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背景:小肠上皮屏障的缺陷与炎症性肠病有关,但他们的角色在疾病的因果关系仍是一个有争议的问题。在某些疾病增加渗透率模型似乎是一个早期事件。白介素10 (IL10) gene-deficient小鼠自发发展结肠炎后12周的年龄。这些老鼠被证明有增加了小肠渗透性,在生命早期出现。此外,结肠炎的发展取决于腔的代理商,如动物不开发疾病如果在无菌条件下长大的。
目的:以确定小肠渗透性升高是可以预防的,如果这样做结肠疾病预防或减毒。
方法:IL10 gene-deficient (IL10−/−)小鼠)处理- 1001 (zonulin肽抑制剂),一个小肽之前证明减少小肠渗透性。小肠渗透性测定体内,每周从4到17周的年龄。结肠疾病评估在美国商会的8周,年龄在17周的炎症细胞因子和髓过氧化物酶测定结肠。结肠渗透率和组织学也端点。
结果:对待动物小肠渗透性显著降低。平均乳果糖/甘露醇时间曲线下的面积:5.36 (0.08 SE)控制vs 3.97 (0.07 SE)在高剂量- 1001组,p < 0.05。在8周的年龄有显著减少结肠黏膜渗透性和电阻增加。17周的年龄,分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)从结肠外植体显著低于治疗组(106.93 vs 25.33 (4.30 SE) pg /毫克(17.51 SE) pg / ml控制,p < 0.01)。所有其他标记还演示了一个清晰的还原治疗结肠炎的动物。额外的实验表明,在- 1001只在小肠功能活跃。
结论:这项工作表明,肠道通透性的增加可能是一个重要的病原学的事件在IL10结肠炎的发展−/−老鼠。
来自Altmetric.com的统计
增加肠道通透性提出了几十年来是全身性疾病的一个原因。在一些自身免疫性疾病如糖尿病,克罗恩氏病和腹腔疾病,增加肠道通透性被认为是早期疾病的功能。在克罗恩病、肠通透性增加肠道non-inflamed部分中描述的,以及在健康患者的直系亲属,这表明这个缺陷可以独立于炎症的发生。1- - - - - -5然而,是否这是一个偶发症状,疾病或一个关键的步骤,它的早期表现疾病发病机制是未知的和有争议的问题。
肠道屏障功能包括动态和复杂的结构位于肠道上皮细胞之间的连接。这些连接打开和关闭不断在生理反应6- - - - - -8和pathogen-induced刺激。9- - - - - -10的生理途径之一涉及肠道通透性增加zonulin通路。这个途径是假定后,观察细菌病原体之间的交互霍乱弧菌和肠上皮屏障。几个这种细菌产生的毒素之一,该zonula occludens毒素(ZOT),肠道通透性增加。这种哺乳动物毒素及其同系物zonulin被认为在肠上皮细胞顶膜受体结合。11激活这个途径启动细胞内的信号级联反应涉及紧密连接蛋白的磷酸化paracellular的开放空间。12Zonulin分泌调节在腹腔疾病的报道,131型糖尿病14疱疹样皮炎。15有人建议,合成增加小肠渗透性中观察到这些条件是次要zonulin分泌和在这些疾病的发病机制可能是重要的。
合成八肽氨基酸对应的受体结合主题zonulin zonulin抑制剂合成。这zonulin肽抑制剂(- 1001)竞争力块顶端zonulin受体和防止zonulin打开紧密连接的二级。11这只抑制被认为发生在小肠ZOT / zonulin受体被发现在空肠和回肠末端,但不是在结肠。16我们选择使用这种化合物,鉴于长期供水,以确定是否增加小肠渗透性可以预防白介素10 (IL10基因缺陷−/−)鼠标。
这款鼠标的发展参差不齐,慢性结肠炎类似于人类的克罗恩病。17从本研究的角度来看,IL10−/−疾病小鼠模型有两个重要特征。首先,这些动物被描述为从早期小肠渗透性增加之前在生活和疾病的发作。18第二,疾病发展是依赖于腔的因素;它没有发生在动物在无菌条件下长大的。这些观察表明,结肠炎中观察到这些动物可能成为异常的结果小肠渗透性增加的腔的经纪人表示粘膜免疫系统。这是一个假设,我们曾提出了其他一些自身免疫性疾病。19
也许最好的证据表明肠道通透性增加有一个在自身免疫性疾病病原学的作用来自于BB的糖尿病大鼠模型。在这些动物自身免疫性1型糖尿病发展自发地在动物喂食正常饮食,但与水解饮食是可以预防的。之前我们已经表明,这些动物增加了胃和小肠渗透性即使收到水解的饮食。20.此外,糖尿病动物食用的表达正常的饮食也可以预防废除肠道通透性的增加和zonulin受体拮抗剂- 1001。21这些数据强烈建议,至少在这个动物模型的自身免疫性疾病,饮食抗原可以启动疾病通过一个机制,包括胃肠道渗透性增加。它还提供了支持这一概念,可能有新颖的手段防止某些自身免疫性疾病的目标增加肠胃渗透率。
因此,本研究的目标是2倍。首先,我们希望确定之前报道泄漏的小肠可以预防治疗IL10−/−动物zonulin受体抑制剂。第二,如果我们能阻止小肠渗透性的增加这些动物中观察到这预防或改善后续的结肠炎?
材料和方法
动物
纯合子IL10−−/老鼠上生成一个129 Sv / Ev遗传背景,和129 Sv /电动汽车控制被安置在特定的无菌条件下,直到断奶(3周),当他们搬到传统的动物住房。老鼠被安置在高效微粒空气HEPA过滤器笼子和美联储标准鼠标chow饮食。这些老鼠繁殖和饲养在动物设施在阿尔伯塔大学的。
药物治疗
IL10−/−3.5周和129岁的老鼠Sv /电动汽车控制随机分成四组每组(n = 10 - 13)。从4周,两组IL10−/−老鼠接受在他们的饮用水- 1001,而一群IL10−/−老鼠和一群129 Sv /电动车老鼠没有接受治疗。两个治疗组的饮用水被溶解准备每天0.1毫克/毫升(低剂量)或1.0毫克/毫升(高剂量)在过滤蒸馏水- 1001。安慰剂组每天喝蒸馏水准备过滤。小鼠治疗直到17周的年龄,当他们被颈椎错位。
在不同的实验中,10-12-week-old IL10−/−老鼠和129 Sv /电动车老鼠鉴于zonulin受体激动剂在- 1002(1毫克/毫升)或在- 1002和- 1001(1毫克/毫升)的饮用水一对照组24 h。给出了牛血清白蛋白(1毫克/毫升)。老鼠置于代谢笼在这24小时收集尿液。
在- 1001,- 1002提供的优雅Alba疗法(巴尔的摩,马里兰州美国)整洁,粉的化学物质。
我们室试验
老鼠被杀死在8周的年龄由颈椎错位和一段结肠切除。粘膜是安装在有机玻璃室暴露黏膜和浆膜表面10毫升的含氧克雷布斯缓冲区(115年更易/ l:氯化钠,氯化钾,1.25 CaCl21.2 MgCl22 KH2阿宝4225 NaHCO3;pH值7.35)。缓冲区被维持在37°C通过加热水套和传播有限公司2/ O2。果糖(10更易/ l)添加到浆膜和粘膜。基底甘露醇通量的测量,1更易/ l的甘露醇370 KBOr的3H是添加到粘膜。自发transepithelial电位差(PD)决定,组织是夹在零电压通过不断引入一个适当的短路电流自动电压钳(" 1000年世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)。组织耐离子(1 / G), G是电导,电位差和短路电流的计算根据欧姆定律。22
体内磁导率测量
每周一次,所有老鼠都安置在代谢笼后4 h后立即快速的食物和水,填喂法0.2毫升糖探针含有100毫克的蔗糖,12毫克的乳果糖,8毫克的甘露醇和6毫克的三氯蔗糖。补偿4 h没有zonulin抑制剂治疗,实验老鼠30µl,吸管,解决方案的含有0.083毫克(低剂量)或0.83毫克- 1001(高剂量),45分钟之前将他们放置在代谢笼。安慰剂组收到30μl过滤蒸馏水。尿液收集后的动物被放置在各自的笼子里,和提供食物和水。
从每个动物尿液收集22 h收集管,处理100µl麝香草酚10%解决方案(1.0克/ 10毫升异丙醇)和石蜡油(100µl防止尿液蒸发)。样本被冻结在−70°C到分析。所有糖都是量化的离子交换高效液相色谱法(HPLC)如前所述。23短暂,纤维二糖添加作为内标,尿液是透过0.4µm过滤和稀释。样本deionised然后注入在Dionex MA-1离子交换柱(Dionex,加州桑尼维尔,美国)。糖被筛选了与氢氧化钠0.4毫升/分钟的流量。峰值检测Dionex高效液相色谱使用脉冲测量电流的检测和量化的峰值区域。最终的数据被报道为部分分泌物(蔗糖和蔗糖素)或分数比排泄物(乳果糖/甘露醇)。部分排泄的分数被定义为强饲法剂量尿样中恢复。
三氯蔗糖也化验了高效液相色谱法。分离是通过使用Dionex Ionpac NS1列和acetonitrile-water洗脱液的流量1毫升/分钟。与电化学检测器检测进行了时尚与其他糖类。对于这些化验,phenyl-β——使用的内部标准d-thiogalactoside(σ化工、奥克维尔,安大略省,加拿大)添加到最初的尿液样本浓度为0.1毫克/毫升。
粘膜细胞因子分泌
4、8和17周的年龄,结肠器官文化是从控制老鼠,准备IL10−/−老鼠,IL10−/−老鼠在- 1001处理。因为在IL10结肠炎的不自然−/−老鼠冒号被移除,用PBS刷新,四分之一的组织在组织培养板减少纵向和resuspended(猎鹰3046;实验室的器具,正欲林肯公园,新泽西,美国)在RPMI 1640补充10%胎牛血清,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100 U /毫升)。文化在37°C 5%孵化有限公司2。24小时后,上层的收获和储存在−70°C细胞因子水平的分析。丸是4天,体重晾干。TNFαIFNγ水平细胞上清液测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Medicorp,蒙特利尔,魁北克,加拿大)。
髓过氧物酶测定
在17周的年纪,一段结肠的所有的动物被解剖后,称重和立即瞬间冷冻。样本保存在−70°C到髓过氧化酶(MPO)浓度测定。结肠组织MPO水平测量使用酶联免疫试剂盒(美国马萨诸塞州细胞科学、广州)。
组织学损伤分级
牺牲后,近、中、远端回肠结肠和全被收获,固定在10%磷酸盐福尔马林。这些样品是嵌入在石蜡在托托,在4μm切片,与苏木精和伊红染色,光学显微镜检查。综述了幻灯片蒙蔽的方式由一个病理学家(JSD)和被分配一个组织学得分从Saverymuttu肠道炎症使用方案修改等。24
统计分析
数据表示为(SEM)方法。用图基组之间比较用方差分析测试事后比较。所有计算都使用Graphpad Prism 3.0,执行和意义被认为在p < 0.05。
结果
磁导率
以确定是否存在主要渗透在IL10缺陷−/−老鼠,我们检查了小肠渗透性从4到17周的年龄和野生型小鼠相比。的IL10−/−老鼠从4周开始增加小肠渗透性比Sv /电动车129野生型小鼠(图1)。促炎细胞因子IFNγ和TNFα已经证明是结肠的升高这种动物在结肠炎的存在。18为了确定小肠渗透性缺陷之前结肠炎,我们测量这些细胞因子的分泌在结肠4、8和17周的年龄。所示图1 b, C的IL10−/−和野生型老鼠产生类似水平的IFNγ和TNFα4和8周但是他们的细胞因子分泌水平明显在17周的年龄更大,当动物表现出结肠炎。显然,异常小肠渗透性之前结肠炎符合这一标准的发展。
来决定是否增加小肠渗透性是zonulin依赖动物在- 1001处理。当日常饮用水的zonulin拮抗剂- 1001是有效地减少IL10小肠渗透性−/−老鼠(图2)。治疗4周后,大剂量- 1001减少小肠渗透性控制动物中观察到的水平。这可以从8周的年龄(图2)。动物接受低剂量- 1001显示显著减少整体渗透率(表示为渗透率曲线下的面积)相比安慰剂组(图2 b),但这一剂量不返回小肠渗透到正常水平(图2)。
类似的衰减效果观察组织学检查。这些结果说明图7。中可观察到明显的炎症IL10−/−老鼠是类似于观察那些与低剂量的治疗- 1001。然而,这些动物接受高剂量的化合物有显著减少组织学得分,不过仍明显大于中观察到的分数控制动物。
的影响在减少小肠渗透性- 1001还在8周的年龄明显体外。证明了在图3小肠渗透性,甘露醇和电阻决定在美国腔。在- 1001有效减少剂量的渗透率在小肠甘露醇(图3)。此外,电阻的损失,IL10观察−/−动物,是防止高剂量治疗组,但不是低剂量治疗组(图3 b)。
炎症
测试是否减少小肠渗透性会影响结肠疾病的发展,我们评估结肠疾病的几个参数。在整个实验过程中我们方法确定上皮结肠损伤用口头管理三氯蔗糖的间隙。结肠炎的额外标记包括体外结肠渗透率在8周的年纪,在17周的年龄,结肠细胞因子分泌,MPO内容和组织学。
在8周的年龄结肠渗透率IL10甘露醇是增加−/−动物相应的电阻下降。这些变化在很大程度上预防和治疗动物的野生型老鼠两治疗组显示出类似的结果(图4 a, B)。这表明结肠疾病的初步证据,在IL10观察−/−老鼠,是预防或延迟治疗在- 1001。
结肠损伤测量每周使用蔗糖素排泄(图5)。IL10−/−老鼠和控制分泌类似数量的三氯蔗糖尿液中直到10周,之后他们开始显示大量的蔗糖素升高(图5)。IL10−/−动物有显著增加累积损伤比野生动物(图5 b)。两治疗组明显比IL10损害较少−/−动物,但仍显著高于野生型组。在- 1001治疗似乎已经大大改善,但不能完全阻止结肠疾病由这个参数决定。
在17周的年纪,IFNγ和结肠TNFα分泌明显减少在治疗组中- 1001。只有IL10−/−组显示显著增加细胞因子分泌率相比,野生动物(图6 a, B)。结肠嗜中性粒细胞浸润,以组织MPO内容(图6 cIL10)增加−/−和低剂量- 1001小鼠相比控制但并不显著增加在高剂量治疗组。综上所述,这些数据表明,在治疗- 1001,活跃在小肠是有效地减少结肠炎症中观察到这些动物。
代表提出了结肠组织学的例子图7。上面板是在××20放大而降低40。在图7 b、面板a / b说明了组织学特性背景中观察到的动物只有少量炎症细胞在固有层。这与IL10−/−老鼠板c / d所示有显著增加炎症细胞室。面板e / f和g / h代表部分取自动物的低和高剂量治疗- 1001,分别。可以欣赏,炎性变化观察到这些动物是不到那些IL10−/−老鼠。
有人建议,在结肠zonulin受体缺失;然而,工作是做兔子,不是老鼠。16因此,排除这个途径的可能性存在于结肠的影响在我们的实验观察到的结果是药物在结肠,我们进行了功能分析测试的存在zonulin效应在结肠内使用zonulin肽受体激动剂(- 1002)。中观察到图8挑战与该代理后,只小肠渗透性增加,而蔗糖素排泄保持不变。这是真正的为IL10−−/和野生型老鼠。使用浓度增加- 1002我们能够证明,乳果糖/甘露醇比率的增加在没有剂量,剂量依赖和溶解度的限制在- 1002,我们观察到的任何影响结肠(数据未显示)。当野生型和IL10−−/动物被处理的组合在- 1002,- 1001和小肠渗透性的增加被废除,证明在- 1002增加的影响小肠渗透性可以预防或被同一代理我们在先前的实验中使用。
讨论
克罗恩病的病因学是知之甚少。然而,它提出了三个主要的功能必须出现疾病的发生:(1)基因易感粘膜免疫系统;(2)抗原、促炎症化合物在肠道,会引发敏感的免疫系统;和(3)肠道屏障功能的改变使得这抗原接触粘膜免疫系统。19在这方面缺乏IL10鼠标是一个有趣的人类克罗恩氏结肠炎模型。它不开发结肠炎没有肠道菌群,表明一个或多个组件在极其复杂的植物开发炎症触发易感粘膜免疫系统。
本文提供的实验提供证据表明,在小肠屏障功能IL10结肠炎发生的是必要的−/−鼠标。克罗恩氏病和其他动物模型,包括衰老加速倾向鼠标(桑普)和鼠标腺瘤中表达下调(mdra)缺乏鼠标显示增加小肠渗透性之前疾病表达式。25- - - - - -27本研究扩展了这些观察的一个重要的方式证明逆转这一障碍缺陷可以减弱这种疾病,这意味着增加渗透率不仅仅是一种附带现象而是是一个重要的病原学的事件。
我们体内小肠渗透性测量显示,这些老鼠证明异常小肠渗透性在4周的年龄,这是早我们可以测量的时间点。事实上之前已经证明了这个缺陷可以通过体外检测技术在2周的年龄,在缺乏组织学损伤。25在这项研究中,我们测量了促炎细胞因子的分泌疾病的标志,2528和这个标准表明,增加小肠渗透性发生疾病。
正常的胃肠渗透率是严格监管机制,在大多数情况下,未知。然而,最近的研究表明,一个生物通路,调节涉及zonulin渗透率。似乎这种激素分泌腔和激活一个顶端受体启动一连串的事件紧密连接。这个途径的识别也为药理操纵提供了一个机会增加这个途径的渗透率与值得注意。因为zonulin受体不是存在于结肠上皮细胞,16药物通过这种机制不应该工作在结肠的影响。确认这是真的在我们的老鼠,我们测试是否zonulin-mediated事件可能引发结肠相同的条件下,用于我们的实验。我们使用在- 1002,肽- 1001很相似,但zonulin受体的激动剂,并发现,在高浓度只能增加小肠渗透性。此外,当受体激动剂和拮抗剂有小肠渗透性的变化是预防,建议他们通过同样的途径。这些数据表明,zonulin受体小鼠的结肠中不存在(如兔子所述),但我们不能排除这样一种可能性,即肽只是退化在小肠的交通。然而,无论哪种解释是正确的,这些数据表明,结肠炎在这项研究中观察到的衰减在- 1001治疗后在小肠由于其效果。
重要的是要认识到,在我们的实验中虽然结肠炎是改善不废除。即使在治疗动物仍有轻度炎症的组织学证据以及MPO积累。有几种可能的解释。首先,动物只接受治疗4周的年龄和小肠渗透性不是沦落到“正常”到8周的年龄。动物断奶后从他们的母亲在3 - 4周的年龄很难发起这种疗法更早。然而,我们知道,渗透率存在缺陷2周时,这意味着我们没有完全消除这种潜在的炎症刺激。第二,完全有可能,结肠疾病的动物模型不仅是由小肠检查发生的事件,但也通过直接交互的结肠菌群IL10缺乏免疫系统。因此,减少抗原表达在小肠可能不完全废除疾病细菌组件仍然可以诱导分泌的促炎细胞因子结肠炎症和延续。829日
总之,我们相信,这些实验数据支持的假设,在一个基因感染主机、小肠渗透性增加可以促进炎性疾病的感应。在BB鼠胰岛细胞,表达的疾病20.并减少异常渗透率之前这种疾病在- 1001能改善糖尿病。21目前的研究已经扩展这些观察IL10的证明−/−鼠标不正常小肠渗透性不仅先于结肠炎的发展也是病原学的重要。减少小肠渗透性在- 1001明显变弱结肠炎。
确认
我们要感谢KR公园和F张在高效液相色谱分析技术帮助和动物。我们也感谢T特纳帮助成像和阿尔巴制药科学家们的帮助在药物制剂和输入。
引用
脚注
资助:这项工作是由一个从加拿大健康研究所的慷慨资助。
利益冲突:JM是阿尔巴疗法的科学顾问委员会的成员。其他作者没有利益冲突。
伦理批准:本研究中使用的老鼠繁殖和饲养在动物设施在阿尔伯塔大学的。所有动物进行了程序依照协议批准机构动物保健和使用委员会。
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