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研究文章胃肠病学免费获取|10.1172 / JCI80997
1德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院1门诊部。
2德国美因茨大学免疫学研究所。
3.德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院肾病理科。
4Humanitas临床和研究中心,意大利米兰。
5德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院人类遗传学研究所。
6东安格利亚大学诺维奇医学院,诺维奇研究园,英国诺维奇。
7哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根。
8瑞典哥德堡大学医学研究所Sahlgrenska癌症中心。
通讯地址:Imke Atreya,翻译研究中心(TRC), Schwabachanlage 12, 91054 Erlangen, Germany。电话:49.0.9131.85.39602;电子邮件:imke.atreya@uk-erlangen.de.
作者注:M.F. Neurath和I. Atreya对这项工作做出了同样的贡献。
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2德国美因茨大学免疫学研究所。
3.德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院肾病理科。
4Humanitas临床和研究中心,意大利米兰。
5德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院人类遗传学研究所。
6东安格利亚大学诺维奇医学院,诺维奇研究园,英国诺维奇。
7哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根。
8瑞典哥德堡大学医学研究所Sahlgrenska癌症中心。
通讯地址:Imke Atreya,翻译研究中心(TRC), Schwabachanlage 12, 91054 Erlangen, Germany。电话:49.0.9131.85.39602;电子邮件:imke.atreya@uk-erlangen.de.
作者注:M.F. Neurath和I. Atreya对这项工作做出了同样的贡献。
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2德国美因茨大学免疫学研究所。
3.德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院肾病理科。
4Humanitas临床和研究中心,意大利米兰。
5德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院人类遗传学研究所。
6东安格利亚大学诺维奇医学院,诺维奇研究园,英国诺维奇。
7哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根。
8瑞典哥德堡大学医学研究所Sahlgrenska癌症中心。
通讯地址:Imke Atreya,翻译研究中心(TRC), Schwabachanlage 12, 91054 Erlangen, Germany。电话:49.0.9131.85.39602;电子邮件:imke.atreya@uk-erlangen.de.
作者注:M.F. Neurath和I. Atreya对这项工作做出了同样的贡献。
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2德国美因茨大学免疫学研究所。
3.德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院肾病理科。
4Humanitas临床和研究中心,意大利米兰。
5德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院人类遗传学研究所。
6东安格利亚大学诺维奇医学院,诺维奇研究园,英国诺维奇。
7哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根。
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2德国美因茨大学免疫学研究所。
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4Humanitas临床和研究中心,意大利米兰。
5德国埃尔兰根-纽伦堡大学埃尔兰根大学医院人类遗传学研究所。
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7哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根。
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作者注:M.F. Neurath和I. Atreya对这项工作做出了同样的贡献。
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发布于2016年1月11日更多信息
虽然肠屏障功能缺陷是炎症性肠病(IBDs)患者的一个关键致病因素,但驱动肠上皮细胞(IECs)疾病特异性改变的分子途径在很大程度上尚不清楚。在这里,我们通过使用全基因组方法描述IBD患者IECs的转录组来解决这个问题。我们观察到活动性IBD患者中IECs的疾病特异性改变,rhoa信号明显受损。在IBDs中,上皮rhoa的定位转移到细胞质中,炎症与rhoa的激活抑制有关,这是由于rhoa前酰化酶香叶酰香叶酰基转移酶i (GGTase-I)的表达减少。在功能上,我们发现条件丧失的小鼠Rhoa或者编码GGTase-I的基因,Pggt1b在IECs中表现为自发性慢性肠道炎症,伴有粒细胞和CD4的积累+T细胞。这种表型与细胞骨架重排和异常细胞脱落有关,最终导致上皮完整性的丧失和随后的炎症。这些发现揭示了rhoa的前酰化缺陷在IBDs的发病机制中起着关键作用。在ggtase - i缺陷IECs的小鼠中,Rho-A信号的治疗性触发抑制了肠道炎症,我们的研究结果为IBD患者的上皮损伤和粘膜炎症的治疗提供了新的途径。
肠上皮细胞单层(IECs)是人体与环境最大的接触区域,是抵御病原体、抗原和毒素的机械边界。1).从隐窝底部的早期发育到绒毛尖端的老化细胞脱落,IECs遵循一个连续的翻转过程(2- - - - - -4).在生理条件下,细胞骨架重排和紧密连接蛋白之间的复杂相互作用保证了细胞脱落本身并不意味着上皮完整性的破坏(5).然而,上皮完整性的改变可能导致肠道炎症的发展(1,6),例如炎症性肠病(7).ibd与IECs的显著改变相关,导致紧密连接通透性增加,细胞骨架重排改变,并诱导上皮细胞死亡和随后的屏障功能丧失(1,6).IBD患者的体内研究表明,IEC完整性的丧失甚至先于疾病的临床复发(8),提示屏障功能的改变在IBDs的发病机制中起着至关重要的作用。然而,与屏障功能障碍启动有关的确切的IEC内在机制仍然是谜。
在亚细胞水平上,Rho GTPases代表信号分子,主要参与细胞骨架蛋白的排列和上皮细胞动力学(9- - - - - -13).因为它们的激活优先发生在gtpase与细胞膜相关时(14,15), Rho蛋白的功能主要取决于它们的细胞内定位(16).小的gtpase的招募是由前戊基化控制的,这是一个翻译后的过程,包括疏水的类异戊二烯附着到蛋白质的c端CAAX基序(17).在肠上皮中,已有研究表明凋亡和生理细胞挤压需要rho介导的信号通路(18,19).此外,已知rh - a /ROCK/Myosin II的相互作用对早期肠管的形态发生很重要非洲爪蟾蜍(20.).然而,目前对肠道上皮细胞中rhoa信号的调控及其对体内肠道稳态的影响还知之甚少。
利用炎症和非炎症组织的IECs基因表达谱,我们发现IBD患者中rhoa信号通路发生了改变。尽管rhoa在正常水平下表达,但IECs中rhoa的胞浆积累表明炎症时rhoa通过前酰化激活受损。一致地,基因缺失Rhoa或Pggt1b(编码驱动rhoa激活的戊烯化催化酶香叶酰香叶酰转移酶i [GGTase-I])影响细胞骨架和细胞脱落,导致上皮损伤和自发性肠道炎症。我们的数据表明,ggtase - i缺陷上皮细胞的损伤是由Rho- a功能障碍驱动的,这种表型可以通过Rho激活成功逆转。综上所述,我们的研究首次强调了功能性rhoa信号通路及其通过前酰化调节维持上皮完整性的相关性。因此,上皮细胞中的丙烯化铑- a成为IBDs的治疗靶点。
上皮细胞rhoa在肠道炎症中的重要作用。上皮损伤引起的肠糜烂和溃疡是IBDs的临床特征,但在肠道炎症背景下上皮破坏的潜在发病机制尚不完全清楚。为了确定炎症时肠上皮细胞信号通路的改变,我们使用了启发式方法,并在克罗恩病患者(CD患者)纯化的IECs中进行了基因表达阵列(阵列数据可通过NCBI的基因表达集合[GEO GSE72780]获得)。纳入患者的临床资料汇总于补充表1(本文的补充材料可以在网上找到;doi:10.1172 / JCI80997DS1).对乳糜泻患者炎症和非炎症肠道区域的IECs进行基因组表达比较分析表明,每个组的样本聚集在一起,我们能够识别出129个显著差异的基因(折叠变化≥1.5;P两组间≤0.05)(图1一个).有趣的是,基因本体论分析表明炎症相关的下调通路涉及上皮细胞动力学和IEC挤压,如Rho- a信号、上皮粘附连接和Rho (图1 b).值得注意的是,涉及Rho GTPases而不是Rho- a的通路,如Cdc42信号,没有显示出显著的变化(补充图1).尽管我们的数据暗示了IECs中rhoa功能受损与人类IBDs炎症之间的关系,但与未炎症组织相比,我们没有发现CD或溃疡性结肠炎患者(UC患者)炎症肠道区域的IECs中rhoa的蛋白或mRNA表达水平降低(图2一个而且补充表2).然而,在对照组患者的IECs中- rh - a几乎只在质膜中检测到,而在肠道炎症区域的IECs则以显著的rh - a胞质积累为特征(图2 b,补充图1、B、C,补充表3),提示IBD患者IECs中不活跃的rh - a占主导地位。同样,炎症时细胞质rhoa的富集也可以在右旋糖酐硫酸钠暴露(dss暴露)小鼠的IECs中得到证实(图2 c而且补充图1 d),这表明上皮Rho-A功能障碍与肠道炎症之间存在联系。为了进一步解决受损上皮rhoa的功能后果,我们制造了iec特异性缺失的小鼠Rhoa(ρΔIEC老鼠)通过杂交老鼠携带loxp -侧翼Rhoa基因(21)与表达cree -重组酶的小鼠在上皮特异性绒毛启动子的控制下(22).IECs中缺乏rh - a会导致体重下降(图3一)和自发性小肠粘膜炎症(高分辨率结肠镜检查显示)(图3 b).通过组织学评分评估炎症组织改变证实了rhoa的小肠病理ΔIEC老鼠。特别是rh - a的小肠ΔIEC小鼠的特征是隐窝异常,绒毛变钝,杯状细胞数量减少(图3、C和D,补充图2一个), CD4明显浸润+T细胞和中性粒细胞(图3 e而且补充图2 b),以及显著升高的Tnfa(图3 f)相比,Rhoafl / fl同窝出生的。结肠组织受影响较小,CD4细胞数量增加+rh - a结肠中T细胞和黏膜TNF-α水平升高ΔIEC与WT动物相比,小鼠无统计学意义(补充图2,C和D).有趣的是,观察到的rhoa肠道表型ΔIEC小鼠不是来自胚胎发生的发育问题,因为rhoa的新生儿ΔIEC老鼠看起来很健康,没有显示体重减轻,也没有区别Rhoafl / fl肠道组织结构方面的窝畜(补充图2,E-G).因此,我们的数据确定上皮rhoa是维持肠道稳态和上皮细胞结构的关键调节因子。rhoa中改变的上皮结构ΔIEC小鼠的肠通透性显著增加(图3 g),提示上皮性rhoa缺乏症可导致肠屏障功能受损。
比较从乳糜泻患者无炎症和炎症肠区分离的IECs的基因表达阵列。(一个)显示IECs中差异表达基因的热图(fold-change≥1.5;P≤0.05)。(B)前20位的规范通路。数据表示为-log (P值)。P值由独立样本获得t测试(智慧分析)。n= 9。
rh - a在人类和小鼠结肠炎中的表达。(一个)人肠道分离的IECs中rh - a蛋白的表达;Blots代表2个实验(上);而且Rhoa从人肠道分离的IECs中mRNA的表达(下)。均值±SEM显示(对照,n= 4;IBD uninflamed,n= 9;CD,n= 5;加州大学,n= 4)。无统计学意义,单因素方差分析与LSD多重比较检验。(B)人类肠道样本中rh - a免疫染色(红色)的代表性图片和定量。切片用EpCAM(绿色)和Hoechst(蓝色)反染色。箭头表示rhoa的胞质积累。条形图显示细胞内含有rh - a的细胞百分比(2个绒毛或隐窝/样本;30 IEC /样本)。平均值±SEM(对照,n= 5;IBD uninflamed,n= 7;CD,n= 3;加州大学,n= 3)。组合P与对照组相比,≤0.001;*P与无炎症的ibd相比≤0.05;单因素方差分析与LSD多重比较检验。原装放大,×63,放大×4。(C) Western blot分析dss暴露小鼠和无挑战小鼠结肠IECs的胞质蛋白和总蛋白中rhoa的含量。Blots代表2个实验(n= 4 /组)。案子,控制;联合国,uninflamed;影响力,发炎。
表型的ρΔIEC老鼠。(一个)对照组和rh - a组体重ΔIEC老鼠;百分比计算在第4周对照小鼠的平均体重。(n= 9)。(B)不同肠段的代表性微型内镜图片(3个实验)。(C)具有代表性的H&E图(3个实验)。原始的放大,×20。(D)不同肠段的组织学评分量化(n= 9)。(E)回肠细胞浸润定量(免疫荧光染色)。n= 6 /组。(F)TnfaqPCR法测定回肠蛋白表达。(n= 6 /组)。(G)口服fitc -葡聚糖血清浓度。n= 4 /组。数据表示均值±SEM一个而且D- - - - - -G.__P≤0.05和组合P与对照组相比,≤0.001,独立样本t测试中,在一个,D,F,G.
乳糜泻和UC患者炎症肠上皮内的戊二酰化缺陷。由于ibd中rhoa信号通路受损不能用rhoa表达减少来解释(图2一个),我们假设在炎症条件下,通过前酰化(GTPase的膜亲和力所必需的翻译后修饰),上皮rhoa的激活受损(23).值得注意的是,rho - a相关戊酰化催化酶GGTase-I的表达分析表明,CD和UC患者在黏膜炎症期间IECs中的蛋白质和mRNA水平显著降低(图4,A和B,补充图3,补充表3、4).肠道炎症与GGTase-I表达减少之间的关系可以在dss诱导的小鼠结肠炎实验模型中进一步证实。在该模型中,炎症后IECs中非丙烯酰化(Np)蛋白的积累显著降低了GGTase-I的表达,表明Np小GTPase Rap1A (Np-Rap1A)的检测增加(图4、C和D,补充图3,B和C).因此,炎症时IECs的戊前酰化缺陷可能与炎症性肠病中rhoa的亚细胞定位和信号转导改变有关。
GGTase-Iβ在人和小鼠结肠炎中的表达。(一个GGTase-Iβ蛋白在人肠道分离的IECs中的表达;Blots是两个实验的代表。相同的样品见图2一个(上);Pggt1b从人肠道分离的IECs中mRNA的表达(下)。(控制,n= 3;IBD uninflamed,n= 7;CD,n= 3;加州大学,n= 4)。__P与对照组相比≤0.05;*P与无炎症的IBD相比≤0.05。(B)人肠道样品中GGTase-Iβ免疫染色(红色)的代表性图片和定量。(控制,n= 6;IBD uninflamed,n= 7;CD,n= 7;加州大学,n条形图显示表达GGTase-Iβ的细胞百分比(2个绒毛或隐窝/样本;60 iec /样本)。组合P与对照组相比,≤0.001;*P与无炎症的IBD相比≤0.05。原始的放大,×63。(CGGTase-Iβ在dss暴露小鼠IECs中的表达:mRNA表达,用qPCR (n= 8 /组)。†††P≤0.0001 vs控制(上);3次实验的代表性涂抹(下)。(D) dss处理小鼠结肠中GGTase-Iβ免疫染色(红色)。平均强度量化(n= 8 /组)。原始的放大,×63。__P与对照组相比≤0.05。免疫染色用EpCAM(绿色)和Hoechst(蓝色)反染B而且D.平均值±SEM见一个- - - - - -D.采用单因素方差分析和LSD多重比较检验一个而且B.独立样本t测试用于C而且D.案子,控制;联合国,uninflamed;影响力,发炎。
为了进一步了解控制的信号机制Pggt1b在肠上皮细胞中表达,上皮类器官在不同的促炎细胞因子存在下培养。使用肠道类器官技术使我们能够在没有上皮外因子的情况下进行分析(24).有趣的是,暴露于IBD标志细胞因子IL-6 (25)显著降低Pggt1b上皮样器官的表达(图5一个),提示炎症性肠病患者炎症肠道中IL-6信号的病理性增加有助于抑制Pggt1bIECs中rhoa活性的表达和随后的损伤。通过比较结肠和小肠中的IECs,我们观察到相反的表达模式白细胞介素6而且Pggt1b高白细胞介素6(补充图4)及相对较低Pggt1b表达式(图5 b)在小肠内。因此,我们的数据表明,IL-6可能增强IECs中区域性以及炎症诱导的前酰化水平的改变。除了相对较低的Pggt1b表达,小肠内IECs也可表现为表达减少Rhoa结肠内mRNA与IECs的比较(图5 b),使小肠更容易受到Rhoa而且Pggt1b抑制。随着地区的不同Rhoa当我们分析全肠组织(补充图4 b),我们的数据进一步表明肠道的调节Rhoa具体表达发生在上皮腔室内。
肠上皮组织中GGTase-Iβ和rhoa表达的调控。(一个)Pggt1b而且Rhoa在未受挑战的WT小鼠经细胞因子处理的肠道类器官中(20 ng/ml细胞因子,8小时刺激)mRNA表达(用qPCR测定)(n= 3 /组)。__P与对照组相比≤0.05;独立样本t测试。(B)Pggt1b而且RhoaWT小鼠不同肠段IECs mRNA表达(n= 4 /组)。__P≤0.05;单因素方差分析与LSD多重比较检验。柱状显示均值±SEM一个而且B.
IECs内的戊前酰化缺陷导致细胞脱落的改变和肠道内稳态的丧失。为了进一步表征前酰化对体内rh - a信号通路和肠道炎症的影响,我们建立了一个具有诱导条件的小鼠系Pggt1b在iec不足。繁殖的Pggt1bfl / fl老鼠(26)与villin- cree - ert2小鼠(22)(他莫西芬诱导ert2依赖性的cre -重组酶表达)导致Pggt-Iβ的生成TiΔIEC小鼠,在他莫昔芬治疗前发育正常,无肠道病理迹象(数据未显示)。它莫西芬诱导的特异性缺失Pggt1b导致上皮细胞减少Pggt1b信使rna (补充图5,A和B)和GGTase-I蛋白的表达,随后,Np蛋白的富集(图6,A和B,补充图5 c).这种缺失导致体重下降(图7),而Pggt1bfl / fl对照组小鼠不受影响。肉眼、内窥镜和组织学分析证实了Pggt-Iβ的慢性肠道炎症和损伤TiΔIEC老鼠(图7中,中).结肠显示中度炎症的迹象,但没有达到统计学意义,而在Pggt-Iβ的小肠中可以观察到显著的绒毛-隐窝结构破坏和上皮完整性的丧失TiΔIEC与对照组小鼠比较(图7 e).小肠组织的免疫荧光和生物化学分析表明,Pggt-Iβ可引起小肠炎症损伤TiΔIEC小鼠的CD4细胞大量浸润+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞(图7 f并显著增加促炎细胞因子的水平,如IL-1β, IL-6和TNF-α (图7 g而且补充图5 d).Pggt-Iβ的结肠组织TiΔIEC小鼠在炎症细胞浸润和细胞因子产生方面仅显示中度改变(补充图5,Ea F)。为了研究IECs的前酰化缺陷是否会损害肠道屏障,我们接下来让小鼠接受fitc -葡聚糖灌胃。我们注意到FITC血清中Pggt-Iβ水平显著升高TiΔIEC与对照组小鼠相比,提示肠道屏障功能的破坏(图7 h).时间过程研究进一步表明,术后上皮损伤和肠屏障损伤的发展Pggt1b删除甚至先于促炎细胞因子的产生(补充图6).因此,肠道屏障功能的丧失是Pggt-Iβ的主要缺陷TiΔIEC老鼠。
验证tamoxifen-inducedPggt1bIECs的缺失(Pggt-IβTiΔIEC老鼠)。Pggt-IβTiΔIEC小鼠腹腔注射他莫西芬,连续3 d。第0天定义为第一次注射他莫西芬的那天。(一个) GGTase-Iβ和Np-Rap1A蛋白的Western blot分析;Blots是3个独立实验的代表。(B十二指肠组织GGTase-Iβ(红色)和Np-Rap1A(红色)免疫染色代表图(n= 4 /组)。切片用EpCAM(绿色)和Hoechst(蓝色)反染色。原始的放大,×63。
表型的Pggt-IβTiΔIEC老鼠。(一个)对照组体重和Pggt-IβT我ΔIEC小鼠(第0天平均体重百分比)。n= 6 /组;__P≤0.05和组合P≤0.001 vs对照组。(B)全肠宏观图片(3次实验)。(C)迷你内镜图片(3次实验)。(D))的照片。原始的放大,×10;insets,×40。(E)不同肠段的组织学评分量化(n= 6 /组)。__P≤0.05和†††P≤0.0001 vs控制。(F)十二指肠细胞浸润定量(免疫荧光染色)。n= 6 /组。(G)用qPCR法检测十二指肠TNF-α的表达。n= 2 /组;代表3个实验。(H口服fitc -葡聚糖血药浓度(n= 4).均值±SEM in一个而且E- - - - - -H.__P与对照组相比≤0.05F- - - - - -H.独立样本t测试中,在一个而且E- - - - - -H.Duoden,十二指肠。
为了研究前酰化是否可能是上皮细胞存活的必要过程,我们接下来研究了类器官的上皮发育(24)从Pggt-IβTiΔIEC老鼠。Pggt1b缺失损害了复杂上皮组织的维持,并导致体外培养的和他莫西酚暴露的Pggt-Iβ类器官的破坏和死亡TiΔIEC老鼠(图8而且补充图7),表明GGTase-I活性是一种控制细胞存活的上皮内因子。这些数据清楚地表明,肠上皮组织和完整性直接依赖于IECs内的前酰化。
ggtase - i β缺陷类器官的发育与存活。从对照和Pggt-Iβ分离的小肠隐窝TiΔIEC用他莫西芬体外治疗小鼠。(一个) 3个独立实验的代表性显微图片。原始的放大,×10。(B而且C用碘化丙啶掺入法(红色)测定细胞死亡染色,如方法中所述。核用Hoechst反染色(蓝色)。代表性的图片;原始放大图,×20 (n= 17) (B).归一化平均荧光强度的量化(红/蓝)。柱状显示平均值±SEM (n= 17) (C).__P与对照组相比≤0.05;独立样本t测试。
细胞凋亡和坏死的失调之前曾被描述为通过屏障功能的丧失引起肠道炎症(4).探讨过度上皮细胞死亡是否可能是Pggt-Iβ发生严重表型的关键驱动因素TiΔIEC小鼠,我们确定凋亡或坏死可能发挥重要作用。不过,也没有对iec的附加特定的删除Casp8,也没有坏死诱导剂Rip3k,挽救了致命的后果Pggt1b删除(补充图8,A-D).此外,在上皮细胞GGTase-I缺失的情况下,沿隐窝轴的IECs增殖并没有减少(补充图8 e),排除了细胞增殖阻滞是Pggt-Iβ组织损伤的关键潜在机制的可能性TiΔIEC老鼠。
我们在关键的内稳态机制没有改变的情况下发现了严重的屏障功能障碍,最终引导我们研究上皮细胞脱落,这是稳定状态下调节上皮细胞周转的关键过程。值得注意的是,使用肠道的活体共聚焦显微镜(5),我们观察到由于Pggt-Iβ上皮间隙的出现,单分子层发生了显著的改变TiΔIEC对照组小鼠除外(图9).在生理条件下,这种空隙是由上皮细胞脱落形成的,并被邻近细胞密封(3.,5,27),以避免屏障功能失效。目的:研究Pggt-Iβ的屏障功能和细胞脱落是否发生改变TiΔIEC正如最近在IBD患者中观察到的那样(8,28,29),我们进行了体内罗丹明泄漏测定。这些研究表明,在Pggt-Iβ中,局部应用的葡聚糖从管腔到固有层的通道增加TiΔIEC与对照组小鼠相比(图9 b而且补充图9).Pggt-Iβ中的绒毛尖端TiΔIEC小鼠出现明显的渗漏点积累和葡聚糖渗透性iec (图9 c),提示上皮细胞完整性改变。此外,Pggt-Iβ增加了细胞脱落TiΔIEC老鼠(补充图9 b),与屏障损失一致,表明脱落改变是介导Pggt-Iβ表型的关键过程TiΔIEC老鼠。
ggtase - i β缺陷上皮细胞的周转和完整性。(一个吖黄碱染色小肠绒毛的活体代表图像(绿色)(3个独立实验)。箭头表示上皮间隙。原始的放大,×40。(B)对照组和Pggt-Iβ的小肠细胞脱落的实时成像TiΔIEC老鼠;吖黄素(绿色)和罗丹明葡聚糖(红色)。2个实验的代表性图片。原始的放大,×20。(C)泄漏入口点(红色箭头)和渗透性iec(白色箭头)的代表性图片和量化。原始的放大,×40。意味着±扫描电镜;n= 8 /组。__P≤0.05和†††P与对照组小鼠相比,≤0.0001;独立样本t测试。
ggtase - i缺陷IECs的电镜分析显示上皮结构破坏和细胞骨架重排改变(图10).GGTase-I缺失时,肌动蛋白纤维和肌凝蛋白IIA在IECs内的定位不再局限于顶端细胞膜,而是沿着侧膜和细胞质扩散(图10 b而且补充图10).利用ggtase - i缺陷IECs的kinome阵列分析细胞骨架重排。64个细胞骨架相关蛋白中有19个的磷酸化被修饰,其中许多蛋白被认为参与了rhoa调控(补充图10 b).由于细胞骨架重排和紧密连接重分布是细胞脱落早期发生的事件之一(27),我们假设细胞脱落在Pggt-Iβ中被阻止TiΔIEC老鼠。因此,我们量化了显示肌动蛋白纤维(漏斗状结构,阻滞事件)与已经脱落到管腔的细胞(细胞核不属于单分子层,完成事件)再分配的iec数量(补充图10 c).的确,在ggtase - i β缺乏的小肠中,阻塞(早期)和完全(晚期)脱落事件的积累(图10 c)表明细胞挤压完成受损。累积的半脱落细胞可能随后损害正常的细胞骨架机制,以密封由此产生的间隙。
ggtase - i β缺陷上皮细胞骨架重排和细胞脱落。(一个) Pggt-Iβ的十二指肠代表性电镜图TiΔIEC和控制老鼠。箭头表示内陷(红色)、顶端网状纤维(蓝色)和丝状超微结构(黄色)(2个独立实验)。原始的放大,×5000;insets×20000。(B) Pggt-Iβ在结肠和十二指肠中f -肌动蛋白纤维(绿色)的phalloidin染色的代表性图片TiΔIEC小鼠(3个独立实验)。核用Hoechst反染。箭头表示肌动蛋白纤维的重新分布。原始的放大,×63。(C)停止脱落与完成脱落事件的量化,表示为总脱落事件的百分比。平均值±SEM;n= 11(结肠);n= 7(十二指肠)。
在GGTase-I缺失的情况下,粘膜炎症是由rh - a信号的阻断引起的。为了进一步分析前酰化缺陷、rhoa信号受损和上皮损伤之间的相互作用,我们接下来对ggtase - i β缺陷IECs的分子变化进行了更深入的表征。定量蛋白质组学和基因表达分析(通过NCBI的GEO [GSE72781]获取阵列数据)显示,322个蛋白质的稳态水平和725个基因的表达在Pggt-Iβ的IECs中受到调控TiΔIEC与对照组小鼠比较(fold-change≥2;P≤0.05)(图11,A和B).GGTase-I缺陷IECs的基因本体论分析表明,GGTase-I前酰化与细胞活力/细胞死亡诱导、细胞骨架重排和细胞形态之间存在关联(图11,C和D,补充表5),与我们的机制观察和先前对潜在Rho靶的发现一致(30.).有趣的是,当我们比较IBD患者的IECs和ggtase - i缺陷的IECs中的基因表达谱时,可以确定rh - a信号通路是在这两种情况下显著调控的仅有的2个通路之一(图11 e).除了rh - a信号外,只有芳基烃受体(AHR)通路(31)在两种情况下都受到调控,但似乎功能相关性较小,因为AHR抑制因子(AHRR)的表达(32)在来自Pggt-Iβ的IECs中没有变化TiΔIEC老鼠(补充图11).此外,rhoa -和ggtase - i缺陷的IECs在阻塞细胞脱落事件的积累上彼此相似(图10、B和C,图12,A和B)以及无法形成规则的类器官结构(图12 c).总之,这些数据强烈表明,rh - a信号的损伤是IECs中GGTase-I活性缺乏的关键后果,与上皮完整性和IBD的发病机制相关。
IECs中蛋白质前酰化减少的分子后果。(一个) Pggt-Iβ在IECs中显著调控的基因热图TiΔIEC对照小鼠(n=每组3人;叠化≥10;P≤0.05;独立样本t测试)。(B) Pggt-Iβ在IECs中显著调控的蛋白质热图TiΔIEC对照小鼠(n= 3表示控制和nPggt-Iβ = 2TiΔIEC老鼠;叠化≥5;P≤0.05;独立样本t测试)。(C而且D去分析。所选基因的表示(C)和蛋白质(D)从前10个列表中聚成与细胞功能(折叠变化)相关的组。(E) CD患者IECs中基因表达谱与Pggt-Iβ的路径分析比较TiΔIEC老鼠(P≤0.05)。独立样本t测试。
rhoa缺陷上皮细胞的完整性和周转。(一个) rhoa缺陷iec内的细胞骨架重排。f -肌动蛋白纤维phalloidin染色的代表性图片(绿色)(3次实验)。核用Hoechst反染。箭头表示肌动蛋白纤维的重新分布。原装放大,×63,放大×3。(B结肠和十二指肠中阻塞和完全脱落事件的量化,用总脱落事件的百分比表示。平均值±SEM;n=每组3人。(C)从对照和rh - a分离的小肠隐窝产生的类器官的发育ΔIEC老鼠;2个实验的代表性图片。
与此相一致的是,ggtase - i β缺乏的IECs表现出膜结合性的大幅减少和胞质rhoa的积累(图13,A和B,补充图12),而其他小的Rho GTPases则没有显示出这种特征(补充图12 b).减少了Rho-A在Pggt-Iβ IECs中的膜定位TiΔIEC小鼠的gtp酶激活效率低下,导致活性gtp结合的rh - a水平降低(图13 c),降低下游rhoa靶蛋白肌球蛋白轻链2 (MLC2)的磷酸化(图13 d).因此,我们证实,在GGTase-I缺失的情况下,IECs中的rh - a激活和信号转导明显受损。在功能水平上,我们想知道激活rh - a信号是否会挽救Pggt-Iβ的肠道病理TiΔIEC小鼠,因此,用Rho激活剂处理这些小鼠。分析Pggt-IβTiΔIEC暴露于特定Rho激活物CN03的小鼠表明,体内IECs中成功触发rhoa活性(补充图12 c)可显著改善内镜下黏膜损伤(图14,A和B),组织学损伤评分明显下降(P= 0.054) (图14,C和D的表达显著减少Il1b而且Il16在十二指肠(图14 e)与未治疗的小鼠相比。因此,通过受损的前酰化形成的rhoa封锁成为Pggt-Iβ黏膜损伤的关键驱动因素TiΔIEC老鼠。观察到的CN03在体内的作用进一步指出了Rho激活剂在治疗上皮性肠道病理方面的潜在治疗适用性。
Pggt-Iβ的rhoa功能障碍TiΔIEC老鼠。(一个) Western blot检测Pggt-Iβ IECs的膜结合蛋白和胞质蛋白中的rh - aTiΔIEC和控制老鼠;Blots代表了3个实验。(B) Pggt-Iβ在结肠中的代表性rh - a免疫染色(红色)TiΔIEC小鼠(2个独立实验)。核用Hoechst反染。原始的放大,×63。(C)对照IECs中gtp结合的rh - a和Pggt-IβTiΔIEC老鼠。平均值±SEM;n= 5样品/组;__P与对照组相比≤0.05;独立样本t测试。(D) Western blot检测对照和Pggt-Iβ的IECs中磷酸化的MLC-2和Np-Rap1ATiΔIEC老鼠;Blots是两个实验的代表。
治疗Pggt-IβTiΔIECRho激活剂CN03激活小鼠。三个独立的实验。(一个)结肠内镜代表性图片。(B)内窥镜检查评分。(C)组织学分析:典型图片为H&E染色。原始的放大,×20。(D)损伤评分量化。(E)Il1b而且白细胞介素6qPCR检测十二指肠细胞表达。3个独立实验的平均值±SEM;(控制,n= 4;Pggt-IβTiΔIEC,n= 6;CN03,n=每组6人)B,D,E.__P与对照组相比≤0.05;*P≤0.05 vs. Pggt-IβTiΔIEC老鼠;单因素方差分析与LSD多重比较检验B,D,E.
上皮损伤是IBD发病机制中一个重要但尚未完全了解的方面(33).虽然最近的研究表明,ibd中的上皮损伤可由IECs中调节细胞死亡的机制启动,如凋亡和坏死(34)的研究中,我们发现了一种新的ibd上皮损伤机制,由受损的rh - a信号引起IECs的细胞骨架改变和细胞脱落改变。这种异常的细胞脱落可能导致肠溃疡和肠糜烂的形成,有利于肠道屏障功能受损,这可能是IBD患者急性发作的临床进展(8,27- - - - - -29).
在炎症肠道中,上皮-外源性介质,如来自活化固有层免疫细胞的促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-13) (35- - - - - -37),是诱导IEC凋亡和病理细胞脱落的有效因子,从而导致上皮屏障功能受损(35,37- - - - - -40).然而,在IBD患者的健康亲属中,异常肠通透性的发生率增加(41),以及ibd中屏障功能丧失的发现往往先于疾病的临床复发(8,28),强烈反对ibd相关上皮屏障缺陷是慢性结肠炎纯粹的继发性现象的假设。相反,上皮-内在改变可能在IBD的发病机制中起着主要作用,它们的调节可能为潜在的治疗或预防干预开辟了一个领域。在此背景下,本文所描述的肠上皮中充分的rh - a前酰化要求代表了一个有趣的新方面,它显著提高了我们对IECs细胞内调节的理解。特别是观察到Pggt1b即使在没有任何免疫细胞源性因子的情况下,体外类器官的缺失也会损害复杂上皮组织的维持,这强烈支持了来自上皮-外源性介质的rh - a信号级联的独立性。另一方面,观察到IL-6对GGTase-Iβ表达的调控作用,清楚地表明了在IBDs发病过程中上皮和上皮-外源性介质之间相互作用的高度复杂性。我们观察到未受挑战的WT小鼠小肠中IECs表达明显减少Rhoa与结肠中的IECs相比,mRNA可能意味着小肠对rh - a和GGTase-Iβ抑制的敏感性增强。因此,在未来的研究中,研究上皮细胞rhoa表达水平或胃肠道激活水平是否确实可能影响IBD患者疾病表现的区域差异将是重要的。
条件基因靶向小鼠的研究强调了rhoa和ggtase - i介导的rhoa激活对肠道功能完整性的功能相关性Rhoa或Pggt1bIECs引起自发性慢性肠道炎症,伴有粒细胞和CD4的积累+T细胞和促炎细胞因子TNF-α的增加。这些小鼠的表型在小肠中特别突出,而在大肠中很少有炎症。这可能是由于大肠中其他小gtpase的代偿作用。这些gtpase的鉴定还需要进一步的研究。
我们的研究结果表明,上皮完整性、肠道结构和内稳态严重依赖于IECs内Rho蛋白的充分前酰化。iec特异性的GGTase-I酶缺失导致肠道疾病,其特征是不活跃的细胞质rh - a积累、上皮损伤和粘膜炎症。同样,IECs中rhoa的去除导致明显的上皮改变和肠道炎症。我们的研究结果表明,igecs中ggtase - i介导的前酰化损伤导致Np胞质rhoa分子的积累,这些分子功能不活跃。这导致细胞骨架重排的调节受损(42)与细胞形状不稳定和细胞脱落改变有关。上皮单分子层内被阻滞细胞脱落事件的积累最终导致屏障功能的丧失和病理性的肠通透性增加。肠道通透性改变可能随后引起慢性肠道炎症。事实上,在诱导性ggtase - i缺陷小鼠中进行的时间过程研究表明,黏膜屏障功能的改变先于粘膜炎症,提示这类动物存在原发性屏障缺陷。在活动性IBD患者的肠道上皮中,GGTase-I水平和胞质rhoa积累显著下调,这一观察结果强调了这些发现与人类的潜在相关性。因此,除了rhoa信号在细胞骨架调节中的作用外(43)、细胞形状的维持(44)和细胞迁移(45), rhoa成为肠道上皮内稳态的关键调节因子,而这一功能在很大程度上取决于丙烯化rhoa的细胞可用性。我们的研究结果表明,炎症过程中rh - a信号通路参与上皮细胞脱落。一致地,抑制rhoa相关激酶(ROCK),以及rhoa靶MLC激酶(MLCK)的缺失,已被证明会导致细胞不完全挤压(27).显微镜下,ROCK和MLCK抑制导致沿脱落细胞侧膜重组肌动蛋白丝和紧密连接蛋白建立的漏斗状结构(阻滞脱落事件)的主要外观。然而,截留脱落事件累积的最终结果之前没有考虑过(27).这种上皮漏斗状结构的积累也可以在Pggt-Iβ的肠道中观察到TiΔIEC小鼠,表明发生了紧密连接蛋白的再分配,但不发生完全挤压和脱落的解决。在缺乏适当的rh - a功能的情况下,改变的细胞脱落最终导致上皮不稳定和屏障功能的丧失,导致慢性肠道炎症。因此,我们的观察证实,由细胞骨架改变引起的细胞脱落阻断(由rhoa介导)是上皮完整性紊乱的基本机制。
新获得的关于rho - a依赖性IEC参与肠屏障功能障碍启动的内在机制的见解,为潜在的介入或转译方法开辟了新的途径。因此,通过特定的Rho激活物或诱导Rho下游信号分子(如ROCK)的治疗触发的Rho- a信号的诱导可能是维持肠道完整性和预防或治疗ibd和其他肠道炎症性疾病的粘膜损伤的一种新策略。
动物模型。老鼠携带LoxP-flankedPggt1b(Pggt1bfl / fl) (26)、caspase 8 (Casp8fl / fl) (4),Rhoa等位基因(Rhoafl / fl) (21),以及Rip3kKO小鼠(46),前面已经介绍过了。Pggt1bfl / fl小鼠由Martin O. Bergö(瑞典哥德堡大学医学研究所Sahlgrenska癌症中心)提供。Rhoafl / fl小鼠由Cord Brakebusch(哥本哈根大学生物技术研究与创新中心,丹麦哥本哈根)提供。生成特定的删除Pggt1b或Rhoa在iec基因,Pggt1bfl / fl或Rhoafl / fl小鼠与vilin - cre或vilin - cre - ert2小鼠杂交(22).Pggt-IβTiΔIEC老鼠被杂交Casp8fl / fl或Rip3k- / -分别损害细胞凋亡或坏死。乙醇他莫西芬(西格玛-奥尔德里奇)溶液在葵花籽油中乳化,通过i.p.或直肠内途径连续给药3天(1 mg/小鼠/天)。以携带loxp-侧翼靶基因但不携带cree -重组酶的窝鼠作为对照。用PCR对耳或尾基因组DNA进行基因分型。动物研究以性别和年龄相匹配的方式进行,每次实验都使用窝伴侣。雄性和雌性动物均在6-10周龄时使用。所有小鼠均在特定的无病原体条件下饲养。除dss引起的结肠炎外,其余实验均为同笼饲养。根据实验室动物科学协会联合会(FELASA)的指导方针,对小鼠进行常规病原体筛查。
DSS-induced结肠炎。在C57BL/6J小鼠中,通过每日补充2% w/v硫酸葡聚糖钠(MP生物制药)的饮用水诱导结肠炎7天(47,48);第7天,当动物获得正常饮水时,停用DSS。DSS治疗开始后10天处死动物。
鼠标内窥镜检查。用高分辨率小鼠视频内窥镜监测小鼠的肠道状况,如前所述(49).小鼠在内窥镜检查期间用2%-2.5%异氟醚氧麻醉。任何结肠炎的评分都基于以下5个参数:肠壁增厚、正常血管模式的改变、纤维蛋白的存在、粘膜颗粒度和大便稠度。对每个参数进行内镜评分(0到3),导致累积评分在0(无炎症迹象)到15(非常严重的炎症)之间(50).
人类的样本。人体材料来自德国埃尔兰根大学诊所医学系;意大利米兰人道研究医院消化内科。收集样本得到了当地伦理委员会和埃尔兰根-纽伦堡大学和人道主义研究医院的机构审查委员会的批准,每个病人都给予了书面知情同意。组织样本嵌入方便的基质中进行冷冻切片,并在-80°C冷冻或新鲜用于IEC分离。纳入我们研究的患者的临床资料总结在补充表1 - 4.
肠上皮通透性评估(fitc -葡聚糖)。在体内评估肠通透性(51).总之,Pggt-IβTiΔIEC对照组小鼠不吃不喝4小时。然后灌胃60 mg fitc -葡聚糖(Sigma-Aldrich)/100 g体重(fitc -葡聚糖平均分子量4000 g/mol)。灌胃后4 h采集血清,以FITC-葡聚糖为标准,分光光度法测定FITC浓度。
体内细胞脱落。简而言之(5,27),小鼠腹腔注射氯胺酮/木lazin麻醉,取出并打开肠道。局部用吖黄素(Sigma-Aldrich)和罗丹明-葡聚糖(10,000 g/mol)染色(Invitrogen)。手术准备被固定在一个横卧床上,并安装在一个灌注生理盐水的房间里。用共聚焦显微镜(徕卡微系统)拍摄绒毛尖端的时间顺序z堆栈图像。
上皮细胞脱落的定量。上皮细胞脱落通过几种技术进行量化。一方面,通过在体内细胞成像检测到的细胞脱落事件计数来量化细胞脱落率。细胞脱落事件的数量由单个图片上基底膜的长度和图像采集时间归一化。共对10只动物进行分析。另一方面,我们还从每个标本的2个单独的活体图像中统计了渗漏和“渗透细胞”(细胞质中含有右旋糖酐的细胞)的数量(n= 8动物)。最后,采用了类似的方法,以量化被捕获和完成的细胞脱落事件的数量。然而,在本例中,我们利用phalloidin对肌动蛋白进行染色,这使我们能够检测到细胞脱落过程早期阶段发生的细胞骨架蛋白重分布。因此,我们量化了细胞的总体脱落率、细胞脱落的不同阶段的分布和葡聚糖渗透性细胞的出现。
IEC隔离。小鼠肠道组织和人体外科标本新鲜用于IEC分离。因此,组织被培养在含有DTT和EDTA (34).用Percoll梯度法纯化IECs。
隐窝分离和类器官培养。无菌分离小肠,清洗并切除。清洗肠碎片,在含有EDTA的螯合缓冲液中孵育,大力重悬,以分离肠隐窝。隐窝嵌入冰上的Matrigel (BD Biosciences)中,并在表面细胞培养板中播种。基质聚合后,在培养基中加入基础培养基(24).整个培养基每2天更换一次,类器官每周传代一次。0.5 μg/ml他莫西芬体外处理类器官;caspase抑制剂Z-VAD (10 μg/ml) (Bachem)或Necrostatin-1 (30 μM) (Sigma-Aldrich)和细胞因子(20 ng/ml)。
隐窝类器官培养中细胞活力和死亡的量化。我们使用细胞活力成像试剂盒(罗氏诊断),以量化体外用他莫西芬处理类器官和随后的删除后类器官的死亡/破坏Pggt1b基因。该试剂盒包括3种不同的染料,用于识别细胞核(蓝色染料)、活细胞(绿色染料)和死细胞(红色染料)。对死亡细胞的识别是基于细胞膜被破坏后这些细胞的通透性。细胞活力的检测是基于代谢活性的,它允许底物的裂解,产生绿色荧光。核染色(蓝色)使基于检测到的细胞总数的结果规范化。用ImageJ软件量化死亡细胞信号(红色信号)和核信号(蓝色信号)的平均强度。
组织学,免疫组化和电子显微镜。用福尔马林固定的石蜡包埋标本进行H&E染色和组织病理学分析。结肠、回肠和十二指肠的组织学损伤评分考虑了上皮糜烂和组织结构扭曲2个参数。每个参数都被评分(无,0;温和,1;明显,2;严重,3),然后对两种结果进行相加(总分为6分)。评分采用盲法。采用TSA Cy3 (PerkinElmer)冷冻切片进行免疫组化。图像通过荧光显微镜(奥林巴斯或徕卡)或共聚焦显微镜(徕卡TCS SP5或徕卡TCS SP8)获得。以下主抗体在4°C下使用一夜:ggtese - i β, 1:100(目录sc-18996, Santa Cruz Biotechnology Inc.);(目录sc-1482,圣克鲁斯生物技术公司; for exclusive detection of Np-Rap1A); EpCAM, 1:100 (catalogs 324201 and 118207, BioLegend); MPO, 1:250 (catalog ab9535, Abcam); CD4, 1:200 (catalog 100506, BioLegend); F4/80, 1:100 (catalog 123101, BioLegend); CD8α, 1:200 (catalog 14-0081, eBioscience); Ki67, 1:1,000 (catalog ab16667, Abcam); Myosin-IIA, 1:200 (catalog 3403, Cell Signaling Technology); cleaved caspase-3, 1:750 (catalog AF835, R&D Systems); and Rho-A, 1:100 (catalogs sc-418 and sc-179, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Biotinylated-Streptavidin antibody pairs were used for detection (1:100–1:200, 30 minutes at room temperature (RT), Santa Cruz Biotechnology Inc., BioLegend). In some cases, direct dye–labeled secondary antibodies were used (1:100, 30 minutes at RT, BioLegend). Actin fiber staining was performed using phalloidin (Invitrogen). In situ cell death detection kit (Roche Diagnostics) was used for detection of TUNEL+细胞。电子显微镜,戊二醛固定材料使用。在嵌入Epon Araldite后,使用蔡司EM 906进行超薄切片切割和分析。
包含IHC量化。我们专门测量了来自上皮细胞的GGTase-Iβ或Rap1A信号的平均强度。使用ImageJ软件,EpCAM+选择上皮细胞(IECs),检测上皮细胞GGTase-Iβ或Rap1A信号的平均强度,根据核染色计数IECs的总数量。每幅图像的总体IECs数用于归一化。使用该策略,我们分析了2个代表性的图像在每个实验n= 4实验。总的来说,每组(对照组和炎症组)8张图像被纳入数据解释。
CD4的数量+, F4/80+, MPO+, CD8+使用ImageJ软件计算每个字段的细胞数。共统计3个不同的图像/样本(×20 objective),并据此计算平均单元数。
RNA分离和定量PCR (qPCR)分析。使用RNeasy Mini kit (QIAGEN)从组织或IECs中分离总RNA。用逆转录酶合成cDNA。用SYBR Green和定量引物(QIAGEN)实时荧光定量PCR (Bio-Rad)检测基因表达。基因表达归一化为管家基因HPRT表达。
基因表达测定(小鼠;数组数据可通过NCBI的GEO [GSE72781]访问)。基因芯片实验由埃尔兰根大学的核心设施(n=每组3人)。RNA质量首先通过真核总RNA纳米(Agilent Technologies)进行评估,并使用Affymetrix小鼠430 2.0芯片检测基因表达。对于多基因阵列测试,包括差异表达分析,软件包FlexArray (Michal Blazejczyk, Mathieu Miron,和Robert Nadon [2007], Genome Quebec, Montreal, Canada;http://www.gqinnovationcenter.com/services/bioinformatics/index.aspx?l=e)使用。基于go的分析使用在线工具注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)和ingenious平台进行。
基因表达测定(人;数组数据可通过NCBI的GEO [GSE72780]访问)。从乳糜泻患者或对照组患者的肠道中采集了30多个样本。如所述,从患者标本中分离出IECs。根据制造商的说明(QIAGEN),使用RNeasy脂质组织迷你试剂盒分离RNA。根据以下纳入标准,选择9个样本进行基因芯片分析:炎症状态的组织病理学确认,生物分析仪确认的可接受的RNA质量,上皮标记绒毛蛋白的可比表达。
GeneChip分析。在erlangen -纽伦堡大学人类遗传学研究所的基因组学核心设施中,使用Affymetrix基因芯片人类基因组U133 Plis 2.0阵列进行全基因组表达分析。对于多基因阵列评估,包括高级显著性分析、聚类和基于基因本体论的基因类测试,使用了软件包Partek Genomics Suite的方差分析。总之,GC-RMA算法应用于所有微阵列的cel文件。接下来,执行日志规模转换、分组和基线定义。对于高级显著性分析,应用以下参数:未配对t测试中,P< 0.05,折变> 1.5,k -均值聚类。消除基因列表中的冗余(如聚类探针测试列表),并进行基因本体富集分析,从而检测出基因子集中统计上代表性过强的蛋白质功能(GO术语)。研究分析了超过54000个表达标签,其中129个显著(P< 0.05)的差异(折叠变化> 1.5)来自CD患者炎症和非炎症肠道区域的IECs。
免疫印迹。在哺乳动物蛋白提取试剂(Thermo Scientific)中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂片(Roche Diagnostics),通过悬浮和孵育获得蛋白质提取物。对于膜/细胞质分离,裂解缓冲液(RIPA)使用和不使用洗涤剂和高速离心步骤。蛋白质提取液通过离心清除,用Bradford法测定蛋白质浓度,在LDS样品缓冲液(Thermo Scientific)中煮沸变性。之后,蛋白质被SDS-PAGE凝胶分离,涂在硝化纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脱脂牛奶阻塞。膜在4℃下与以下一抗孵育一夜:GGTase-Iβ, 1:25 00(目录WH0005229M2, Sigma-Aldrich);Np-Rap1A, 1:10 00(目录sc-1482,圣克鲁斯生物技术公司);罗- a, 1:50 00(目录sc-179,圣克鲁斯生物技术公司);phospho-MLC2, 1:10 00(目录3671,细胞信号技术);Cdc42, 1:10 00(编目2466,细胞信号技术);rac - 1,1:1,000(目录sc-95,圣克鲁斯生物技术公司); Rho-B, 1:1,000 (catalog 2098, Cell Signaling Technology); Rho-C, 1:1,000 (catalog 3430, Cell Signaling Technology); and AHRR, 1:1,000 (catalog sc-138745, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Convenient HRP-linked secondary antibodies were used (incubation for 90 minutes at RT), and chemoluminescence was detected by using ECL Western blotting substrate (Thermo Scientific). Protein expression was compared with the level of actin, 1:2,000 (catalog 4967, Cell Signaling Technology). Inclusion of a positive control sample (protein lysate from testis) allowed reliable identification of the 38–43 kDa protein GGTase-I.
蛋白质组学分析。纯化的iec总蛋白中,20 μg用改进的过滤辅助样品制备(FASP)方法消化(52).除注明外,包括三个生物重复。反相纳米- uplc分离胰蛋白酶肽和使用离子迁移率增强数据独立分析工作流程进行质谱分析,如前所述(52).所有样品分3个技术重复进行分析。
细胞骨架蛋白激活阵列。根据制造商说明,使用Cytoskeleton II Phospho Antibody Array(目录PCP141, Cytoskeleton Inc.)测量其磷酸化状态,评估64个细胞骨架相关蛋白的激活。
ρ激活试验。采用rh - a G-LISA激活测定法(目录BK214, Cytoskeleton Inc.),按照制造商说明测定rh - a激活状态。
ρ激活剂治疗。小鼠随机分为2组(Pggt-IβTiΔIEC±CN03)和Pggt-Iβflx一窝猫作为对照。小鼠在肠道疾病发生前使用Rho Activyator II(目录CN03, Cytoskeleton Inc.)治疗(口服,0.3 μg/小鼠;intrarectal 0.5μg /鼠标)。他莫西芬经直肠内给药。动物在开始他莫西芬诱导后10天被处死。
统计数据。正态分布数据的显著性分析采用二尾Student 'st测试。误差条表示±SEM。对于多重比较,数据采用单因素方差分析和LSD事后检验(IBM SPSS Statistic 21)进行分析。P小于0.05和0.001为显著和高度显著。
研究批准。动物实验方案由埃尔兰根大学动物护理和使用机构委员会批准。动物实验是根据德国法律进行的,并得到了德国安斯巴赫大学(Regierung Mittelfranken,德国)的批准。人体样本的收集得到了埃尔兰根-纽伦堡大学(德国埃尔兰根)医学系伦理委员会和Humanitas研究医院的批准。每位患者均给予书面知情同意。
RLP、C Becker、IA和MFN设计了该研究。RLP和VT完成了大部分的实验。CG对人IECs进行基因表达分析。ST进行定量蛋白质组学分析。KA进行了电子显微镜检查。UB、RA、GF、SV和SD收集人体材料进行研究。AJMW参与了活体动物成像的性能。SW参与了实验的讨论和设计。C Brakebusch和MB为我们提供了转基因小鼠品系。RLP、IA、MFN、AJMW和C Becker分析了数据并撰写了论文。 ABE performed Gene-chip experiments. All the authors discussed the results and commented on the manuscript.
导致这些结果的研究获得了欧洲委员会(REA)研究执行机构下属的人民计划(Marie Curie行动)赠款协议号302170和欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)的IMI计划(BTCure)的资助。这项研究由埃尔兰根-纽伦堡大学临床研究跨学科中心(IZKF)资助。德国研究基金会DFG支持优先项目SPP1656(肠道菌群)和临床研究单位KFO257的这项工作。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。
参考信息:中国投资.2016, 126(2): 611 - 626。doi: 10.1172 / JCI80997。