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摘要
客观的1型糖尿病(T1D)的特征是胰岛自身免疫和β细胞破坏。肠道微生物-免疫的相互作用参与了T1D的病理生理学。我们利用粪便微生物群移植(FMT)研究了1型糖尿病患者中微生物群介导的疾病进展的作用。
设计近期(<6周)T1D患者(18-30岁)被随机分为两组，在4个月的时间内接受3个自体或同种异体(健康供体)FMTs。我们的主要终点是在12个月内通过混合餐试验评估受刺激的C肽释放的保存。次要结局参数为血糖控制、空腹血浆代谢物、T细胞自身免疫、小肠基因表达谱和肠道菌群组成的变化。
结果在12个月时，自体FMT组(n=10名受试者)与健康供体FMT组(n=10名受试者)相比，受刺激的C肽水平显著保持。小肠普氏菌与β细胞残留功能呈负相关(r=−0.55,p=0.02)，而血浆代谢物1-花生四烯醇- gpc和1-豆荚醇-2-花生四烯醇- gpc水平与β细胞残留保存呈线性相关(rho分别为0.56,p=0.01和0.46,p=0.042)。最后，基线CD4 +CXCR3+T细胞计数，小肠水平脱磷孤菌属猪在十二指肠活检中CCL22和CCL5基因表达预测FMT后保留的β细胞功能，而不考虑供体特征。
结论FMT在最近诊断为T1D的患者发病后12个月内阻止了内源性胰岛素分泌的下降。一些微生物来源的血浆代谢物和细菌菌株与保留的残余贝塔细胞功能有关。这项研究为肠道微生物群在T1D中的作用提供了见解。
试验注册号码NTR3697。
- 糖尿病
这是一篇开放获取的文章，按照创作共用署名4.0未移植(CC BY 4.0)许可发布，该许可允许其他人复制、重新发布、混合、转换和基于此作品的任何目的，只要原始作品被正确引用，提供许可证链接，并说明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
肠道菌群与人类代谢和自身免疫性疾病有关。
粪便微生物群的变化与人类1型糖尿病(T1D)有关。
动物研究表明，粪便移植可以改变T1D。
新的发现是什么?
粪便微生物群移植(FMT)稳定了新发T1D患者残留的β细胞功能。
这些差异变化伴随着血浆代谢物、T细胞自身免疫、小肠基因表达以及小肠和粪便微生物群组成的改变。
在人T1D中观察到与小肠基因表达和T细胞自身免疫有关的菌群菌株和血浆(靶向)代谢物变化之间的新的相关性。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这项研究有助于通过FMT量化新发T1D患者肠道微生物群驱动效应的大小。
这项研究为未来的试验提供了样本量，并强调了肠道菌群在T1D受试者中β细胞破坏中发挥作用。
简介
1型糖尿病(T1D)是一种以进行性β细胞破坏为特征的自身免疫性疾病。T1D的T细胞介导的自身免疫起源促使人们努力通过使用包括环孢素在内的免疫抑制药物来靶向T淋巴细胞，以防止疾病进展，1anti-CD3抗体治疗,2antithymocyte球蛋白3.抗cd80和抗cd86抗体治疗。4个5然而，这些治疗策略(最多)对疾病进展有暂时的影响，对长期进展没有影响，并伴有严重的副作用。6 7因此，迫切需要进一步了解T1D的病理生理学，以寻找新的治疗干预措施。
T1D病理生理与肠道菌群的改变有关。8 - 12对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的研究表明，肠道微生物与先天免疫系统的相互作用是T1D发生的关键因素13并可通过粪便菌群移植(FMT)和特定微生物来改善。14此外，越来越多的研究指向了小肠免疫系统的作用。例如，在NOD小鼠中，节段丝状细菌菌株通过与小肠固有层中的t辅助器17型细胞相互作用诱导自身免疫性糖尿病。15因此，大鼠胰腺导管系统输注菌株可以诱导T1D，其胰腺组织学结果与T1D患者观察到的结果相似。16此外，最近的一项研究表明(长期)人类T1D和健康对照受试者之间的小肠菌群和十二指肠基因表达有显著差异。17因此，T1D的发生被认为是由于肠道短链脂肪酸(SCFA)产生受损引起的肠上皮屏障功能的改变。18这种屏障可能是必要的，以防止免疫系统启动β细胞表位，有害细菌模仿19对它可能失去宽容。20.事实上，肠道内的SCFAs丁酸酯和醋酸酯被证明可以改善NOD小鼠的β细胞功能。21然而，我们最近进行了一项人类干预研究，丁酸盐对T1D受试者的免疫或代谢影响很小。22最后，FMT被证明是安全的，可以显著改变受体肠道菌群组成(增加产生丁酸盐的菌株)，并可以影响代谢综合征受试者基于基线菌群的血糖控制。第23 - 25因此，这项针对近期发病T1D受试者的探索性随机对照FMT试验旨在研究积极FMT治疗期间(0-6个月)健康供体(异体)FMT或自身(自体)FMT的顺序治疗对剩余β细胞功能(混合餐试验(MMT)刺激的C肽反应)的影响以及长期效应(0-12个月)。此外，我们还研究了这些新发T1D成人患者的十二指肠菌群组成、十二指肠基因表达、粪便菌群系统发育和宏基因组组成、全血T细胞自身免疫和空腹血浆代谢物变化的关系。研究设计的图解摘要载于图1A及B．
研究概述。(A)研究示意图，显示所进行的分析。(B)研究时间线显示FMTs在0、2和4个月进行，并在每个随访时间点进行分析。(C)空腹C肽随时间的变化。箭头表示何时进行FMT(异体:蓝色，自体:粉色，色带宽度指示SD)。丝带表明独联体。显著性计算采用LMM(见方法)，*** p=0.00019。使用Student 's t检验计算各组间各时间点的P值，9个月时P =0.028, 12个月时P =0.0049。(D) C肽AUC随时间的变化。显著性用LMM计算，**** p=0.000067。 P value calculated using a Student’s t-test between groups at 12 months was p=0.033. (E) Change in A1c over time. Significance was calculated using LMM, p=0.12. P value calculated using a Mann-Whitney U test between groups at 12 months was p=0.19. SDs are depicted by the coloured width in the respective figures. (F, G and H) Individual trend lines for fasting C peptide, C peptide AUC and A1c respectively. AUC, area under the curve; FMT, faecal microbiota transplantation; LMM, linear mixed model; T1D, type 1 diabetes.
材料和方法
病人招聘
新发T1D患者是从阿姆斯特丹地区的门诊招募的。年龄在18-35岁、体重指数(BMI)正常(18.5-25 kg/m²、抗gad /IA-2阳性)的受试者在被诊断为T1D、纳入前最长时间为6周、MMT后仍有β细胞功能残留(血浆C肽>0.2 mmol/L和/或>1.2 ng/mL)时入选。排除标准为在过去3个月内有其他自身免疫性疾病的诊断或症状、免疫力低下、使用过任何全身药物(胰岛素除外)和使用过抗生素或质子泵抑制剂。
粪便供体招募，随机和FMT程序
精益(BMI <25 kg/m2)、杂食性、健康的白人男性和女性被招募来作为粪便捐赠者。选择标准在在线补充方法．受试者在0、2和4个月时，采用计算机随机分配的方式，以1:1的方式接受三种自体或异体粪便移植，这些粪便由鼻十二指肠管使用新鲜产生的粪便(图1 b)来自于先前描述的同性匹配的捐献者24详细内容见在线补充方法．所有患者和调查人员都对治疗分配进行了隐瞒。
主要和次要端点的分析
每个研究访问的详细描述可以在在线补充方法．在0、2、6、9和12个月时进行混合餐试验(残余beta细胞功能)、肠道菌群分析和免疫分析，包括荧光激活细胞分选、淋巴细胞刺激试验(LST)和人白细胞抗原多聚体分析，以列举CD8 T细胞对胰岛自身抗原的自身免疫(CD8量子点(QDot))。在0、6和12个月时测量靶向血浆代谢物(Metabolon, Morrisville, North Carolina, USA)。0个月和6个月时行胃十二指肠镜及十二指肠活检以评估小肠菌群，并进行定量反转录PCR以评估十二指肠基因表达(见在线补充表1)．在所有时间点进行生物特征测量和血糖参数(图1 b)．有关这些分析技术的详细描述，请参阅在线补充方法．
功率计算
在12个月时，每组17例患者(共34例)需要提供80%的功率来检测混合餐试验(MMT)刺激的C肽曲线下面积(AUC)的50%差异(360 mmol/L/min vs 180 mmol/L/min, SD为170 mmol/L/min)26日27日在α=0.05条件下进行双面检验，并假设10%的退出率。之所以选择这个分界点，是因为它是T1D研究中已经确定的分界点，通常被T1D的其他干预研究所采用。27所有分析均基于预先指定的意向治疗队列。对主要终点、文本和图中提到的免疫参数以及粪便菌群和代谢物进行了完整的病例分析。其他(次要)端点的缺失值被假设为随机或完全随机缺失。关于缺失值的详细信息可在在线补充方法(在“缺失值”的小标题下)。试验的主要终点是与基线(0个月)相比，在6个月和12个月时(MMT刺激)C肽释放的保存。之所以选择这个主要终点，是因为本研究主要关注肠道菌群对β细胞功能的影响。虽然有更好的临床标记物来监测糖尿病治疗效果，如糖化血红蛋白、稳态模型评估(HOMA)或每日胰岛素单位数，但这些都受内源性胰岛素分泌和饮食、胰岛素顺应性和胰岛素抵抗的影响;因此，我们不认为这些标记是我们研究的主要终点。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》(2013年更新版)在医学学术中心(阿姆斯特丹)进行的。所有参与者都提供了书面知情同意。该研究在荷兰试验登记处进行了前瞻性注册(https://www.trialregister.nl/trial/3542)．患者的安全由一个独立的数据安全监测委员会(DSMB)保护。患者没有参与到研究过程中。
结果
研究纳入了2013年至2017年的患者。新发T1D患者(由其治疗医师转诊)被随机分配到供体FMT (n=11名受试者)或自体FMT (n=10名受试者)。在进行FMT干预前，一名参与者在第一次研究来访后撤回了同意书。由于缺乏资金，在20名受试者登记并完成研究方案后，试验停止了。基线特征见表1．7名健康瘦弱的供体(其中3名被使用了两次)捐献给新发T1D患者进行异体肠道菌群转移，同一名供体被用于一个T1D患者的连续三次FMTs。两组在基线时无差异，在整个随访期间，所有受试者对胃肠病学干预均有良好的耐受性。此外，没有观察到严重的临床不良事件或血浆生化不良变化。
与异体FMT相比，自体FMT保留了(受刺激的)C肽水平
两组间空腹血浆C肽基线平均值相似(自体组为319 pmol/L±118 (SD)，异体组为327±89;p=0.86, Student 's t检验)，但自体FMT组与异源FMT组相比，在12个月时保存完好(348 pmol/L±115 vs 202±85,Student 's t检验p值=0.0049;线性混合模型(lms) p=0.00019，图1C及F)．通过受刺激的C肽反应AUC表达的残余β细胞功能也有类似的影响，在基线时(自体组为77 mmol/L/min±21 mmol/L/min，异体组为78±33 mmol/L/min)相等;p=0.92, Student 's t检验)，但自体FMT术后12个月的保存率显著提高(85 mmol/L/min±27 vs 53±33,Student 's t检验p值=p=0.033, LMM p值=0.000067，图1D和G)．不出所料，在T1D诊断后开始外源性胰岛素治疗后，自体和异体FMT组在12个月时A1c水平均下降。每天提供相似量的外源性胰岛素(0.47 IU/kg/天vs 0.45 IU/kg/天，p值分别为0.71)。与异体FMT组相比，自体FMT组的血糖控制没有明显改善(A1c 46 vs 53.5 mmol/mol, p=0.19, Mann-Whitney U检验(MWU) p=0.19, LMM p值=0.12，图1E和H)．0、6和12个月时的糖代谢参数见表2．最后，体重、粪便钙保护蛋白、微量白蛋白尿、脂质状况和饮食摄入量(单独评估总热量、脂肪、饱和脂肪、蛋白质、碳水化合物和纤维)在基线时并无差异(表1)或在研究过程中(在线补充图S1A-E为膳食参数，S1F为体重)。
自体和异体fmt处理组的T细胞免疫变化相似
从全血中分析了广泛的先天和适应性免疫细胞表型样本(每组的基线中位数列于在线补充表S3)．单个T细胞对IA-2、GAD65和胰岛素前原(增殖试验和LST)的反应或胰岛自反应性CD8+ T细胞(Qdot)的血频率在研究时间点6个月和12个月时使用预测模型或MWU显示，治疗组间无显著差异。同样，胰岛自反应性CD8+ T细胞的频率在治疗组间无显著差异。此外，FMT没有引起流式细胞术定义的35个白细胞亚群频率的显著变化(在线补充图2)．值得注意的是，CD4+ CXCR3+细胞在组间有差异(p=0.01, MWU)。基线和12个月之间的变化与我们的主要终点C肽AUC的变化呈负相关(p=0.046, rho=−0.47)(在线补充图3A-C)．CD8+ CXCR3+细胞在基线时各组间存在差异(p=0.0076, MWU)。CD8+ CXCR3+细胞变化在两组间也有差异;然而，这与C肽AUC (在线补充图3D-F)．
FMT的治疗分配与(小)肠肠道菌群组成和血浆代谢物的变化有关
在基线时，各组间小肠菌群α多样性无显著差异。6个月时，同种异体FMT组与自体FMT组之间存在边缘性显著差异(p=0.054)，异体FMT组的多样性显著增加(p=0.009;图2一个)．当沿着冗余分析(rda图)的排序轴绘制时，各组之间的小肠菌群组成在基线时聚集不同，在治疗组之间也发生了变化(图2 b)．FMT治疗组的分配可通过特异性小肠菌群(AUROC 0.89±0.18 (CI))的变化可靠地预测普氏菌而且链球菌oralis（图2 c)．然而，在门、科、属和种水平上的变化，小肠菌群的组成没有发生大的变化(在线补充图4)．这些物种的相对丰度在自体粪便移植后均有所下降，而在同种异体粪便移植后均有所增加(图2 d-f)．值得注意的是，的相对丰度普氏菌1组间有基线差异(p=0.033)。δ在两组间有显著差异普氏菌2(p=0.048)而不是普氏菌1(p = 0.069)美国oralis．此外，观察到显著的负相关普氏菌1相对丰度和受刺激C肽AUC (Spearman p=0.015, rho=−0.55，见图2 g)．值得注意的是，十二指肠基因表达的变化(在0和6个月时测量)不能可靠地预测治疗组的分配(AUROC为0.61±0.22)。
小的肠道菌群。(A)治疗组间Shannon多样性在基线和6个月时的箱线图，即随访时进行十二指肠活检。(B) rda图显示治疗组在基线和随访6个月时的聚集性。(C)最能预测治疗组分配分配的相对重要性前10个小肠菌群(XGBoost预测建模算法)。百分比会向设置为100%的最大值扩展。排名前四的菌群相对重要性较高。(D-F) FMT前后6个月小肠前三种菌群箱图。P值计算采用Mann-Whitney U检验。通过Mann-Whitney U检验计算各处理组之间的相对δ值((前后值)/前后值)之间的上p值“(delta)”。面板D:普氏菌1自动基线与allo基线p值=0.033，普氏菌1Allo基线与Allo 6个月p值=0.049，普氏菌2Delta auto与Delta allo p值=0.048，链球菌oralis自动基线与自动6个月p值=0.012。图G部分显示了我们的顶级微生物之间的斯皮尔曼相关性普氏菌1和我们的主要终点混合餐试验(MMT)刺激C肽释放。FMT，粪便菌群移植;RDA,冗余性分析。
粪便菌群在FMT过程中的变化
T1D和健康供体的粪便菌群组成在基线时不同，在治疗组之间也有差异(在线补充图S5A和B)．然而，alpha多样性在基线、6个月或12个月FMT治疗组之间以及供者和受者之间没有显著差异。组间在门、科、属和种水平上有一定的变化(在线补充图5)．基于0 ~ 12个月间粪便微生物群分类变化的分组分配预测显示AUROC为0.72±0.24。脱磷孤菌属猪在不同的治疗组中，最具分化性的菌株(在线补充图6A)．基于代谢途径预测的治疗组AUROC较差，为0.68±0.27。两个FMT组之间最具差异的代谢途径是硒-氨基酸生物合成途径(在线补充图6B)．有趣的是,大量的d .猪在随访6个月(p=0.024, MWU)和12个月(p=0.023)时，治疗组之间的差异(图3 a - b)．此外,改变d .猪与空腹C肽变化呈正相关(p=0.009，图3 c)和血浆1-花生四烯醇- gpc水平(p=0.004，图3 d，这个代谢物将在下一段讨论)。此外，相对丰度的变化d .猪与两者的相对丰度变化呈负相关普氏菌1（图3 e),普氏菌2 (图3 f)．
临床结果与血浆代谢物和脱磷孤菌属猪．(A)大量的粪便d .猪随着时间的推移(异体:蓝色，自体:粉色，带宽度指示SD)。P值计算采用Mann-Whitney U检验。6个月时p值=0.024,12个月时p值=0.023。(B)折叠变化d .猪两组之间(异体:蓝色，自体:粉色)。对各组0 ~ 12个月间的δ进行Mann-Whitney U检验计算δ p值，p值=0.006。(C) 0-12个月delta粪的Spearman相关图d .猪和δ(0-12个月)空腹C肽。(D)粪便相关图d .猪和1-arachidonoyl-GPC。(E)粪便相关图d .猪和小肠普氏菌1。(F)粪便相关图d .猪和小肠普氏菌2．(G)最能预测治疗组分配分配的前10个代谢物(XGBoost预测建模算法)。百分比将按比例向最大的方向扩展，设置为100%。前三种代谢物在分析中具有较高的相对重要性。(H-J)前三种代谢物的相对丰度随时间的变化(异体:蓝色和自体:粉色，带宽度指示SD)。报道中位数±IQR (P25-P75)。12个月时各组间P值采用Mann-Whitney U检验计算。1-豆蔻酰-2-花生四烯醇- gpc在12月龄组间差异有统计学意义(p值=0.020)。1-花生四烯醇- gpc在12月龄组间有差异，p值=0.020。(K)空腹C肽变化与1-豆蔻酰-2-花生四烯醇- gpc变化之间的Spearman相关性。 (G) RDA of fasting plasma metabolites over time in T1D compared with healthy donors. T1D, type 1 diabetes.
FMT时血浆代谢物的变化
通过0 - 12个月间空腹血浆代谢物的变化可靠地预测治疗组的分配(AUROC 0.79±0.23)。10个最具预测性的代谢物的相对重要性显示在图3 g．从前三种代谢产物中，1-myristoyl-2-arachidonoyl-GPC (MA-GPC) (p=0.02, MWU)和1-arachidonoyl-GPC(A-GPC) (p=0.02)，但不是(1) - 1-enyl-palmitoyl−2-linoleoyl-GPE(EPL-GPE)， 12月龄组间差异(图3 h-j)．此外，血浆MA-GPC水平的变化与空腹C肽的变化显著相关(p=0.012, MWU，图3 k)以及FMT组和供体之间血浆代谢产物的总体变化(图3 l)．
基线粪便菌群组成、基线粪便代谢途径和基线十二指肠基因表达预测FMT反应
接下来，我们进行了事后分析，以研究基线粪便菌群组成是否预测FMT的临床反应(图4 a - b)，确实如此(AUROC 0.93±0.14)。在这方面，肠道水平拟杆菌caccae而且Coprococcus卡图斯在大多数微生物中脱颖而出(在线补充图7)，两者在基线时在应答者中明显多于非应答者(图4 c - d)．其他的肠道细菌菌株，Paraprevotellaspp,Collinsella aerofaciens，拟杆菌eggerthii而且瘤胃球菌属callidus有反应者和无反应者在基线时也有显著差异(在线补充图8A-E)．的变化呈边缘性显著负相关c·卡图斯C肽AUC (p=0.053, r=−0.44，图4 e)．
FMT临床应答者与非应答者的基线粪便菌群和功能通路。图A部分显示了6个月和12个月时应答者的数量以及每个治疗组中有多少受试者。应答定义为C肽AUC较基线下降<10%。所有分析均使用12个月的应答者。图B部分显示了C肽AUC随时间变化的个别主题线。有反应的用紫色，没反应的用黄色。图C和D部分显示了拟杆菌caccae而且Coprococcus卡图斯随着时间的推移,分别。各时间点组间P值采用Mann-Whitney U检验计算。为b . caccae在基线时，p值=0.0099，为c·卡图斯基线时，p值=0.00049。图E部分显示了delta之间的相关性c·卡图斯(0-12个月)和δ C肽AUC(0-12个月)。示出了斯皮尔曼的比值(r)， p值是用斯皮尔曼的秩计算出来的。图F部分显示了脂肪酸和β氧化的相对丰度随时间的变化，基线时的p值=0.014,6个月时的p值=0.011;图G部分显示了丙酮酸发酵到丙酮的相对丰度随时间的变化，基线时的p值=0.0015;图H部分显示了结肠酸构建块生物合成途径的相对丰度时间，基线p值=0.015。所有p值均采用Mann-Whitney U检验计算。AUC，曲线下面积;粪便菌群移植。
相比之下，通过粪便菌群组成的变化(AUROC 0.76±0.23)预测治疗反应的准确性低于通过基线组成的变化。然而，变异反应最好的物种是拟杆菌ph8，粘胶放线菌，陶氏拟杆菌，唾液链球菌，bromii瘤胃球菌而且leptum梭状芽胞杆菌（在线补充图9A),其中b .细菌ph8MWU (p = 0.015)r . bromii(p=0.013)在有反应者和无反应者中较少，唾液链球菌(p=0.045)在有反应者和无反应者中更丰富亚种在基线有显著差异，在应答者中呈下降趋势(在线补充图9B-I)．
同样，基线粪便微生物代谢途径(AUROC 0.85±0.22)比粪便微生物代谢途径变化(AUROC 0.69±0.27)更准确地预测临床反应。基线丰度最能预测反应的代谢途径包括脂肪酸和β氧化I、丙酮酸发酵生成丙酮和大肠杆菌酸的生物合成(在线补充图10)，在基线时，有反应者显著高于无反应者(p=0.014, p=0.0015和p=0.015, MWU，图4 f-h)．然而，应答者与非应答者在这些通路上没有显著差异变化。此外，这些通路的基线丰度和这些通路的变化都与主要终点(MMT刺激C肽反应)无关。
结果显示，基线十二指肠基因表达比改变十二指肠基因表达(AUROC 0.73±0.24)更准确地预测临床反应(AUROC 0.83±0.21)。在基线时，分化最多的基因是CCL22、CLDN12、CCL4、CD86、CCL13、CCL19、CXCL12、CLDN14、CX3CL1和CXCL1 (图5一个)，而CCR5和CCL18 (图5 b)是差异变化最显著的基因。在基线时，有反应者和无反应者的这些基因表达有显著差异:CCL22 (p=0.0039, MWU)、CCL19 (p=0.011)、CXCL12 (p=0.0039)、CXCL1 (p=0.021)和CCR5 (p=0.015) (图5 c g)．此外，这些基因的基线值与受刺激C肽AUC的变化有很好的相关性(图5 h l)．有趣的是，在FMT治疗后，所有这些基因都减少了，但只有CCL19的减少(p=0.049)具有统计学意义。最后，紧连接蛋白CLDN12的基因表达在基线时无应答者中较高(在线补充图S11A)，而应答者的CCL4和CD86基因表达较高(在线补充图S11B和C)．
整合多组学分析
研究了FMT显著影响参数之间的相关性。由于在两个治疗组中都发现了应答者，因此首先在我们的集合数据集中探索相关性(n=20) (图6)，然后分别在治疗组内(图6B和C)和FMT的临床反应者(在线补充图S12)．在池数据集中(图6)，发现了一组相互交织的显著参数，它们与葡萄糖调节标记物呈正相关或负相关(即C肽AUC，空腹C肽和A1c;图6)．一方面，血浆代谢物MA-GPC和A-GPC高度相关，准确预测胰岛素分泌的保存，正相关d .猪，与空腹C肽呈正相关。另一方面，普氏菌1，普氏菌2而且美国oralis与葡萄糖调节和代谢物MC-GPC和A-GPC呈负相关。此外，剩余β细胞功能与CCL22活性和CD4+ CXCR3+ T细胞活性呈负相关，而CD4+ CXCR3+ T细胞活性与CCL22活性呈负相关d .猪．分别分析治疗组，自体组保留的β细胞功能(高C肽)在基线时表现为高c·卡图斯高诱导大肠杆菌酸生物合成、脂肪酸和β氧化途径和高CCL22和CXCL12表达，以及随后的降低r . bromii，与这两种途径和基线时的CCL22呈负相关(图6 b)．在同种异体组，保留β细胞功能的特点是粪便减少Roseburia intestinalis以及UMP生物合成途径的减少(顺便提一句，这与普氏菌1而且2)以及CD86和CCL18表达的下降，这两种表达在应答者中均在基线时较高，随后下降。CD86和CCL18基因依次与r . intestinalis，而CCL18与UMP生物合成途径正相关(图6 c)．最后，在临床反应者中，保留β细胞功能的特征是十二指肠下降普氏菌1，普氏菌2,粪便c·卡图斯，代谢产物EPL-GPE，途径脂肪酸和β氧化，CD4+ CXCR3+ T细胞，而d .猪增加(在线补充图S12)．
FMT上血浆代谢物改变、菌株和残留β细胞功能的相关图。(A)显示合并的所有受试者的Spearman相关性(n=20)的图。仅显示显著相关性(p<0.05)。红色表示负相关，蓝色表示正相关。网点大小对应于p值(越大越小)，网点颜色对应于相关强度(斯皮尔曼系数)。该图来自一个更大的图，其中所有与我们的主要终点不相关的参数和/或任何关键参数都被删除了。(B)如图A部分所示，用于自体治疗组。(C) A如图A部分，为同种异体治疗组。AUC，曲线下面积;粪便菌群移植。
讨论
我们在此首次报道了FMT对新发病T1D中残余β细胞功能的影响。这与最近的观察研究一致，支持肠道菌群在T1D受试者中的作用。8 - 12与我们的假设相反，自体FMT比健康供体FMT表现更好，而即使在同种异体组，在未治疗的T1D中，MMT刺激的C肽反应下降比预期的要小。26日27日一个有吸引力的解释是，当FMT供体菌群与宿主的免疫相容性更好时，FMT的有益免疫效应(无论供体来源如何)更明显和持久。我们怀疑异体FMT增加了已知在诊断前后发生的炎症，31通过提供免疫外来的结肠菌群，宿主对小肠(T细胞被认为是训练的地方)的耐受性较低32)，这可能会盖过由不同制剂同时产生的有益效果。与动物研究相比，FMT的有益作用与产生scfa菌株的变化无关。21然而，观察结果表明，从饮食中提取并被肠道菌群转化的特定血浆代谢物具有免疫调节作用。33
自体FMT对β细胞功能的保存是T细胞介导的
许多针对T细胞的研究表明，T1D中β细胞功能的延迟丧失。1 3-5 34 35我们的研究强调了宿主结肠微生态移植后β细胞的保存是由T细胞介导的，因为应答者在12个月时CD4+ CXCR3+和CD8+ CXCR3+ T细胞有差异地减少。已知β细胞通过产生与CXCR3结合的配体(即CXCL9、10和11)来吸引自反应T细胞。36-38此外，已知假定的免疫改变不是发生在外围，而是发生在胰腺和引流淋巴结、小肠粘膜或肠引流淋巴结的局部。39事实上，改变小肠粘膜中的调节性T细胞的色调可以预防T1D。40 41此外，我们发现小肠中CCL22的基线表达是临床反应的一个强有力的预测因子。此前有研究表明，T1D受试者的小肠CCL22表达高于对照组，17CCL22曾被认为是T1D的新治疗策略，例如，通过激活和招募调节性T细胞和减少CD8+ T细胞的数量，保护NOD小鼠的自身免疫。42 43在我们的应答者中，CCL4的表达也较高，而在NOD小鼠中，CCL4通过中和IL-16来保护T1D44它也是T细胞对il -4介导的T1D保护所需要的。45此外，临床应答者的小CD86表达高于无应答者，这是有趣的，因为CD86是完全T细胞激活所必需的，也是Abatacept的一个靶点，它可以延缓T1D受试者β细胞功能的衰退。4 46
细胞功能的保存与特定肠道菌群菌株的变化有关
与之前的文献一致，47我们建议d .猪通过T1D抑制自身免疫等离子体1-arachidonoyl-GPC从而影响CXCR3+ T细胞。预测模型显示，基线粪便菌群分类和代谢途径准确预测了12个月时的反应。然而，鉴定出的微生物(如，b . caccae而且c·卡图斯)与我们的任何相关免疫参数、小肠基因或血浆代谢物都不相关。这表明粪便菌群组成是与反应相关的宿主免疫特性的结果而不是原因。唯一的例外是d .猪这是一种硫酸盐还原菌株，此前曾被证明可以塑造肠道菌群对饮食的个别反应。48它的有益作用可能是通过产生硫化氢介导的，硫化氢是一种被发现具有神经刺激作用的分子49并影响调节性T细胞和免疫稳态。50此外,我们确认d .猪作为FMT治疗组分配的优秀粪便微生物预测因子。有趣的是，这种小肠细菌菌株也与FMT上受刺激的C肽反应的变化有有益的关联，其丰度在自体组和整体应答者中增加。有趣的是,d .猪与血浆1-花生四烯醇- gpc (图3我)，它是我们的关键代谢物之一，也与提高C肽的生产有关。此外,d .猪这种代谢物与CD4+ CXCR3+和CD8+ CXCR3+ T细胞呈负相关，这与之前在小鼠T1D中的报道一致。51总之,d .猪可以通过a - gpc的产生来抑制这些细胞，例如，通过免疫细胞的突出树突摄取到肠腔，从而抑制自身免疫。52有趣的是,d .猪最近从人类肠道中培养出来，可以在人类T1D中测试这种菌株。53在治疗组之间，十二指肠中分化最好的其他细菌种类是两种未命名的普氏菌spp和S。oralis．在这方面，粪便8但不是十二指肠普氏菌此前曾与T1D联系在一起。我们对多组学分析的探索性整合随后表明这些普氏菌spp和美国oralis与我们关键的有益代谢物MA-GPC呈负相关，这是一种甘油磷脂。在这方面，其他磷脂先前被认为与新发病T1D中的β细胞功能有关。26b . stercoris积极与相关d .猪A-GPC和负与美国oralis而与C肽无正相关。有趣的是,b . stercoris最近发现能被znt8活性CD8+ T细胞交叉识别。19最后,改变r . bromii(自体FMT组)和r . intestinalis(异体FMT组)与C肽的变化呈负相关，尽管这两种菌株通常被视为有益微生物，它们在富含纤维的饮食中大量繁殖，产生SCFAs并促进肠道完整性。
限制
首先，该探索性随机对照试验在达到计算样本量之前停止登记。它的样本量有限，也没有被用于A1c等次要临床终点。然而，它为更大规模的研究来证实我们的发现铺平了道路。尽管新发T1D患者FMT治疗疗效的基线肠道菌群组成的驱动因素目前尚不清楚，但我们推测临床反应水平可能是由FMT中的肠道微生物菌株组成(不论供体来源)以及自身免疫调性等宿主因素驱动的。添加一种标准的饮食干预是否能与更好匹配宿主免疫的FMT供体协同工作，以优化临床代谢和免疫反应，还需要进一步研究。其次，我们试图通过在基线和6个月后(因此在积极的FMT干预期间)进行十二指肠粘膜活检来接近干预的局部效果。然而，大多数相关的免疫效应预计发生在胰腺和胰腺淋巴结，这些隔室无法在在世的T1D患者中取样。第三，我们最早的生物样本是在第一次FMT后2个月采集的。因此，可能早发生但已经减弱的变化可能被错过了。第四，我们的人群只包括因此发病较慢的T1D的成年受试者，这可能与发病较早的青少年T1D在免疫学上有所不同。54尽管这项在成人T1D患者的大型随机对照试验中进行的试点试验正在等待确认，但我们的研究也证明了在年轻T1D受试者中应用FMT的试验。第五，尽管胰岛素抵抗在T1D中起着一定的作用，但在本研究中我们没有对其进行量化。正如之前的研究表明，胰岛素敏感性可以同时提高23日24和减少25通过捐赠FMT。尽管在β细胞衰竭和绝对胰岛素缺乏的状态下不太可能，但可以想象的是，FMT增加了胰岛素敏感性，从而抵消了C肽释放的增加，并掩盖了可观察到的好处。最后，在未来的研究中，我们应该包括一个真正的安慰剂对照组(例如，灌洗和十二指肠管放置没有FMT)，以比较自体FMT输注与新发T1D β细胞功能下降的“自然”过程。
结论
在我们的研究中，新发T1D患者将结肠来源的微生物组粪便移植到宿主小肠和大肠中有效地延长了剩余的β细胞功能。从这个产生假设的研究中，我们报告了几个重要的发现。首先，包括粪便在内的几种新型细菌菌株d .猪而且b . stercoris还有十二指肠普氏菌spp和美国oralis具有治疗潜力。因此，FMT后血浆磷脂和色氨酸衍生物如1-豆荚酰-2-花生四烯醇- gpc和1-花生四烯醇- gpc以及6-溴色氨酸的增加与小肠CCL22表达和全血免疫细胞亚群如CXCR3+ CD4+ T细胞的有益改变有关。虽然在T1D的临床试验中开发已确定的线索进行评估将具有挑战性和耗时，但FMT本身似乎是一种安全的治疗方式，可以很容易地应用于临床研究，以分析T1D病理生理学中肠道菌群的因果影响。因此，我们希望我们的探索性研究将引发更大规模的随机FMT试验(异体vs自体vs真正的安慰剂)，并进行更长时间的随访，以确认和扩展我们基于FMT的干预对人类T1D β细胞功能渐进性丧失的令人信服的发现。
致谢
我们感谢医生/护士P Geelhoed, T M Vriesendorp, H J Aanstoot, R Zwertbroek, A Pijlman, A W van den Beld, I Wakelkamp, A Muller, A Binnerts, W van Houtum, N Posthuma, D Faber, J de Sonnaville, F A J Verburg, N Smit, C Oldenburg, I Bonapart, K Mahmoud, T Paardekoper, C Pronk和T Claassen纳入患者。我们感谢Hans Heilig和Steven Aalvink对DNA分离的支持。H R Buller和B A Hutten被公认为DSMB成员。最后，我们尊敬地感谢我们的参与者无私地应用自己来帮助完成这个繁重的项目。
补充材料
脚注
调整通知这篇文章在Online First发布后进行了修改。作者关系已更新。
资金该试验由AMC医学博士奖学金资助(给Nieuwdorp)，并据此任命了PFdG。VS由EFSD/JDRF/礼来2017赠款支持。BR是荷兰糖尿病研究基金会和Stichting DON专家中心的主任，也是Wanek家族1型糖尿病项目的主任。WMDV得到了荷兰科学研究组织(斯宾诺莎奖)的支持。MN由2013年ZONMW-VIDI赠款(016.146.327)支持。
相互竞争的利益MN和WMDV是荷兰Caelus健康科学咨询委员会的创始人和成员。WMDV是比利时A-Mansia科学咨询委员会的创始人和成员。MN是美国Kaleido生物科学公司的科学顾问委员会成员。
病人同意发表不是必需的。
伦理批准所有的研究程序都得到了阿姆斯特丹UMC(地点AMC)的机构审查委员会的批准。
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