4、N6和N8)中,约10%-12%的小鼠缺乏TLR5,但其WT窝仔均未出现自发性直肠脱垂。有趣的是,在日本饲养的TLR5KO小鼠中未观察到脱垂。与TLR5KO小鼠相比,在我们的设施中培育的缺乏其他tlr(即2,3,4,11)和全球tlr信号适配器MyD88的小鼠没有表现出这种表型,而在我们的设施中培育的il -10缺失小鼠以先前观察到的频率出现脱垂(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba).TLR5KO小鼠的直肠脱垂似乎是不可逆的,与不成功的繁殖有关。尽管如此,继续繁殖非脱垂的TLR5KO小鼠产生的后代继续脱垂的频率很高(365只小鼠中有40只),而同窝小鼠的后代没有表现出这种表型(>400只小鼠中有0只)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba
TLR5KO小鼠发生自发性结肠炎。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba约10%的TLR5KO (T5KO)小鼠出现代表性直肠脱垂。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba) TLR5KO小鼠和WT同窝小鼠盲肠/结肠的代表性大体外观。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba) TLR5KO小鼠和WT同窝小鼠器官重量的比较。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba) TLR5KO小鼠和WT同窝小鼠盲肠和结肠近端h&e染色切片。TLR5KO小鼠可见广泛的免疫细胞浸润、局灶性隐窝上皮破坏、水肿和上皮增生。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba免疫荧光显微图显示用抗gr1染色的中性粒细胞(红色)和用DAPI反染色的所有细胞核(蓝色)。比例尺:100 μM。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
直肠脱垂和体重减轻是自发性小鼠结肠炎的标志,因此,我们接下来确定TLR5KO小鼠是否正在发展结肠炎,通过该疾病状态的几个明确指标进行评估。具体来说,除去脱垂的TLR5KO小鼠(它们都有健壮的透壁结肠炎),我们将TLR5KO小鼠与它们的WT窝鼠在肠道出血、形态学、器官重量和组织病理学方面进行了比较。此外,我们还测量了他们的体重和盲肠、结肠、肝脏和脾脏的重量。大约20%的非脱垂TLR5KO小鼠表现出可检测到的自发出血(粗出血或隐性出血),这在任何WT小鼠中都没有检测到。此外,25%的TLR5KO小鼠表现出粗壮结肠炎的总体特征,包括盲肠收缩、肿胀、不透明的近端结肠和缺乏形态良好的粪便(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).任何WT小鼠都没有表现出这样的表现。盲肠和结肠外观的这些改变与简单测量器官重量相关,因此可以通过简单测量器官重量来量化,在安乐死时没有表现出自发直肠脱垂的TLR5KO小鼠中,约30%的器官重量发生了显著变化(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaC)。与结肠炎状态进一步一致的是,TLR5KO小鼠的脾脏明显增大。脾肿大与肠系膜和舌淋巴肿大密切相关(数据未显示)。组织病理学分析证实了部分TLR5KO小鼠有结肠炎(无论它们是否有直肠脱垂)的概念。具体来说,在肠道外观(或器官重量)出现明显改变的小鼠中,盲肠和近端结肠均显示出广泛的上皮增生区域,与单个核浸润、局灶性隐窝上皮破坏和水肿相关(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaD),在WT窝仔或60%的TLR5KO小鼠(按上述参数肠道显示正常)中不存在。根据组织学外观,使用中性粒细胞特异性免疫染色(α-GR-1)发现TLR5KO小鼠结肠近端有大面积中性粒细胞,而在WT小鼠中没有观察到(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2BaE)或TLR5KO小鼠缺乏肠道改变的明显证据。总之,这些结果表明,大约35%-40%的TLR5KO小鼠出现了某种程度的自发性结肠炎。与盲肠和结肠相比,TLR5KO小鼠的小肠在宏观和组织病理学上与WT窝仔相似,并且在这些组织中组织淋巴结构的数量、大小或外观上没有明显差异(补充图3)。gydF4y2Ba
为了促进我们对TLR5缺失如何导致自发性结肠炎的理解,我们试图定义一种血清标记物,使我们能够选择尚未发展成健壮性结肠炎的小鼠。我们观察到血清淀粉样蛋白A (SAA)的水平,SAA是一种一般的炎症急性期标记物,已被证明与人和小鼠的肠道炎症程度相关(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),可用于识别患有健壮性结肠炎的小鼠。具体而言,所有WT小鼠的SAA水平均低于40 μg/ml,而41% (29/70)TLR5KO小鼠的SAA水平高于50 μg/mlgydF4y2Ba2gydF4y2BaA)。SAA升高的小鼠也显示血清脂素2水平升高(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB),这是另一个炎症的一般标志,其血清水平在结肠炎时升高(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba).SAA在发生直肠脱垂的小鼠中升高最多,每只脱垂小鼠SAA浓度均高于2000 μg/ml。此外,SAA水平高于100 μg/ml的TLR5KO小鼠通过上述定义的参数显示出明显的结肠炎证据,而WT小鼠和SAA水平低的TLR5KO小鼠(T5KO-L)在这些参数上仅存在中度差异(图5)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一部)。SAA水平也与组织病理学评估确定的结肠炎程度相关。具体而言,尽管组织病理学评分在WT和T5KO-L小鼠之间仅显示出适度的差异,但SAA水平高的TLR5KO小鼠(T5KO-H)的结肠炎与IL-10KO小鼠表现出的结肠炎有些相似,特别是使用piroxicam治疗的IL-10KO小鼠,后者促进了结肠炎的发展(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).与结肠炎状态进一步一致的是,T5KO-H小鼠也有显著程度的贫血和白细胞增多(表5ko - h)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),而T5KO-L小鼠与WT同窝小鼠差异不显著。因此,SAA水平可用于TLR5KO小鼠可能患有或不患有健壮性结肠炎的分层。在断奶后不久(25天)测量时,28只TLR5KO小鼠中0只SAA升高。相反,一些小鼠的SAA在5 - 8周龄时升高,而一些小鼠甚至在6个月大时仍保持低SAA。因此,虽然一些T5KO-L小鼠最终可能会发展成结肠炎,但这一名称也反映了这些小鼠表现出的一定程度的疾病异质性。gydF4y2Ba
SAA水平标志着TLR5KO小鼠结肠炎的严重程度。gydF4y2Ba对8 ~ 12周龄TLR5KO小鼠和WT同窝小鼠实施安乐死并进行参数分析。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) SAA:开放三角形代表采集血清时直肠脱垂的小鼠。然后用SAA水平对小鼠进行分层分析gydF4y2BaBgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaEgydF4y2Ba。T5KO-H表示SAA >100 μg/ml;T5KO-L表示SAA< 50 μg/ml;(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)免疫印迹显示血清脂素2。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)粪便中的隐血(gydF4y2BaDgydF4y2Ba盲肠、结肠、脾脏重量。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba盲肠和结肠MPO水平。*gydF4y2BaP
TLR5KO小鼠的共生细菌负担增加。gydF4y2Ba接下来,我们考虑了TLR5KO小鼠表现出的结肠炎的一些潜在机制。肠屏障功能障碍与人类炎症性肠病和耐多药缺失小鼠表现出的自发性结肠炎相关,并被认为是其基础(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba).因此,我们通过用常用的渗透性标志物(HRP和fitc -右旋糖酐)灌胃小鼠并测量其在血清中的水平来测量上皮屏障功能。我们观察到坚固结肠炎TLR5KO小鼠(即T5KO-H)对这些大分子的肠渗透性增加(图5)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).这种方法没有揭示T5KO-L小鼠和WT窝鼠之间的渗透性差异。因此,在TLR5KO结肠炎中,肠道对大分子的渗透性增加,但可能不是疾病过程中的早期事件。gydF4y2Ba
T5KO-H小鼠对大分子的渗透性增加。gydF4y2BaT5KO-L小鼠(非结肠炎)、T5KO-H小鼠(结肠炎)和WT窝仔小鼠空腹3小时,然后按方法所述给予fitc -葡聚糖(4 kDa或40 kDa)和HRP。3小时后给小鼠放血,荧光光谱法测定血清FITC和HRP浓度。*gydF4y2BaP
此后,我们将研究重点放在非结肠炎TLR5KO小鼠上,希望能观察到可能导致它们发展成结肠炎的事件。我们考虑了TLR5的缺失是否会导致小鼠无法维持肠道菌群的适当稳态。为了解决这种可能性,我们定量了在环境条件下能够在非选择性琼脂上生长的肠道细菌的水平。我们观察到T5KO-L小鼠粪便中可培养细菌总数中度升高(约5倍)(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaA)。T5KO-H小鼠的升高程度更明显,尽管该组也表现出更大的变变性(几何平均值显示,T5KO-H小鼠的总可培养粪便cfu水平比T5KO-L小鼠高8.5±5.5倍)。接下来,我们定量了我们首先去除非粘附物质的结肠节段中的细菌水平(如方法中所述)。我们在T5KO-L小鼠的结肠中观察到这种紧密粘附的细菌的水平明显较高(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaB)。此外,一些T5KO-L小鼠(而不是它们的WT同窝小鼠)在它们的肝脏和脾脏中都有适度但清楚地检测到的细菌负担,每个器官约有100-200个细菌(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, C和D)。因为绝大多数肠道细菌都是严格的厌氧菌,很难培养,如果不是不可能,这些结果应该被视为只是肠道菌群的一个小样本。尽管如此,他们认为TLR5的缺失会导致肠道菌群的显著改变。gydF4y2Ba
T5KO-L小鼠的细菌负担增加。gydF4y2Ba将来自T5KO-L或WT窝仔的粪便或指示组织均质,并在非选择性培养基上进行环境培养。cfu的定量方法见方法。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)粪便;(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)洗过的冒号;(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)脾;(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)肝脏。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,与WT小鼠差异显著。gydF4y2Ba
接下来,我们试图确定我们从T5KO-L小鼠的肝脏/脾脏中培养的细菌是否可能是已知的病原体,或者它们是否只是可能从肠道中易位的正常肠道细菌。我们注意到,从这些器官培养的细菌菌落要么小而呈黄白色,要么大而呈金黄色。在WT和T5KO-L小鼠的粪便培养中都可以发现外观相似的菌落,尽管绝大多数粪便cfu产生的菌落要小得多,颜色要浅得多。因此,我们假设形成这种菌落的粪便cfu可能与我们从肝脏和脾脏培养的cfu是同一物种。为了研究这种可能性,我们从粪便或器官中选择每种类型的菌落,并通过革兰氏染色检查其外观。均为革兰氏阳性球菌,菌落外观与其聚类方式相关。接下来,我们从这些分离株中克隆并测序了16S rna。在测序的6株T5KO-L肝/脾分离株中,4株为阳性gydF4y2Ba葡萄球菌saprophyticusgydF4y2Ba其中2个是gydF4y2Ba葡萄球菌hominisgydF4y2Ba。在测序的2株WT粪便CFU分离株中,1株为gydF4y2Ba美国saprophyticusgydF4y2Ba1是gydF4y2Ba美国hominisgydF4y2Ba。在WT小鼠的粪便中鉴定这些菌株与这些细菌是牛、啮齿动物和人类肠道菌群的正常组成部分的知识是一致的(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba).虽然确定这些少数cfu是非致病性的,当然,并不排除我们的菌落中可能存在病原体,但与这些TLR5KO小鼠共享笼子并繁殖的免疫缺陷小鼠(ragg - 1ko和MyD88KO)没有出现任何疾病的临床指标,这与典型的病原体相冲突。此外,T5KO的WT窝友在3个水平的杂交/回交中都没有表现出结肠炎的迹象,这表明这些小鼠的肠道细菌很可能是共生微生物,并反驳了我们的菌落中存在真正的致病性微生物。因此,虽然gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba获得肠外定位可能是TLR5信号缺失的结果,这些分离物和定植这些小鼠的其他细菌在WT小鼠中都没有致病性。gydF4y2Ba
TLR5KO结肠表现出基因表达失调。gydF4y2Ba我们推断,由于TLR5信号通路的缺失导致宿主防御基因表达的降低可能是T5KO-L小鼠细菌负担增加的基础,尽管相反,细菌负担的增加似乎也很可能由于其他先天免疫信号通路的激活增加而导致宿主防御基因表达的增加。为了研究这些可能性,我们使用了最近描述的协议(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)通过24小时体外培养结肠肠段来评估持续的肠道细胞因子生产。我们测量了鞭毛蛋白有效诱导的细胞因子(KC, IL-6),以及纯化鞭毛蛋白未有效诱导(至少在我们手中)的细胞因子(IFN-γ, IL-12p70, IL-23, IL-1β和TNF-α),但这些细胞因子对TLR4配体LPS的反应是有效上调的。我们观察到,尽管T5KO-L小鼠的细菌负担增加,但鞭毛蛋白诱导的细胞因子KC和IL-6的水平显著降低(图gydF4y2Ba5gydF4y2BaA).相反,尽管缺乏炎症的组织病理学证据,T5KO-L小鼠结肠释放明显更高水平的促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α), ThgydF4y2Ba1gydF4y2Ba细胞因子(IFN-γ和IL-12p70)gydF4y2Ba17gydF4y2Ba细胞因子(IL-17和IL-23)。我们还检测了这些结肠上清液中血管生成素-4 (Ang4)蛋白的水平,这种蛋白被认为在宿主对革兰氏阳性细菌的防御中起着重要作用(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba).与WT同窝小鼠相比,T5KO-L小鼠结肠中Ang4的表达显著降低。最后,我们还测量了这些细胞因子在这些小鼠血清中的水平。虽然大多数这些细胞因子在T5KO-L小鼠的血清中检测不到(即,不严重结肠炎),但这些小鼠的血清KC低于WT窝仔,而结肠炎T5KO-H小鼠的血清KC水平高于WT窝仔(图)gydF4y2Ba5gydF4y2BaB). TLR5KO小鼠血清IL-18升高。因此,TLR5的缺失导致一些宿主防御基因的表达减少,特别是鞭毛蛋白强烈诱导的Ang4和2细胞因子(KC和IL-6)。然而,TLR5的缺失也导致一组促炎细胞因子的表达增加,这些细胞因子的表达可能是由其他TLR配体驱动的。为了进一步评估TLR5KO小鼠结肠中改变的基因表达,我们接下来进行了基因表达的全局检测。具体来说,我们使用cDNA微阵列技术比较了TLR5KO小鼠(T5KO-L或T5KO-H)与其WT窝仔小鼠结肠中的相对基因表达。这些研究汇集了每组3只小鼠的mRNA。这种分析可能反映了肠道内常驻细胞的基因表达变化和/或反映了白细胞的浸润,特别是在明显结肠炎的小鼠中。与WT窝仔相比,粗壮结肠炎T5KO-H小鼠显示出超过800个(35000个)基因的显著升高。虽然这些基因的总体概况可能最简单地被描述为“促炎”,但它们也可以合理地分为功能类别(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba;具体的基因列于补充表1),包括抗菌基因和细胞因子/趋化因子。定性上,在T5KO-L小鼠中观察到类似的结肠基因表达模式,尽管每一类中显著升高的基因数量及其表达升高的程度都有所减少。这些mrna表达的增加与我们的结肠培养蛋白检测结果一致(每组至少5只小鼠)。随后,我们对这些样品进行了其他几种蛋白(IL-10, IL-18, MUC2, MMP7, MMP9)的检测,根据我们的微阵列分析,这些蛋白在TLR5KO小鼠的结肠中都有上调(补充图4)。该微阵列分析还表明,TLR5KO小鼠的LPS信号通路相关基因表达增加,例如TLR4, LPS结合蛋白,TLR4经定量RT-PCR证实表达上调(补充图4)。gydF4y2Ba
T5KO-L小鼠自发性结肠细胞因子表达改变。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2BaWT或T5KO-L小鼠的结肠在添加抗生素的无血清培养基中体外培养24小时。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba通过ELISA或SDS-PAGE免疫印迹法检测释放到培养基中的细胞因子(Ang4)。elisa显示为每个条件至少8只小鼠的平均值±扫描电镜。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba) SAA低或高的TLR5KO小鼠的血清(见图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)或WT窝仔进行细胞因子检测,如gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,但始终检测到KC和IL-18。*gydF4y2BaP
IL-10在降低TLR5KO结肠炎发病率和严重程度中的作用gydF4y2Ba上述肠道基因表达研究表明,即使是缺乏结肠炎组织病理学证据的T5KO小鼠,肠道基因表达也存在失调。我们假设内源性抗炎机制可能起到预防自发性结肠炎的作用。例如,抗炎细胞因子IL-10在非结肠炎T5KO-L小鼠中表达升高2倍,在结肠炎T5KO-H小鼠中表达升高8倍(补充图4和补充表1),这种表达模式表明它可能起着对抗这些小鼠中升高的促炎基因表达的作用。为了研究这种可能性,将TLR5KO小鼠与缺乏IL-10基因的小鼠杂交,生成TLR5/IL-10DKO (DKO,双KO)小鼠和IL-10KO同窝小鼠。缺乏il -10的窝仔表现出直肠脱垂的比率与我们最初的IL-10KO群体相似(约50%到16周),其余的足够健康以产生后代。相比之下,在il -10缺失的背景下,TLR5的缺失导致10周时80%的直肠脱垂(6个月时100%)和一致的繁殖失败(图10)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba此外,T5/IL-10DKO小鼠结肠中IL-17的表达显著增加,而结肠炎IL-10KO小鼠的IL-17表达量远低于结肠炎T5KO小鼠(图5)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB).这些结果表明,IL-10抗炎途径在对抗TLR5缺失导致的促炎途径中发挥重要作用,但只能预防部分小鼠的结肠炎。此外,结肠炎TLR5KO小鼠相对于结肠炎IL-10KO小鼠产生的大量IL-17表明Th - r5ko的潜在作用gydF4y2Ba17gydF4y2Ba途径在TLR5KO结肠炎中的作用。gydF4y2Ba
TLR5/IL-10DKO小鼠表现出高表达的IL-17和严重的结肠炎。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba观察TLR5/IL-10DKO小鼠和IL-10KO同窝小鼠直肠脱垂发生率。发生脱垂的小鼠被安乐死,脱垂总是与结肠炎的明显明显证据相关。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)直肠脱垂小鼠结肠在脱垂24小时内分离,体外培养24小时;ELISA法检测IL-17的产生。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
TLR5KO结肠炎由TLR4的激活驱动。gydF4y2BaTLR5信号被认为完全依赖于MyD88,因此,MyD88KO小鼠完全缺乏TLR5功能。然而,MyD88KO小鼠不会发生自发性结肠炎(即使在我们的设施中与TLR5KO小鼠共用笼子)。这表明TLR5KO小鼠的细菌负担增加可能通过激活其他tlr导致结肠炎-我们的微阵列数据也表明了这一概念。为了支持这种可能性,MyD88KO小鼠的结肠培养缺乏所有测量到的细胞因子,包括KC、TNF-α和IL-1β(数据未显示)。因此,我们生成了同时缺乏TLR4和TLR5的小鼠,并检查了它们的肠道表型。与TLR5KO小鼠相比,TLR4/5DKO小鼠既没有出现直肠脱垂(75只小鼠中0只,其中许多小鼠随访至10个月大),也没有出现可检测到的肠道出血。此外,盲肠和结肠的显微镜检查显示盲肠只有轻微的组织病理学异常(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和图gydF4y2Ba7gydF4y2BaTLR4/5DKO小鼠的结肠重量仅略有增加,缺乏TLR5KO小鼠中显著的盲肠重量减少和脾肿大(以及肠淋巴结肿大)(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaC).盲肠中髓过氧化物酶(MPO)水平中度升高,但结肠中没有(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaB),一些TLR4/5DKO小鼠(25只中有7只)的SAA水平显著升高(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaC).在12周龄和6月龄的TLR4/5DKO小鼠中观察到结肠炎证据的缺乏。我们还确定了TLR4/5DKO小鼠是否具有TLR5KO小鼠所表现出的细菌负担升高。我们观察到,与TLR5KO小鼠一样,TLR4/5DKO小鼠的粪便和结肠粘附物中可培养的肠道细菌水平显著升高(图gydF4y2Ba7gydF4y2BaD).然而,与TLR5KO小鼠不同,TLR4/5DKO小鼠在肝脏/脾脏中缺乏可检测到的细菌,这表明结肠炎症可能导致肠道细菌向这些器官的易位。接下来,我们比较了这些小鼠结肠自发分泌的细胞因子(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).为了与窝友进行直接比较,并评估与上述数据相关的结果,如图所示gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,我们保持不变gydF4y2BaygydF4y2Ba轴刻度,如图所示gydF4y2Ba7gydF4y2Ba。尽管肠道细菌负荷升高,TLR4/5DKO小鼠的结肠表现出较少的KC、IL-6和TNF-α自发分泌,并且与WT小鼠一样,没有分泌可检测到的IL-12p70或IL-23。此外,TLR4/ 5dko小鼠血清KC水平明显降低,为了进一步评估TLR5在肠道细胞因子产生中的作用,我们还测量了TLR4缺失小鼠(TLR4/ 5dko同窝小鼠的后代)结肠细胞因子的产生。我们观察到,在tlr4缺失的背景下,TLR5的缺失仍然会降低KC和IL-6的结肠生成,但只会导致TNF-α和IL-17的适度增加。TLR4/5DKO小鼠IL-1β水平升高gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)的分泌相对于WT窝仔仍然升高,这表明这可能是由另一种途径驱动的。最后,尽管在TLR5KO小鼠中Ang4的表达持续降低,但在TLR4/5DKO小鼠中Ang4的表达是可变的(数据未显示),这表明该基因的表达可能受到多种途径的调控,并且/或其在TLR5KO中的表达降低实际上可能是由细胞因子/炎症环境引起的。gydF4y2Ba
删除TLR4可消融TLR5KO小鼠的结肠炎。gydF4y2Ba对12周龄TLR4/5DKO和WT窝仔实施安乐死并进行参数分析。H&E-stained (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)盲肠及(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)结肠。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba盲肠、结肠和脾脏的重量。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba盲肠和结肠MPO水平。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba) SAA水平。(gydF4y2BaFgydF4y2Ba)粪便和结肠附着的cfu。*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
删除TLR4可以减少TLR5KO小鼠结肠细胞因子的产生。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba) TLR4KO、TLR4/5DKO或WT窝仔的结肠在添加抗生素的无血清培养基中体外培养24小时。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba) ELISA法测定释放到培养基中的细胞因子。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)血清KC检测*gydF4y2BaP
作为一种额外的方法,我们试图通过用抗生素治疗小鼠来降低肠道细菌的水平来降低TLR配体的水平。具体来说,我们接下来用链霉素治疗5周大的结肠炎TLR5KO小鼠3周,并确定它是否改善了它们的结肠炎。这种治疗显著降低了他们的SAA水平(图gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),减轻了严重炎症和直肠脱垂(7只治疗小鼠中有5只预防了脱垂)。相比之下,未接受抗生素治疗的结肠炎TLR5KO小鼠在这段时间内均出现直肠脱出(18只小鼠中的18只)。此外,我们同样对已经发生直肠脱垂的TLR5KO小鼠进行了治疗,发现这些治疗小鼠的肠道和脾脏的大小和外观相对正常,尽管这种治疗没有逆转脱垂(数据未显示)。总之,这些结果表明,TLR5的缺失导致无法管理肠道菌群,导致TLR4的激活增加,并可能介导促炎基因表达的其他途径,这些促炎基因表达驱动炎症细胞的募集,从而允许肠道细菌到达脾脏。gydF4y2Ba
抗生素治疗可改善TLR5KO小鼠的结肠炎。gydF4y2Ba5周龄结肠炎T5KO-H小鼠给予链霉素(1.25%在饮用水中)治疗3周。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)链霉素治疗前后SAA水平。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba盲肠和结肠大体外观的代表图像。(i)非结石(T5KO-L)。(ii)未经治疗的结肠炎(T5KO-H)。(iii)链霉素治疗3周后SAA高水平降低的T5KO-H小鼠。gydF4y2Ba
为了进一步确定TLR5的缺失是否会导致通过TLR4的反应升高,我们测量了lps诱导的脾细胞和腹腔巨噬细胞的体外反应。与WT窝仔相比,来自非结肠炎(即T5KO-L) TLR5KO小鼠的脾细胞在LPS作用下表现出高3倍水平的IFN-γ(补充图5A)。相比之下,从WT和TLR5KO小鼠分离出的巨噬细胞对LPS的反应相似(补充图5B),这表明TLR5KO脾细胞对LPS的反应升高可能是获得性的,并可能由于肠道细菌稳态的改变而表现在肠道中,而不是反映TLR5在调节TLR4中的固有作用。gydF4y2Ba
基于体外细菌-上皮相互作用的广泛建模,其中鞭毛蛋白是促炎基因表达的主要先天免疫激活剂,我们假设缺乏TLR5的小鼠会表现出较低的粘膜炎症发展趋势。相比之下,我们观察到转基因小鼠缺乏TLR5表现出自发的促炎基因表达升高,并且在一部分小鼠中表现出自发结肠炎。TLR5的缺失也会导致肠道菌群的改变。无论是促炎基因表达,还是由TLR5缺失而非菌群升高引起的自发性结肠炎,都需要TLR4。总之,这些观察结果表明TLR5KO结肠炎可能源于TLR5缺失导致的肠道微生物稳态改变。这些观察结果表明,TLR5在保护肠道方面起着重要而非多余的作用。相比之下,被改造成缺乏其他个体TLRs的小鼠通常没有表现出强烈的基础肠表型。gydF4y2Ba
虽然只有部分TLR5KO小鼠表现出明显的结肠炎临床和/或组织病理学证据,但非结肠炎TLR5KO小鼠由于TLR5信号的丢失仍然表现出明显的基础异常。具体来说,非结肠炎TLR5KO小鼠结肠中的细菌负担增加,并且在肝脏/脾脏中可检测到此类细菌。一种可能性是,TLR5的缺失可能会导致结肠中细菌负担的增加,原因是肠道中基因的表达减少,如gydF4y2BaAng4gydF4y2Ba尽管在TLR4/5DKO小鼠中维持Ang4的表达否定了这种可能性。因此,另一种可能性是,IL-8 (KC)和IL-6在调节粘膜免疫中发挥重要作用,结肠表达的减少也可能导致肠道菌群的改变。具体来说,我们设想,局部上皮细胞的IL-8分泌可能允许有限的靶向招募少量的中性粒细胞,这些中性粒细胞可以有效地清除破坏上皮细胞的细菌。这种“微感染”的清除可以在没有临床表现的情况下发生,并且可能很难在组织病理学上观察到。为了支持这种普遍的可能性,我们注意到健康的小鼠结肠(许多菌株/来源)分泌了大量的KC,尽管在健康的结肠粘膜中中性粒细胞相对稀少。在这种情况下,失去tlr5介导的KC产生将导致这些微感染的清除效率低下,导致更大的感染,然后通过TLR4等其他途径触发促炎基因表达。以IL-6为例,我们推测,考虑到IL-6在调节适应性免疫中的重要作用,肠道IL-6的降低可能导致适应性黏膜免疫系统功能不佳。gydF4y2Ba
重要的是,所有这些tlr5调控的宿主防御机制都可以广泛地帮助控制各种细菌物种的水平,而不管特定物种是否表达鞭毛蛋白。按照这种可能性,gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba从TLR5KO小鼠的结肠、肝脏和脾脏中分离出的菌株是非运动性的,因此可能不会产生鞭毛蛋白。虽然这些gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba是已知的条件致病菌(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),它们向肝脏和脾脏的易位在TLR4/5DKO小鼠中没有发生,这表明这一事件可能是疾病的结果,而不是潜在的机制。因此,可能导致TLR5KO结肠炎的微生物群的具体性质尚不清楚。虽然我们的实验方法(TLR5KO小鼠总是直接与它们的WT同窝小鼠(或第一代后代)进行比较)反对在群体中存在真正的病原体,但它不排除在TLR5信号缺乏的小鼠中引起疾病的机会性病原体的可能性。已知其他自发结肠炎小鼠(如IL-10, Mdr)的疾病严重程度取决于它们所处的环境,普遍存在的微生物群被认为是唯一最重要的决定因素。一个特别重要的作用已被描述gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba大多数小鼠设施不认为它们具有致病性和/或监测,因为它们不会在WT小鼠中引起疾病。我们的小鼠群体(TLR5KO和WT)检测呈阳性gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba(对送往美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学的粪便进行pcr检测)。我们推测,微生物区系的差异可能是日本饲养的TLR5KO小鼠没有发展到足以引起直肠脱垂的严重结肠炎的基础。gydF4y2Ba
虽然在本研究中没有具体的实验解决,但许多观察表明,TLR5KO无法维持肠道菌群的适当稳态在很大程度上是由于TLR5信号在肠上皮细胞中的丢失。也就是说,我们观察到的结肠蛋白表达的减少仅限于由纯化鞭毛蛋白诱导的基因和由上皮细胞表达的基因,而“主”炎症细胞因子(TNF-α, IL-1β), ThgydF4y2Ba1gydF4y2Ba细胞因子(IL-12p70, IFN-γ)和ThgydF4y2Ba17gydF4y2Ba在TLR5KO小鼠中表达升高的细胞因子(IL-17, IL-23)既不受鞭毛蛋白的诱导,也不受上皮细胞的影响。因此,上皮细胞系普遍对鞭毛蛋白有反应,而tlr5介导的细胞因子在另一个粘膜部位(即肺)的表达需要上皮细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba).最后,TLR5KO小鼠中微生物稳态的改变是由上皮细胞中TLR5功能的丧失引起的,这一观点也得到了最近的研究结果的支持,这些研究结果表明,通过依赖于TLR信号通路,特异性地阻断上皮细胞中NF-κB活化导致自发性结肠炎(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)和另一份最近的报告表明,上皮NF-κB激活可能具有保护作用,而免疫细胞NF-κB则导致结肠炎(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba).相比之下,上皮细胞对许多其他TLR配体的一般无反应表明,TLR5KO小鼠中导致结肠炎的TLR4激活可能主要是由造血细胞介导的,尽管促炎细胞因子诱导的上皮TLR4可能起作用。gydF4y2Ba
TLR4/ 5dko小鼠缺乏强健性结肠炎,这表明TLR4在TLR5KO小鼠中促进肠道炎症的重要性。MyD88KO小鼠无自发性结肠炎,同时无结肠促炎细胞因子,这与TLR信号通常是调节肠道炎症的主要手段的可能性是一致的。然而,由于MyD88KO小鼠也不能对nod样受体途径产生的IL-1β和IL-18产生反应,TLR5的缺失可能导致通过Ipaf和/或Naip5增加细胞内鞭毛蛋白的识别,其功能在很大程度上是通过调节成熟IL-18和IL-1β的产生(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),会引发结肠炎。此外,增加的细菌负荷可能最终导致细菌产物,如n -甲酰化肽直接招募免疫细胞。gydF4y2Ba
除了TLR5KO小鼠可能缺乏鞭毛蛋白诱导的细胞因子和抗菌蛋白的表达外,我们推测TLR5KO小鼠也可能改变了细胞凋亡/细胞存活水平。这种改变可能是由于它们的细菌负担增加,或者,考虑到TLR5信号在调节细胞生存中的作用日益得到重视,可能是由于肠道中鞭毛蛋白基础水平缺乏TLR5信号。在体外,鞭毛蛋白同时激活促凋亡和抗凋亡信号通路(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba),但在鞭毛蛋白缺乏引起的肠胃炎发生时,细胞凋亡明显增加gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba表明TLR5信号通路在病原体挑战期间促进细胞存活的潜在重要作用(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba).TLR5的基底外侧极化以及极化上皮细胞和结肠中缺乏对顶端鞭毛蛋白的促炎信号表明,TLR5不会被管腔共生微生物强有力地激活(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba).然而,在这种情况下,低水平的TLR5信号可能不足以导致炎症,但可能足以调节体内平衡gydF4y2Ba/gydF4y2Ba细胞存活途径。gydF4y2Ba
虽然小鼠TLR5信号的完全丧失会导致“自发性”结肠炎的发展,但携带显性负TLR5等位基因(称为TLR5)的人类TLR5功能的75%丧失gydF4y2Ba停止gydF4y2Ba,似乎并没有很好地模拟这种表型。具体来说,TLR5的运输gydF4y2Ba停止gydF4y2Ba没有影响伤寒获得或临床病程的地区在哪里gydF4y2Ba伤寒沙门氏菌gydF4y2Ba是地方性的(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba), TLR5的运输亦不受影响gydF4y2Ba停止gydF4y2Ba似乎会增加一个人患上特发性肠道炎症的可能性,即克罗恩病和溃疡性结肠炎。相反,在某些种族背景下,TLR5的携带gydF4y2Ba停止gydF4y2Ba与克罗恩病呈负相关,这表明TLR5功能的降低实际上可以预防这种疾病(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).虽然这种明显的悖论背后的机制尚不清楚,但我们的观察仍然提供了对克罗恩病的机制洞察。具体来说,基因突变gydF4y2BaNod2gydF4y2Ba已建议让Nod2失去功能(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)或过度活跃(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba)或通过其他TLRs导致信号失调(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),从而分别由于先天免疫缺陷、先天免疫亢进或免疫失调而导致克罗恩病。因此,我们观察到的工程先天性免疫缺陷可导致结肠炎支持前一种可能性,即先天性免疫缺陷由于基因改变gydF4y2BaNod2gydF4y2Ba和/或其他基因可能在一定程度上是克罗恩病的基础。gydF4y2Ba
老鼠。gydF4y2Ba杂合TLR5小鼠(在混合C57BL/6 × 129/Sv背景下产生,回交3代至C57BL/6)从微生物疾病研究所送往查尔斯河实验室,在那里它们经历了相对标准的隔离期,在此期间,哨点小鼠被检查大多数已知的小鼠病原体。在埃默里大学进行了一段额外的隔离/测试后,培育了杂合子TLR5小鼠,以产生N4、N6和N8水平的TLR5KO小鼠和WT窝仔。本文数据来源于WT同窝小鼠和TLR5、TLR5KO小鼠N6水平。TLR5KO小鼠分别与IL-10KO或TLR4KO小鼠(购买自Jackson实验室)杂交,生成TLR5/IL-10DKO和IL-10KO窝仔或TLR4/5DKO小鼠和WT窝仔。MyD88KO(回交超过10代)已经在我们的设施中培育了3年多,并与最初从杰克逊实验室购买的真正的C57BL/6小鼠进行了比较。所有的动物实验都得到了埃默里大学伦理委员会的批准。gydF4y2Ba
TLR5 KO小鼠基础表型的评估。gydF4y2Ba年龄和性别匹配(8 ~ 12周龄)的WT和TLR5KO小鼠逆行眼眶出血,CO处死gydF4y2Ba2gydF4y2Ba窒息。立即用冰冷的PBS冲洗盲肠和结肠,称量(清洗前称量盲肠),观察结肠自发炎症、收缩和肿胀情况。然后将组织快速冷冻在液氮中进行生化分析或RNA分离或快速冷冻在OCT中或固定在10%缓冲福尔马林中进行组织学分析。另外,称重肝脏和脾脏。分析血清中的SAA (ELISA试剂盒来自Biosource)、脂脂素2(通过Western blotting使用来自R&D系统的抗体)、IL-6、KC、IFN-γ、IL-1β和TNF-α(使用Duoset试剂盒)、IL-18 (Quantikine)来自R&D系统、IL-12p70、IL-17、IL-23 (eBiosciences)和IL-10 (BD Biosciences)。粪便血和盲肠/结肠MPO的测量如前所述(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba).中性粒细胞在6 μm冷冻切片上进行免疫荧光染色。简而言之,切片固定在冷丙酮中,在PBS中洗涤,用阻断缓冲液培养,然后是α-GR1-APC (BD - Pharmingen),洗涤,并安装在含有DAPI的介质中。APC信号伪红色。通过PBS/0.01% Triton X-100均质,然后在非选择性Luria-Bertani琼脂上连续稀释,测定新鲜分离的粪便、肝脏或脾脏中的CFU水平。为评估结肠粘膜下cfu,纵切结肠广泛清洗,用镊子轻轻刮擦,然后如上所示均质/电镀。在密苏里大学研究动物诊断实验室(哥伦比亚,密苏里州,美国)通过标准血液学分析确定完整的外周血计数。gydF4y2Ba
结肠炎的组织病理学评分。gydF4y2Ba对盲肠和结肠的h&e染色切片进行结肠炎评分如下:细胞浸润(0,与典型的C57BL/6小鼠没有区别;1、温和;2、温和;3、健壮性,包括中性粒细胞);水肿(0,无;1、轻微;3、温和的);地穴丢失(0,无;1、轻微;2、温和; 3, substantial); and goblet cell depletion (0, none; 1, modest; 2, substantial)
结肠的文化。gydF4y2Ba结肠切片按照Rakoff-Nahoum等人的描述进行培养(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).简而言之,1厘米长的结肠近端片段在HBSS中清洗,并辅以青霉素和链霉素(Cellgro)。这些片段在24孔平底培养板(Costar)中培养,培养液为无血清RPMI 1640培养基(Cellgro),并添加青霉素和链霉素,gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺和非必需氨基酸。24小时后,收集上清液,在13000下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下保存10分钟,并在-20°C保存直到分析。兔多克隆抗体;通过免疫印迹法分析结肠培养上清液中的MUC2 (Biomeda)、MMP9和MMP7 (Chemicon)。gydF4y2Ba
体内上皮屏障通透性。gydF4y2Ba使用fitc标记的右旋糖酐方法进行屏障功能的体内检测,如所述(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba).简而言之,6至8周大的WT和TLR5KO小鼠被剥夺食物和水4小时,并喂给小鼠渗透性示踪剂fitc标记的右旋糖酐4 kDa或40 kDa (0.6 mg/g体重)或HRP (0.02 mg/g体重;Sigma-Aldrich)。3小时后经眶后采血,测定各样品的荧光强度(激发490 nm;发射波长:520 nm;HITACHI F-4500荧光分光光度计),fitc -葡聚糖浓度由fitc -葡聚糖连续稀释生成的标准曲线测定。用HRP底物三甲基联苯胺比色法测定血清中的HRP,并在650 nm处测量吸光度。gydF4y2Ba
抗生素治疗。gydF4y2Ba5周大的结肠炎T5KO-H小鼠在常规饮用水中给予1.25%链霉素(Sigma-Aldrich) 3周。然后对小鼠进行反眼眶放血进行SAA分析,对其实施安乐死,并对其进行大体肠道病理分析。gydF4y2Ba
16S rDNA测序鉴定细菌。gydF4y2Ba采用正向(5 ' -AGAGTTTGATCACTGGCTCAG-3 ')和反向(5 ' -TACGGCTTACCTTGTTACGACTT-3 ')引物和纯化PCR产物(QIAquick纯化试剂盒来自QIAGEN) PCR扩增16S rRNA,克隆到p-宝石- t Easy载体(Promega)。利用亚克隆效率DH5α化学活性细胞(Invitrogen)进行转化。在Luria-Bertani/ampicillin/IPTG/X-Gal板上筛选插入转化子,并选择阳性白色菌落,在37℃震动过夜;质粒DNA分离(QIAGEN),并使用M13正向和反向引物在Agencourt Bioscience Corp.的Genomic Services进行测序。gydF4y2Ba
微阵列分析。gydF4y2Ba简而言之,使用TRI制备了来自结肠的总RNA(每组3只小鼠)gydF4y2BazolgydF4y2Badnasi - free RNase1 (QIAGEN)处理。凝胶电泳验证了RNA转录本的完整性。从30 μg总RNA合成标记cDNA。结肠RNA和小鼠参考RNA (Stratagene)样本分别用Cy5-和cy3 -偶联的dCTP标记(GE Healthcare)。标记后,cdna用Mouse MEEBO 38K Array芯片(Vanderbilt Microarray Shared Resource)进行纯化、浓缩、杂交过夜。阵列扫描使用GenePix 4100A扫描仪(分子设备)。所有实验都与相同的Stratagene小鼠参考RNA进行比较,以便在所有实验中比较每个基因的相对表达水平。归一化后,选择强度大于背景均值2倍的基因。gydF4y2Ba
统计数据。gydF4y2Ba用Student 's评价统计学意义gydF4y2BatgydF4y2Ba测试,gydF4y2BaPgydF4y2Ba小于0.05的值为显著值。gydF4y2Ba
这项工作得到了广泛医学研究基金会、美国克罗恩病和结肠炎基金会以及美国国立卫生研究院(DK061417)对A.T. Gewirtz的资助。M. Vijay-Kumar是美国克罗恩病和结肠炎基金会研究奖学金的获得者。我们也感谢美国国立卫生研究院消化系统疾病研究与发展中心资助埃默里大学(DK064399)。我们感谢Rheinallt Jones的有益讨论,以及Sean Lyons和Daniel Moore III的技术支持。gydF4y2Ba
使用的非标准缩写:gydF4y2BaAng4 angiogenin-4;DKO,双KO;KC,角质形成细胞来源的趋化因子;MPO、髓过氧物酶;SAA,血清淀粉样蛋白A;SAA含量高的T5KO-H、TLR5KO;SAA水平低的T5KO-L, TLR5KO。gydF4y2Ba
利益冲突:gydF4y2Ba作者宣称不存在利益冲突。gydF4y2Ba
参考信息:gydF4y2Baj .中国。投资。gydF4y2Ba117gydF4y2Ba: 3909 - 3921(2007)。doi: 10.1172 / JCI33084gydF4y2Ba