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胰腺
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SOX9在胰腺癌发展中调控ERBB信号
  1. 阿德里安·Grimont1，
  2. 安德烈亚·V·皮尼奥2，3.，
  3. 马克·J·考利2，3.，
  4. 塞西尔Augereau1，
  5. 阿曼达·莫森2，3.，
  6. Marc Giry-Laterriere2，3.，
  7. Géraldine Van den Steen1，
  8. 尼古拉Waddell3.，4，
  9. 玛丽娜Pajic2，3.，5，
  10. 克里斯汀Sempoux6，
  11. 健民吴2，3.，5，
  12. 肖恩·格里蒙德3.，4，7，
  13. 安德鲁·V·比金2，3.，5，7，
  14. Frédéric P勒麦格尔1，
  15. 伊尔丝Rooman2，3.，5，
  16. 帕特里克Jacquemin1
  1. 1Université天主教德鲁汶，德迪夫研究所，布鲁塞尔、比利时
  2. 2癌症研究部，金霍恩癌症中心加文医学研究所，悉尼、澳大利亚
  3. 3.澳大利亚胰腺癌基因组计划
  4. 4昆士兰大学分子生物科学研究所昆士兰医学基因组学中心，昆士兰、澳大利亚
  5. 5新南威尔士大学圣文森特临床学院、澳大利亚
  6. 6病理科，大学catholique de鲁汶,倩碧大学医疗圣卢克，布鲁塞尔、比利时
  7. 7格拉斯哥大学Wolfson Wohl癌症中心，苏格兰、英国
  1. 对应到Ilse Rooman博士，Kinghorn癌症中心，Garvan医学研究所，370维多利亚街，新南威尔士州，2010达林赫斯特，澳大利亚悉尼;i.rooman@garvan.org.au;Patrick Jacquemin博士，Université鲁汶天主教，德迪夫研究所，希波克拉特大道75/B1.75.03，布鲁塞尔B-1200，比利时;patrick.jacquemin在{}uclouvain.be．

摘要

客观的转录因子SOX9最近被证明在胰腺腺泡-导管化生中刺激导管基因表达，并加速胰腺导管腺癌(PDAC)前癌前病变的发展。在这里，我们研究了SOX9在胰腺肿瘤发生中的作用。

设计我们分析了手术切除PDAC的基因组和转录组数据，并将表达分析扩展到来自PDAC样本的异种移植和PDAC细胞系。在产生PDAC的人类细胞系和小鼠模型中操纵SOX9的表达。

结果我们发现基因畸变在SOX9大约15%的患者肿瘤基因。大多数PDAC样品强烈表达SOX9蛋白，经典PDAC中SOX9水平较高。该肿瘤亚型与更好的患者预后相关，该亚型的细胞系对靶向表皮生长因子受体(EGFR/ERBB1)信号通路的治疗有反应，这是胰腺肿瘤发生所必需的通路。在人PDAC中，SOX9的高表达与属于ERBB通路的基因的表达相关。特别是，ERBB2在PDAC细胞系中的表达受到SOX9的刺激。小鼠中Sox9表达失活证实了其在PDAC启动中的作用;结果表明，Sox9刺激ERBB通路中几个成员的表达，并且是ERBB信号通路活性所必需的。

结论通过整合患者样本和小鼠模型的数据，我们发现SOX9在胰腺肿瘤发生过程中调控ERBB通路。我们的工作为靶向肿瘤发生机制的治疗开辟了前景。

  • 免疫组织化学
  • 发展基因
  • 表皮生长因子
  • 基因打靶
  • 胰腺癌

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2014-307075

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 胰腺导管腺癌(PDAC)是癌症死亡的主要原因。更好地了解这种疾病的发病机制将有助于更好的治疗。

    • 小鼠模型表明，PDAC可以起源于化生腺泡细胞，演化成称为胰腺上皮内瘤变(PanIN)的肿瘤病变。激活原癌基因KRAS的突变是90%以上PDAC的起始事件。

    • 在致癌Kras诱导的PDAC小鼠模型中，sry相关的人动力组(HMG)盒因子9 (Sox9)在腺泡-导管化生(ADM)和PanIN的形成中是必需的。Sox9如何促进PanIN的形成仍然是一个悬而未决的问题。

    • 表皮生长因子受体(EGFR/ERBB1)在ADM和kras诱导的胰腺肿瘤发生中也是必不可少的。EGFR及其相关通路在PDAC中的调控机制尚不清楚。

    新的发现是什么?

    • 在人类中，显示SOX9高表达的胰腺肿瘤优先属于经典的PDAC亚型。已知该亚型的细胞对egfr定向治疗有反应。

    • 在人类PDAC样本中，SOX9的高表达与EGFR途径中几个成员的高表达相关，特别是ERBB2。

    • 无论是在人类还是在小鼠中，SOX9都调节ERBB2的表达，ERBB2是EGFR的首选协受体。

    • 对PDAC小鼠模型的分析表明，Sox9控制EGFR通路的活性。这一机制至少部分解释了Sox9在PanIN形成中的作用。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 确定PDAC样本中SOX9的表达水平将有助于确定肿瘤的分子亚型。

    • 在PDAC样本中定义SOX9和其他选定基因的表达特征可以帮助预测这些肿瘤对erbb靶向治疗的反应和生存结果。

    • 目前的结果为未来探索ERBB2在PDAC起始和发展中的作用提供了依据。确定该蛋白在胰腺癌中的重要功能将打开针对ERBB2到PDAC治疗的可用治疗武器库，可能与egfr定向治疗联合使用。

    介绍

    胰腺导管腺癌(PDAC)是最具侵袭性的癌症之一。其特点是发病率上升，患者预后不良，40年来一直没有改变。预后不良主要是由于耐药和诊断较晚，这反映了我们对驱动PDAC发生和发展的分子机制的不完全理解。1

    PDAC几乎总是与激活原癌基因突变相关喀斯特最近外显子组测序证实了这一点。2对转基因小鼠模型的分析表明，腺泡细胞经历腺泡-导管化生(ADM)，在这个过程中，腺泡细胞表型地转化为导管样细胞。3 - 5激活的存在喀斯特胰腺上皮内瘤变(PanIN)是一种非侵袭性导管病变，在其他原癌基因激活或肿瘤抑制基因缺失的情况下，最终演变为PDAC。3.，6，7在人类中观察到的胰腺炎(一种具有明显ADM的胰腺炎症性疾病)与PDAC风险增加相关，进一步支持了这种肿瘤发生模型。4，8因此，揭示胰腺肿瘤发生早期的机制至关重要。

    腺泡分化的丧失、典型导管分化的胚胎特征再现、炎症和致癌Kras表达在致癌过程中密切相关。9 - 11最近的观察表明，表皮生长因子受体(EGFR/ERBB1)通路有助于ADM，对kras诱导的胰腺肿瘤发生至关重要。12，13EGFR信号通路刺激RAS，导致强大的细胞外信号调节激酶(ERK)激活，这是胰腺转化所必需的。12

    人动力组(HMG)转录因子SOX9是胰管细胞命运的调节因子。14我们之前报道过，在炎症条件下，SOX9在化生腺泡细胞中表达，并有助于ADM的发生。15其他研究表明，Sox9对于PDAC起始是至关重要的，尽管Sox9在这种情况下起作用的精确机制还有待阐明。5

    在本研究中，我们进一步探讨了SOX9在PDAC发病机制中的作用。利用人类PDAC基因表达谱的生物信息学分析和培养细胞系中SOX9水平的实验操作在活的有机体内在小鼠模型中，我们发现SOX9调节ERBB信号的活性。因此，我们的工作建立了PDAC肿瘤发生的两个关键参与者之间的功能联系，即SOX9和EGFR信号。

    材料与方法

    人类PDAC样本的获取和基因组、转录组和生存分析

    生物标本由澳大利亚胰腺癌基因组计划(APGI;伦理批准:HREC/11/ rah /329 -胰腺癌分子病理学，包含APGI，由悉尼当地卫生区- rpa区批准，协议X11-0220)。

    的代表SOX9使用来自APGI的肿瘤-正常对的外显子组测序分析突变。2使用Illumina Omni1M四单核苷酸多态性(SNP)阵列检测体细胞拷贝数变化，并使用genon进行分析。16就像Biankin一样et al。2

    根据参考文献构建SOX9功能域模型17和18，以及UniProt的螺旋结构域。SOX9由UniProt报道的自然变异和COSMIC报道的体细胞变异标注。这里描述的点突变之前由作者报道过，2该突变的功能影响由Polyphen2评估19和筛选。20.

    基因表达数据存储在基因表达Omnibus (GEO;加入GSE50827)，处理方法与Biankin相同等，2并包括103个原发肿瘤的数据，其中95个包含疾病特异性生存期，97个包含总生存期注释。通过Pearson和Spearman秩相关检验SOX9基因表达与微阵列上其他基因的相关性。采用Student t检验检验Collisson定义的两种PDAC亚型SOX9表达的差异等．21KOBAS22，23用于通路富集分析。选择超几何检验来测试KEGG和Reactome通路的统计富集，并对p值进行多次比较校正。24

    还对5个最低和5个最高的肿瘤进行了分析SOX9表达式。用LimmaGP评估差异表达的基因(V.19.4;考利等，稿件准备中;可以在http://pwbc.garvan.unsw.edu.au/gp）.LimmaGP生成了一个预排序文件，将每个基因映射到其t统计量，作为差异表达的度量;对于有多个探针的基因，报告绝对t统计量最大的探针的值。使用该预排序文件，使用GSEApreRanked (V.3.0;软件可于http://pwbc.garvan.unsw.edu.au/gp)，它是GSEA在预排序模式下的geneppattern包装器，25使用1000个排列，以及包含分子特征数据库(V.3.0)中定义的基因本体生物过程术语的基因集集合。26

    中位生存期采用Kaplan-Meier法估计，生存曲线差异采用log-rank检验。使用R/Bioconductor进行生存分析生存包中。

    老鼠实验

    根据美国国家科学院列出的标准，老鼠得到了人道的照顾。Sox9/ f，LSL-KrasG12D和ElaCreERT2老鼠被描述过。-所有菌株都保持在CD1富集背景中。6周大的小鼠分别用他莫西芬(Sigma)和4-羟他莫西芬(4OT;Sigma)溶解在玉米油中(Sigma;分别为30和0.3 mg/mL)。注射他莫西芬后至少10天，急性胰腺炎通过6小时腹腔注射天蓝素(Sigma, 125µg/kg)诱发，每隔一天，持续5天。治疗第1天(D1)。第7天(D7)处死小鼠。为了诱导慢性胰腺炎，在急性天蓝素治疗结束时，小鼠继续接受每日注射天蓝素，5天/周。第65天(D65)处死小鼠。值得注意的是，注射他莫西芬后，天蓝素治疗前，所有基因型的胰腺组织学正常(见在线补充图S12)。

    免疫组织化学和免疫荧光

    进行免疫组化(IHC)或免疫荧光，如Prévot等．30.在线补充方法a提供了更多详细信息。

    结果

    SOX9在人PDAC中发现基因畸变和表达改变

    最近描述了Sox9在ADM和PanIN发展中的作用5，15Sox9在PDAC发展中的作用值得进一步探索。作为第一步，我们调查了SOX9一项已发表的90例来自APGI的散发性PDAC病例的队列研究。2通过对患者肿瘤和匹配对照的自动外显子组测序数据和SNP阵列分析的组合，然后进行人工审查，我们发现了一例在中存在点突变的病例SOX9。此外，我们发现5例拷贝数增加，4例丢失1个拷贝，4例拷贝中性杂合性丢失(LOH)SOX9基因(图1A).表达微阵列分析显示PDAC队列中拷贝数的增加倾向于与SOX9表达的增加相关(见在线补充图S1A)。所发现的点突变是一个非同义的C和a突变在转激活域SOX9(NM_000346.3: c.1436C >;NM_000346.3: p.Pro479His;在网上看到的补充图S1B)，通过重测序验证，并通过Polyphen2评分(0.998)和SIFT评分(0.0)预测其影响蛋白功能。然而，未突变的SOX9和突变的SOX9具有相同的转录活性，这表明这种突变对SOX9的转激活功能没有影响补充图就是S1C)。

    Genetic aberrations in the SOX9 gene are frequently found in a cohort of human PDAC and SOX9 is differentially expressed in PDAC subtypes. (A) Frequency (%) of SOX9 somatic mutations and copy number variants in the APGI cohort (n=90). (B) Kaplan–Meier curve for disease specific survival in groups with an IHC score 0–100 (n=12) versus IHC score comprised between 101 and 200 (n=29) and IHC score >200–300 (n=69), respectively the SOX9low, SOX9medium, and SOX9high group; p<0.01. Pie chart represents the proportion of samples within each group. (C) SOX9 mRNA expression levels, obtained from Illumina microarray analysis (total samples, n=89), in the classical and QM PDAC subtypes. SOX9 expression was higher in the classical subtype than in the QM subtype (n=29 and n=26, respectively, *p<0.05). PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; APGI, Australian Pancreatic Cancer Genome Initiative; IHC, immunohistochemistry; QM, quasi-mesenchymal; LOH, loss of heterozygosity.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    基因畸变SOX9SOX9在PDAC亚型中有差异表达。的频率(%)SOX9APGI队列中的体细胞突变和拷贝数变异(n=90)。(B)免疫组化评分0-100 (n=12)组与免疫组化评分101 - 200 (n=29)组和免疫组化评分>200 - 300 (n=69)组疾病特异性生存率的Kaplan-Meier曲线，分别为SOX9低、SOX9媒介， SOX9高集团;p < 0.01。饼图表示各组样本的比例。(C)从Illumina微阵列分析中获得的SOX9 mRNA表达水平(总样本，n=89)，在经典和QM PDAC亚型中。SOX9在经典亚型中的表达高于QM亚型(n=29, n=26， *p<0.05)。PDAC，胰导管腺癌;APGI，澳大利亚胰腺癌基因组计划;包含IHC,免疫组织化学;QM quasi-mesenchymal;LOH，杂合性丧失。

    然后我们分析了SOX9蛋白在PanIN病变中的表达补充图S2A)和PDAC肿瘤从APGI使用组织微阵列(见在线补充图开通)。PanIN病变呈异质性表达模式，从强阳性到阴性，偶尔在同一病变内发现两种情况。PDAC样本的异质性持续存在，约60%的样本表现出强烈的SOX9核表达(SOX9高)和10%得分较低(SOX9 .低;图1B)这些观察延伸了最近一项独立研究的结果5并全面描述了人类早期I期和II期PDAC中SOX9基因和蛋白的表达格局。

    SOX9表达水平差异的PDAC样本分为不同的亚型，具有不同的结果和治疗机会

    为了将SOX9表达与PDAC肿瘤类型和预后联系起来，我们研究了SOX9是否与PDAC肿瘤类型和预后相关高、SOX9媒介和SOX9低肿瘤表现出不同的特征。SOX9蛋白表达与肿瘤大小、肿瘤分级、n期或t期或血管空间侵犯无关(数据未显示)。然而，我们观察到SOX9患者高和SOX9媒介肿瘤具有更好的疾病特异性生存率(图1B)和总生存率(数据未显示)，这也反映在检查SOX9 mRNA表达时(见在线补充图S3)。

    Collisson等人根据基因表达特征将PDAC分为不同的亚型。经典和准间充质(QM)亚型区分患者生存结果和潜在的治疗反应性;具有经典亚型的患者具有更好的生存和细胞系的生长，经典特征对EGFR途径的抑制更敏感。21我们应用这一分类，发现SOX9 mRNA的表达在经典亚型(图1C).此外，SOX9高与QM(7/36)相比，经典型(15/36)肿瘤(其中36/69有基因表达数据)富集。这在SOX9中并不明显媒介组(其中18/29有基因表达数据;4/18古典和6/18 QM)或SOX9低组(其中6/12有基因表达数据;1/6经典和2/6 QM)。

    我们得出SOX9高肿瘤优先属于具有改善生存结局的经典亚型，可能对egfr靶向治疗有更好的反应。

    SOX9是人PDAC中ERBB2表达的上游调控因子

    为了深入了解机制，我们分析了PDAC队列的表达微阵列数据，并确定了表达与SOX9相关的基因(在线)补充表S1)。其中，我们发现HNF1β，另一种典型的胰腺导管转录因子，HES1，成人胰腺中SOX9的上游调节因子，GATA6在PDAC经典亚型中具有独特的功能作用。14，21重要的是，KOBAS通路分析显示多种机制富集，包括ERBB信号通路(在线)补充表S2)。一些ERBB家族成员与SOX9表达高度相关，如ERBB3和ERBB2。

    为了更好地捕捉“极端SOX9表达者”之间的差异，我们比较了队列中SOX9表达最高的5个样本和表达最低的5个样本。再一次，我们发现ERBB2与Mediator 1 (MED1)一起出现在前30个基因中，MED1是ERBB2的转录刺激因子(图2一个)。31通过GSEA，我们发现SOX9与癌症生物学中涉及的几种上调通路有关。主要主题是蛋白激酶活性，特别是丝裂原活化蛋白激酶和EGFR/ERBB，以及细胞周期控制和基因表达调控(在线)补充表S3)。除了ERBB2, ERBB通路的其他成分，如EGFR和ERBB2IP/ERBIN(一种与ERBB2相互作用的蛋白质，对其活性很重要)，32，33还显示了核心浓缩(数据未显示)。

    SOX9 regulates ERBB2 expression. (A) Heat map of the 30 most upregulated genes in the five highest (red) SOX9-expressing tumours versus the five lowest (blue) SOX9-expressing tumours (p<4.37×10−4) based on microarray data from the Australian Pancreatic Cancer Genome Initiative cohort. (B) Correlation plot of SOX9 and ERBB2 band densities (n=8, r=0.78, p=0.02), quantified in western blot analysis, in a panel of ATCC cell lines (cell lines with a star have epidermal growth factor receptor (EGFR) activating mutations). Consequently, they were not included in the quantification). (C) Correlation plot of SOX9 and ERBB2 immunohistochemistry (IHC) scores in a panel of patient-derived xenografts (n=19, r=0.59, p<0.001). The full circle indicates a tumour with loss of heterozygosity of ERBB2. (D) Western blot analysis and quantification of ERBB2 and SOX9 mRNA and protein expression in HPAC and HPAFII cells stably infected with no shRNA (−), or shRNA against a scrambled sequence (Scr), ERBB2 or SOX9, analysed 5 days after selection (n=3). (E) Similar analysis performed on BxPc-3 cells transfected with a doxycycline-inducible eGFP expression plasmid, as a control, or with a doxycycline-inducible SOX9 expression plasmid. Results were analysed 72 h after transfection (n=3). (F) Confocal microscopy for ERBB2 and SOX9 in BxPc-3 cells without (−) or with (+) doxycycline-inducible haemagglutinin (HA)-tagged SOX9. 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) was added to visualise the nuclei. In all graphs, *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    SOX9调节ERBB2的表达。(A) 5个最高(红色)表达sox9的肿瘤与5个最低(蓝色)表达sox9的肿瘤中30个上调基因的热图(p<4.37×10)−4)基于来自澳大利亚胰腺癌基因组计划队列的微阵列数据。(B) SOX9和ERBB2条带密度的相关图(n=8, r=0.78, p=0.02）在一组ATCC细胞系(带有星形的细胞系具有表皮生长因子受体(EGFR)激活突变)中定量。因此，他们不包括在量化中)．(C)一组患者源性异种移植中SOX9和ERBB2免疫组化(IHC)评分的相关图(n=19)，r = 0.59, p < 0.001)。完整的圆圈表示肿瘤的杂合性缺失ERBB2．(D)选择后5天分析的HPAC和HPAFII细胞中ERBB2和SOX9 mRNA和蛋白质表达的Western blot分析和定量，HPAC和HPAFII细胞中没有稳定感染shRNA(−)，或shRNA对抗打乱序列(Scr)， ERBB2或SOX9。(E)用强力霉素诱导的eGFP表达质粒转染BxPc-3细胞作为对照，或用强力霉素诱导的SOX9表达质粒转染BxPc-3细胞进行类似的分析。转染72 h后分析结果(n=3)。(F)在没有(−)或带有(+)强西环素诱导血凝素(HA)标记的SOX9的BxPc-3细胞中观察ERBB2和SOX9的共聚焦显微镜。加入4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)来观察细胞核。在所有图中，*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。

    ERBB2表达的降低会损害细胞生长，正如我们用稳定转导ERBB2 shRNA的胰腺HPAFII和PanIN细胞所做的实验所表明的那样补充图S4)。6因此，我们决定探索SOX9与ERBB通路之间的联系，重点研究SOX9对ERBB2的调控，因为这两个基因的表达在KOBAS和GSEA中都有关联。一组PDAC细胞系western blot中ERBB2和SOX9蛋白的分析证实了SOX9和ERBB2蛋白表达之间的相关性(图2B)。此外，原发性肿瘤异种移植中SOX9和ERBB2蛋白的IHC评分证实了SOX9和ERBB2蛋白表达的正相关(图2C).值得注意的是，数据点在整圆内图2C，尽管SOX9表达评分高，但显示ERBB2缺失，来自于一个特殊的肿瘤，其LOH为ERBB2(数据未显示)。这些数据共同支持SOX9和ERBB2在PDAC中的表达良好相关。

    为了进一步研究SOX9和ERBB2之间的关系，我们对PDAC细胞系进行了操作。shrna介导的SOX9下调可降低HPAC和HPAFII细胞中ERBB2蛋白水平，但仅降低HPAC细胞中ERBB2 mRNA水平(图2D).利用siRNA检测SOX9，我们还观察到pan10.05和Panc-1细胞中ERBB2蛋白表达降低;在本实验中，ERBB2 mRNA在两种细胞系中均未减少补充图S5)。强力霉素诱导过表达SOX9的BxPc-3细胞上调ERBB2 mRNA和蛋白(图2E);事实上，共聚焦显微镜可以显示，在没有强力霉素的情况下，几乎检测不到的ERBB2表达被视为主要在细胞质中检测到的点，而在强力霉素存在的情况下，很容易在细胞膜上检测到大量的ERBB2表达(图2F)。

    这些结果表明SOX9在转录和转录后水平上控制ERBB2的表达。为了更好地理解这种转录调控，我们在人和小鼠ERBB2启动子中寻找SOX9结合位点，并在这些区域中发现了一个与SOX9结合一致的潜在二聚体位点补充图S6A)。然而，含有人类或小鼠启动子的报告质粒的转录活性在SOX9存在时没有被修改补充图S6B)，表明SOX9不能与这些序列结合或不足以激活这些调控区域的转录。

    总之，这些观察强烈表明SOX9促进ERBB2的表达，ERBB2是胰腺细胞生长的刺激因子。

    在小鼠胰腺肿瘤发生过程中，Sox9控制ErbB信号通路成员的表达

    为了探索Sox9在胰腺癌发展中的作用和机制，我们转向了胰腺肿瘤发生的小鼠模型。cre -重组酶介导的致癌K-Ras (KrasG12D)在腺泡细胞内(ElaC呃喀斯特G12D当与天蓝素驱动的胰腺炎症相关时，已知会诱导化生和PanIN。10，28，29当Sox9在这种情况下失活时(ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f)，不再观察到化生和瘤变。5，27我们使用急性和慢性炎症组来确认和扩展这些数据补充图年代S7-10)。

    我们进一步发现，Sox9的缺失也与天蓝素诱导的胰腺炎的炎症反应降低有关。大鼠水肿，巨噬细胞和T淋巴细胞数量减少ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f胰脏，比较ElaC呃喀斯特G12Dpancreata(在线补充图S11)。重要的是，这一发现使人联想到早期数据表明胰腺缺乏ErbB1 /表皮生长因子受体，在相同的致癌Kras背景下，也表现出炎症减轻和对PanIN发展的耐药性。12，13结合我们对人类样本的观察，这再次表明ErbB信号和Sox9功能是相关的。

    为了进一步证实这一点，我们通过免疫荧光标记在小鼠模型中检测了Egfr、ErbB2和Erbin的表达。实验还包括标记Erk, Erk是ErbB的下游靶点，对PanIN的发展很重要，12也是Sox9的潜在靶点。34在正常胰腺中，这些蛋白在腺泡细胞中检测不到，而在导管和中心腺泡细胞中几乎没有表达补充图S12)。在胰腺炎的D7 (图3A)，一些野生型(WT)在化生腺泡中，ErbB2和Erk表达水平较低，而Erbin和Egfr表达比例较高(图3B).细胞中可见ErbB2、Erbin、Egfr和Erk的强烈诱导ElaC呃喀斯特G12D老鼠;通常，在化生腺泡和管状复合体中检测到它们的表达，淀粉酶表达降低(图3D).重要的是，ErbB2标记复合体区分了管状复合体和腺泡衍生的管状复合体，因为前者中没有淀粉酶，后者中淀粉酶含量低(见在线)补充图向)。在ElaC呃Sox9/ f和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f胰腺中仅可见微弱的导管表达ErbB2和Egfr，腺泡表达微弱的Erbin和Erk (图3C, E)。在D65WTErbB2、Erbin、Egfr和Erk的表达主要局限于导管腔室。在一个喀斯特G12D背景(ElaC呃喀斯特G12D)，除Sox9失活外，这些蛋白在PanIN发育过程中均高水平表达(ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f;在线补充图S14系列)。我们的结论是，在胰腺肿瘤发生过程中，Sox9是刺激ERBB信号成分表达所必需的。

    Sox9 controls expression of members of the epidermal growth factor receptor (EGFR) pathway during pancreatitis. (A) Scheme of cerulein treatment. (B-E) Immunofluorescent labelling of amylase, ErbB2, Erbin, Egfr and extracellular-signal-regulated kinase (Erk) in wild type (WT) (B), ElaCER Sox9f/f (C), ElaCER KrasG12D (D) and ElaCER KrasG12D Sox9f/f (E) mice at day 7 (D7) of acute pancreatitis. The expression of ErbB2, Erbin, Egfr and Erk is strongly induced in metaplastic acini and tubular complexes in the ElaCER KrasG12D pancreas (arrowhead, D), whereas it is only weakly induced in the WT metaplastic acinar cells (arrowhead, B). In ElaCER Sox9f/f (C) and ElaCER KrasG12D Sox9f/f (E) pancreas, this expression is restricted to the apical pole of the metaplastic acinar cells for Erbin (C and E) or to the ducts, for ErbB2 (C and E) and Egfr (C and E). In both genotypes, Erk expression is weakly observed in metaplastic acinar cells (arrowhead, E). Magnifications of WT and ElaCER KrasG12D metaplastic cells are shown in the insets (B and D). Scale bars=50 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    在胰腺炎期间，Sox9控制表皮生长因子受体(EGFR)通路成员的表达。(A)天蓝素处理方案。(B-E)野生型淀粉酶、ErbB2、Erbin、Egfr和细胞外信号调节激酶(Erk)的免疫荧光标记(WT) (B),ElaC呃Sox9/ f(C),ElaC呃喀斯特G12D(D)和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f(E)急性胰腺炎第7天(D7)小鼠。ErbB2、Erbin、Egfr和Erk在大肠癌化生腺泡和管状复合体中强烈诱导表达ElaC呃喀斯特G12D胰腺(箭头，D)，而仅弱诱导WT化生腺泡细胞(箭头，B)ElaC呃Sox9/ f(C)和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f(E)胰腺，这种表达仅限于Erbin的化生腺泡细胞的根尖(C和E)或ErbB2 (C和E)和Egfr的导管(C和E)。在两种基因型中，在化生腺泡细胞中都能微弱地观察到Erk的表达(箭头，E)WT和ElaC呃喀斯特G12D化生细胞如图(B和D)所示。比例尺=50µm。

    Sox9在小鼠胰腺肿瘤发生过程中控制ErbB信号通路

    ErbB信号成分表达降低ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f小鼠表明，这种途径在这些小鼠中很少或没有活性。Egfr和Erk的磷酸化与ErbB通路的激活相关，并被用于进一步研究通路活性。在没有胰腺炎的情况下，P-Egfr和P-Erk染色在测试基因型的导管中几乎检测不到补充图S12)。在急性胰腺炎第7期(图4),在WTP-Egfr和P-Erk在一组化生腺泡细胞(图4C).在缺乏Sox9的情况下，这些磷酸化形式在腺泡室中不再被检测到(图4D)ElaC呃喀斯特G12D小鼠化生腺泡和管状复合体中发现了高水平的P-Egfr和P-Erk (图4E)。ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f小鼠腺泡细胞中未检测到P-Egfr, P-Erk水平较低(图4E).在长期设置中(图4B)，在D65时，Erk被弱磷酸化WT，ElaC呃Sox9/ f和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f而在小鼠的PanINs中检测到高水平的磷酸化ErkElaC呃喀斯特G12D老鼠。P-Egfr仅在PanINs中检测到ElaC呃喀斯特G12D老鼠(图4E).这些数据表明，在致癌的Kras背景中，P-Egfr和P-Erk的检测和ErbB通路的激活依赖于Sox9。

    The absence of Sox9 reduces epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling activity during pancreatitis. (A and B) Scheme of cerulein treatments. (C–F) Immunofluorescent labelling for amylase, P-Egfr, and P-extracellular-signal-regulated kinase (Erk) in wild type (WT) (C), ElaCER Sox9f/f(D), ElaCER KrasG12D (E), and ElaCER KrasG12D Sox9f/f (F) mice at day 7 (D7) of acute pancreatitis and D65 of chronic pancreatitis. At D7, the activity of Egfr and Erk is strongly induced in tubular complexes of ElaCER KrasG12D mice (E) whereas this activity is reduced in WT (C), ElaCER Sox9f/f (D) and ElaCER KrasG12D Sox9f/f (F) mice. At D65, the activity of Egfr and Erk is elevated in pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) (E) found in ElaCER KrasG12D mice, whereas the EGFR pathway is strongly reduced or inactive in WT, ElaCER Sox9f/f and ElaCER KrasG12D Sox9f/f mice (C, D, F). Insets show magnifications revealing P-Erk labelling in nuclei: levels of P-Erk were lower in WT, ElaCER Sox9f/f and ElaCER KrasG12D Sox9f/f metaplastic acinar cells (C, D and F), as compared with PanIN cells of ElaCER KrasG12D mice (labelled in blue by 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining) (E). Star: mucin vesicle. Scale bars=50 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Sox9的缺失降低了胰腺炎期间表皮生长因子受体(EGFR)信号的活性。(A和B)天蓝素处理方案。(C-F)野生型淀粉酶、P-Egfr和p -细胞外信号调节激酶(Erk)的免疫荧光标记(WT)(C),ElaC呃Sox9/ f(D),ElaC呃喀斯特G12D(E)ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f(F)急性胰腺炎第7天(D7)和慢性胰腺炎第65天的小鼠。在D7时，Egfr和Erk的活性在管状复合体中被强烈诱导ElaC呃喀斯特G12D(E)而这种活动在WT(C),ElaC呃Sox9/ f(D)和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f老鼠(F)。在D65，在胰腺上皮内瘤变(PanIN) (E)中发现，Egfr和Erk的活性升高ElaC呃喀斯特G12D而在小鼠中，EGFR通路强烈减少或不活跃WT，ElaC呃Sox9/ f和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f小鼠(C, D, F)。插图显示放大显示细胞核中的P-Erk标记:P-Erk水平在小鼠中较低WT，ElaC呃Sox9/ f和ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f化生腺泡细胞(C, D和F)，与PanIN细胞比较ElaC呃喀斯特G12D小鼠(蓝色标记为4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色)(E)。星号:粘蛋白囊泡。比例尺=50µm。

    为了进一步测试在Sox9缺失的情况下ErbB通路的功能，通过酶解获得的胰腺细胞簇被包埋在胶原凝胶中，并在表皮生长因子(EGF)缺失或存在的情况下培养。在这种情况下，腺泡细胞发生化生变化，并在依赖egf的过程中转化为导管样囊肿。35在无EGF的情况下，两组囊肿大小相似WT和ElaC呃Sox9/ f组织培养(图5A, D)。ElaC呃喀斯特G12D显示明显更大的囊肿，证实了致癌Kras在这些培养条件下产生化生结构的倾向(图5B, D)。36EGF诱导囊肿大小增加2.0倍和1.5倍WT和ElaC呃Sox9/ f文化,分别;这说明在基础条件下，Sox9对EGF的功能没有显著影响(图5A, D，在ElaC呃喀斯特G12D在EGF存在的情况下，观察到囊肿大小增加了3.8倍(图5A, D)。重要的是，在缺乏Sox9的情况下，这种增加降低了1.8倍(ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f;图5C, D)。从这些组织培养实验中，我们得出结论，在突变Kras存在时，Sox9是EGF完全反应所必需的。

    The formation of epidermal growth factor (EGF)-induced duct-like cysts in collagen cultures of ElaCER KrasG12D pancreata is inhibited in the absence of Sox9. (A-C) Digested pancreata are cultured in the absence (−) or in the presence (+) of EGF. Phase contrast microscopy shows cyst formation in acinar cell cultures. Magnifications of cysts are shown in the insets. Scale bars=50 µm. (D) Quantification of cyst area in wild type (WT), ElaCER Sox9f/f, ElaCER KrasG12D and ElaCER KrasG12D Sox9f/f cultures, in the absence (−) or in the presence (+) of EGF (n=3, ***p<0.001, comparing ElaCER KrasG12D vs WT, ElaCER Sox9f/f, and ElaCER KrasG12D Sox9f/f cultures). Scales bars=100 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    胶原蛋白培养中表皮生长因子诱导的导管样囊肿的形成ElaC呃喀斯特G12D在缺乏Sox9的情况下，胰脏分泌受到抑制。(A-C)消化后的胰腺在没有EGF(−)或存在EGF(+)的情况下培养。相衬显微镜显示腺泡细胞培养中囊肿形成。插图中显示囊肿的放大图。比例尺=50µm。(D)野生型囊肿面积的定量(WT)，ElaC呃Sox9/ f, ElaC呃喀斯特G12D和ElaC呃喀斯特G12DSox9f /f培养，在没有(−)或存在(+)EGF (n=3， ***p<0.001，比较ElaC呃喀斯特G12DvsWT，ElaC呃Sox9/ f，和ElaC呃喀斯特G12DSox9f /f文化)。鳞片条=100µm。

    总之，这些实验表明，Sox9在kras诱导的ADM中刺激ErbB通路，我们认为，由于Sox9和ErbB2信号缺失导致的ADM缺乏阻止了PanIN的进展。

    讨论

    SOX9是胰腺细胞分化的关键转录因子，最近被认为是ADM和胰腺肿瘤病变起始的关键。5，15这就迫切需要深入研究SOX9在PDAC发展和进展中的驱动机制。

    我们的基因组数据证明了这一点SOX9在大约15%的样本中可以看到人类早期I期和II期PDAC的畸变。我们发现大约5%的PDAC拷贝数增加，这往往与较高的SOX9表达相关。鉴于大多数样本中SOX9基因的高表达，这一发现与最近的另一项研究一致，5以及拷贝数得失率相等，我们不认为拷贝数增加是人类PDAC样本中SOX9高表达背后的主要机制。

    PDAC样本在不同患者之间具有明显的异质性。2，7，21我们首先从不同肿瘤亚群的角度研究SOX9，因为这可能有助于破译SOX9的运作机制。我们采用了一项基于综合基因表达特征分析将PDAC分为不同亚型的研究。21我们发现SOX9在经典PDAC中表达更高，同时，一个SOX9高肿瘤更可能属于预后较好的亚型。令人欣慰的是，我们还发现GATA6的功能仅限于经典亚型的PDACs，在我们的患者样本中与SOX9有良好的相关性。可以假设SOX9高肿瘤可以进化成SOX9低在后者中，EGFR通路会被下调。这得到了小鼠研究的支持，这些研究表明PDAC最初依赖于Egfr，但最终变得独立。12，13这表明，Sox9功能在PDAC发展的初始阶段始终是必需的，但后来可能变得可有可无，这可能取决于正在发展的肿瘤的突变格局。

    我们对人类PDAC的分析强调了SOX9的高表达与ERBB信号通路成员(如ERBB2和EGFR)的高表达之间的关系。在小鼠模型中重现了PDAC发展的初始步骤，Sox9对于egf依赖的ADM和PanIN的发展是必需的，PanIN的病变也依赖于EGFR通路的活性。12，13总之，我们的小鼠和人类数据表明，SOX9在egf反应性胰腺肿瘤的形成过程中是必需的，即从最初的化生和PanIN病变到恶性肿瘤的形成。然而，ADM和PanIN发育受阻见于ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f小鼠本身可以解释在这些小鼠中观察到的ERBB通路下调，尽管我们建立SOX9和ERBB通路之间联系的结果并不支持这一观点。

    ERBB2在PDAC发育中的作用没有EGFR那么明确。12，13然而，ERBB2是EGFR首选的二聚体伙伴，EGFR/ERBB2异源二聚体结合EGF的亲和力比EGFR同型二聚体高7倍。37此外，ErbB2在PanIN病变中始终强烈表达，而Egfr则表现出异质性;此外，P-Erk水平与ErbB2表达的相关性非常好，但与v的相关性要低得多，6这表明ErbB2在PDAC的发展中具有功能性作用。我们对ERBB2 shRNA处理的PanIN和HPAFII细胞生长的观察支持了这一点。因此，ERBB2可能被认为是一个治疗靶点。6有趣的是，最近对ERBB2扩增胰腺癌临床特征的研究否定了早期研究的结论，即靶向ERBB2对治疗PDAC无效。38-40相反，研究人员观察到ERBB2和EGFR双重靶向治疗胰腺癌的良好效果。41这些观察结果和我们目前的研究结果为进一步探索ERBB2在早期PDAC中的作用提供了依据。

    SOX9表达的调控导致ERBB2表达的改变，这表明SOX9是ERBB2介导的信号传导的上游调控因子。这种调节的性质似乎很复杂:尽管在所有测试的细胞系中都可以看到ERBB2蛋白水平的SOX9依赖性变化，但在这些细胞系中，SOX9和ERBB2 mRNA之间存在可变的相关性。这表明ERBB2在转录和转录后水平上受到SOX9的控制。我们的结果表明，ERBB2近端启动子的活性不依赖于SOX9，这增加了SOX9对转录的间接控制的可能性。MED1可能在这种控制中发挥作用。31有趣的是，我们的微阵列数据显示，在人类PDAC样本中，SOX9的高表达与MED1的高水平相关，最近的一篇文章通过染色质免疫沉淀揭示了SOX9与MED1启动子结合。42已知ERBIN可以稳定ERBB2蛋白，并限制其在细胞膜上的定位，32，33可能在转录后控制中起作用。因此，在人类PDAC样本中，高水平的SOX9与高水平的ERBIN相关，ERBIN表达下调见于ElaC呃喀斯特G12DSox9/ f老鼠。有趣的是，当SOX9在BxPC3细胞中过表达时，细胞膜上ERBB2定位的增加与ERBIN表达的上调相关(数据未显示)。

    有趣的是，在SOX9高表达的肿瘤中，许多免疫相关途径被下调，包括免疫反应、对病毒的反应、适应性免疫反应和细胞因子的生物合成和分泌，主要是由FOXP3、CD40L、SFTPD、TLR7和8以及一些趋化因子、细胞因子和白介素的变化所驱动。这进一步强调了SOX9之间的功能差异高和SOX9低肿瘤。

    总之，我们的研究结果揭示了SOX9对EGFR/ERBB2在PDAC发展中的调控，这一发现为进一步探索在胰腺癌发展过程中针对EGFR和ERBB2的治疗干预开辟了前景。

    致谢

    我们感谢M. Sander和M. Hebrok在发表前分享结果，S. Konieczny提供建议，Rolf Kemler和发育研究杂交瘤银行(爱荷华大学)提供CK19抗体，L. Mei提供Erbin抗体，B. de Crombrugghe提供p89质粒，P.P. Prévot进行讨论，以及D. Stoffers, D. Tuveson和G. Scherer提供ElaCre呃， LSL克拉斯G12D和Sox9/ f老鼠,分别。我们感谢B. Pastorelli、B. Pirlot和J. Pettitt提供的专家技术援助。

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    补充材料

    脚注

    • IR和PJ的贡献相同。

    • 贡献者AG:研究概念与设计，数据的获取，数据的分析与解释，统计分析和文稿的起草。AVP, MJC, AM和JW:数据的获取，数据的分析和解释，统计分析。CA、MG-L、GVdS、NW:数据采集、数据分析、数据解释。MP:技术或物质支持。CS:数据分析和解释。SMG和AVB:获得资金、技术或物质支持。FPL, IR和PJ:研究概念和设计，数据分析和解释，文稿起草和获得资金。

    • 资金这项工作得到了新南威尔士州癌症研究所的资助;澳大利亚国家卫生和医学研究理事会;澳大利亚政府:创新、工业、科学、研究和高等教育部;澳大利亚癌症研究基金会;昆士兰政府;昆士兰大学;新南威尔士州癌症委员会;加文医学研究所;Avner Nahmani胰腺癌研究基金会;R.T.霍尔信托; Petre Foundation; Jane Hemstritch in memory of Philip Hemstritch; Gastroenterological Society of Australia; American Association for Cancer Research Landon Foundation—INNOVATOR Award; Royal Australasian College of Surgeons; Royal Australasian College of Physicians; Royal College of Pathologists of Australasia; HGSC-BCM: NHGRI U54 HG003273; CPRIT grant RP101353-P7 (Tumour Banking for Genomic Research and Clinical Translation Site 1); Fondation contre le Cancer (Belgium); Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS (Belgium); Université catholique de Louvain. AG was supported by a grant from EU FP7 (Marie Curie Initial Training Network BOLD) and a Télévie fellowship. AVP and MJC are supported by early career fellowships from Cancer Institute NSW. CA holds a Télévie fellowship, IR is a Future Research Fellow of the Cancer Institute NSW (10/FRL2-03) and PJ is a Research Associate of the Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS.

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 伦理批准悉尼当地卫生区rpa区，协议X11-0220。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 数据共享声明未发表的数据可通过电子邮件请求对应作者。