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肝脏病学
原始研究
慢性乙型肝炎病毒感染患者HBsAg和HBcrAg水平对hbv特异性T细胞表型和功能的影响
  1. 埃尔迈拉Aliabadi1，2，3.，
  2. 梅勒妮Urbanek-Quaing1，2，3.，
  3. 本杰明Maasoumy1，3.，
  4. Birgit不来梅1，
  5. 马丁Grasshoff4，
  6. 杨黎2，4，5，
  7. 克里斯蒂安·E·尼豪斯1，2，
  8. (Heiner Wedemeyer1，3.，
  9. Anke R M Kraft1，2，3.，
  10. 马库斯Cornberg1，2，3.，5，6
  1. 1消化、肝脏、内分泌科，汉诺威医学院，汉诺威、德国
  2. 2双核实验与临床感染研究中心，汉诺威、德国
  3. 3.德国感染研究中心(Deutsches Zentrum für Infektionsforschung DZIF)，合作网站汉诺威-布伦瑞克，汉诺威、德国
  4. 4个体化医疗计算生物学，亥姆霍兹感染研究中心(HZI)， c/o CRC，汉诺威、德国
  5. 5个体化感染医学中心，c/o CRC，汉诺威、德国
  6. 6解决感染易感性的卓越集群(RESIST;EXC 2155)，汉诺威医学院，汉诺威、德国
  1. 对应到Markus Cornberg博士，德国汉诺威医学院消化病学、肝病学和内分泌科;cornberg.markus在{}mh-hannover.de

摘要

客观的乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞是控制HBV感染的主要效应细胞，而乙型肝炎表面抗原(HBsAg)被认为是免疫应答受损的关键因素，这是慢性HBV感染的一个标志。除HBsAg外，其他病毒标记物如乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)是可用的，但它们与HBV特异性免疫反应的潜在关联尚不明确，如果这些标记物用于旨在功能性治愈HBV的新疗法的患者分层，这将是重要的。

设计我们分析了92例不同HBsAg和HBcrAg水平的乙型肝炎e抗原阴性慢性HBV感染患者的T细胞反应。重叠肽用于体外反应分析(n=57)， HBV核心18-特异性聚合酶(pol)455特殊技能CD8+对35例人白细胞抗原(HLA)-A*02患者的T细胞进行检测。此外，研究了抗程序性细胞死亡配体1(抗pd - l1)的体外反应性。

结果hbv特异性T细胞反应不受HBsAg水平的影响，而是受年龄和CD4的影响+T细胞反应在低HBcrAg水平的患者中最高。HBV核心的表型和功能18-特异性和pol455特殊技能CD8+T细胞不同，但HBsAg和HBcrAg水平不影响他们的谱。用抗pd - l1阻断可以恢复hbv特异性T细胞，但从低HBsAg患者特别是低HBcrAg患者分离的T细胞效果显著更高。

结论我们的数据表明，年龄和HBcrAg而不是HBsAg与hbv特异性T细胞反应相关。最后，由HBsAg，特别是HBcrAg指示的非常低的抗原水平可能会影响T细胞对检查点抑制的反应。

  • 乙型肝炎
  • 细胞免疫学
  • 慢性肝炎
  • 免疫反应
  • T淋巴细胞

数据可用性声明

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324646

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞在慢性HBV感染患者中衰竭和受损。

    • 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)暴露的时间(由患者的年龄指示)，而不是HBsAg的数量，与抗hbv免疫应答水平相关，特别是乙型肝炎表面特异性T细胞应答。

    • HBV-specific CD8+具有不同目标特异性的T细胞(HBV核心表位与HBV聚合酶(pol)表位)具有不同的表型和功能特征。

    • 检查点抑制(用抗程序性细胞死亡蛋白1(抗pd -1)或抗程序性细胞死亡配体1(抗pd - l1)进行体外阻断)可以恢复hbv特异性T细胞反应的体外反应性。

    新的发现是什么?

    • HBV特异性T细胞反应(也包括HBV核心特异性T细胞和HBV pol特异性T细胞)不受HBsAg水平的影响，而是受患者年龄的影响，特别是CD4+T细胞反应。

    • 乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)水平低的患者hbv特异性CD4水平较高+T细胞反应(与年龄无关)，尤其是HBV核心特异性和HBV pol特异性T细胞反应。

    • HBV核心特异性和HBV pol特异性CD8的不同表型和功能特征+T细胞反应不受不同HBsAg或HBcrAg水平的影响。

    • CD4+和CD8+从低水平HBsAg (<100 IU/mL)，特别是低水平HBcrAg (<3 Log U/mL)患者中分离出的T细胞对PD-L1阻断更敏感。这与年龄无关。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 结果强调，年龄作为感染持续时间的指标是hbv特异性CD8功能的重要因素+和CD4+T细胞，不仅是HBV表面特异性T细胞，而且是HBV核心特异性和极点特异性T细胞，这与HBsAg水平无关。这一数据对于考虑年轻患者进行旨在功能性治愈HBV的新型免疫疗法非常重要。

    • 我们的研究结果还强调，HBcrAg可能是一种比HBsAg更好的病毒标记物，可以区分乙型肝炎e抗原阴性且保留hbv特异性(CD4+) T细胞反应，因此可以考虑对患者进行分层，以寻求针对HBsAg损失的新疗法。

    • 数据还表明，无论年龄大小，低HBsAg和/或低HBcrAg的患者都是基于免疫的治疗(如检查点抑制)的更好候选者，这支持了例如RNA干扰等降低抗原的假设。

    • 总的来说，我们的数据提供了新的见解，对于针对HBV功能性治愈的新疗法的患者分层考虑很重要。

    介绍

    乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一个主要的全球卫生问题，全球约有2.57亿人慢性感染，每年因进行性肝病和肝细胞癌(HCC)导致88.7万人死亡。1用核苷类似物(NA)或干扰素(IFN)治疗可抑制慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV DNA并减缓疾病进展。2然而，慢性HBV感染的功能性治愈(定义为持续性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)丢失)是HBV治疗的主要目标，目前的治疗方法很少实现。3.一些新的治疗策略旨在功能性治愈，包括抗病毒和免疫调节疗法正在开发中。3.患者的选择对于新的研究化合物的早期临床试验非常重要，因为慢性HBV感染是高度可变的，而且慢性HBV感染的不同阶段在免疫反应方面也可能有所不同。4一方面，重要的是要确保治疗组的平衡，否则可能出现异质反应，另一方面，重要的是要为每种治疗方案选择最合适的患者，以证明高疗效。3.

    人们一致认为，定量HBsAg是新治疗药物临床试验患者分层的一个关键标志3.;另一方面，可能有必要首先直接降低HBsAg(如RNA干扰)，以通过免疫调节疗法产生效果。5

    hbv感染的肝细胞会分泌大量仅含有HBsAg的非传染性亚病毒颗粒6这可以对宿主的免疫系统产生影响，对病毒有利。有人提出，HBsAg可能作为诱饵饱和抗- hbs抗体，从而降低病毒中和。7此外，慢性乙型肝炎患者持续的高抗原刺激与细胞免疫反应受损有关。8 - 11HBV特异性T细胞被认为是控制HBV感染的主要效应细胞之一，受损和耗尽的T细胞反应是慢性HBV感染的一个标志8 - 11）.然而，循环HBsAg对T细胞反应的影响存在争议。最近，研究表明hbv特异性T细胞反应与血清HBsAg水平无关，但患者年龄可能反映了感染的持续时间，是hbv特异性T细胞频率的决定因素。12相反，另一项研究表明hbv特异性CD4+在HBsAg <500 IU/mL的患者中，T细胞应答显著升高，体外阻断程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)通路仅在低HBsAg水平的患者中可以提高T细胞的抗病毒能力。13与上述假设一致，即需要降低HBsAg以确保免疫调节疗法的有效性，通过基于rnai的疗法降低HBsAg可增加治疗性疫苗在小鼠模型中的疗效。5相比之下，另一项研究表明，HBsAg清除与基于白介素2的免疫治疗干预后抗病毒T细胞反应的增加无关。14

    了解哪些病毒和宿主因素与hbv特异性免疫反应相关，识别可用于临床试验选择和分层患者的生物标志物非常重要，这些临床试验旨在研究功能性治愈的新治疗策略。除HBsAg外，其他病毒蛋白也可能对免疫反应产生潜在影响。最近，由于能够使用商业试验确定乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)，另一种HBV标记物已被广泛使用，可能与慢性乙型肝炎患者的免疫反应有关。HBcrAg结合了由变性乙型肝炎e抗原(HBeAg)、HBV核心抗原和人工核心相关蛋白(p22cr)产生的抗原反应性。15日16与HBsAg相比，HBcrAg可能是肝内共价闭合环状DNA (cccDNA)更好的替代标记物，其转录活性也可能更好。17HBcrAg还有助于预测对抗病毒治疗的反应和停用NA后的复发，以及预测疾病进展为肝硬化和HCC的发展和复发。15日16然而，目前还没有HBcrAg水平是否与hbv特异性免疫反应相关的数据。

    因此，本研究的目的是分析明确的慢性HBV感染患者的频率和表型，以及T细胞对体外免疫调节的功能和响应性，这些患者的HBsAg和HBcrAg水平不同。

    患者与方法

    患者及样品制备

    共纳入92例HBeAg阴性慢性HBV感染患者。在57例患者中，分析了总T细胞的表型以及hbv特异性T细胞的表型和功能(表1，在线补充图S1A)和35例HLA-A*02阳性患者的核心18-特异性聚合酶(pol)455特殊技能CD8+T细胞分析(表2，在线补充图S1B）.根据HBsAg水平(<100;100 - 1000;1000年10月000;≥10 000 IU/mL)或HBcrAg水平(< 3,3 - 3.87，≥3.87 Log U/mL) (在线补充图S1）.HBcrAg <3表示低HBcrAg，≥3.87 Log U/ml表示高HBcrAg的临界值是基于先前对慢性HBV感染不同阶段的大型队列研究得出的。18

    Characterisation of total CD4+ and CD8+ T cells in patients with CHB with different levels of HBsAg and HBcrAg. (A) Concatenated t-SNE plots of CD4+ and CD8+ T cell subsets (upper panels) and intensities of the indicated markers (lower panels) in 49 patients with CHB categorised according to HBsAg and HBcrAg levels. (B–C) Frequencies of CD4+ and CD8+ T cell effector memory subsets as well as CD4+ and CD8+ T cells expressing activation and exhaustion markers grouped according to HBsAg (B) and HBcrAg (C) levels. Statistical significance between each of the two groups was tested by Mann-Whitney test for non-parametric data and by unpaired t-test for parametric data (B–C). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. CHB, chronic hepatitis B; HBcrAg, hepatitis B core-related antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; TCM, central memory T cell; TEM, effector memory T cell; TEMRA, terminally differentiated effector memory T cell; HLA-DR, human leukocyte antigen – DR; KLRG1, killer cell lectin like receptor G1; PD-1, programmed cell death protein 1; t-SNE, t-distributed stochastic neighbor embedding.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    总CD4的特征+和CD8+不同HBsAg和HBcrAg水平的CHB患者的T细胞。(A) CD4的串联t-SNE图+和CD8+根据HBsAg和HBcrAg水平分类的49例CHB患者的T细胞亚群(上图)和指示标记物的强度(下图)。(B-C) CD4频率+和CD8+T细胞效应记忆亚群以及CD4+和CD8+表达激活和衰竭标记的T细胞根据HBsAg (B)和HBcrAg (C)水平分组。非参数资料采用Mann-Whitney检验，参数资料采用非配对t检验(B-C)，两组间比较有统计学意义。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。CHB，慢性乙型肝炎;乙型肝炎核心相关抗原HBcrAg;HBsAg，乙型肝炎表面抗原;T厘米，中央记忆T细胞;T新兴市场，效应记忆T细胞;TEMRA，终分化效应记忆T细胞;HLA-DR，人白细胞抗原-DR;KLRG1，杀手细胞凝集素样受体G1;PD-1，程序性细胞死亡蛋白1;t-SNE, t分布随机邻居嵌入。

    查看该表:
    表1

    慢性HBV感染HBeAg阴性患者的研究队列

    查看该表:
    表2

    HLA-A*02阳性慢性HBV感染患者的研究队列

    采用标准的Ficoll密度梯度离心法从患者体内分离出外周血单个核细胞(pmcs)，并在液氮中冷冻保存以备后续使用。19

    丙氨酸转氨酶(ALT)、HBV DNA、HBsAg和HBcrAg水平如前所述测定。18

    所有试验都是根据《赫尔辛基宣言》所支持的原则进行的。汉诺威医学院当地伦理委员会确保了该项目。所有参与本研究的个体均获得书面知情同意。

    HBV重叠肽、单肽和HLA I类右旋聚体

    HBV特异性基因型D重叠肽(OLPs) (ProImmune, Oxford, UK)由15个氨基酸组成，由10个氨基酸重叠，横跨整个HBV核心(两个池)，表面(四个池)和聚合酶(八个池)(在线补充表S1）.19

    HLA-A*02限制性hbv特异性肽，表位核心18-27(FLPSDFFPSV)和聚合酶455 - 463(GLSRYVARL)由ProImmune合成。HLA-A*02-特异性右旋糖酐购自Immudex (Copenhagen, Denmark)。

    hbv特异性肽体外刺激后T细胞亚群表型和hbv特异性T细胞反应

    总T细胞的体外表型和hbv特异性T细胞功能的分析如前所述(抗体见在线补充材料和方法）.19

    简单地说，pbmc扩张10天，并用hbv特异性OLPs或HLA-A*02限制性多肽刺激。在减去培养基对照后，通过添加相应的肽池来计算得到的T细胞反应。

    为了分析T细胞恢复，将抗程序性细胞死亡配体1(抗pd - l1，克隆M1H1, eBioscience)与hbv特异性肽一起添加到培养物中。所有样品均在BD LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上采集。

    pMHCI多基磁富集

    hbv特异性CD8的分离+如前所述，利用多基磁珠富集T细胞。20 21用表面和细胞内标记物对富集和预富集细胞进行染色。

    统计分析

    流式细胞术数据采用FlowJo软件(V.9.9.4和V.10.6.2)进行分析。SPICE V.6.0用于显示多功能流式细胞术数据(Simplified Presentation of incredible complicated evaluation, National Institutes of Health(NIH))。为了消除年龄的影响，使用R v .进行半偏相关分析。https://www.r-project.org）.使用GraphPad Prism 8 (GraphPad Software)进行统计分析。非参数资料采用Mann-Whitney检验、Wilcoxon配对检验、Kruskal-Wallis检验、Spearman相关检验，参数资料采用Student 's配对t检验、单向方差分析、Pearson相关检验。显著性p值为:*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。柱状图显示平均值，误差柱表示平均值的标准误差。

    结果

    HBsAg和HBcrAg水平对总T细胞的影响

    我们首先筛选总CD4的比例+和CD8+49例不同水平HBsAg和HBcrAg患者的体外T细胞及其记忆效应亚群、γδ T细胞、黏膜相关不变T细胞(MAIT细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)(表1，在线补充图S1A）.采用流式细胞术检测T细胞特异性分化、激活和调控标志物(在线补充图S2A）.t-SNE图显示CD4的聚类无明显差异+和CD8+T细胞亚群(图1一个）.此外，颗粒酶B、HLA-DR、Ki-67和PD-1在总T细胞中的表达模式在患者组之间保持相似。naïve、中央记忆、效应记忆和终分化效应记忆CD4的比例+T细胞在不同水平的HBsAg或HBcrAg组中没有改变(图1 b, C）.然而，HBsAg≥10 000 IU/mL和HBcrAg≥3.87 Log U/mL的患者中枢记忆和效应性记忆CD8的频率显著降低+T细胞亚群(图1 b）.频率naïve，中央存储器和效应器存储器CD8+T细胞与HBsAg水平显著相关(在线补充图S2B）.仅HBcrAg水平与效应记忆CD8呈显著负相关+T细胞(在线补充图S2C）.HBsAg、HBcrAg水平与CD4的相关性+T细胞与慢性乙型肝炎患者无相关性(在线补充图S2B,C）.在不同HBsAg或HBcrAg水平的患者组中，γδ T细胞、MAIT细胞和Treg细胞的比例没有变化(在线补充图S2D）.

    HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses in patients with different levels of HBsAg and HBcrAg. HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses following 10-day in vitro stimulation with HBV overlapping peptide pools. (A) Representative flow cytometry plots of HBV-specific CD4+ T cell responses from patients with different levels of HBsAg and HBcrAg. (B–C) HBV-specific IFN-γ+ CD4+ and IFN-γ+ CD8+ T cells from 57 patients with CHB categorised based on their HBsAg (B) and HBcrAg (C) levels (total-specific T cell response: sum of 14 peptide pools). Statistical significance between each of the two groups was tested by Mann-Whitney test for non-parametric data and by unpaired t-test for parametric data (B–C). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. CHB, chronic hepatitis B; HBcrAg, hepatitis B core-related antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; IFN, interferon; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    HBV-specific CD4+和CD8+不同水平HBsAg和HBcrAg患者的T细胞反应。HBV-specific CD4+和CD8+用HBV重叠肽池体外刺激10天后T细胞反应。(A) hbv特异性CD4的代表性流式细胞仪图+不同水平HBsAg和HBcrAg患者的T细胞反应。(B-C) hbv特异性干扰素γ+CD4+和干扰素-γ+CD8+来自57例CHB患者的T细胞根据其HBsAg (B)和HBcrAg (C)水平进行分类(总特异性T细胞反应:14个肽库的总和)。非参数资料采用Mann-Whitney检验，参数资料采用非配对t检验(B-C)，两组间比较有统计学意义。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。CHB，慢性乙型肝炎;乙型肝炎核心相关抗原HBcrAg;HBsAg，乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素;肿瘤坏死因子。

    HBsAg和HBcrAg水平对hbv特异性T细胞功能的影响

    57例HBeAg阴性患者的HBV特异性T细胞反应，通过测量细胞因子反应(如IFN-γ和IFN-γ/肿瘤坏死因子(TNF))，在体外用覆盖HBV核心、表面和聚合酶抗原的特异性OLPs扩张和再刺激10天后评估(在线补充图S1A）.CD4的代表性流式细胞仪图+T细胞反应描述在图2一个．

    一般来说，IFN-γ+CD4+T细胞反应比IFN-γ更频繁地检测到+CD8+T细胞反应(图2 b, C）.HBV核心特异性和pol特异性细胞因子+与表面特异性T细胞相比，T细胞占优势(图2 b, C）.重要的是，在不同血浆HBsAg水平的患者中观察到HBV核心、表面和pol特异性T细胞反应无显著差异(图2 b)， HBsAg与hbv特异性CD4无相关性+和CD8+T细胞反应(在线补充图S3）.如果有的话，IFN-γ的频率有增加的趋势+CD4+和CD8+HBsAg≥10 000 IU/mL患者的T细胞(图2 b）.相比之下，不同HBcrAg水平的患者有显著差异。HBV-specific CD4+高HBcrAg(≥3.87 Log U/mL)患者的T细胞对核心和聚合酶肽的反应明显低于低HBcrAg (<3 Log U/mL)或中等HBcrAg (3 - 3.87 Log U/mL)患者(图2 c）.HBV核心特异性CD4+T细胞反应与血浆HBcrAg水平呈显著负相关(在线补充图S3B）.

    HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses in different age groups. HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses following 10-day in vitro stimulation with HBV overlapping peptide (OLP) pools grouped according to the patients’ age. (A) Representative flow cytometry plots of HBV core-specific IFN-γ+/TNF+ CD4+ T cell responses of two patients. (B) Heat map showing mean of frequencies of total cytokine+ HBV-specific CD4+ and CD8+ T cells (age groups: 18–39, n=25; 40–49, n=17; ≥50, n=15). (C) IFN-γ+ HBV-specific CD4+ and CD8+ T cells of different age groups. (D) Correlation analyses of age with frequencies of total IFN-γ+ CD4+ and CD8+ T cells. (E) Mean percentages of multifunctional CD4+ and CD8+ T cell responses after in vitro expansion with total HBV OLPs (sum of 14 OLP pools). Statistical significance between each of the two groups was tested by Mann-Whitney test for non-parametric data and by unpaired t-test for parametric data (B–C). *p<0.05; **p<0.01. IFN, interferon; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    HBV-specific CD4+和CD8+T细胞在不同年龄组的反应。HBV-specific CD4+和CD8+用HBV重叠肽(OLP)池体外刺激10天后的T细胞反应根据患者年龄分组。(A) HBV核心特异性IFN-γ的代表性流式细胞仪图+/肿瘤坏死因子+CD4+两名患者的T细胞反应。(B)显示总细胞因子频率平均值的热图+HBV-specific CD4+和CD8+T细胞(年龄:18-39岁，n=25;40至49,n = 17;≥50岁,n = 15)。(C)干扰素-γ+HBV-specific CD4+和CD8+不同年龄组的T细胞。(D)年龄与总IFN-γ频率的相关性分析+CD4+和CD8+T细胞。(E)多功能CD4细胞的平均百分比+和CD8+用HBV总OLP(总计14个OLP池)体外扩增后的T细胞反应。非参数资料采用Mann-Whitney检验，参数资料采用非配对t检验(B-C)，两组间比较有统计学意义。* p < 0.05;* * p < 0.01。干扰素干扰素;肿瘤坏死因子。

    值得注意的是，队列中有18例患者在取样时接受了NA治疗(表1，在线补充表2)，但这对hbv特异性CD4没有显著影响+和CD8+T细胞反应(在线补充图S4A）.

    Functional and phenotypical characteristics of HBV core18-specific and HBV pol455-specific CD8+ T cells in patients with CHB. HBV-specific CD8+ T cell responses following 10-day in vitro stimulation with core18 or pol455 peptides in HLA-A*02 positive patients with CHB. (A) HBV-specific IFN-γ+ CD8+ T cell responses categorised based on HBsAg or HBcrAg levels. (B) Enriched ex vivo frequencies of naïve, TCM, TEM and TEMRA populations and expression of PD-1, KLRG1, CD39, Eomes, Tbet, PD-1 CD127 and TCF1 by HBV core18 and pol455-specific CD8+ T cells. (C) Radar plot depicting the mean percentage of ex vivo HBV core18 and pol455-specific CD8+ T cell expressing different markers obtained from patients with CHB categorised based on HBsAg and HBcrAg levels. Statistical significance was tested by Wilcoxon test and Mann-Whitney test for non-parametric data and by unpaired t-test for parametric data (A–C). ns, not significant; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. CHB, chronic hepatitis B; DCM, dead cell marker; FSC, forward scatter; HBcrAg, hepatitis B core-related antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HLA, human leukocyte antigen; IFN, interferon; PD-1, programmed cell death protein 1; pol, polymerase; SSC, side scatter; TCF1, transcription factor 1; TCM, central memory T cell; TEM, effector memory T cell; TEMRA, terminally differentiated effector memory T cell; TNF, tumour necrosis factor;.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    HBV核心的功能和表型特征18-特异性和HBV pol455特殊技能CD8+慢性乙型肝炎患者中的T细胞。HBV-specific CD8+体外核刺激10天后T细胞反应18或者波尔455HLA-A*02阳性CHB患者多肽的研究。(A) hbv特异性IFN-γ+CD8+T细胞反应根据HBsAg或HBcrAg水平分类。(B)丰富的体外频率naïve, T厘米T新兴市场和TEMRAPD-1、KLRG1、CD39、Eomes、Tbet、PD-1 CD127和TCF1在HBV核中的表达情况18和波尔455特殊技能CD8+T细胞。(C)描述体外HBV核心平均百分比的雷达图18和波尔455特殊技能CD8+根据HBsAg和HBcrAg水平，从CHB患者中获得表达不同标记物的T细胞。非参数资料采用Wilcoxon检验和Mann-Whitney检验，参数资料采用非配对t检验(A-C)，检验差异有统计学意义。Ns，不显著;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。CHB，慢性乙型肝炎;DCM，死细胞标志物;FSC，向前散射;乙型肝炎核心相关抗原HBcrAg; HBsAg, hepatitis B surface antigen; HLA, human leukocyte antigen; IFN, interferon; PD-1, programmed cell death protein 1; pol, polymerase; SSC, side scatter; TCF1, transcription factor 1; T厘米，中央记忆T细胞;T新兴市场，效应记忆T细胞;TEMRA，终分化效应记忆T细胞;肿瘤坏死因子;

    我们还分析了慢性HBV感染的阶段是否有影响，并根据HBV(<或≥2000iu /mL)和ALT(正常或升高)将患者分为四个不同的类别(在线补充表3）.HBV DNA≥2000iu /mL、ALT升高(HBeAg阴性肝炎)的患者CD4明显降低+T细胞反应(在线补充图S4B）.值得注意的是，本组5例患者中有5例HBcrAg水平≥3.87 Log/mL。ALT水平与hbv特异性CD4无相关性+或CD8+T细胞反应(Spearman r=−0.05,p=0.7;Spearman r=0.21, p=0.11)。

    年龄对hbv特异性T细胞反应的影响

    鉴于HBsAg数量与年龄呈显著负相关6日12（在线补充图S5A)，我们检测了三个不同年龄组(18-39岁、40-49岁和≥50岁)的hbv特异性T细胞反应。总IFN-γ的频率+CD4+(HBV核心、表面和聚合酶的总和)在年轻患者(<40岁)中明显高于老年患者(≥50岁)(图3A, B和C）.特别是，hbv特异性IFN-γ的总数之间观察到显著的负相关+CD4+T细胞与年龄(图3 d）.对HBV pol特异性T细胞的影响更为明显。值得注意的是，接受NA治疗的患者在不同年龄组中分布均匀(18-39岁:n=8/25(32%)， 40-49岁:6/17(35%)，≥50岁:4/15(27%))。

    Impact of PD-L1 blockade on HBV-specific T cell responses in patients with CHB. HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses following 10-day in vitro stimulation with HBV overlapping peptide (OLP) pools with or without the addition of anti-PD-L1 antibody. (A) IFN-γ expression by HBV-specific CD4+ and CD8+ T cells of patients with different HBsAg level. Open circles mark three patients with HBsAg of 1000–10 000 IU/mL with the highest T cell response who showed all HBcrAg levels of <3 Log U/mL. (B) Correlation analyses of HBsAg residuals with difference or log2 fold change of HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses after expansion in presence of anti-PD-L1. (C) IFN-γ expression by HBV-specific CD4+ and CD8+ T cells of patients with different levels of HBcrAg. Total-specific T cell response: sum of all 14 OLP pools. Statistical significance was tested by Wilcoxon test for non-parametric data and by paired t-test for parametric data (A, C). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. CHB, chronic hepatitis B; HBcrAg, hepatitis B core-related antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; IFN, interferon; PD-L1, programmed cell death ligand 1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    PD-L1阻断对CHB患者hbv特异性T细胞反应的影响HBV-specific CD4+和CD8+用HBV重叠肽(OLP)池体外刺激10天后T细胞反应，加入或不加入抗pd - l1抗体。(A) hbv特异性CD4表达IFN-γ+和CD8+不同HBsAg水平患者的T细胞。开圈标记三名HBsAg在1000-10 000 IU/mL之间，T细胞反应最高的患者，所有HBcrAg水平均<3 Log U/mL。(B) HBsAg残差与hbv特异性CD4差异或log2倍变化的相关性分析+和CD8+T细胞在抗pd - l1存在下扩增后的反应。(C) hbv特异性CD4表达IFN-γ+和CD8+不同HBcrAg水平患者的T细胞。总特异性T细胞反应:所有14个OLP池的总和。非参数资料采用Wilcoxon检验，参数资料采用配对t检验(A, C)， *p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。CHB，慢性乙型肝炎;乙型肝炎核心相关抗原HBcrAg;HBsAg，乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素;PD-L1，程序性细胞死亡配体1。

    此外，hbv特异性T细胞的能力，特别是CD4+在刺激下产生多种细胞因子的T细胞随着年龄的增长而减少(图3 e）.

    HBsAg和HBcrAg水平对核心的影响18-特异性和pol455特殊技能CD8+HLA-A*02阳性CHB患者的T细胞

    最近的研究表明hbv特异性CD8的表型和功能特征+慢性乙型肝炎患者的T细胞是不同的，这取决于靶向的HBV表位，22日23日但未评估HBsAg和HBcrAg水平的影响。因此，我们学习了core18-特异性和pol455特殊技能CD8+不同HBsAg水平(<100和>10 000 IU/mL)和HBcrAg水平(<3和≥3 Log U/mL)的35例HLA-A*02阳性CHB患者的T细胞(表2，在线补充图S1B）.与之前的研究一致，22日23日我们确认了CD8+T细胞靶向HBV核心18与pol相比，同源HBV多肽体外刺激后IFN-γ表达更高455特殊技能CD8+T细胞，但这是独立于HBsAg和HBcrAg (图4一）.我们随后选择了24例HLA-A*02阳性的CHB患者，以评估HBsAg和HBcrAg水平对核心表型的影响18-特异性和pol455-特异性CD8+肽- mhc基右旋聚体富集T细胞(图4 b，在线补充图S1B）.基于CD45RA和CCR7表达的记忆分化模式分析表明，naïve-like CD8的表达频率较高+T细胞靶向pol455是否显著高于目标核心18．相反，核心18特殊技能CD8+T细胞的效应记忆表型频率明显高于pol455特殊技能CD8+T细胞(图4 b）.CD39、KLRG1、Eomes和Tbet在核间表达差异无统计学意义18-特异性和pol455-特异性T细胞。然而,核心18特殊技能CD8+T细胞中PD-1的表达高于pol455特殊技能CD8+T细胞(频率见图4 b;MFI核心的平均值18与波尔455: 375 vs 166, p值分别<0.0001)。我们还记录了核心部分PD-1和CD127的高共表达18-specific vs pol455特殊技能CD8+T细胞(图4 b)，但核间转录因子1 (TCF1)表达无差异18-特异性和pol455-特异性T细胞(图4 b）.重要的是，CD8的表型没有显著差异+T细胞靶向核心18或者波尔455除核心部位KLRG-1表达显著升高外，不同HBsAg或HBcrAg水平的患者均有明显差异18特殊技能CD8+HBsAg >患者的T细胞10 000 IU/mL (图4 c）.

    抗pd - l1阻断对hbv特异性CD4的影响+和CD8+T细胞

    T细胞在慢性HBV感染中功能衰竭，可以通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来恢复功能(综述于10 - 26）.因此，我们质疑通过靶向共调节途径逆转功能受损的hbv特异性T细胞是否受到血浆HBsAg或HBcrAg数量的影响。有趣的是，hbv特异性OLPs刺激PBMC并阻断PD-1/PD-L1通路可显著增强IFN-γ+CD4+HBsAg <100 IU/mL和HBsAg 1000-10 000 IU/mL患者的T细胞(图5一个）.为了确保年龄因素不影响HBsAg与T细胞功能恢复的相关性，我们通过执行半部分相关(图5 b）.随后，分析显示HBsAg残差与IFN-γ呈显著负相关+CD4+和干扰素-γ+CD8+通过阻断PD-1/PD-L1通路恢复T细胞。

    当我们分析不同水平HBcrAg患者的T细胞恢复时，我们观察到CD4和CD4均显著增加IFN-γ表达+和CD8+低HBcrAg (<3 Log U/mL)患者的T细胞和CD8+中间组T细胞(3-3.87 Log U/mL)图5 c）.抗pd - l1阻断对HBcrAg高的患者无显著影响。值得注意的是，CD4细胞增加最多的三个病人+和CD8+在HBsAg为1000-10 000的组中，T细胞反应均为<3 Log U/mL的低HBcrAg水平，占该组显著值。

    抗pd - l1阻断对核心的影响18-特异性和pol455特殊技能CD8+T细胞

    最后，我们评估了血浆HBsAg和HBcrAg水平对核心反应性的影响18-特异性和pol455特殊技能CD8+T细胞体外阻断PD-1/PD-L1通路。HBV核刺激后不同HBsAg和HBcrAg水平的CHB患者的代表性流式细胞术图18和波尔455存在或不存在抗pd - l1抗体的多肽显示在图6．抗pd - l1仅在HBsAg和HBcrAg较低(分别<100 IU/mL和<3 log U/mL)时对IFN-γ反应有影响，但这仅对HBV pol显著455特殊技能CD8+T细胞。

    Impact of PD-L1 blockade on HBV core18-specific and pol455-specific CD8+ T cell responses. HBV-specific CD8+ T cell responses following in vitro stimulation with core18-specific or pol455-specific peptides in presence or absence of anti-PD-L1 antibody. (A) Patients with CHB with HBsAg <100 or ≥10 000 IU/mL and (B) patients with CHB with HBcrAg <3 or >3 Log U/mL. Statistical significance was tested by Wilcoxon test. ns, not significant; *p<0.05; **p<0.01. CHB, chronic hepatitis B; HBcrAg, hepatitis B core-related antigen; HBsAg, hepatitis B surface antigen; IFN, interferon; PD-L1, programmed cell death ligand 1; pol, polymerase; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    PD-L1阻断对HBV核心的影响18-特异性和pol455特殊技能CD8+T细胞反应。HBV-specific CD8+体外核刺激后的T细胞反应18-specific或pol455-特异性肽存在或不存在抗pd - l1抗体。(A) HBsAg <100或≥10 000 IU/mL的CHB患者和(B) HBcrAg <3或>3 Log U/mL的CHB患者。采用Wilcoxon检验进行差异有统计学意义。Ns，不显著;* p < 0.05;* * p < 0.01。CHB，慢性乙型肝炎;乙型肝炎核心相关抗原HBcrAg;HBsAg，乙型肝炎表面抗原;干扰素干扰素; PD-L1, programmed cell death ligand 1; pol, polymerase; TNF, tumour necrosis factor.

    讨论

    慢性HBV感染的功能性治愈(定义为持续的HBsAg丢失)是HBV治疗的首选目标，但在慢性乙型肝炎患者中很少实现。2 3因此，新的抗病毒和免疫调节疗法正在开发以改善这一目标。为了确定这些疗法的最合适的候选，例如，免疫调节疗法识别与hbv特异性免疫反应相关的标记物可能很重要。定量HBsAg尤其被认为在免疫应答受损和无法清除HBV中发挥重要作用。6在本研究中，我们研究了不同HBsAg水平患者的T细胞反应，但也考虑了另一种新的HBV标记物HBcrAg，目前还没有关于免疫反应的数据。

    首先，我们的数据显示包括CD4在内的整体T细胞组成+和CD8+与HBsAg水平相关，CHB患者的T细胞、γδ T细胞、MAIT细胞和Treg细胞几乎保持不变，证实了先前的研究。12

    值得注意的是，我们观察到HBsAg水平与naïve CD8显著正相关+定量HBsAg与中枢记忆和效应记忆CD8呈显著负相关+T细胞。由于HBsAg数量与年龄呈负相关，这些T细胞群的差异最有可能归因于患者的年龄。27 28

    接下来，我们在这里表明，hbv特异性T细胞功能，通过体外对肽刺激的反应来测量，也与HBsAg的数量无关。这最初不同于最近的一项研究，该研究记录了显著较高的hbv特异性多功能CD4+低HBsAg水平(<500 IU/mL)患者与高HBsAg水平(>50 000 IU/mL)患者的T细胞比较13但年龄对T细胞反应的影响未被考虑。正如在这里和其他研究中观察到的，6日12HBsAg水平与年龄呈负相关，因此hbv特异性T细胞反应，特别是pol CD4+在我们的研究中，反应与年龄呈负相关。勒伯特最近的一项研究等是第一个提出与特定时间点的HBsAg量无关，而是与T细胞对表面抗原的特异性反应相关的感染持续时间和抗原暴露时间。12然而，勒伯特等在他们的研究中显示，针对HBV核心和HBV pol的特异性T细胞并没有随着年龄的增长而减少。值得注意的是，他们的队列更具异质性，包括来自亚洲和欧洲(英国)的年轻hbeag阳性和hbeag阴性患者的混合。12我们的队列只包括来自欧洲的成年hbeag阴性患者，并且表面特异性T细胞反应已经几乎不存在。此外，大约32%的患者接受了NA治疗，但接受NA治疗的患者在年龄组中分布均匀。

    然而，我们工作的主要焦点是分析HBcrAg水平的免疫反应，因为HBsAg可能不是cccDNA转录活性的最合适标记物，特别是在hbeag阴性患者中16日17因为综合HBV DNA可能是该人群中HBsAg的主要来源。6 29尽管hbeag阴性患者的HBV DNA水平较低，但细胞核的胞浆内表达可能较高。30.在成人HBeAg阴性人群中，HBcrAg可以解释HBeAg和核心，因此可以使差异独立于HBsAg水平，与核心特异性和极点特异性免疫反应相关;事实上，我们发现低HBcrAg (<3.87 Log U/mL)患者的hbv特异性CD4明显更高+T细胞的反应，特别是对核心和pol。重要的是，hbv特异性CD4+T细胞表现出比CD8更强的反应+一般的T细胞。hbv特异性CD4越强+T细胞反应已经被我们在其他项目中观察到。19有一种可能是一些潜在的CD8+由于用15 mer OLPs刺激细胞，未检测到T细胞反应。31重要的是，CD4+T细胞似乎比CD8更能抵抗与年龄相关的表型和功能变化+T细胞。32这可能有助于解释CD4的年龄相关性+T细胞反应较强，CD8年龄相关性显著+T细胞在成年人群中已经丢失。

    为了进一步了解hbv特异性CD8的表型和功能+在T细胞中，我们使用基于MHC I糊状物的富集来检测hbv特异性CD8的低频率+T细胞靶向两个已知的HLA-A*02限制性表位，HBV核心18和乙肝病毒pol455HLA-A*02阳性CHB患者。与最近的报道一致，22日23日我们证实这两种表位特异性CD8+T细胞表现出不同的表型，具有更高的功能和更高的PD-1表达+和PD-1+/ CD127+(记忆样表型)在核心18-特异性与pol相比455特殊技能CD8+T细胞。在这里，我们展示了这些核心之间的差异18-特异性和pol455特殊技能CD8+T细胞不受个体患者血液中HBsAg或HBcrAg含量的实质性影响。因为表面特异性CD8的检出率极低+在慢性HBV感染患者的T细胞中，我们无法研究HBsAg和HBcrAg对CD8表型的影响+T细胞靶向表面抗原的表位。更全面的研究分析hbv特异性CD8+T细胞受其他HLA I类分子和hbv特异性CD4的限制+受HLA II类分子限制的T细胞仍然需要。将病毒标记物与肝内T细胞反应联系起来也很有趣，这在我们的研究中是不可能的。

    HBV特异性T细胞在CHB患者中表现出衰竭表型，恢复T细胞功能可能是控制HBV的有效治疗策略。9尽管HBsAg水平不影响hbv特异性T细胞反应，但我们证明从低HBsAg患者分离出的T细胞对PD-L1阻断更敏感。与之前的报告一致，13我们观察到PD-1阻断在hbv特异性CD4中有更强的作用+T细胞比hbv特异性CD8更明显+T细胞。有趣的是，在去除年龄的影响后，我们发现HBsAg残差与CD4呈显著负相关+以及CD8+PD-L1阻断后T细胞恢复。这证实了一个假设，即减少HBsAg可能是一个治疗靶点，以提高免疫疗法的功能性治愈率。5重要的是，PD-L1阻断效果的差异在HBcrAg分层的患者队列中比在HBsAg分层的患者队列中更为明显。因此，对检查点阻断反应最好的HBsAg水平较高(1000-10 000 IU/mL)的患者HBcrAg水平异常低<3 Log U/mL，这表明这些患者的HBsAg可能来源于整合的HBV DNA。此外，值得注意的是，PD-L1阻断在核心特异性和极点特异性免疫应答中的作用更为明显，这与Le Bert的研究再次相似等，12可能表明HBsAg暴露的持续时间已经太长，hbbs特异性T细胞更难复活。因此，这些数据可能表明cccDNA转录活性的程度和持续时间可能在T细胞的复苏能力中发挥重要作用。同样，在HLA-A*02阳性患者队列中，我们仅在低HBsAg和低HBcrAg组中观察到PD-L1阻断的作用。有趣的是，只有pol455特殊技能CD8+PD-L1阻断后t细胞反应显著恢复。它已经显示和讨论了pol455-特定和核心18特殊技能CD8+T细胞具有不同的表型，核心特异性T细胞的扩增与PD-1正相关+/ CD127+T细胞，而pol455特异性T细胞则没有这种相关性。22我们也确认了更高的PD-1+/ CD127+核心表达18-特异性T细胞。因此我们假设这个核18特殊技能CD8+T细胞不像pol那样受损455因此，额外的免疫检查点封锁可能不会对扩展能力产生重大影响，并最终影响核心的功能18-特异性T细胞，而pol455如果HBsAg和HBcrAg水平较低，检查点阻断可以恢复特异性T细胞。然而，PD-L1阻断对不同表位反应的差异影响需要进一步研究，这可能对免疫疗法的发展很重要。基于我们的研究结果，我们认为降低抗原水平(HBsAg水平低于阈值<100 IU/mL，特别是HBcrAg水平低于3 Log U/mL)可能会增加体外免疫调节的反应性。重要的是，这种影响与年龄无关。一些临床研究表明，非常低的HBsAg水平阈值<100 IU/mL表明免疫力提高。的确，HBsAg水平<100 IU/mL可以作为识别患者自发或治疗诱导HBsAg清除概率较高的标记。6此外，一些回顾性研究表明，一些HBsAg水平非常低的患者(<100 IU/mL)6或低HBcrAg水平33在终止NA的长期抗病毒治疗后能够维持HBV的控制。这一结果也与小鼠模型的研究结果一致，这些研究表明，通过单克隆抗体清除HBsAg在一定程度上降低了hbv诱导的耐受性，并提高了B细胞和CD4+T细胞对随后治疗性疫苗接种的反应34使用小干扰RNA减少HBsAg分别提高了后续治疗性疫苗接种的反应。5

    本研究的一个可能的局限性是，它是在18岁以上成年患者的横断面队列中进行的。对儿童和青少年患者的影响可能更为明显。12由于大多数慢性乙型肝炎患者是在儿童时期发展成慢性感染的，35需要进一步收集慢性HBV感染儿童和青少年的数据，以评估不同HBV病毒标记物对HBV特异性T细胞功能和表型谱的长期影响。

    我们还需要讨论ALT水平升高所表明的肝脏炎症也可能导致hbv特异性T细胞反应的改变和受损，例如，炎症肝脏中精氨酸的缺乏可能是CD8 T细胞信号和功能缺陷的机制。36然而，在我们的队列中，ALT水平仅在少数患者中升高，且与T细胞反应不相关。

    总之，我们的数据表明，在成人hbeag阴性患者中，HBsAg的数量本身并不影响总免疫细胞的组成或hbv特异性T细胞的表型和功能。然而，年龄可能反映抗原暴露的持续时间，HBcrAg被认为是cccDNA转录活性的更好指标，可能对T细胞反应有重要影响，因此应被视为患者选择的重要分层因素。重要的是，非常低的抗原水平可能会影响T细胞对免疫调节治疗的反应(如检查点抑制)。因此，联合降低抗原负荷(包括HBsAg，特别是HBcrAg)与检查点抑制剂如PD-1/PD-L1阻断剂或其他治疗性免疫干预措施可能是未来治愈慢性HBV感染的一种有前途的选择。

    数据可用性声明

    所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。根据审稿人2的要求，我们删除了一些多余的补充图。然而，数据总是可以被请求的。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    该研究得到了汉诺威医学院伦理委员会(伦理号:3374-2016)的批准。

    致谢

    补充图1是用BioRender.com创建的。

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    补充材料

    脚注

    • ARMK和MC是联合资深作者。

    • 贡献者EA、ARMK和MC负责研究的概念和设计。EA和MU-Q进行实验和数据分析。BM和BB贡献了乙型肝炎核心相关抗原分析。MG和YL支持统计学分析。CEN提供患者的临床资料。所有作者都对数据解释做出了贡献。EA, MU-Q, ARMK, HW和MC撰写了手稿。ARMK和MC负责整体内容。所有作者都批判性地修改了手稿。

    • 资金这项工作由德国卓越战略- EXC 2155 -项目号390874280下的德国Forschungsgemeinschaft (DFG，德国研究基金会)和德国感染研究中心DZIF (TTU‐05‐701,TTU‐05‐702,TTU- iich -07-808)资助。Elmira Aliabadi和Melanie Urbanek-Quaing得到了汉诺威生物医学研究学院(HBRS)和感染生物学中心(ZIB)的支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。

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