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摘要
客观的在之前使用Barrett食管患者的食管鳞状细胞(正常食管鳞状细胞(NES)-B细胞)和无Barrett食管患者的食管鳞状细胞(NES- g细胞)的研究中，我们发现酸和胆盐只在NES-B细胞中诱导尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)的表达。CDX2是肠上皮形成所需的转录因子，是活化B细胞核因子kappa-轻链增强子(NF-κB)信号的靶点，可被阿司匹林抑制。我们探讨了NES-B和NES-G细胞之间CDX2表达差异的机制，以及阿司匹林对CDX2表达的影响。
设计我们将nees - b和nees - g细胞暴露于酸和胆盐中，添加和不添加阿司匹林，并评估其对IκB-NF-κB- pkac复合体激活、p65 NF-κB亚基功能和CDX2表达的影响。
结果在NES-B和NES-G细胞中，酸和胆盐激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生H2O2，激活IκB-NF-κB-PKAc复合体。与NES-G细胞相比，NES-B细胞表现出更高水平的磷酸化IκB和p65, NF-κB转录活性更高，说明NES-B细胞中IκB-NF-κB- pkac复合物被酸和胆盐激活更强，p65 siRNA抑制了其CDX2表达的增加。阿司匹林阻断了nees - b细胞中IκB磷酸化、p65核易位、CDX2启动子激活以及酸和胆盐诱导的CDX2表达。
结论nees - b和NES-G细胞在酸和胆盐激活NF-κB时的差异可能是其CDX2表达差异的原因，且其CDX2表达可被阿司匹林阻断。这些发现或许可以解释为什么有些戈德罗食管患者会发展成巴雷特食管，而另一些则不会，以及为什么阿司匹林可以防止巴雷特食管的发展。
- 食管疾病
- 食管反流
- 炎症
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)指导肠上皮的形成，被认为在巴雷特肠型化生的发病机制中起关键作用。
酸和胆盐诱导巴雷特食管患者的食管鳞状细胞(正常食管鳞状细胞(NES)-B细胞)中CDX2的表达，但在无巴雷特食管的GORD患者的食管鳞状细胞(NES- g细胞)中没有表达。
CDX2是活化B细胞核因子kappa -轻链增强子(NF-κB)信号的靶点，可被阿司匹林抑制，但不能被其他非甾体抗炎药(NSAIDs)抑制。
最近的一些病例对照研究发现，阿司匹林(但没有其他非甾体抗炎药)可以预防巴雷特食道的发展。
新的发现是什么?
在NES-B和NES-G细胞中，酸和胆盐激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生H2O2该蛋白可激活IκB-NF-κ b蛋白激酶A催化亚基(PKAc)复合体。
与es - g细胞相比，暴露于酸和胆盐后，es - b细胞表现出更高水平的磷酸化IκB、磷酸化p65、p50/p65 NF-κB异源二聚体形成和NF-κB/p65转录活性，表明es - b细胞中IκB-NF-κB- pkac复合体被酸和胆盐激活的程度更高。
siRNA抑制NES-B细胞中p65，可防止酸和胆盐诱导的CDX2表达增加。
阿司匹林可阻断nees - b细胞系中酸和胆盐诱导的IκB磷酸化、p65核易位、CDX2启动子激活和CDX2表达的增加。在原代培养的nees - b细胞中，阿司匹林可阻断酸和胆盐诱导的CDX2启动子激活的增加。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们发现，nees - b细胞和NES-G细胞在酸和胆盐激活NF-κB的程度上存在主要差异，这可以解释它们在CDX2表达上的差异，这可能解释了为什么有些GORD患者发生Barrett食管，而另一些则没有。
我们的研究发现，阿司匹林可以阻止NES-B细胞中由酸和胆盐诱导的NF-κB活性的增加，这可能可以解释一些病例对照研究的发现，阿司匹林可以防止巴雷特化生的发展，而其他非甾体抗炎药则不能。
我们的研究结果为阿司匹林在临床试验中预防GORD患者Barrett食管的发展，以及在射频消融术治疗患者中预防Barrett上皮化生的复发提供了理论依据。
简介
据估计，在西方国家有2-7%的成年人患有巴雷特食管，在这种情况下，肠型化生黏膜有恶性肿瘤的危险，取代了食管鳞状黏膜被GORD破坏。1，2高达40%的西方成年人报告了食道食道综合征的症状，目前尚不清楚为什么只有少数人患上了巴雷特食道。3.我们之前已经证明，当食管鳞状上皮细胞暴露于酸和胆盐(反流胃液中的有害物质)时，激活的分子通路在个体之间存在差异，我们提出，这些差异可能决定了gord损伤的食管是通过鳞状细胞再生过程愈合，还是通过巴雷特食管的发展通过化生愈合。4 - 8
许多流行病学研究表明，使用阿司匹林和其他非甾体抗炎药(NSAIDs)可以防止食道腺癌的发展，这种癌症是由巴雷特化生发展而来的。9，10有趣的是，最近的一些病例对照研究发现，阿司匹林可以防止有GORD症状的个体发生巴雷特化生，而其他非甾体抗炎药则不能。11，12目前还不清楚为什么对巴雷特化生的保护应该仅限于阿司匹林，而不是其他非甾体抗炎药。阿司匹林和非阿司匹林非甾体抗炎药通过抑制从花生四烯酸中产生前列腺素的环加氧酶发挥一些有益作用。13，14然而，与其他非甾体抗炎药不同的是，阿司匹林也抑制激活B细胞(NF-κB)通路的促炎核因子kappa-轻链增强子。15在胰腺中，NF-κB信号已被证明在分子重编程过程中发挥关键作用，这是胰腺腺泡-导管化生的基础。16因此，阿司匹林对巴雷特化生的独特保护作用可能归因于阿司匹林对NF-κB的抑制作用，而这是其他非甾体抗炎药所不具备的。
NF-κB在正常食管鳞状上皮(NES)中不被激活，但在GORD炎症的食管上皮中被激活。17在早期的研究中，我们发现酸和胆盐诱导食管鳞状细胞NF-κB信号通路。6，18另一个可能受NF-κB信号影响的重要转录因子是尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)，这是一种指导肠上皮形成的关键发育转录因子。19，20.CDX2信使RNA (mRNA)和蛋白在巴雷特食管肠型化生活检标本中常见。21 - 24日
CDX2启动子包含两个已知的NF-κB结合位点。25多项研究表明，酸和胆盐可以增加培养的大鼠和部分人类食管鳞状细胞中Cdx2启动子的活性，并增加Cdx2 mRNA的表达。每股26到29与NF-κB一样，CDX2在因GORD而发炎的人食管活检标本中也有表达，但在未发炎的食管活检标本中没有表达。24在反流性食管炎的动物模型中，反流损伤的食管上皮在巴雷特氏样化生出现之前表现出Cdx2表达增加。30 -这些研究表明，炎症食管鳞状上皮中CDX2的表达可能预示着Barrett食管的发展，CDX2的表达可能是NF-κB信号通路的结果。
在早期的研究中，我们发现酸和胆盐诱导了Barrett食管患者食管鳞状细胞中CDX2的表达，但在无Barrett食管的GORD患者中没有。6此外，在Barrett食管患者的鳞上皮细胞中，我们发现酸和胆盐刺激p50和p65 NF-κB亚基转移到细胞核，但只有p50亚基结合CDX2启动子并诱导CDX2表达。6在目前的研究中，我们探索了酸和胆盐仅在巴雷特食管患者的食管鳞状细胞中诱导CDX2表达的机制，以及阿司匹林是否可能抑制CDX2的表达。
材料和方法
原代食管鳞状细胞和食管鳞状细胞系的培养
我们使用了四种非肿瘤性的端粒酶永生的食管鳞状上皮细胞系，这些细胞系是从内镜活检的食管食管远端鳞状上皮标本中创建的与Barrett食管(NES-B3T和NES-B10T)和GORD患者没有巴雷特食管(NES-G2T和NES-G4T)。5，6为了简单起见，在本报告的其余部分，我们将提到来自GORD患者的两种鳞状细胞系与Barrett's食道简称NES-B细胞，以及来自GORD患者的两种鳞状细胞系没有Barrett食管简称NES-G细胞。我们还使用前面描述的技术从3例GORD患者Barrett食管远端食管建立了食管鳞状上皮细胞(NES-B3P, NES-B6P和NES-B7P)的原代培养。6这些研究得到了达拉斯退伍军人医疗中心机构审查委员会的批准。原代细胞培养物和细胞系与成纤维细胞喂养层共培养，并如前所述保持在生长培养基中。33，34原代细胞培养和细胞系在37°C 5% CO中保持2孵化器。对于单个实验，原代细胞培养物和细胞系在没有成纤维细胞喂养层的情况下被均匀地接种到胶原蛋白iv包被的孔中(BD Biosciences, San Jose, California, USA)，并保持在生长培养基中。
酸和胆盐暴露
将细胞暴露于三种不同的实验培养基之一:(1)酸性充分生长培养基(用1 M HCl使pH值为4.0)，(2)中性胆盐培养基(包含总浓度为400 M的结合胆汁酸，pH值为7.2，如前所述6)或(3)酸性胆盐培养基(pH值为4.0的相同胆汁酸溶液)。中性充分生长培养基(pH 7.2)作为对照培养基。在24小时的暴露中，酸性全生长培养基和酸性胆盐培养基的pH值调整为pH 5.5。
阿司匹林治疗
western blotting实验用100 μ M的阿司匹林(Sigma)预处理细胞2h后，加入含阿司匹林的酸胆盐培养基30min。然后收集细胞裂解物。逆转录- pcr实验用100µM的阿司匹林(Sigma)预处理细胞2h后，加入含阿司匹林的酸胆盐培养基24h。然后收集总rna。转染CDX2启动子后，用100 μ M的阿司匹林(Sigma)预处理细胞系和原代细胞培养物2小时。在细胞系实验中，加入含阿司匹林的酸盐和胆盐培养基60 min，然后取出替换为中性pH培养基6 h;在原代细胞培养实验中，添加含阿司匹林的酸和胆盐培养基24小时。然后测定细胞提取物的荧光素酶活性。中性的充分生长培养基(pH 7.2)，添加或不添加阿司匹林作为对照。
结果
在酸性和胆汁盐暴露后，NES-B细胞中p50和p65 NF-κB亚基的核易位大于NES-G细胞
在基线时，我们发现NES-B细胞和NES-G细胞有相似水平的细胞质和核p65和p50蛋白(图1A).与我们早期的研究一致，6酸、胆盐或两者结合的处理消除了任何可检测到的细胞质p65和p50水平，并导致NES-B细胞的p50和p65核水平显著升高(图1B).相比之下，用酸和胆盐处理NES-G细胞可降低但未消除细胞质中p50和p65的水平，导致p50核水平升高，而p65核水平仅略有升高(图1B, C和网上看补充图S1)．
酸、胆盐和酸性胆盐显著增加NES-B细胞中p50和p65的核水平。NES-G和NES-B细胞系中细胞质和核p65和p50蛋白的western blotting代表性实验(A)在基线时(数字描述与负载对照有关的半定量分析，显示在个别凝胶下)和(B)暴露于酸、胆盐和酸性胆盐后。(C) NES-G2T细胞细胞质和细胞核p65和p50蛋白免疫荧光的代表性实验(比例尺=50µm)。(D)在NES-G细胞系中，酸、胆盐和酸性胆盐不会增加p50或p65与CDX2启动子的DNA结合。p50和p65染色质免疫沉淀试验的代表性实验IgG作为对照。输入显示剪切染色质，未添加免疫沉淀到分析中。免疫荧光图像和western blots是两个独立实验的代表性结果。一个酸;A&B，酸性胆盐; B, bile salts; C, untreated control; M, marker.
继续
在早期使用nees - b细胞的研究中，我们发现，尽管酸和胆盐暴露导致p50和p65的核易位，但只有p50亚基与CDX2基因启动子结合并增加了CDX2的表达。6在目前使用NES-G细胞的研究中，染色质免疫沉淀试验显示，在基线时未处理的NES-G细胞中，p50和p65仅与CDX2启动子DNA有极少量的结合(图1D).尽管酸和胆盐暴露导致NES-G细胞中p50的核易位，但该核易位并不伴随着p50与CDX2启动子结合的增加(图1D).这些发现揭示了来自Barrett食管和非Barrett食管的GORD患者的食管鳞状细胞在酸和胆盐如何激活NF-κB方面存在很大差异，并为我们早期观察到的酸和胆盐没有增加es - g细胞中CDX2的表达提供了分子解释。6
除了p50外，酸和胆盐诱导食管鳞状细胞中CDX2启动子激活需要增加p65的核水平
如上所述，在es - b细胞中，暴露于酸和胆盐会导致p50和p65 NF-κB亚基的核易位和CDX2启动子的激活，但只有p50亚基与启动子结合。相反，在NES-G细胞中，酸暴露导致p50亚基的核易位，而p50不结合CDX2启动子。NES-B细胞中p50激活CDX2启动子的一个可能解释是p65核水平的增加比在NES-G细胞中观察到的要大。即使p65不直接结合启动子，可能启动子激活需要如此大的核水平的增加。为了探索这种可能性，我们在一个NES-B细胞系(NES-B10T)中使用特定的小抑制RNA (siRNA)敲除p65，我们之前已经证明在酸性胆盐暴露下CDX2启动子活性增加。6图2A表明，在基线和暴露于酸、胆盐和酸性胆盐之后，转染p65 siRNA确实敲除了NES-B10T全细胞裂解物中的p65蛋白。与对照细胞相比，p65敲低的NES-B10T细胞在酸、胆盐或酸性胆盐处理后仅显示p50核易位轻微降低(图2B)。然而，在对照细胞中看到的酸和胆盐诱导的CDX2启动子活性的增加被p65的敲除几乎消除了(图2C).这些研究结果表明，p65和p50核水平的升高对于酸和胆盐激活食管鳞状细胞中的CDX2启动子是必不可少的。
在食管鳞状细胞中，酸和胆盐诱导CDX2启动子激活需要p65核水平的增加。(A) Western blot显示转染对照小抑制RNA (siRNA)或p65 siRNA的NES-B10T细胞的全细胞裂解物中p65蛋白水平，未处理，暴露于酸、胆盐和酸性胆盐后。(B)代表性的western blot显示转染对照siRNA或p65 siRNA的NES-B10T细胞中p50核蛋白水平，未处理和暴露于酸、胆盐和酸性胆盐后。所示的Western blot是两个独立实验的代表性结果。(C)含对照siRNA或p65 siRNA的NES-B10T中，酸和胆盐诱导CDX2启动子激活。柱状图表示均值±SEM。与非酸性胆汁盐处理对照组相比，***p≤0.001。一个酸;A&B，酸性胆盐;B,胆汁盐; U, untreated.
酸和胆盐导致NES-B细胞中p50/p65异二聚体形成略有增加，IκB-和pacc结合的p65显著降低，但NES-G细胞中没有
p50和p65 NF-κB亚基形成异质二聚体，在未受刺激的细胞中，通过与抑制性IκB蛋白家族的成员结合，在细胞质中保持不活跃。35，36这种IκB- nf -κB复合体可以通过IκB蛋白的磷酸化被激活，然后被降解，释放p50/p65异二聚体并使其能够转移到细胞核。我们对p50进行免疫沉淀，然后对p65进行western blotting，以确认这些NF-κB蛋白在NES-G2T和NES-B10T细胞系中形成异质二聚体(图3A).未受刺激时，两种细胞系均表现出p50/p65异源二聚体的形成。暴露于酸性、胆盐和酸性胆盐中，NES-G2T细胞中异质二聚体的形成增加极小，而NES-B10T细胞中异质二聚体的形成略有增加(图3A).接下来，我们对p65进行免疫沉淀，然后对IκB进行western blotting，以确定细胞质中与IκB结合的p65的数量。在两种NES-G细胞系中，酸性、胆盐和酸性胆盐暴露只导致i κ b结合p65的极少量下降(图3相反，这些相同的暴露导致NES-B细胞中与IκB结合的p65的数量显著减少(图3B). p65的异源二聚体形成和p65亚基的转录活性可以通过蛋白激酶A (PKAc)的催化亚基磷酸化来调节，蛋白激酶A是IκB-NF-κB复合体的另一个组成部分。36，37通过对p65的免疫沉淀，我们发现PKAc确实是NES细胞中IκB-NF-κB复合体的一个组成部分(图3B).在两种NES-G细胞系中，暴露于酸和胆盐只导致pkac结合的p65发生最小的变化(图3B).相反，在NES-B细胞中，暴露于酸和胆盐的组合中几乎消除了PKAc与p65的结合(图3B)。
与NES-G细胞相比，暴露于酸、胆盐和酸性胆盐的NES-B细胞显示出更多的p50/p65异源二聚体形成，胞质中i κ b和pacc结合的p65更大的减少。具有代表性的western blot结果显示(A) p50蛋白的免疫沉淀(IP)和p65蛋白的免疫印迹(IB)，以及(B) p65蛋白的IP和IκB和PKAc蛋白的IB。所示的Western blot是两个独立实验的代表性结果。一个酸;A&B，酸性胆盐;B,胆汁盐;C,未经处理的控制。
酸和胆盐可提高NES-B细胞NF-κB/p65的转录活性，但对NES-G细胞无影响
IκB Ser32和Ser36位点的磷酸化导致其泛素化和蛋白酶体快速降解，释放p50/p65异二聚体复合物，使其能够转移到细胞核。35导致IκB降解的信号也可以导致PKAc的激活，PKAc使p65的Ser276位点磷酸化，刺激其转录活性。35，37我们发现，暴露于酸、胆盐和酸性胆盐显著增加了NES-B细胞中IκB (Ser32/36)和p65 (Ser276)的磷酸化(图4A).相比之下，这些相同的暴露导致IκB磷酸化的增加较小，而NES-G细胞中p65磷酸化的增加很小(图4A).使用NF-κB报告结构，我们发现酸性胆盐处理显著增加了NES-B细胞中NF-κB/p65的转录活性，但在NES-G细胞中没有(图4B)。
暴露于酸、胆盐和酸性胆盐会导致正常食管鳞状上皮(NES)-B细胞中活化B细胞(NF-κB)-PKAc复合物激活的i κB核因子kappa-轻链增强子(NF-κB)-PKAc复合物激活的增加大于NES- g细胞。(A)代表性的western blot结果显示NES细胞中酸和胆盐诱导的NF-κB-PKAc (Ser32/36)和phospho-p65 (Ser276)。(B) NES细胞中NF-κB/p65活性对酸性胆盐反应的荧光素酶报告试验。(C和D)酸性胆盐导致食管鳞状细胞产生过氧化氢(H2O2)通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)激活IκB-NF-κB-PKAc复合体。代表性的western blot结果显示，(C) peg -过氧化氢酶抑制酸性胆盐诱导的磷酸化i κ b和磷酸化p65的升高2O2清除剂和(D)二苯基碘(DPI)，一种NADPH氧化酶抑制剂。所示的Western blot是两个独立实验的代表性结果。*p<0.05与非酸性胆盐处理对照组比较。一个酸;A&B，酸性胆盐;B,胆汁盐;C,未经处理的控制。
食管鳞状细胞暴露于酸性胆盐产生H2O2通过NADPH氧化酶系统引起IκB和p65的磷酸化
IκB的降解和PKAc的激活都与活性氧(ROS)的产生有关，在早期的研究中，我们证明了暴露于酸性胆盐的食管鳞状细胞通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)系统产生ROS。38由于H2O2是NADPH氧化酶系统产生的主要ROS，我们用peg -过氧化氢酶(过氧化氢(H2O2)清道夫)或二苯基碘(DPI)(一种NADPH氧化酶抑制剂)，将它们暴露于酸性胆盐中，并对磷酸化i κ b (Ser32/36)和磷酸化p65 (Ser276)进行western blot检测。PEG-catalase (图4C)和DPI (图4D)防止酸性胆盐增加NES-G4T和NES-B10T细胞中IκB和p65的磷酸化。这表明酸性胆盐通过产生细胞内H激活IκB-NF-κB-PKAc复合体2O2通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NAPH)氧化酶系统。
阿司匹林阻断了nees - b细胞中IκB的磷酸化、p65的核易位、CDX2启动子的激活以及酸和胆盐诱导的CDX2 mRNA的表达
IκB磷酸化(Ser32/36)是NF-κB激活的关键步骤，是IκB激酶(IKK)β蛋白的主要功能。35在一项早期的研究中，我们发现酸性胆盐激活IKKβ，它反过来磷酸化NES-B10T细胞中的IκB。39因此，为了防止NF-κB激活，IKKβ是合理的靶标。IKKβ是阿司匹林的靶点，而不是非阿司匹林非甾体抗炎药的靶点。15在早期的研究中，我们发现酸和胆盐在NES-B细胞中诱导CDX2的表达，但在NES-G细胞中没有。6因此，我们仅用酸性胆盐和阿司匹林(100 μ M)处理NES-B细胞，并评估IκB和p65的磷酸化以及CDX2启动子活性和mRNA表达。阿司匹林治疗可以消除酸性胆盐诱导的IκB磷酸化的增加，但p65没有作用(图5A)阻断p65核易位的增加(图5B).此外，阿司匹林消除了NES-B10T细胞中酸性胆盐诱导的CDX2启动子活性的增加(图5C)，阿司匹林可消除NES-B3T和NES-B10T细胞中酸性胆盐诱导的CDX2 mRNA表达增加(图5D)。
阿司匹林可抑制正常食管鳞癌(NES)-B细胞中IκB磷酸化水平、p65核水平、尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)启动子激活和CDX2信使RNA (mRNA)表达的增加。(A) NES-B10T细胞中具有代表性的蛋白印迹显示磷酸化IκB和总IκB丝氨酸32/36、磷酸化65和总p65 (Ser276)。(B)含和不含阿司匹林的酸性胆盐诱导NES-B10T细胞中p65核蛋白的免疫荧光;4'，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)在同一视野内显示细胞核数量(比例尺=50µm)。(C)在NES-B10T细胞中，酸性胆盐加和不加阿司匹林诱导CDX2启动子激活。柱状图表示均值±SEM。(D)酸性胆盐诱导NES-B3T和NES-B10T细胞内CDX2 mRNA表达的PCR分析。巴雷特上皮细胞系BAR-T作为CDX2 mRNA表达的阳性对照。所示的Western blot是两个独立实验的代表性结果。与非酸性胆汁盐处理的对照组相比，*p≤0.05。 A&B, acidic bile salts; C, untreated controls.
阿司匹林阻断巴雷特食管患者原代食管鳞状细胞中酸和胆盐诱导的CDX2启动子激活
通过从三名Barrett食管患者(原发性NES-B3、NES-B6和NES-B7)的内镜活检中建立的原代食管鳞状细胞培养，我们证实了阿司匹林对酸性胆盐诱导的CDX2启动子激活的影响。在食管鳞状细胞中，酸性胆盐处理导致CDX2启动子活性显著增加，而在所有三种原代细胞培养中，阿司匹林治疗都阻断了CDX2启动子活性(图6)．本文提供了一个概述我们的研究阐明的机制的示意图模型图7．
阿司匹林阻断了巴雷特食管(正常食管鳞状上皮(NES)-B3, NES- b6, NES- b7)患者食管鳞状上皮细胞原代培养中尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)启动子被酸性胆盐激活。柱状图表示均值±SEM。*p与非酸性胆汁盐处理对照组比较<0.05;**p<0.01，与非酸性胆汁盐处理对照组比较。A&B，酸性胆盐。
反流酸和胆盐引起活化B细胞核因子kappa-轻链增强子(NF-κB)通路激活，导致巴雷特食管患者食管鳞状细胞中尾端相关同源体转录因子2 (CDX2)表达的机制原理图。反流酸和胆盐刺激烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH)产生过氧化氢(H2O2)，它激活IκB激酶(IKK)β， IKK β又通过IκB的磷酸化激活IκB- nf -κ b蛋白激酶A催化亚基(PKAc)复合体。这导致IκB的降解，释放p50/p65异源二聚体。激活的IκB-NF-κB-PKAc复合体中的PKAc磷酸化p65，诱导进一步形成p50/p65异二聚体，这些异二聚体转移到细胞核，刺激NF-κB p50靶基因(如CDX2)的转录，这些靶基因可能在柱状化生中发挥作用。阿司匹林可通过阻断IKKβ活性，阻断NF-κB信号通路和CDX2表达。因此，对于那些鳞状上皮易通过化生而非鳞状细胞再生来治愈反流性食管炎的GORD患者，阿司匹林可能能够预防Barrett食管的发展。
讨论
我们对酸和胆盐诱导巴雷特食管患者食管鳞状细胞(NES-B细胞)中CDX2表达的机制进行了探索，但没有在无巴雷特食管的GORD患者食管鳞状细胞(NES-G细胞)中诱导CDX2表达的机制获得了许多新的发现。在NES-B细胞和NES-G细胞中，我们已经证明酸和胆盐激活NADPH氧化酶系统产生H2O2该蛋白通过一系列的磷酸化激活IκB-NF-κB-PKAc复合体。然而，在NES-B细胞中这种复合物的激活程度要大得多，我们发现，与暴露于相同浓度的酸和胆盐的NES-G细胞相比，NES-B细胞中磷酸化的IκB和p65水平要高得多。由于ne - g细胞中IκB-NF-κB- pkac复合体激活有限，p65 NF-κB亚基仍然与细胞质中的IκB结合，与p50亚基不同，p65不转移到细胞核中。这是很重要的，因为我们还证明了核p65蛋白水平的增加是由酸和胆盐激活CDX2启动子所需的，即使只有p50结合启动子。最后，我们证实了阿司匹林可以阻止IKKβ激活IκB，阻断NES-B细胞中IκB的磷酸化、p65的核易位、CDX2启动子的激活以及酸和胆盐诱导的CDX2 mRNA的表达。
在早期的报道中，我们提出反流酸和胆盐激活的食管分子通路的个体差异可能决定反流性食管炎是通过鳞状细胞再生还是通过柱状化生过程治愈。4 - 8我们目前的研究阐明了GORD患者和非Barrett食管患者食管细胞在酸和胆盐激活IκB-NF-κB-PKAc复合体程度上的主要差异。这些差异可以解释我们早期观察到的酸和胆盐在NES-B细胞中诱导CDX2的表达，但在NES-G细胞中没有。CDX2是肠型柱状上皮发育所需的关键同源基因，在反流性食管炎动物模型中，食管鳞状细胞中CDX2的表达预示着肠化生的发展。30 -因此，患者之间在反流诱导食管激活IκB-NF-κB- pkac复合体的程度上的差异(因此NF-κB信号导致CDX2的表达)可能决定了GORD是否导致Barrett肠型化生的发展。目前尚不清楚巴雷特化生的祖细胞是位于食管(鳞状上皮基底细胞或食管腺管细胞)还是位于胃贲门。40在任何情况下，表达CDX2(和NES-B细胞一样)的能力似乎是肠型化生发展的先决条件。41
NF-κB活性可由多种信号触发，所有这些信号最终都集中在一个共同的靶标上——细胞质IκB-NF-κB- pkac复合体。37复合物中IκB蛋白的磷酸化导致其降解，从而释放PKAc和p65 NF-κB亚基。37触发IκB降解的信号也可以激活PKAc磷酸化p65 (Ser276)，这是一种翻译后修饰，有利于p50/p65异二聚体的形成，并刺激p65的转录活性。36，37，42此外，在免疫沉淀实验中，PKAc的激活强度已被证明与p65结合的PKAc的丢失有关。37通过免疫沉淀和western blotting，我们发现PKAc确实与IκB和p65在食道鳞状细胞中共同存在。我们还发现，酸和胆盐导致p65与IκB和PKAc结合的显著降低，并伴有NES-B细胞中p50/p65异源二聚体形成的轻微增加和NF-κB/p65转录活性的显著增加，但在nees - g细胞中没有。
非甾体抗炎药、巴雷特化生和巴雷特癌之间的联系仍然是一个极具争议的话题，不同的研究有时会得出相互矛盾的结论。例如，最近的一项研究使用meta分析方法，从BEACON联盟进行的病例对照研究中收集数据，发现使用非甾体抗炎药(包括阿司匹林)和巴雷特食道之间没有显著联系。43我们的分子研究已经为病例对照研究的发现提供了一个潜在的解释，即阿司匹林可以防止Barrett食管的发展，而其他非甾体抗炎药则不能。11，12与其他非甾体抗炎药不同，阿司匹林阻断ATP与IKKβ的结合，从而使其磷酸化IκB的主要功能失效。35我们发现阿司匹林100 μ M可抑制酸和胆盐诱导的es - b10t细胞中磷酸化i κ b、CDX2启动子激活和CDX2 mRNA表达的增加。我们并不惊讶阿司匹林对p65的磷酸化没有影响，因为这是PKAc的作用，一种不被阿司匹林抑制的酶。通过三种来自Barrett食管GORD患者的原代鳞状细胞培养，我们证实阿司匹林可以阻断酸和胆盐诱导的CDX2启动子激活。服用阿司匹林治疗慢性炎症疾病的患者血清浓度在1000-5000 μ M之间，因此，口服给药很容易达到100 μ M的血清浓度。15因此，我们阐明了一种分子机制，即阿司匹林可能保护GORD患者的Barrett's食管的发展，其鳞状上皮表达CDX2以响应酸和胆汁的反流。
最后，我们的研究结果可能对采用射频消融术(RFA)治疗的Barrett患者的管理有重要的意义，射频消融术目前是切除发育不良Barrett食管的首选内镜手术。3.射频消融使用导管为基础的球囊植入电极，将射频能量输送到化生粘膜，造成广泛的周向热损伤。然后患者用质子泵抑制剂(PPIs)治疗，以控制胃酸反流，并使消融的化生柱状黏膜与新鳞状上皮愈合。早期研究表明RFA后Barrett化生复发率较低，但最近的研究显示复发率高得多，在一些报道中，4年内患者的复发率接近50%。44这些复发的起源尚不清楚，但似乎可能是由gord诱导的食道损伤引起的，而PPI治疗并不能完全防止这种损伤。即使是高剂量的PPIs，也不能使许多巴雷特食管患者的食道酸暴露正常化，尽管PPI治疗，胆汁酸反流仍在继续。45如果复发性巴雷特化生的发病机制涉及反流酸和胆盐触发IκB-NF-κB- pkac复合体的激活，NF-κB信号通路导致CDX2的表达，那么阿司匹林治疗可能会中断这一过程。因此，我们的研究结果为阿司匹林(与PPIs联合使用)阻断食管上皮细胞NF-κB激活以防止RFA后Barrett's化生复发的临床试验提供了分子基础。
总之，我们证明了在酸和胆盐激活NF-κB通路的强度上，来自Barrett食管和非Barrett食管的GORD患者的食管鳞状细胞存在显著差异。虽然酸和胆盐增加H2O2通过NADPH氧化酶系统在两种食管鳞癌患者的食管鳞状细胞，H2O2充分激活NF-κB通路，仅在Barrett患者的鳞状细胞中引起CDX2的表达。此外，我们发现阿司匹林可以通过抑制IκB的磷酸化来阻断酸和胆盐诱导的CDX2表达。这些发现阐明了分子机制，这可能解释了为什么有些GORD患者出现巴雷特食管，而另一些则没有，以及为什么阿司匹林在最近的一些病例对照研究中似乎可以防止巴雷特食管的发展。这些结果也为应用阿司匹林预防RFA后复发性巴雷特化生的临床试验提供了理论依据。
参考文献
脚注
贡献者XH:研究设计;技术和物资支持;数据分析和解释;对稿件进行批判性修改;重要的知识内容;起草稿件。XZ、CY、EC、QZ、KBD、THP、JPL和DHW:技术和材料支持;重要的知识内容。RSB:学习概念;对手稿和重要的知识内容进行批判性的修改。 SJS: study concept; analysis and interpretation of data; critical revision of manuscript and important intellectual content. RFS: study concept/design; analysis and interpretation of data; critical revision of manuscript; important intellectual content and drafting of manuscript.
资金这项工作得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究项目(SJS)的优秀评审奖#BX002666的支持，美国国立卫生研究院(R01-DK63621和R01-DK103598);K12 HD-068369和K08-DK099383到EC;R01-DK097340 DHW;(to - rfp S-2014 MDA2013-02-02发给RSB;NCI BETRNet项目CA163004和职业发展奖OD 012097授予JPL;美国胃肠病协会June和Donald O. Castell食道临床研究奖(授予KBD);
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相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准这些研究得到了达拉斯退伍军人医疗中心机构审查委员会的批准。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。