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客观的相反的长期存在的先决条件诱导选择性(即bifidogenic)影响,最近的研究表明,生命起源以前的干预导致ecosystem-wide微生物群的转变。然而,这个过程的一个全面的描述是仍然缺乏。在这里,我们应用16 s rDNA微生物群分析和匹配(气相色谱质谱)代谢组学评估的后果菊粉发酵结肠细菌的生态系统的构成和粪便代谢物概要文件。
设计粪便样本收集在一个双盲、随机、交叉干预研究建立评估菊粉消费在凳子上频率的影响健康的成年人患有轻度便秘进行分析。粪便微生物群组成和代谢物资料与研究的临床结果以及生活质量测量记录。
结果而粪便代谢物概要文件没有显著改变了菊粉消费,我们分析了检测全球微生物群组成和具体inulin-induced影响不大的相对丰度的变化Anaerostipes,Bilophila和双歧杆菌属被确定。观察到的减少Bilophila菊粉消费后丰度与柔和的凳子和有利的变化constipation-specific生活质量的措施。
结论Ecosystem-wide膳食干预的效果分析与生命起源以前的inulin-type果聚糖在结肠微生物群透露,这种效果是特别相关的三个属,其中一个(Bilophila)代表一个有前途的小说为机械的研究目标。
试验注册号码NCT02548247。
- 结肠微生物区系
- 生命起源以前的
- 便秘
这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和其派生作品在不同的条款进行许可,提供了最初的工作是正确地引用和非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
饮食干预与益生元构成的一个主要策略来调节肠道微生物群的组成和活动。
消费的影响inulin-type果聚糖在结肠双歧杆菌属人口是有据可查的。
与最近发现在老鼠身上的研究指向广谱效应,生命起源以前的特异性的影响已经成为争论的话题。
有什么新发现吗?
Inulin-type果聚糖有选择性的影响在人类肠道微生物群。
唯一属持续影响菊粉补充双歧杆菌属,Anaerostipes和Bilophila。
减少Bilophila丰富对菊粉消费与改善constipation-related生活质量指标。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
本研究首次评估膳食菊粉的效果使用新一代测序技术干预肠道微生物群。菊粉的效果的演示了选择性允许定制基于失调的性质有针对性的干预措施。之间的联系Bilophila富足和幸福结合的易感性属菊粉的干预措施为生命起源以前的研究打开了新的视角。
介绍
生命起源以前的概念于1995年被引进,指的是“non-digestible食物成分,有益影响宿主选择性刺激增长和/或活动的一个或一个结肠细菌的数量有限,因此改善健康的。1自从,建议修改这个定义已经定期。最近的修正案提出这个概念的扩展身体网站除了大肠以及夹杂物对宿主健康好处的干预目标,但也限制的取消对结肠生命起源以前的选择性的影响生态系统组成。2,3后者是引人注目的,因为生命起源以前的概念是从观察选择性的刺激双歧杆菌属增长对菊粉发酵。4 - 6然而,目标自然生命起源以前的研究方法最常用的量化细菌丰度不允许排除生命起源以前的影响超出了分类集群在调查中。3通过测序的方法,允许microbiota-wide评估的相对丰度变化,最近的两个小鼠肠道微生物群落的研究表明广谱响应生命起源以前的刺激后,7,8料槽相互作用和变化所导致的肠道环境。9在越来越多的人达成共识关于基层微生物群对益生元,选择性细菌刺激的必要性,使对宿主健康有益的影响也受到了质疑。3许多预测健康生命起源以前的干预措施的好处是由于增强saccharolytic发酵和增加产量的短链脂肪酸10(包括结肠细菌之间的共同特征。11因此,该领域的一个新兴的舆论是选择性生命起源以前的刺激是不必要的严格的要求——这种观点已经成为一个热门的辩论话题无论是在学术界和产业界。2
迄今为止,生命起源以前的干预措施的影响总体上还没有调查人类结肠细菌的生态系统使用meta-omics方法已经证明了自己的价值在一个广泛的研究领域。这里,我们着手纠正这种过时的设计通过分析收集的粪便材料在膳食干预研究inulin-type果聚糖。试验建立了随机,双盲,安慰剂对照,交叉试验在健康成年人有轻微便秘吃12克chicory-derived Orafti菊粉每天沿着四周治疗期(图1)。显著增加大便频率产生的菊粉消费成立,12导致第一次正面意见由欧洲食品安全局菊苣菊粉和维护正常的排便。13与此同时,基于科学的观点专有健康声明(13.5条)对菊苣菊粉和肠功能已经被欧盟委员会(European Commission)批准。使用16 s rDNA基因扩增子测序和匹配的气相色谱质谱(gc - ms)代谢物分析,我们分析了菊粉的样品收集评估影响治疗粪便微生物群组成和代谢物概要文件和相关研究结果的临床结果以及生活质量测量。
随机,双盲,安慰剂对照,交叉试验。参与者被随机分布在两个研究武器,与安慰剂组和治疗干预措施的顺序切换武器。每次试车和干预期后,粪便样本微生物群和代谢物的分析以及元数据收集(访问V2-V5)。
结果与讨论
生命起源以前的干预调节肠道菌群组成
首先,我们着手调查调制菊粉消费对结肠的影响生态系统组成。为此,我们定义的、数量化的微生物群组成,利用时间序列数据收集的全部潜力(图1)。遗留分析属丰度资料排除潜在的治疗效果持久性洗脱期的持续时间以外的综合研究设计(Wilcoxon测试,q值> 0.5;在网上看到的补充表S1)。因此,样本的试车期和安慰剂干预被视为快照自然变异的肠道生态系统。这些快照允许估计基线个人微生物变化随着时间的推移,通过计算互惠Bray-Curtis (BC)不同。比较的基线变化之间的不同生命起源以前的干预和试车/安慰剂样本应该揭示潜在的发生inulin-induced微生物组成的变化。基于这些假设,我们观察到公元前增加不同与菊粉消费与基线相比变化(公元前意味着不同的0.27 vs 0.25, SD 0.09和0.10;Wilcoxon测试,p = 0.0045)。当我们的分析表明,菊粉的效果补充粪便微生物成分是足够大的背景下,出现基线时间变异,匹配分析基于粪便挥发性代谢物概要文件没有透露与菊粉消费相关的重大影响(公元前意味着不同的0.29 vs 0.27, SD 0.09和0.09;Wilcoxon测试,p = 0.0731)。粪便细菌代谢物浓度当然只是部分反映实际生产,鉴于细菌之间的微妙的平衡生产、槽和宿主吸收,平衡生态系统稳定和宿主健康的关键。它还需要提到粪便代谢物分析不包括完整的代谢物但专注于挥发性代谢物。 As a consequence, potential changes in more polar metabolites may have been missed.
生命起源以前的协变量大小与微生物的影响
接下来,我们计算生命起源以前的处理对微生物的影响大小变化通过执行限制主坐标分析(帽)。使用所有165个样本的测序数据收集,微生物变异引起的菊粉消费约为0.8%(置换试验,p < 0.01;图2)。当限制分析样本的安慰剂和菊粉干预时期,估计效果增加到1.2%(置换试验,p < 0.05)。虽然这些百分比可能出现,而适度的(个人间变异估计分别为63.9%和77.2%,),他们会把生命起源以前的干预效果的协变量前最近发现微生物的群体分析变异。14平行分析并没有显示出显著的影响粪便代谢物的菊粉消费资料(见在线补充图S1)。利用原始研究的交叉设计,我们探索的影响inulin-type果聚糖在结肠发酵更详细地生态系统。传统微生物标记而言,交叉分析允许我们识别treatment-induced降低观察微生物群丰富(p < 0.05;在网上看到的补充表S2)。尽管报道对粪便一致性15,16和运输时间,17观察到inulin-triggered丰富并没有减少与变异在布里斯托尔凳子量表评分和大便频率(枪兵的测试中,r =−−0.004和0.156,分别q值> 0.05;在网上看到的补充表S2)。未发现显著差异在微生物群均匀度和多样性之间的治疗和安慰剂样本,样本分布也不是微生物菌群(普遍社区星座18)影响生命起源以前的干预(见在线补充表S2和S3)。菌群的变化却能合成更多形成(个体的微生物改变从一个普遍的微生物群星座到另一个)菊糖摄入后不会发生更频繁(19%)比安慰剂后摄入(19%)(见在线补充表S3)。
生命起源以前的治疗占点之间微生物变异的0.8%。生命起源以前的治疗是作为一个约束因素的主坐标分析布雷柯蒂斯距离(CAP)在样本的干预(o)以及试车期(x)样本后菊粉补充(蓝色)占点之间微生物变异的0.8%(置换试验,p < 0.01)。属对生命起源以前的治疗双歧杆菌属,Anaerostipes和Bilophila,Wilcoxon测试,核反应能量< 10−4,< 10−3分别和< 0.01)绘制祝圣礼。
有选择性的影响双歧杆菌属,Anaerostipes和Bilophila
Genus-level交叉扩增子资料分析显示只有少数特定的微生物类群的影响。我们观察到的相对丰度增加双歧杆菌属和Anaerostipes种虫害对菊粉消费(Wilcoxon测试,q值< 10−4和< 10−3分别;图3;在网上看到的补充表S4)。此外,生命起源以前的干预导致的减少Bilophila人口(核反应能量< 0.01;图3;在网上看到的补充表S4)。而缺席Anaerostipes和双歧杆菌属,我们观察到一个强大的相关性inulin-induced相对丰度和初始数据的变化Bilophila(皮尔森相关,r =−0.71 p < 10−6;在网上看到的补充图S2和表S5A)。震级之间没有链接的治疗引起的相对丰度的变化Anaerostipes,双歧杆菌属和Bilophila可以建立在线吗补充表S5B)。使用一个假说驱动的方法,因此减少多个测试调整的负担,我们评估潜在的一些类群丰度的变化对生命起源以前的刺激与之前报道的易感性。月19 - 21日无显著变化Akkermansia,真细菌,Faecalibacterium或乳酸菌人口与菊粉消费有关(见在线补充表S6)。关于粪便代谢物,交叉分析后才显示dodecanal浓度的增加菊粉消费(Wilcoxon测试中,核反应能量< 0.001;在网上看到的补充表S7)。这个结果证实使用稀疏的偏最小二乘判别分析(见在线补充图S3)。然而,重要的是要注意,分析技术应用不允许所有代谢产物的检测粪便水。一些潜在相关代谢物(乳酸、琥珀酸和甲酸等)因此不包括在我们的数据。分析潜在的相关性与inulin-responsive属完整的数据集的大小显示,dodecanal浓度变化之间的连续与两个相关样本Anaerostipes和双歧杆菌属丰度变化(枪兵的测试中,r = 0.50,核反应能量< 10−9分别和ρ= 0.29,核反应能量< 0.05;在网上看到的补充图S4 S8和表)。虽然dodecanal可能饮食的起源,22增加粪便浓度似乎建议改变肠道脂质消化与菊粉治疗有关。23
菊粉消费增加双歧杆菌属和Anaerostipes丰度,而Bilophila数量下降。Genus-level交叉扩增子的资料分析显示增加的相对丰度双歧杆菌属和Anaerostipes种虫害在生命起源以前的干预(Wilcoxon测试中,核反应能量< 10−4和< 10−3分别)和显示下降Bilophila人口(核反应能量< 0.01)。
治疗的具体影响生态系统成分(有限数量的一致响应类群超出个人间变异)显著扩增子测序研究和对比发现在啮齿动物中进行。7,8尽管越来越多的结肠细菌inulin-degraders已确定,21,24菊粉的特异性干预点双歧杆菌属spp,生命起源以前的研究的长期目标。因此,我们的研究证实了bifidogenic性质inulin-type果聚糖,这归因于属有效吸收能力和细胞降解fructooligosaccharides大。25除了双歧杆菌,Anaerostipes和Bilophila算在菊粉treatment-responsive类群。前者是butyrate-producing属菊糖降能器组成21和物种的能力槽单糖和双歧杆菌发酵由初级菊粉降解产生的产品。26值得注意的是,大量的增加Anaerostipes还观察到与inulin-type饮食干预3个月后在肥胖女性的果聚糖。27最突出的肠道后者属的分离Bilophila wadsworthia、asaccharolytic硫酸盐还原分类单元,通常由< 0.1%的正常的人类胃肠道微生物群28和与消费的动物性饮食。29日鉴于其独特的能力来执行无氧呼吸使用taurine-derived亚硫酸盐作为电子受体,30.观察到的变化Bilophila丰度提示inulin-induced定量或定性胆汁酸生产的变化。事实上,——据我们所知,只有研究prebiotic-induced胆囊胆汁的变化资料报告增加100% glycine-to-taurine接合率后菊粉消费在动物模型。31日虽然这些发现非常适合我们的观察,其他机械的假设不能被丢弃:降低肠内腔的pH值造成inulin-type果聚糖发酵32也可以创造一个不那么有利的环境Bilophila茁壮成长。33概述inulin-induced成分的改变肠道微生物群-补充一些机械的假设提出了图4。然而,它仍然是重要的压力,我们的分析集中在健康、轻度便秘时,需要注意个人和推断不同的分群结果。例如,我们的结果不同于那些观察到一个菊粉对肥胖相关的干预失调;这些差异可能是由于方法论上的差异,以及不同生理环境的干预。27,34同样,在相同的研究中,发现了果聚糖消费与转变粪便短链脂肪酸概要文件。35
概述inulin-induced成分改变肠道微生物群辅以机械的假设。雷达绘图显示缩放变化相对丰度属(端riI vs端I)每个个体,在菊粉与降低大量的属干预坐落在丰富和增加固体外圆(零)。丰度变化的属确认为inulin-responsive突出显示。
生活质量作为一个潜在的目标生命起源以前的干预措施
然后我们评估协会属和代谢物鉴定为响应之间的生命起源以前的干预和饮食或胃肠道参数。对于每一个个体,我们计算一个距离度量评估元数据的转变,代谢物和属参数之间的连续样本。接下来,生成的参数之间的相关性变化进行评估。dodecanal之间无显著关联变异和任何元数据记录观察(见在线补充表S9)。同样,变化之间没有关联双歧杆菌属,Anaerostipes和Bilophila相对丰度和饮食模式的变化除了生命起源以前的干预可能会发现(见在线补充表S10)。然而,对于非饮食元数据,来达到一个相关性Bilophila丰度变化和粪便一致性的变化(片面的斯皮尔曼的测试中,r =−0.22,核反应能量< 0.05)。此外,这一分析显示之间的关联Bilophila和病人便秘的生活质量评估(PACQoL)评估身体不适和治疗满意度(r = 0.20,核反应能量< 0.05和r =−0.30,核反应能量< 0.01;在网上看到的补充图S5和S11表)。据我们所知,这是第一次报告的变化丰富的细菌属与柔和的凳子和有利的变化constipation-specific与菊糖膳食干预后生活质量措施。基于其频繁检测病人组,28其丰富的潜在毒性36和潜在的有害的代谢终端产品,28,37b . wadsworthia通常归类为pathobiont。37因此,观察之间的联系Bilophila减少对菊粉消费和生活质量提高敦促这个分类单元的作用需要进一步研究在主机的幸福。
结论
据我们所知,目前的研究是第一次评估补充菊粉的效果在一个双盲、随机、交叉干预结合ecosystem-wide微生物组和代谢组分析技术。38补充我们的影响分析表明,inulin-type果聚糖在粪便微生物群的变化主要是受限制的Anaerostipes,Bilophila和双歧杆菌属相对丰度。尽管应用程序相同的分析用于微生物粪便代谢物,数据只有dodecanal被发现增加丰富的菊粉的干预。因此,可以得出结论,inulin-type果聚糖确实有选择地影响有限数量的结肠细菌的生长情况,会议最具有争议的标准定义的益生元。此外,我们发现第一个迹象表明减少Bilophila包含已知pathobionts属,与增强宿主健康和可能发挥作用inulin-associated生命起源以前的机制。
方法
研究设计
一个广泛的研究设计和程序的概述,我们参考Mickaet al。12简单地说,本研究建立随机,双盲,安慰剂对照,交叉试验(临床Trials.gov ID:NCT02548247)针对调查的影响chicory-derived菊粉(Orafti菊糖)在健康人肠功能与便秘(见在线补充表S12)。伦理批准获得Landesarztekammer巴登-符腾堡州,德国斯图加特(f - 2010 - 092 # A1)。研究设计由两个四周干预期期间12 g的菊粉(治疗)或麦芽糊精(安慰剂对照)每天消耗(图1)。每个干预期之前是两周试车阶段期间,受试者服用安慰剂控制。冲刷阶段成立后第一个干预期。元数据收集包括个人信息(年龄、性别、体重指数、病人便秘的历史和吸烟状况)和学习课程相关的变量如饮食信息(重量和比例的能量摄入的脂肪,蛋白质和碳水化合物消耗),胃肠道参数(粪便一致性,大便频率、腹胀的感觉,不完全排空,紧张,腹部不适和气体通道)和PACQoL参数(治疗满意度和身体不适),这是记录在每个访问(V2-V5)。12粪便样本的肠道微生物群的系统发育分析和代谢物分析被访问V2, V3, V4和V5 (图1)。所有分析按方案组(42人信服的参与者组(n = 44)提供粪便样本)。
粪便代谢物分析
挥发性有机化合物(VOC)测定方法后成衣的et al。39总之,粪便物质悬浮在水中,2-ethylbutyrate飙升作为内部标准。硫酸钠和硫酸被添加到样品盐酸化解决方案,分别。VOC分析了采用气相色谱(DSQ热电子,圣何塞,加利福尼亚,美国)耦合purge-and-trap系统(速度,Teledyne Tekmar,梅森,俄亥俄州,美国)。色谱分析使用AMDIS V.2.1软件(国家标准与技术研究院(NIST),盖瑟斯堡,马里兰州,美国)。识别的代谢物检测使用NIST库。化合物显示在NIST质谱匹配因素≥90%库被验明正身。相对指标的VOC vs 2-ethylbutyrate作为内部标准计算。165个代谢物的测定样品。总共有382 VOC所有样本的识别和量化。
粪便微生物群系统发育分析
Falony粪便微生物群进行分析描述et al。14短暂,DNA从粪便中提取材料使用该款PowerMicrobiome RNA隔离设备。V4地区16 s rRNA基因扩增的引物对515 f / 806 r,根据Kozich单多路复用标识符和适配器et al。40这一对引物已被证明,允许足够的检测分类范围广泛的结肠细菌,包括双歧杆菌属spp。41测序进行使用Illumina公司MiSeq编曲和测序工具MiSeq V2生产250 bp paired-end读取。多路分解后,fastq序列合并使用FLASH42软件默认的参数。成功地结合读取过滤基于质量(> 90%的核苷酸一定质量分数为每个读30或更高)使用Fastx工具包(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)。嵌合体与UCHIME被移除43和每个样本深度被精减至10000读随机选择的读。读取被分配使用RDP分类器的分类。44总共165份42人(3失踪样本/协议队列)分析了覆盖与平均80属293属样本。
粪便微生物分析
观察到丰富,估计丰富性,Pielou的均匀度指数(J)和香农多样性指数计算的R包PHYLOSEQ。45Enterotyping (http://enterotype.embl.de/enterotypes.html基于分区Medoids使用Jensen-Shannon散度18进行联合genus-abundance矩阵包括研究样本与1000个样本来自佛兰德补充肠道菌群项目吗14为了增加enterotyping准确性。
统计分析
所有统计分析R (V.3.1.0)。鉴于微生物之间的相似之处和代谢物的数据结构(多维zero-enriched数据矩阵),分析后的数据集进行同样类似的策略。既属丰度和代谢物浓度不是正态分布,非参数测试。执行多个测试校正时适用。
遗留分析
成对Wilcoxon测试是用来评估样本之间的差异在干预期(V4-V2、IP的手臂;图1)来评估可能遗留的治疗效果。没有任何重大(核反应能量< 0.05)之间的区别这两个样品是假定排除遗留干预措施。
基线和治疗分析
公元前意味着不同样本之间不(riI结束,riP和P;图1)与平均间隔不同治疗(我)和不使用单边Wilcoxon测试样本,微生物组和代谢组数据,为了评估生态层面菊粉干预的影响。在公元前平行,不同引起的安慰剂(端riP vs端P)和菊粉(riI vs结束我)干预而使用成对Wilcoxon测试在两个相异。
主坐标分析的约束
确定菊糖的摄入量对微生物的影响成分,我们应用帽(R包素食,46函数限制规模)使用BC不同距离度量,以菊粉为制约因素和参与者的ID作为调节因素。意义是计算排列测试(功能anova.cca、默认参数)。属对菊粉治疗被安装到任命(函数envfit)。
交叉分析
匹配的特定格式的交叉设计,我们使用专用的统计分析来评估菊粉治疗的潜在影响。47简而言之,为每个单独的和参数研究(丰富度、均匀度、分类单元或代谢物丰富),家里的观察每个干预期结束时减去(V5-V3;图1)。交叉分析包括在评估差异研究武器(IP vsπ;图1使用Wilcoxon测试)在生成的输出,在需要时实施群体分层(菌群,却能合成更多形成性别)和业务应用Benjamini错误发现率(BH-FDR;48)为多个测试正确。
相关性
之间的相关性变化观察丰富粪便一致性和菊粉治疗引起的频率(riI vs结束我)评估使用枪兵的相关性。
属确认为对菊粉治疗,观察到的大小之间的相关性相对丰度的变化对菊粉消费(riI vs结束我)和他们最初的丰度(结束riI)评估使用皮尔逊相关性。也之间的相关性大小inulin-induced转变(端riI vs端I)的不同反应属评估使用皮尔逊相关性。之间的相关性变化相对丰富的反应属和响应代谢物(连续样本:V3-V2、V4-V3 V5-V4,使用所有的165个样本)进行了测试使用枪兵的相关性。
稀疏的偏最小二乘判别分析
稀疏的偏最小二乘判别分析(sPLS-DA)进行R包mixOmics按方案组的所有165个样本。菊粉补充类(是的(41)和(124))作为分层因素在粪便代谢物矩阵。删除所有代谢物接近零方差(函数nearZeroVar),粪便代谢物矩阵变量被减少到可容纳147观众。选择最优数量的组件基于平均平衡分类错误率与质心距离50多个重复的10倍交叉验证10 PLS-DA模型组件(函数性能)。选择变量的最优数量为每个组件选择基于平均后与重心平衡的分类错误率最低调优sPLS-DA模型(函数tune.spldsda;与50重复使用4组件和10倍交叉验证;在网上看到的补充图S3)。稳定计算频率的选择的代谢物(函数性能)最后sPLS-DA模型与10倍交叉验证和10个重复。
集成的微生物群,代谢物和元数据分析
使用所有四个样品收集在研究过程中,变化丰富的inulin-responsive属treatment-affected代谢物的浓度和元数据之间的家里连续样本计算,调整了失踪的样品。之间的相关性变化使用枪兵的测试进行评估。BH-FDR是应用于所有测试为多个测试正确。
确认
我们要感谢所有参与者,利恩Rymenans和克洛伊Verspecht粪便DNA提取和图书馆准备,和Raes实验室的所有成员参与科学讨论关于手稿。
引用
脚注
DV和GF同样起到了推波助澜的作用。
贡献者概念和设计的研究(圣),数据收集(ST, KV和JR),数据准备(MS,圣,JW, DV和KV),数据分析和解释(DV, GF和SV-S),写作和重要的修订手稿(DV、GF SV-S, MS, ST, KV和JR)。所有作者批准出版的最终版本。
资金DV是由机构为创新科技(IWT)。支持SV-S和JW从研究基金会博士后奖学金弗兰德斯(FWO)。研究由BENEO GmbH,德国曼海姆Sudzucker集团的一员。研究结果和数据包含在已开发的和/或出版BENEO GmbH是一家。BENEO GmbH保留专用权的结果和数据可能的健康索赔请求。
相互竞争的利益女士和圣BENEO / Sudzucker集团的员工。作者独自负责的内容和本文的写作。
伦理批准Landesarztekammer巴登-符腾堡州,德国斯图加特。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
数据共享声明基因分型结果数据是可用在欧洲机构(https://www.ebi.ac.uk/ega/)——研究。EGAS00001002173。