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摘要
背景与目的:细菌性痢疾(BD)后肠易激综合征(IBS)或功能性肠道疾病(FBD)的发病率尚未得到广泛评估，对感染后(PI) IBS的发病机制知之甚少。因此，我们调查了中国BD康复患者中IBS和FBD的发病率，为了进一步阐明其发病机制，我们研究了神经免疫的变化，包括白细胞介素(IL)、肥大细胞、神经肽以及肥大细胞与肠神经的关系。
方法:一项队列研究纳入了295名双相障碍康复患者(71.4%从粪便中发现志贺氏菌)和243名对照组，包括未感染双相障碍的患者兄弟姐妹或配偶。所有受试者都接受了1-2年的问卷调查，以探讨罗马II标准定义的FBD和IBS的发生率。在56例其他来源的肠易激综合征(PI和非PI)中，用抗胰蛋白酶抗体染色肠粘膜活检标本，并在光镜下计数肥大细胞数量。此外，肥大细胞与神经元特异性烯醇化酶(NSE)、P物质(SP)、5-羟色胺(5-HT)或降钙素基因相关肽阳性神经纤维的关系用阿利新蓝和神经肽抗体双染色观察。在56例肠易激综合征患者中随机抽取30例(PI-IBS, n = 15)，采用逆转录-聚合酶链反应检测肠黏膜中白细胞介素(IL)-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra) mrna的表达。将上述结果与12个非ibs对照组进行比较。
结果:在BD感染队列中，FBD和IBS的发生率分别为22.4%和8.1%(合计)-10.2%(在who志贺氏菌中)，显著高于对照组FBD(7.4%)和IBS(0.8%)的发生率(p<0.01)。长时间的腹泻(小于7天)与较高的FBD风险相关(优势比3.49(95%置信区间1.71-7.13)。PI-IBS患者回肠末端和直肠乙状结肠黏膜IL-1β mRNA表达明显升高(p<0.01)。PI-IBS组回肠黏膜肥大细胞数量(11.19个(2.83个))和非PI-IBS组(10.78个(1.23个))明显高于对照组(6.05个(0.51个)(p<0.01)。此外，在IBS患者的回肠末端和直肠乙状结肠黏膜，NSE、SP和5-HT阳性染色的神经纤维密度增加(p<0.05)，呈簇状，周围肥大细胞数量增加(与对照组相比p<0.01)。
结论:BD是PI-IBS的一个致病因素。免疫系统和神经系统可能都在PI-IBS的发病机制中发挥重要作用。
- BD，细菌性痢疾
- FBD，功能性肠道疾病
- IBS，肠易激综合症
- ,白介素
- IL-1ra，白细胞介素1受体拮抗剂
- π,post-infective
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- NSE，神经元特异性烯醇化酶
- SP，物质P
- 降钙素基因相关肽
- 5、5 -羟色胺
- SA-HRP，链霉亲和素辣根过氧化物酶
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- 肠易激综合症
- 功能性肠病
- 菌痢
- 白介素
- 肥大细胞
- 肠神经纤维
数据来自Altmetric.com
- BD，细菌性痢疾
- FBD，功能性肠道疾病
- IBS，肠易激综合症
- ,白介素
- IL-1ra，白细胞介素1受体拮抗剂
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- SA-HRP，链霉亲和素辣根过氧化物酶
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
先前的研究表明，传染性腹泻后6个月功能性肠道疾病(FBD)的患病率为25%。1，2英国的一项研究表明，在一年的随访中，细菌性胃肠炎发作后，肠易激综合征(IBS)的诊断率为4.4%，而普通人群队列的诊断率为0.3%。3.我们的研究提供了进一步的证据，表明既往有痢疾病史是一个重要的危险因素(优势比3.00;p<0.001)。4然而，细菌性痢疾(BD)后IBS或FBD的患病率尚未得到广泛评估。
此外，对感染后肠易激综合征(PI-IBS)的发病机制知之甚少。只有25%的感染性腹泻患者出现肠易激综合征样症状，这一事实表明，在这些感染患者中出现肠易激综合征症状需要其他先决条件，如神经和免疫系统的相互作用。5研究认为，脑肠相互作用在肠易激综合征的发病机制中起着重要作用。肠神经和免疫细胞成分之间可能存在联系。根据目前的文献，我们认为肥大细胞可能是急性肠道感染期间连接局部免疫反应和神经激素系统的可能候选者。6,7
本研究的目的是:(1)探讨PI-IBS和FBD后的发生率;(2)鉴定PI-IBS和非PI-IBS患者的肠道免疫反应，特别是白细胞介素(IL)的表达和肥大细胞的数量;(3)探讨肠易激综合征发病机制中肥大细胞与肠神经的关系。
患者与方法
研究设计/患者
来源一:后续研究
本研究以1998年4月至10月在北京协和医院痢疾门诊就诊的双相障碍患者及其未感染双相障碍的家庭成员为研究对象，随访时间为1-2年，主要通过详细的症状问卷进行电话采访。急性双相障碍通过粪培养阳性或基于以下标准诊断:(1)下腹痛、直肠灼烧和急性腹泻症状;(2)粪便分泌物镜检显示多形核白细胞>15/ /高倍镜，未发现原生动物或卵细胞;(3)经抗生素治疗治愈，无复发。
在队列研究中，在同一时期没有发生痢疾或急性感染性腹泻发作的患者的兄弟姐妹或配偶被纳入对照。患者人数和来源见图1。
显示病人数量和来源的流程图。BD，细菌性痢疾;FBD，功能性肠道疾病;IBS，肠易激综合症;π,post-infective。
来源二:涉及肥大细胞/神经纤维和白介素研究的受试者
患者来自PUMCH胃肠病学诊所(图1)。56例符合Rome II标准并有急性症状的腹泻型肠易激综合征患者进行了肠粘膜肥大细胞数量和神经纤维密度检查。该组包括25名男性和31名女性(平均年龄43.3岁)。其中，27例有传染性腹泻史，经抗生素治疗成功的患者被认为是PI-IBS(其中11例从原始粪便培养中鉴定出志贺氏菌)。其余29例无感染性腹泻史，归为非pi - ibs;在IBS发病前有肠道症状的患者被排除在外。所有受试者均接受了以下检查以排除其症状的解剖学或生化解释:详细的病史;体格检查;常规血液、尿液和粪便分析;凳子文化;血液化学测试; abdominal ultrasonography; and colonoscopy. During colonoscopy, one mucosal biopsy specimen was taken at each of the following locations: 5 cm proximal to the ileocaecal valve and at the rectosigmoid junction. Specimens were freshly suspended in formalin for Immunohistochemical study. In 30 cases taken at random from the 56 patients, an additional biopsy specimen was obtained at each location and stored in liquid nitrogen for investigation of IL mRNA expression. There was no difference (p>0.05) in onset to biopsy interval between PI-IBS (mean 1.32 (SD 0.6) years) and non-PI-IBS (1.57 (0.56) years) patients. Twelve subjects (five male and seven female; mean age 43.4 years) who had a negative screening colonoscopy as part of a health examination (n = 3), for rectal bleeding finally diagnosed as haemorrhoids (n = 6), or for post-polypectomy surveillance (n = 3), and who had no bowel symptoms, served as controls for both study groups. The control group underwent the same examination procedure as the study groups and two biopsies at each location were taken during colonoscopy. All biopsies were approved by the examinees.
问卷调查
根据Neal和同事的报告，在后续研究中，患者和对照组受试者回答了相同的问卷2稍加修改。问题涉及痢疾发作后出现的症状，如:腹部不适或疼痛、大便形式、排便习惯改变、紧迫感、排便紧张或排便不完全、粘液或粘液排出、腹胀或腹胀感。问题还涉及患者的一般健康状况、既往病史和痢疾发生前一年的排便习惯。所有问题之后都是“如果是，从什么时候开始，一周多少天，一年多少个月”?
大多数(90%)患者及其家属接受了电话采访，其余通过邮件进行采访。根据Rome II标准诊断FBD或IBS。8FBD包括其他功能性肠道疾病以及IBS(见表1脚注)。
IL mrna表达的鉴定
IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1ra) mrna鉴定如下:用Trizol (Gibco)试剂从粘膜活检中提取RNA按照公司提供的程序进行，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)按照Jobin和Gauthier的程序进行9稍加修改。RT-PCR试剂盒来自博大公司(北京，中国)。
RT反应如下:dNTP 1 μl, M-MuLV 1 μl, 5×M-MuLV buffer 1 μl，随机引物1 μl, Rnase inhibitor 0.5 μl, RNA样品4 μl，再加ddH2加入O，最终量为20 μl。在37°C下反应2小时，然后在95°C下反应5分钟。
PCR时，RT产物4 μl与1 μl dNTP、0.5 μl Taq聚合酶、5 μl 10×PCR反应缓冲液、5 μl 15mm MgCl孵育24 μl IL-1α (P1: 5 ' -gtc TCT gaa tca gaa atc CTT cta tc-3 ';P2: 5 ' -CAT GTC AAA TTT-CAC TGC TTC ATC -3 '， 420 bp产品);4 μl IL-1β1: 5 ' -ata agc cac TCT aca-gct-3 ';P2: 5 ' -ATT GGC CCT GAA AGG AGA GA-3 '， 436 bp产品);4 μl IL-1ra1: 5 ' -ggc CTC CGC agt cac cta atc act ct-3 ';P2: 5'TAC TAC TCG TCC TCC tg - aag TAG AA-3 '， 521 bp产品);1 μl β-肌动蛋白(P1: 5'gaa TTC atg TTT gag acc TTC aa3 ';P2: 5'CCG GAT CCA TCT CTT GCT-CGA AGT CCA-3 '， 318 bp产品)。dd H2加入O，最终量为50 μl。IL-1α、IL-1β和β-肌动蛋白的PCR反应条件为:94°C 5分钟，然后在94°C 50秒、55°C 50秒、72°C 1分钟下进行35个循环;72°C下再伸展6分钟。IL-1ra PCR反应的条件为:94℃5分钟，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃3分钟，35个循环;在72°C下重新伸展8分钟。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，IL-1α、IL-1β、IL-1ra和β-actin条带的mrna照片作为互补cdna表达，并用Phoretix ID Advanced软件进行检测。每个样本中IL-1α、IL-1β或IL-1ra的cDNA强度用β-肌动蛋白的强度归一化(相对IL-1强度= IL-1强度/β-肌动蛋白强度)。
肥大细胞和神经纤维的免疫组化研究
采用兔抗肥大细胞胰酶(福州迈新公司)对黏膜肥大细胞进行染色。组织切片(4 μm)用兔抗ast细胞tryptase在4℃孵育过夜。然后，在37°C下加入山羊抗兔生物素化IgG和链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP) 30分钟。用二胺联苯胺染色。在每一步之间用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗所有载玻片。
根据Stead及其同事的方法，通过肥大细胞和神经肽双染色研究肥大细胞和神经纤维之间的关系，6稍加修改。兔神经元特异性烯醇化酶(NSE)、P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)和5-羟色胺(5-HT)抗血清抗体来自福州麦新股份有限公司。除中性福尔马林外，活检标本进一步在乙酸/乙醇(1:9)中固定8小时。组织切片用阿利新蓝8GX (Sigma)染色后，在4℃下加入兔抗人抗体(NSE、SP、CGRP或5-HT)过夜，在37℃下加入山羊抗兔生物素化IgG 10-30分钟。用SA-HRP处理玻片。用3-氨基-9-乙基咔唑染色。每一步之间用PBS冲洗所有载玻片。PBS代替一抗处理对照载玻片。
肥大细胞计数和神经肽染色评分采用单盲(即检查者在不了解患者状况或诊断的情况下阅读玻片)。每个患者的样本都被随机分配的数字编码;单元格计数后，代码被破解。计算和记分系统如下:
Biostatistical分析
所有项目分析的频率在研究组和对照组之间用χ进行比较2测试。采用回归分析和变异分析探讨危险因素。
细胞计数表示为高倍显微镜下每个场的细胞数(平均值(SD))。神经纤维染色阳性表达为高倍显微镜下每个野区评估的数值评分(平均值(SD))。在比较中使用了一种方差分析。p<0.05为差异显著;P <0.01为极显著差异。
结果
后续研究
共有329例患者参与研究(有效率73.1%)。34例有FBD病史的应答者被排除在外。其余295例无FBD病史的患者纳入研究。71.4%的病例从粪便培养中鉴定出志贺氏菌。由于最终分析中IBS或FBD的发生率在细菌可识别组和不可识别组之间没有显著差异(p>0.05)，因此在分析中合并了数据。
295例感染性腹泻病例中，男女比例为1:1.34。虽然243个对照组的男女比例较高(1.53:1)，但FBD或IBS的发病率在性别之间没有显著差异(p>0.05)。感染性腹泻组的平均年龄为40.74岁(SD 14.94岁)，对照组为41.26岁(14.76岁)。两组在年龄和经济地位方面具有可比性。
感染性腹泻和对照组FBD和IBS的发生率
BD组随访1-2年，66例(22.4%)发生FBD, 24例(8.1%)发生IBS。志贺氏菌感染患者IBS发生率为10.2%(24/235)。对照组FBD发生率为7.4%，IBS发生率为0.8%，显著低于BD组(p<0.01)。
感染性腹泻期间FBD的危险因素
变异的回归分析表明，感染性腹泻持续时间的延长导致FBD发病率的增加(表1)。如果感染持续时间超过7天，与持续时间少于一周的患者相比，患者未来发展FBD的风险增加2.5倍。因此，我们得出结论，感染性腹泻的持续时间是FBD的一个重要危险因素。
在我们的研究中，性别或年龄对FBD或IBS的发生率无显著影响(p>0.05)。
肠黏膜中il - mrna的表达
在PI-IBS患者中，回肠末端粘膜或直肠乙状结肠黏膜中IL-1β mRNA (RT-PCR在436 bp处鉴定为cDNA)的表达明显高于非PI-IBS患者或对照组(表2，图2)。
白细胞介素1β (IL-1β) mRNA在肠易激综合征(IBS)患者和对照组肠黏膜中的表达逆转录-聚合酶链反应产物电泳;IL-1β mrna在436 bp处表达为互补cdna。粘膜标本来自:感染后(PI)-IBS患者直肠乙状结肠连接处1道;PI-IBS患者回肠末端2巷;非pi - ibs患者的直肠乙状结肠连接处3道;非pi - ibs患者回肠末端4巷;对照组直肠乙状结肠连接处5巷;以及对照组回肠末端的6号巷。IL-1β mrna在PI-IBS患者中的表达(如1和2通道所示)明显高于非PI-IBS患者和对照组。
IBS组间IL-1α或IL-1ra mrna的表达无差异(p>0.05)， IBS组与对照组之间也无差异(p>0.05)。
肠易激综合征患者肠黏膜肥大细胞数量及肥大细胞与神经纤维的关系
肠易激综合征患者和对照组肠黏膜肥大细胞数量
PI-IBS组回肠黏膜肥大细胞数量(11.98(2.83))和非PI-IBS组(10.78(1.23))明显高于对照组(6.05 (0.51)(p<0.01)(表3)。与对照组相比，两组肠乙状结肠黏膜肥大细胞数量无显著性差异(p>0.05)。在任何一个部位，PI-IBS患者和非PI-IBS患者的肥大细胞数量均无显著差异(p>0.05)。
IBS患者肠黏膜NSE、SP、5-HT、CGRP阳性纤维表达评分及神经纤维与肥大细胞的关系
如表3所示，与对照组相比，PI-IBS和非PI-IBS患者回肠末端粘膜或直肠乙状结肠交界处NSE、SP和5-HT阳性纤维表达评分显著升高(p<0.05)。但两组间CGRP阳性纤维的表达均无显著性差异(p>0.05)。PI-IBS患者和非PI-IBS患者的NSE、SP、5-HT或CGRP阳性纤维的黏膜表达在任何部位均无差异(p>0.05)。
使用双染色技术，可以识别肥大细胞和抗体染色的神经纤维之间的关系。神经纤维被染成鲜红色，呈簇状紧密环绕肥大细胞(图3)。在肠易激综合征患者中，与对照组相比，肥大细胞周围染色呈阳性的神经纤维密度显著增加，回肠黏膜末端被这些纤维包围的肥大细胞数量也增加(6.73(1.02))。v4.25 (0.50);6.84 (0.85)v4.28 (0.40);6.72 (0.81)v4.00 (0.63);6.73 (0.82)vNSE、SP、5-HT和CGRP染色纤维分别为4.33 (0.54);所有p < 0.01)。然而，PI-IBS组与非PI-IBS组之间无差异(p>0.05)。
肠易激综合征(IBS)患者(A)和对照组(B)回肠末端粘膜(×1000)中神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色神经纤维的表达。肥大细胞染色为蓝色，含有NSE的纤维染色为红色。在IBS患者黏膜中，在多个肥大细胞周围有高密度的暗红色NSE纤维，而在对照组中，在少数肥大细胞周围有非常有限的染色纤维。
讨论
我们对295例没有FBD病史的BD康复患者的研究表明，在1-2年的随访期后，22.4%的患者出现FBD症状，8.1%(总共)-10.2%(其中发现志贺氏菌)的病例出现了ibs样症状，如Rome II标准所定义的。对照组由243名无BD发作的受试者组成，在年龄、经济和社会地位与研究队列相当，FBD和IBS症状的发展分别仅发生7.4%和0.8%，显著低于研究组(p<0.01)。我们的研究结果与尼尔报告的结果相似等在英国(FBD 25% IBS 7%)，2尽管他们的病人有食物中毒，主要由弯曲杆菌或沙门氏菌感染引起，我们的病人患有双相障碍，其中大多数感染了志贺氏菌。我们还注意到，双相障碍持续时间越长，FBD的发生率越高，这可能是由于初始治疗延迟或不恰当，或更严重的炎症导致了神经纤维的更深损伤。10日,11本研究建议急性肠道感染初期应给予有效的治疗，以防止易感病例随后发展为FBD或IBS。
我们观察到PI-IBS患者肠黏膜中IL-1β mRNA的表达显著增加，这进一步支持了PI-IBS由炎症反应增强引起的观点。我们的观察结果与Gwee和同事的报道相似。12他们发现在急性胃肠炎后3个月出现IBS症状的患者直肠黏膜中IL-1β mRNA的表达增加，但我们的研究提供了感染后炎症反应持续时间更长的证据。我们还检测到肠易激综合征患者回肠末端固有层内肥大细胞数量的增加。这与Sullivan及其同事的研究是一致的。13在另一项研究中，我们发现IBS患者活跃期肠黏膜肥大细胞群的激活率为85%，而非IBS对照组仅为15% (p<0.01)(待发表)。肠黏膜肥大细胞数量的增加和激活以及其介质(以IL-1β为代表)的释放可能反映了PI-IBS患者对先前炎症的免疫反应增强。IL-1β的释放可能通过抑制水、电解质和小颗粒的肠道运输而导致生理功能的改变，如腹泻。14日,15此外，IL-1β是一种有效的促痛觉过敏剂，可能是导致肠易激综合征直肠刺激过敏的原因。16最近，其他作者17，18在IBS患者的结肠粘膜中观察到T淋巴细胞数量显著增加，这表明这些患者的免疫反应持续存在。这些观察结果以及我们对PI-IBS患者中肥大细胞数量增加和IL-1β mRNA高表达的研究结果强烈表明，粘膜免疫系统激活作为炎症反应可能在PI-IBS的发病机制中发挥重要作用。
我们的研究进一步证明了肠易激综合征患者肠粘膜中的肥大细胞与肠神经之间存在紧密的附着。Stead和同事6十多年前指出，在一些结肠结构疾病中，从回肠到乙状结肠的人类黏膜中，肥大细胞与神经之间存在密切关系。在本研究中，我们能够在IBS患者中进一步证明，较高密度的阳性染色神经纤维(如NSE、SP和5-HT纤维)紧密附着在肠粘膜的肥大细胞上。此外，与正常对照组相比，IBS患者(PI-IBS和非PI-IBS)中被神经纤维包围的肥大细胞数量显著增加(p<0.01)。斯皮勒和同事们17还发现弯曲杆菌肠炎后PI-IBS患者直肠黏膜中肠内分泌细胞(包括含5-HT的细胞)和T淋巴细胞数量增加。免疫细胞/肥大细胞与肠神经之间的这种联系是重要的，因为它为免疫细胞与神经之间的动态相互作用提供了结构要求，从而形成对肠功能的综合神经-免疫调节。这是最近其他调查人员的推测。19，20.5-HT的鉴定和激发进一步支持了这一假设3.大鼠结肠感觉神经元上的受体。21，22神经肽，如SP和CGRP，可以向相反方向调节肥大细胞的活性。23因此，影响神经系统的因素也可能通过这一途径参与IBS的发病。
总之，我们的研究为BD是PI-IBS的致病因素提供了新的证据。我们观察到PI-IBS患者炎症反应增强，肠黏膜出现神经和肥大细胞聚集，提示免疫系统和神经系统在PI-IBS的发病中都起重要作用。然而，我们无法解释在非PI-IBS和PI-IBS患者中，肥大细胞的数量也增加了，阳性染色神经纤维的表达也增加了。我们不知道PI-IBS是否代表一种特殊形式的IBS，或者所有形式的IBS的发展是否必须经历相同的发病机制。需要进一步的研究来阐明这个问题。
参考文献
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