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  • 巨噬细胞直接通过LOXL2-mediated癌细胞在胰腺导管腺癌转移级联

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菜单条
胰腺
原始研究
巨噬细胞直接通过LOXL2-mediated癌细胞在胰腺导管腺癌转移级联
  1. 玛尔塔Alonso-Nocelo1,2,
  2. 劳拉Ruiz-Canas1,2,
  3. 帕特丽夏桑丘3,
  4. Kıvanc Gorgulu4,
  5. 索尼娅Alcala1,2,
  6. 珊瑚Pedrero1,2,
  7. Mireia Vallespinos1,2,
  8. 胡安•卡洛斯Lopez-Gil1,2,
  9. 玛丽娜Ochando1,2,
  10. 埃琳娜Garcia-Garcia5,
  11. 莎拉玛丽亚大卫Trabulo6,
  12. Paola Martinelli7,
  13. 帕特丽夏Sanchez-Tomero1,2,
  14. 卡门Sanchez-Palomo8,
  15. 帕特丽夏Gonzalez-Santamaria1,9,
  16. 卢尔德Yuste1,2,9,
  17. 索尼娅玛丽亚Wormann10,
  18. Derya Kabacaoğlu4,
  19. 朱莉伯爵11,12,
  20. 阿尔贝托•马丁1,
  21. 费尔南多·萨尔瓦多1,
  22. 桑德拉·瓦莱1,2,
  23. 劳拉Martin-Hijano1,2,
  24. 阿尔弗雷多Carrato11,12,13,
  25. 莫特Erkan14,
  26. 劳拉Garcia-Bermejo15,
  27. 帕特里克·C赫尔曼16,
  28. Hana Algul4,
  29. 能Moreno-Bueno1,9,17,18,
  30. 克里斯托弗Heeschen6,19,
  31. 旧金山波蒂略1,17,
  32. “卡诺1,9,17,
  33. Bruno赢面小1,2,12
  1. 1马德里自治大学Departament的生物化学、(UAM),Departament癌症生物学、研究院Investigaciones基于Alberto溶胶CSIC-UAM,马德里、西班牙
  2. 2癌症干细胞和Fibroinflammatory微环境组、慢性疾病和癌症,面积3,皇家研究院·拉蒙-卡哈尔de Investigacion疗养地(IRYCIS),马德里、西班牙
  3. 3米格尔Servet转化研究单位,医院,阿拉贡研究院Investigacion疗养地,萨拉戈萨、西班牙
  4. 4综合癌症中心慕尼黑,Klinikum雷希特der Isar der Technischen大学慕尼黑,慕尼黑、德国
  5. 5Departamento de解剖学Patologica, Fundacion Alcorcon大学医院,Alcorcon、西班牙
  6. 6干细胞和癌症组、分子病理学课程,西班牙国家癌症研究中心(CNIO),马德里、西班牙
  7. 7癌症研究所综合癌症中心,Medizinische大学维恩,维恩、奥地利
  8. 8Departamento de解剖学Histologia y Neurociencia,马德里自治大学,马德里、西班牙
  9. 9癌症和人类分子遗传学,皇家研究院Investigacion IdiPAZ疗养院,马德里、西班牙
  10. 10艾哈迈德为胰腺癌研究癌症中心,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,德州美国
  11. 11分子流行病学和预测肿瘤标记物组、慢性疾病和癌症,面积3,皇家研究院·拉蒙-卡哈尔de Investigacion疗养地(IRYCIS),马德里,西班牙,马德里、西班牙
  12. 12胃肠道肿瘤的研究项目,在癌症生物医学研究网络(CIBERONC),马德里、西班牙
  13. 13Alcala大学,马德里、西班牙
  14. 14大学转化医学研究中心——KUTTAM,伊斯坦布尔、土耳其
  15. 15生物标志物和治疗目标群体,面积4,皇家研究院·拉蒙-卡哈尔de Investigacion疗养地(IRYCIS),马德里、西班牙
  16. 16内科,乌尔姆大学,乌尔姆、德国
  17. 17乳腺癌的研究项目,在癌症生物医学研究网络(CIBERONC),马德里、西班牙
  18. 18国际队Fundacion MD安德森,马德里、西班牙
  19. 19单细胞组学中心和重点实验室的癌基因及相关基因,上海交通大学医学院,上海,中国
  1. 对应到小布鲁诺赢面博士Departamento de Bioquimica马德里自治大学(UAM),学院Investigaciones基于阿尔贝托溶胶,马德里,西班牙;bsainz在{}iib.uam.es

文摘

客观的的lysyl oxidase-like蛋白2 (LOXL2)有助于肿瘤进展和转移在不同肿瘤实体,但它的作用在胰腺导管腺癌(PDAC)尚未评估在免疫活性的体内PDAC模型。

设计为此,我们使用PDAC病人数据集,patient-derived异种移植体内和体外模型,和四个条件转基因小鼠模型(GEMMS)在PDAC解剖LOXL2的作用。GEMM-based研究k -+ / LSL-G12D;Trp53LSL-R172H;Pdx1-Cre老鼠(KPC)和k -+ / LSL-G12D;Pdx1-Cre老鼠(KC)交叉Loxl2等位基因(液氧老鼠Loxl2Exon2fl / fl)或条件Loxl2overexpressing老鼠(R26Loxl2KI /吻)生成KPCL2KO或KCL2KO和KPCL2KI或KCL2KI老鼠,它被用来研究总体存活率;肿瘤发病率、负担和分化;转移;上皮间充质转变(EMT);具备干细胞和胶原蛋白细胞外基质(ECM)的组织。

结果使用这些PDAC小鼠模型,我们表明,Loxl2消融对主要肿瘤发展和增长几乎没有影响,其损失明显减少转移和提高总体生存率。我们认为这种效应non-cell自治因素,主要是ECM重塑。Loxl2超表达,另一方面,促进小学和转移肿瘤增长和总体存活率下降,这可能与增加EMT和具备干细胞。我们还发现了肿瘤macrophage-secreted制瘤素M (OSM)作为诱导物LOXL2表达式,并显示目标体内巨噬细胞的影响Osm和Loxl2表达和胶原纤维排列。

结论综上所述,我们的研究建立在PDAC LOXL2小说病理生理角色和功能,这可能是潜在的用于治疗转移性疾病。

  • 胰腺癌
  • 细胞基质的相互作用
  • 巨噬细胞
  • 分子肿瘤学
  • 胰腺纤维化

数据可用性声明

本手稿中使用数据集的数据可在公共、开放获取存储库。其他数据是可用的合理要求。https://www.nature.com/articles/ng.3398;https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885 - 016 - 2540 - 6;//www.marcconsult.com/content/66/9/1665。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2021 - 325564

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 胰腺导管腺癌的特点之一(PDAC)肿瘤微环境是一个广泛的多反应,包含一个致密的纤维组织和丰富collagen-rich细胞外基质(ECM),可以调节肿瘤形成、发展和药物抗性。

    • 赖氨酰化氧的蛋白质家族,包括lysyl oxidase-like蛋白2 (LOXL2),负责ECM胶原蛋白和弹性蛋白交联,导致生物化学、物理和机械效应,调节肿瘤进展。

    • LOXL2已经被证明可以提高肿瘤进展,入侵和转移的肿瘤实体通过细胞自动机制,激活等上皮间充质转变(EMT)和non-cell自治机制,如ECM组织。

    本研究的意义

    有什么新发现吗?

    • 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)分泌制瘤素M (OSM)作为诱导物PDAC LOXL2表达的肿瘤。

    • 的损失Loxl2在喀斯特G12D借PDAC老鼠肿瘤显著降低转移,并提高了整体生存,通过non-cell自治因素,主要是ECM胶原重塑。

    • 过度的Loxl2在喀斯特G12D借PDAC老鼠肿瘤促进小学和转移肿瘤生长,减少整体生存,通过增加EMT和具备干细胞。

    • 针对tam体内减少Osm和Loxl2表达,导致减少转移。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 如何以及何时LOXL2目标PDAC肿瘤发展可能有不同的含义和生物效应。

    • LOXL2抑制剂用于结合tam的抑制剂或OSM-mediated信号可能把减少PDAC肿瘤细胞的转移潜能。

    介绍

    胰腺导管腺癌(PDAC)是一种最致命的固体肿瘤和癌症相关死亡的最常见原因之一。1 2PDAC一直治疗患者一般来说,同样的,没有分层治疗协议,很大程度上是由于分类/分子亚型的共识并不存在。然而这教条,被众多挑战转录组研究在过去的十年里,尽管许多亚型识别在不同研究中,两个子类型不断出现:(1)祖/古典和(2)quasi-mesenchymal /鳞状基底。3

    虽然这些分子资料尚未影响临床治疗决策,他们用来增强肿瘤微环境的作用在PDAC(时差)。4 - 6PDAC的特点之一是一个复杂的多细胞时间的发展,广泛的多反应,由致密的纤维组织的特征7可以发挥重要的生化、物理和机械影响PDAC细胞,8以及丰富的细胞外基质(ECM),由胶原、纤连蛋白,透明质酸和tenascin C等组件。9刚度和ECM调节肿瘤组织主要通过胶原沉积增加,交联纤维排列。而后者与PDAC肿瘤进展,有关药物抗性和转移,10 - 13基质和ECM的pro-tumour作用(即胶原蛋白沉积)PDAC最近挑战,14日15强调我们仍然在PDAC基质的完整理解。

    为此,我们开始着手评估在PDAC ECM组织的作用。ECM的交联的胶原蛋白和弹性蛋白主要是催化了赖氨酰化氧(LOX)家族的蛋白质,由五名成员组成的(LOX和四个相关的酶,lysyl oxidase-like蛋白1 (LOXL1) 4)。16 - 19液态氧和LOX-like蛋白质,特别是LOXL2,调查在许多肿瘤实体;但是,没有共同的普遍的作用机制已被确认为液态氧或特定LOX-like蛋白质提高肿瘤进展,入侵和转移,在18到22岁表明肿瘤特定细胞自治以及non-cell自治因素可能在起作用。

    这些挑战阻碍了翻译LOX-like的蛋白质和LOX抑制剂的诊所,但同时强调进一步调查这些蛋白质在肿瘤特异的上下文中的角色仍然是需要的。因此,由于PDAC pro-tumour胶原纤维组织的作用,和我们以前的研究在其他肿瘤实体解剖LOXL2的角色,汽车出行我们利用PDAC病人数据集,人类patient-derived异种移植模型和我们之前发表Loxl2基因敲除小鼠模型和超解剖LOXL2的角色在PDAC肿瘤起始,进展和转移。

    方法

    基因表达数据集,GSEA分析,kaplan meier和皮尔逊相关分析

    在这项研究中使用的基因表达数据集是公开的。从Janky数据集等28从地理下载(GSE62165);Moffit所的数据集等4从地理下载(GSE71729);和元数据集,数据集包含GSE15471, GSE16515, GSE22780 GSE32688,生成所述ref29日。

    PDAC patient-derived异种移植

    先前建立PDAC patient-derived异种移植(PDAC PDX)获得博士曼努埃尔·伊达尔戈在材料转让协议Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (CNIO)(参考编号I409181220BSMH)。表示pdx扩大在女性6 - 8周前NU-Foxn1nu裸体小鼠(Envigo、西班牙)如前所述。30.pdx 110314年、140114年和010414年主要源于病人PDAC雷希特der Isar医院肿瘤切除,慕尼黑工业大学,随后CNIO建立。

    细胞培养

    人类Panc185、Panc215 Panc253, Panc010414 Panc354 PDAC PDX-derived文化建立了如前所述。30.建立KPC文化一直先前描述31日使用惟一标识符和细胞系编号(如ID6, ID11 ID85, ID95)。KPCL2KO和KPCL2KI从移植肿瘤细胞系建立了。简单地说,肿瘤被剁碎,与胶原酶酶消化(胶原酶类型P,猫没有。J62406.03阿尔法蛇丘)和随后的RPMI 1640媒体(表达载体,猫没有。61870044)含10%胎牛血清(表达载体)和50个单位/毫升青霉素和链霉素(表达载体,猫没有。11548876)。上皮细胞克隆选择,汇集,进一步扩展到异构癌症细胞系,re-genotyped描述26使用惟一标识符和编号(如ID11, ID32 ID86)。

    基因改造小鼠模型

    PDAC的小鼠模型:k -+ / LSL-G12D;Trp53LSL-R172H;Pdx1-Cre小鼠模型(KPC)和k -+ / LSL-G12D;Pdx1-Cre小鼠模型(KC)前面描述的,32保存在C57BL / 6背景。的液氧Loxl2等位基因(外显子2)老鼠Loxl2fl / fl和条件Loxl2-EGFPoverexpressing小鼠模型R26Loxl2-EGFPKI /吻前所述,26并继续混合背景。先进的PDAC研究肿瘤小鼠所产生的雄性KPC小鼠雌性繁殖Loxl2Exon2fl / fl生成杂合的KPCL2 (Het)KO老鼠(KPCL2+ /−与女性R26)或Loxl2KI /吻小鼠产生Het KPCL2KI老鼠(KPCL2+ /吻)。与预期比率和KPCL2后代出生KO小鼠没有表现出视觉功能缺陷或异常胰腺组织学(数据没有显示)。Het老鼠从不同育种进一步获得KPCL2过去了+ / +,KPCL2+ /−和KPCL2−−/老鼠的Loxl2损耗研究或获得KPCL2+ / +,KPCL2+ /吻,KPCL2KI /吻老鼠的Loxl2超表达研究。引物pcr中列出在线补充表S2。野生型(+ / +)垃圾KPCL2伴侣KO和KPCL2KI线是作为控制实验。为肿瘤负担和转移分析,老鼠牺牲在17 - 18周后出生(组2)。机关、肿瘤和宏观转移分离/确定,重和数字记录。组织在4%多聚甲醛固定,快速冷冻或消化如上所述主细胞系建立。生存曲线分析,只有老鼠在人道的端点和牺牲,发达的胰腺肿瘤包括(组1),所有的人被排除在分析之外。

    不那么咄咄逼人PDAC模型也被使用。这些研究男性KC与雌性老鼠交配Loxl2Exon2fl / fl生成Het KCL2KO老鼠(KCL2+ / -与女性R26)或Loxl2KI /吻小鼠产生Het KCL2KI老鼠(KCL2+ /吻)。Het老鼠从不同育种进一步获得KCL2过去了+ / +,KCL2+ /−和KCL2−−/老鼠的Loxl2损耗研究或获得KCL2+ / +,KCL2+ /吻和KCL2KI /吻老鼠的Loxl2超表达研究。野生型(+ / +)垃圾KCL2伴侣KO和KCL2KI线是作为控制实验。和转移肿瘤负担分析,队列2小鼠牺牲38-40周后出生,和动物加工如上所述。生存曲线分析,只有老鼠牺牲在人道的端点包括(组1)。

    肿瘤形成的动力学上的差异以及小鼠表现出的百分比在野生型KPCL2转移KO和KPCL2KI和KCL2KO和KCL2KI行观察,确定是由于背景的差异。

    病人和公众参与研究

    无论是病人还是公众直接参与这项研究。包括患者样本,通过生物提供知情同意医院Ramon y Cajal-IRYCIS (PT13/0010/0002)集成在西班牙国家生物银行网络(ISCIII生物库没有注册。B.0000678)(详细的进一步补充方法)。

    统计分析

    结果意味着±SEM除非另有规定。两两进行多重比较和单向方差分析和图基或Dunnett测试后。除非另有说明,未配对的双面(95% CI)学生的t被用来确定的两组之间的差异。P值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有使用GraphPad棱镜V.6.0分析。

    额外的方法可以找到在线补充材料。

    结果

    LOXL2信使RNA表达与贫困患者的总体生存和上皮间充质转变PDAC

    的转录水平LOXL2首先计算表达式的值在三个公开GSE62165转录组数据集,28元数据集29日GSE71729,4符合之前的出版物,到三十五LOXL2表达显著升高整个胰腺肿瘤与邻近正常组织样本(图1一个)。这种增长是独立验证的信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质含量在先前发表的系列31日刚切除PDAC肿瘤(图1 b和在线补充图S1A, B)。关于生存,一个清晰的偏差,减少在观察中位总生存期(OS)LOXL2-表达患者(50-percentile)相比LOXL2 -低表达患者贝利(50-percentile)等系列36(图1 c)。此外,LOXL2表达的更激进的鳞状亚型与其他三个亚型(图1 d贝利),分类的等。36基因集富集分析(GSEA)比较样本属于顶部和底部的四分位数LOXL2前面所提到的三种数据集进行的表达式,我们观察到显著和一般丰富通路在所有系列(在线补充图S2A),上皮间充质转变(EMT)和转化生长因子(TGFß)信号一致,大大丰富了所有LOXL2高表达患者独立的数据集分析(图1 e和在线补充图S2A, B)。关于EMT,斯皮尔曼等级次序相关或皮尔森相关矩阵的上皮和间充质基因排序的病人LOXL2信使rna水平和接受监督层次聚类(欧几里得距离测量,平均连锁聚类)证实了正相关LOXL2信使rna表达水平与EMT和间叶细胞的基因,分别为(在线补充图S3A和图1 f)。同样地,高水平的LOXL2与明显恶化生存和区间参数(在线补充图S3B)。

    LOXL2 mRNA expression correlates with poor overall survival and EMT in patients with PDAC. (A) Differential expression of LOXL2 in adjacent (Adj.) normal tissue vs PDAC tumours and metastasis (met) in GSE62165, META data set, and GSE71729. Unpaired two-sided Student’s t-test. (B) LOXL2 relative mRNA levels ±SD (n=2 technical replicates) in a panel of surgically resected human PDAC tumours (n=25) and four normal pancreas (nPanc) controls (left). Pooled mean ±SEM analysis including four primary KPC tumours (right). (ns, not significant; ****p<0.0001; two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (C) Overall survival of patients with PDAC from the Bailey (n=96) data set, stratified according to the median value of LOXL2 expression. HR=Hazard ratio, Cox proportional hazard regression model. A Log-rank test was performed for survival analysis. (D) Differential expression of LOXL2 in PDAC tumours, subtyped as progenitor, squamous, immunogenic or ADEX from the Bailey et al data set. (**P<0.01, ****p<0.0001, one-way analysis of variance with Dunnett post-test). (E) EMT pathway enrichment plots from transcriptomics analysis (GSE62165, META and GSE1729 data sets) of LOXL2 high vs LOXL2 low patients. FDR <0.25. (F) Pearson correlation matrix of mesenchymal-related and epithelial-related genes in 179 patients with human PDAC (TCGA) sorted for LOXL2 mRNA levels and nearest neighbour. The matrix was subjected to supervised hierarchical clustering (Euclidean distance measurement, average linkage clustering). EMT, epithelial to mesenchymal transition; FDR, false discovery rate; LOXL2, lysyl oxidase-like protein 2; mRNA, messenger RNA; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; TCGA, The Cancer Genome Atlas.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    LOXL2信使rna表达与贫困患者的总体生存和EMT PDAC。(A)的微分表达式LOXL2在邻近的(形容词)正常组织vs PDAC GSE62165肿瘤和转移(遇到),元数据集,GSE71729。未配对的双面学生的学习任务。(B)LOXL2相对mRNA水平±SD (n = 2技术复制)在人类PDAC一组手术切除肿瘤(n = 25)和四个正常胰腺(nPanc)控制(左)。池意味着±SEM分析包括四个主要KPC肿瘤(右)。(ns,不重要;* * * * p < 0.0001;双面四Mann-Whitney U测试)。(C)患者的总体生存的PDAC贝利(n = 96)的数据集,分层的中值LOXL2表达式。HR =风险比,Cox比例风险回归模型。生存率较进行生存分析。(D)的微分表达式LOXL2子类型为祖,PDAC肿瘤鳞状上皮细胞,免疫原性或ADEX贝利等数据集。(* * P < 0.01, * * * * P < 0.0001,与Dunnett测试后单向方差分析)。(E) EMT通路富集情节从转录组分析(GSE62165元和GSE1729数据集)LOXL2高和LOXL2低的病人。罗斯福< 0.25。(F)皮尔森相关矩阵mesenchymal-related和epithelial-related基因在179例人类PDAC TCGA()排序LOXL2信使rna水平和最近的邻居。矩阵受到监督层次聚类(欧几里得距离测量,平均连锁聚类)。EMT,上皮间充质转变;罗斯福,错误发现率;LOXL2, lysyl oxidase-like蛋白2;信使RNA信使RNA;PDAC,胰腺导管腺癌;TCGA,癌症基因组图谱。

    巨噬细胞诱导LOXL2和EMT PDX-derived通过OSM PDAC细胞

    接下来,我们分析了LOXL2蛋白质水平的PDAC PDX肿瘤作为一个模型系统。的11个PDX肿瘤分析,只有高度转移265 PDX模型37表示LOXL2 (图2一个),这表明异种移植在体内使失去LOXL2,人类特定时间因素介导LOXL2表达式是缺乏的老鼠和/或时间的因素是缺乏文化。建筑在我们之前公布的工作显示,只有人类M2巨噬细胞(MØ)可以促进人类的EMT PDX-derived细胞,31日我们测量LOXL2表达式与MØPDX-cultures孵化条件媒体(MCM)和一个清晰的间叶细胞形态观察过渡(图2 b)以及细胞散射和能动性增加(在线补充视频1和2)、体外入侵(图2 c)和体内肝脏和肺殖民(在线补充图S4A, B)。转录,MCM增加几个EMT转录因子的表达以及proto-typical液态氧,和其他LOX-like成绩单,EMT-associated LOXL2 upregulation最高(图2 d),它被证实在蛋白质水平(图2 e)。

    补充视频

    补充视频

    Macrophages induce LOXL2 and EMT in PDX-derived PDAC cells via OSM. (A) LOXL2 expression in indicated human PDXs. Tubulin, loading control. Positive (+) control=cell lysate from LOXL2-overexpressing 293 T cells. (B) Light micrographs of PDX-derived cells cultured for 72 hours with control media or conditioned medium from M2-polarised MØs (MCM). Scale bar=200 µm. Insets=2X magnified areas. (C) Light micrographs of Panc354 PDX-derived cells cultured for 72 hours with control media (Ctl) or MCM (left). Scale bar=400 µm. Representative images of migrating Ctl-treated or MCM-treated cells through a 0.8 micron transwell (top, right), and mean fold-change ±SD of MCM-treated invading cells compared with Ctl-treated Panc354, Panc215 or Panc265 cells, set as 1.0. (**P<0.01, ***p<0.001, unpaired Student’s t-test). (D) Mean fold-change ±SD of relative mRNA levels for the indicated genes in Ctl-treated or MCM-treated cells. Values normalised to ß-actin. Ctl-treated samples were set as 1.0. (*P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, unpaired Student’s t-test). (E) LOXL2 expression in Ctl-treated (–) or MCM-treated (+) PDX-derived cells. Tubulin, loading control. (F–H) OSM protein levels (pg/mL) present in (F) unpolarised PBMC-conditioned media or MCM, (G) unpolarised (Ctl) PBMC-conditioned media or conditioned media from TGFß1-treated PBMCs, or (H) serum from healthy controls or patients with PDAC. (*P<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001, unpaired two-sided Student’s t-test). EMT, epithelial to mesenchymal transition; LOXL2, lysyl oxidase-like protein 2; mRNA, messenger RNA; OSM, oncostatin M; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PDX, patient-derived xenografts; TGF, transforming growth factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    巨噬细胞诱导LOXL2和EMT PDX-derived通过OSM PDAC细胞。(一)人类pdx LOXL2表达式表示。微管蛋白,加载控制。阳性(+)控制=细胞溶解产物从LOXL2-overexpressing 293 T细胞。(B)光显微图PDX-derived细胞培养72小时控制媒体或条件培养液M2-polarised MØs (MCM)。酒吧= 200µm规模。Insets = 2 x放大区域。(C)光显微图Panc354 PDX-derived细胞培养72小时控制媒体(Ctl)或罗马数字(左)。酒吧= 400µm规模。代表图像的迁移Ctl-treated或MCM-treated细胞通过一个0.8微米transwell(顶部,右),和平均叠化±SD MCM-treated入侵细胞而Ctl-treated Panc354, Panc215或Panc265细胞,设置为1.0。 (**P<0.01, ***p<0.001, unpaired Student’s t-test). (D) Mean fold-change ±SD of relative mRNA levels for the indicated genes in Ctl-treated or MCM-treated cells. Values normalised to ß-actin. Ctl-treated samples were set as 1.0. (*P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, unpaired Student’s t-test). (E) LOXL2 expression in Ctl-treated (–) or MCM-treated (+) PDX-derived cells. Tubulin, loading control. (F–H) OSM protein levels (pg/mL) present in (F) unpolarised PBMC-conditioned media or MCM, (G) unpolarised (Ctl) PBMC-conditioned media or conditioned media from TGFß1-treated PBMCs, or (H) serum from healthy controls or patients with PDAC. (*P<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001, unpaired two-sided Student’s t-test). EMT, epithelial to mesenchymal transition; LOXL2, lysyl oxidase-like protein 2; mRNA, messenger RNA; OSM, oncostatin M; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; PDX, patient-derived xenografts; TGF, transforming growth factor.

    我们先前表明,MCM包含已知的EMT诱导物TGFß1,31日和TGFß信号一直调节患者的高LOXL2表达式(即最高四分位数)(在线补充图开通);然而,重组TGFß1 (rTGFß1)治疗不诱导EMT状态或LOXL2表达在人类PDX-derived细胞(在线补充图自己)。因此,我们假设,其他MCM EMT诱导因素可能调解LOXL2表达式。制瘤素米(OSM)代表一个似是而非的替代(1)垃圾等表明OSM比TGFß1更强有力的EMT的诱导物,虽然收敛到一个类似pSTAT3 / SMAD3-mediated EMT通路,38(2)OSM存在于罗马数字(图2 f),(3)rTGFß1可以诱导MØs分泌OSM (图2 g),(4)OSM血清中存在在更高层次从PDAC患者与健康对照组相比(图2 h)。事实上,治疗PDX-derived细胞重组OSM (rOSM)诱导间充质形态过渡(在线补充图S4D)以及增加迁移(在线补充图S4E)和感应EMT-related基因的转录,包括LOXL2 (在线补充图自己底部),表明MØ-secreted OSM可以诱导LOXL2表达式。我们还观察到一个清晰的MCM的高OSM浓度之间的相关性和pSTAT3激活和LOXL2蛋白表达(在线补充图S4F)。重要的是,沉默LOXL2 Panc354细胞没有恢复的能力rOSM或者MCM诱导体外EMT-like表型(在线补充图S5A-C),这表明LOXL2不是下游司机EMT-related刺激引起的表型。

    的损失Loxl2提高操作系统和减少肿瘤负担

    由于人类PDX模型不概括人类身上(图2一个),我们发现小鼠系统进一步外推。我们首先确认四个主要鼠PDAC KPC (Pdx1-cre;喀斯特LSL.G12D / +,Tp53LSL.R172H / +)派生细胞系表达察觉Loxl2水平,这类似于人类PDAC肿瘤细胞,小鼠MØ-secreted因素可以引起Loxl2表达式(在线补充图S6A, B)。具体来说,MCM或rTGFß1 rOSM诱导Loxl2 KPC细胞和/或一个EMT-like状态(在线补充图S6B-F);然而,我们一直观察到rTGFß1是一个更强有力的EMT诱导物比rOSM鼠标设置。接下来,我们跨越了液氧Loxl2等位基因的老鼠26KPC老鼠产生KPC;Loxl2fl / fl敲除小鼠(KO)(称为KPCL2KO)研究LOXL2体内的作用(图3一)。的损失Loxl2表达KPCL2KO证实了肿瘤提取细胞或新鲜肿瘤定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫印迹(WB)分析,分别为(图3 b, C)。其他Lox-like mrna的水平并没有受到损失的影响Loxl2,除了Loxl3(图3 b)。我们下一个评估系统,肿瘤发病率和肿瘤负担KPC野生型(wt) HetLoxl2(KPC;Loxl2+ / -)和KPCL2KO老鼠,在两个不同的群体(见方法)。在第一组,损失的Loxl2显著扩展操作系统(图3 d),我们得出结论,从第二个队列,并不是由于肿瘤发病率的差异(图3 e),而是减少肿瘤负担(图3做减法和在线补充图S7)。有趣的是,Loxl2删除也强烈影响肿瘤分化。而KPC肿瘤是异质的,64%的肿瘤代表更多的分化表型分析和36%的肿瘤显示低分化表型,低分化肿瘤的比例在KPCL2减少到大约9%KO老鼠(图3 h)。

    Loss of Loxl2 improves overall survival and decreases tumour burden. (A) Scheme of the genetic mouse models for pancreatic cancer. The colour code (blue, KPC wild type (wt); red, KPCL2KO) is used for all results. (B) Mean relative mRNA levels±SEM of indicated genes in tumour-derived cells from the indicated genotypes (nd, not detected; ns, not significant; *p<0.05, ***p<0.001; one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett’s post-test). (C) Loxl2 expression in tumour homogenates from the indicated KPC genotypes. Gapdh, loading control. (D) Survival of wt (+/+), Het (KPC; Loxl2 +/-) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice. All mice died of PDAC associated disease at the indicated times (p value is shown; ns, not significant; log-rank (Mantel-Cox) test). Calculated median survivals are: wt (+/+): 19 weeks; Het (KPC; Loxl2 +/-): 21 weeks; and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-): 26 weeks. (E) Percent tumour incidence in wt (+/+), Het (KPC; Loxl2 +/-) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice at 17–18 weeks post birth. (P values are shown, contingency analysis, two-sided Fisher’s exact test). Tumour incidence was determined as positive if a macroscopic tumour was visible on necropsy. (F) Mean pancreas weight ±SEM in wt (+/+), Het (KPC; Loxl2 +/-) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice at 17–18 weeks post birth (left). (**P<0.01; ns, not significant; one-way ANOVA with Tukey post-test). Representative images of PDAC tumours/genotype (bottom) at 17–18 weeks post birth. (G) Quantification of tissue area in mouse pancreata from wt (+/+), Het (KPC; Loxl2 +/-) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice at 17–18 weeks post birth, categorised as severely altered tissue (acinar-to-ductal metaplasia (ADM) and inflammation), pancreatic intraepithelial neoplasias (PanINs I–III), cancer tissue (PDAC) or normal acinar tissue (*p<0.05, contingency analysis, two-sided Fisher’s exact test). (H) Representative H&E-stained sections for the grading of the respective tumours: wt (+/+) KPC (blue, n=14), Het KPC (KPC; Loxl2 +/-) (orange, n=21) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice (red, n=11). Pie chart insets=percent of differentiated (blue) vs poorly differentiated (yellow) tumours for each genotype. Scale bar=250 µm. Het, heterozygous; KO, knockout; Loxl2, lysyl oxidase-like protein 2; mRNA, messenger RNA; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    的损失Loxl2提高总体存活率,减少肿瘤负担。(一)计划胰腺癌的基因小鼠模型。颜色代码(蓝色,KPC野生型(wt);红色,KPCL2KO)是用于所有的结果。(B)的意思是相对mRNA水平±SEM表示表示基因在肿瘤提取细胞的基因型(nd,而不是检测;ns,不重要;* * * * p < 0.05, p < 0.001;单向方差分析(方差分析)与Dunnett测试后)。(C) Loxl2表示KPC基因型表达肿瘤匀浆。Gapdh加载控制。(D)的生存wt (+ / +), Het (KPC;Loxl2+ / -)和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -老鼠)。所有老鼠死于PDAC相关疾病在指定时间(p值显示;ns,不重要;log-rank (Mantel-Cox)测试)。计算中位数生存:wt(+ / +): 19周;Het (KPC;Loxl2+ / -):21周;和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -):26周。(E)百分比肿瘤发病率在wt (+ / +), Het (KPC;Loxl2+ / -)和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -老鼠在17 - 18周后出生。(P值显示、应急分析、双边确切概率法)。肿瘤发病率被确定为积极如果宏观肿瘤在尸体剖检可见。(F)的意思是胰腺重量±SEM wt (+ / +), Het (KPC;Loxl2+ / -)和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -老鼠在17 - 18周后出生(左)。(* * P < 0.01;ns,不重要;单向方差分析与图基检测后)。代表图像的PDAC肿瘤/基因型(底部)在17 - 18周后出生。(G)量化组织区域的鼠标pancreata wt (+ / +), Het (KPC;Loxl2+ / -)和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -)小鼠在17 - 18周后出生,归类为严重改变组织(acinar-to-ductal化生(ADM)和炎症),胰腺上皮内瘤(PanINs》),癌组织(PDAC)或正常腺泡的组织(* p < 0.05,应急分析、双边确切概率法)。(H)代表H&E-stained部分各自的肿瘤的分级:wt (+ / +) KPC(蓝色,n = 14), Het科威特石油公司(KPC);Loxl2+ / -)(橙色,n = 21)和KO科威特石油公司(KPC);Loxl2- / -)小鼠(红色,n = 11)。饼图insets = %的分化(蓝色)和低分化为每个基因型(黄色)肿瘤。酒吧= 250µm规模。Het,杂合的;KO,淘汰赛;Loxl2,lysyl oxidase-like蛋白2;信使RNA信使RNA;PDAC,胰腺导管腺癌。

    Loxl2过度恶化操作系统和增加肿瘤负担

    我们下一个交叉KPC老鼠与前所述条件overexpressing老鼠Loxl226生成KPC;R26Loxl2-EGFPKI /吻敲入(KI)小鼠(称为KPCL2KI)(图4一)。EGFP和Loxl2超表达在肿瘤(或细胞)源自KPC;R26+ / +KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠被荧光显微镜证实,世行和RT-qPCR分析(图4 b, C)和超表达的Loxl2并不影响其他Lox-like成员的水平(图4 c)。操作系统、肿瘤发病率和评估肿瘤负担,又使用two-cohort方法,相比之下KPCL2KO老鼠,我们观察到减少操作系统(图4 d),肿瘤发病率增加(图4 e)和更多的肿瘤负担(图4 f-h和在线补充图S7)时Loxl2过表达。这种肿瘤负担的增加伴随着更低分化表型KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠,KPC的90%;R26L2KI /吻老鼠发展低分化肿瘤(图4我)。

    Overexpression of Loxl2 worsens overall survival and increases tumour burden. (A) Scheme of the KPC-based Loxl2 overexpression genetic mouse model. The colour code green, KPCL2KI, is used for all results. (B) Light and EGFP tumour images (left). Loxl2 expression in tumour homogenates from the indicated KPC genotypes (right). Gapdh, loading control. Positive (+) control=cell lysate from murine Loxl2-overexpressing 293 T cells. (C) Mean relative mRNA levels ±SEM of indicated genes in tumour-derived cells from the indicated genotypes (***p<0.001; ns, not significant; one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett’s post-test). (D) Survival of KPC wild type (+/+), KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI mice. All mice died of PDAC associated disease at the indicated times (p value is shown; ns, not significant; log-rank (Mantel-Cox) test). Calculated median survivals are: wild type (+/+): 20 weeks; KPC; R26L2+/KI: 18 weeks; and KPC; R26L2KI/KI: 17 weeks. (E) Percent tumour incidence in KPC wild type (+/+), KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI mice at 17–18 weeks post birth. (****P<0.0001; ns, not significant; contingency analysis; two-sided Fisher’s exact test). Tumour incidence was determined as positive if a macroscopic tumour was visible on necropsy. (F) Mean pancreas weight ±SEM in KPC wild type (+/+), KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI mice at 17–18 weeks post birth. (*P<0.05, **p<0.01; ns, not significant; one-way ANOVA with Tukey post-test). (G) Representative images of PDAC tumours/genotype at 17–18 weeks post birth. (H) Quantification of tissue area in mouse pancreata from wild type (+/+) KPC mice (blue, n=7) and KPCL2KI (KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI) mice (green, n=12) determined at 17–18 weeks post birth, categorised as severely altered tissue, PanINs I–III, PDAC or normal acinar tissue (*p<0.05, **p<0.01, contingency analysis, two-sided Fisher’s exact test). (I) Representative H&E-stained sections for the grading of the respective tumours: wild type (+/+) KPC (blue, n=6), KPC; R26L2+/KI (dark green, n=6) and KPC; R26L2KI/KI mice (light green, n=6). Pie chart insets=percent of differentiated (blue) vs poorly differentiated (yellow) tumours the indicated genotypes. Scale bar=250 µm. ADM, acinar-to-ductal metaplasia; KI,knock-in; Loxl2, lysyl oxidase-like protein 2; PanINS, pancreatic intraepithelial neoplasias; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; wt, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    过度的Loxl2恶化的总体生存和肿瘤负担增加。(一)KPC-based的方案Loxl2超表达基因的小鼠模型。绿色的颜色代码,KPCL2KI用于所有的结果。(B)光和EGFP肿瘤图像(左)。Loxl2表达在肿瘤匀浆KPC基因型(右)表示。Gapdh加载控制。阳性(+)控制=细胞溶解产物从小鼠Loxl2-overexpressing 293 T细胞。(C)的意思是相对mRNA水平±SEM表示表示基因在肿瘤提取细胞的基因型(* * * p < 0.001;ns,不重要;单向方差分析(方差分析)与Dunnett测试后)。(D)的生存KPC野生型(+ / +),KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠。所有老鼠死于PDAC相关疾病在指定时间(p值显示;ns,不重要;log-rank (Mantel-Cox)测试)。计算中位数生存:野生型(+ / +):20周;KPC;R26L2+ /吻:18周;KPC;R26L2KI /吻:17周。(E) KPC野生型肿瘤发病率百分比(+ / +),KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠在17 - 18周后出生。(* * * * P < 0.0001;ns,不重要;应变分析;双面的确切概率法)。肿瘤发病率被确定为积极如果宏观肿瘤在尸体剖检可见。(F)的意思是胰腺重量±SEM KPC野生型(+ / +),KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠在17 - 18周后出生。* * (* P < 0.05, P < 0.01;ns,不重要;单向方差分析与图基检测后)。(G)代表图像的PDAC肿瘤/基因型在17 - 18周后出生。(H)量化组织的地区从野生型老鼠pancreata (+ / +) KPC老鼠(蓝色,n = 7)和KPCL2KI(KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻)小鼠(绿色,n = 12)决定在17 - 18周后出生,归类为严重改变组织,PanINs》, PDAC或正常腺泡的组织(* * * p < 0.05, p < 0.01,应急分析、双边确切概率法)。(我)代表H&E-stained部分各自的肿瘤的分级:野生型(+ / +)KPC(蓝色,n = 6), KPC;R26L2+ /吻(深绿色n = 6)和KPC;R26L2KI /吻老鼠(浅绿色,n = 6)。饼图insets = %的分化(蓝色)和低分化肿瘤(黄色)指定的基因型。酒吧= 250µm规模。ADM, acinar-to-ductal化生;KI,敲入;Loxl2,lysyl oxidase-like蛋白2;PanINS胰腺上皮内瘤;PDAC,胰腺导管腺癌;wt,野生型。

    Loxl2在最初的PDAC开发过程中发挥作用

    由于突变型p53加速肿瘤进展和恶性转化通过基因组不稳定性导致增加的突变,39 40我们分析的影响Loxl2在wt p53 KC损失或超表达(喀斯特LSL.G12D / +;Pdx1-cre)小鼠开发acinar-ductal化生(ADM),胰腺上皮内瘤(PanIN)前体病变,PDAC,但速度较慢,多KPC老鼠,允许初始变革性事件的评估。类似于KPC老鼠,损失Loxl2操作系统而过度增加Loxl2有相反的效果(在线补充图S8A, B)。关于胰腺重量,只观察到KC显著增加;R26L2KI /吻老鼠(在线补充图S8C);然而,在组织层面,pancreata KCL2 38-40星期KO老鼠主要由健康组织或组织PanIN病变和ADM与wt老鼠相比,显示更大的和重要的比例(p < 0.001) PDAC病变(在线补充图S8D上,在KCL2 E)。KI老鼠,显著增加的百分比PDAC观察与wt小鼠相比在线补充图S8D底,F)。

    Loxl2损失和过度影响PDAC转移和肿瘤干细胞特性

    除了肿瘤负担和大小的差异(图3和图4),我们也观察到显著差异在宏观转移Loxl2调制(图5一个)。转移发生率(宏观上和组织学证实,在线补充图S9A, B)KPCL2KO和KPCL2KI老鼠是与各自的wt的同胞相比,这两个wt KPC菌株有不同的背景,显示不同的基底转移。符合生存,KPCL2KO老鼠减少肝、肺和腹膜(小肠、淋巴结、胃和/或隔膜)转移与wt同窝出生的(图5 b)。逆KPCL2中观察到的情况KI老鼠,发病率明显高于转移(图5 c),包括腹腔内转移,如肠系膜淋巴结和隔膜转移(图5 a, C和在线补充S9A B)。在缺乏突变型p53, KCL2KO老鼠也有显著降低转移发生率,可能直接造成的这些老鼠PDAC病变的发生率降低,而在KC;R26L2+ /吻和KC;R26L2KI /吻老鼠,在肝脏和肺转移发生率增加观察(在线补充图S9C, D)。

    Loxl2 loss and overexpression affects PDAC metastasis and cancer stem cells properties. (A) PDAC tumours and metastases from indicated genotypes (white arrows, metastases). (B–C) Percent incidence of metastasis in (B) wild type (+/+), Het (KPC; Loxl2 +/-) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice or (C) KPC wild type (+/+), KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI mice at 17–18 weeks post birth. (**P<0.01, ****p<0.0001; ns, not significant; contingency analysis, two-sided Fisher’s exact test). (D–E) Left: Representative immunohistochemical stainings for indicated proteins in tumour sections from (D) wild type (+/+) KPC and KO KPC (KPC; Loxl2-/- ) mice or (E) wild type (+/+) KPC and KPCL2KI (KPC; R26L2KI/KI) mice. Scale bar=250 µm. Right: Quantification of per cent positive (+) cells/region of interest (ROI). (****P<0.0001; ns, not significant; unpaired Student’s t-test). (F) Mean number % colony area ±SEM, determined 11 days post seeding in indicated cell lines (n=3 cell lines/genotype, ****p<0.0001, ns, not significant, two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (G) Mean number (no.) spheres/mL ±SEM, 7 days post seeding, in tumour cell lines from indicated genotypes (*p<0.05, ***p<0.001, unpaired Student’s t-test). (H) Mean percentage of EpCAM+/CD133+ cells ±SEM, in tumour cell lines from indicated genotypes (***p<0.001, two-sided t-test with Mann-Whitney U test). Het, heterozygous; KI, knock-in; KO, knockout; Loxl2, lysyl oxidase-like protein 2; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; wt, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    Loxl2损失和过度影响PDAC转移和肿瘤干细胞特性。(一)PDAC肿瘤和转移表示基因型(白色箭头,转移)。(c)百分比的转移发生率(B)野生型(+ / +),Het (KPC;Loxl2+ / -)和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -)或(C) KPC野生型小鼠(+ / +),KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠在17 - 18周后出生。(* * P < 0.01, * * * * P < 0.0001;ns,不重要;应急分析、双边确切概率法)。左(D e):代表免疫组织化学染色显示肿瘤蛋白质部分(D)野生型(+ / +)KPC和KO科威特石油公司(KPC;Loxl2- / -)或(E)野生型小鼠(+ / +)KPC和KPCL2KI(KPC;R26L2KI /吻老鼠)。酒吧= 250µm规模。右:量化每分阳性(+)细胞/感兴趣的区域(ROI)。(* * * * P < 0.0001;ns,不重要;未配对学生t)。(F)平均数±SEM %殖民地地区,确定11天播种后表示细胞系(n = 3细胞系/基因型,* * * * p < 0.0001, ns,不显著,双边t Mann-Whitney U测试)。(G)平均数±SEM(号)领域/毫升、播种后7天,从表示基因型肿瘤细胞系(* * * * p < 0.05, p < 0.001,未配对的学生的学习任务)。(H)平均百分比EpCAM±SEM + / CD133 +细胞,肿瘤细胞系中表明基因型(* * * p < 0.001,双边t检验与Mann-Whitney U测试)。Het,杂合的; KI, knock-in; KO, knockout;Loxl2,lysyl oxidase-like蛋白2;PDAC,胰腺导管腺癌;wt,野生型。

    EMT-associated蛋白质的表达与PDAC转移密切相关。41 42同样的,我们以前证明之间的关联Loxl2和急诊医疗监管转录因子Snail1在乳腺癌小鼠模型。23除了增加的百分比Twist1-positive细胞,没有观察到其他的表达差异在KPCL2 EMT-associated蛋白质分析KO肿瘤(图5 d和在线补充图S10A)。在KPCL2KI然而,老鼠表达的所有蛋白质增加(图5 e和在线补充图S10B),符合EMT计划时增加Loxl2是过表达。同样,正如所料,减少钙粘蛋白膜从KPCL2表达在肿瘤细胞中发现KI老鼠更低分化形态的整合这些肿瘤(在线补充图S11A, B)。有趣的是,当肿瘤提取文化这四个基因型与EMT抗病诱导剂治疗TGFß1或Osm,所有细胞对两rTGFß1——或者rOSM-stimulation形态(尽管不同),转录和蛋白质水平(在线补充图S12和13所示),表明存在与否无关Loxl2,这些细胞是TGFß1-responsive Osm-responsive和EMT-competent。

    我们也评估癌症干细胞的比例(二者),会影响肿瘤和转移负担41在KPCL2KO和KPCL2KI文化。Loxl2超表达显著增加集落形成能力(图5 f),这或许可以解释增加肿瘤KPCL2中观察到的重量和大小KI老鼠。同样,两个球体形成能力(自我更新),二者的比例(确定EpCAM + / CD133 +)在KPCL2显著增加KI细胞,但在KPCL2下降KO细胞(图5 g, H),这表明Loxl2表达可能与CSC状态。尽管如此,虽然没有肿瘤频率的差异在极端限制稀释试验都KPCL2而出名KO或KPCL2KI细胞与各自wt控件(相比在线补充图S14A, B),观察肿瘤大小和重量的显著差异KPCL2注入KO细胞(在线补充图S14A),建议减少肿瘤起始和/或增长动力学。

    Loxl2PDAC细胞内渗是必要的吗

    KPCL2的能力KO和KPCL2KI细胞移植肺的小鼠尾静脉注射测量来确定实验转移能力。既不存在也没有Loxl2KPCL2的转移能力的影响KO和KPCL2KI体内细胞形成肺转移(图6 a, B),这表明Loxl2表达式不影响实验转移能力(即外渗,播种和殖民)PDAC-derived细胞注入循环而是可能阻碍或促进入侵和/或内渗原发性肿瘤细胞通过non-cell自治机制。因此,我们首先确认Loxl2 KPCL2分泌KI细胞而不是KPCL2KO细胞(在线补充图S14C),下一个建立原位肿瘤体内注射H2b-mCherry-labelled KPCL2KO或EGFP + KPCL2KI细胞,单独或结合1:1比例(图6 c)。如果KPCL2KO细胞有能力减少intravasate由于缺乏细胞外Loxl2,外生Loxl2 KPCL2表达式KI这个表型细胞应该救助。四个星期后注入,肿瘤形成平等权重的老鼠(图6 d),预期mCherry-positive分布和EGFP-positive细胞(图6 e)。提出,H2b-mCherry-labelled KPCL2KO细胞出席人数明显降低循环与EGFP + KPCL2相比KI细胞,(图6 f);然而,显著增加mCherry-positive发现细胞在小鼠的血液和肝脏肿瘤建立与EGFP + KPCL2 1:1的比例KI细胞(图6 f, G),确认KPCL2KO肝脏细胞能够intravasate和种子外生Loxl2时提供。

    Loxl2 is necessary for PDAC intravasation. (A–B) Mean lung tumour weight ±SD in (A) wild type (+/+, ID32) KPC and Het KPC (KPC; Loxl2 +/-, ID86) cells (blue) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-, ID90 and ID98) cells (red) or (B) wild type (+/+, ID15 and ID29) KPC cells (blue) and KPCL2KI (KPC; R26L2+/KI, ID63 and KPC; R26L2KI/KI, ID4) cells (green) at 4 weeks post injection in NOD-SCID immunodeficient mice (left) (ns, not significant; unpaired Student’s t-test). Representative images of extracted lungs (top, right) and H&E images (bottom, right). (C) Experimental set-up for in vivo orthotopic tumour establishment in NOD-SCID immunodeficient mice with H2b-mCherry-labelled KPCL2KO (KPC; Loxl2 -/-) cells or EGFP+KPCL2KI (KPC; R26L2KI/KI) cells, alone or at a 1:1 ratio (groups 1, 3 and 2, respectively). (D) Mean tumour weight ±SD, 4 weeks post orthotopic injection, for each group (n=5 mice per group) (left). Representative images of PDAC tumours (right). (E–G) Mean number (no.) of mCherry-positive (red) or EGFP-positive (green) cells in (E) tumour homogenates, (F) blood or (G) liver homogenates, in indicated groups (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns, not significant; unpaired Student’s t-test). Het, heterozygous; KI, knock-in; KO, knockout; Loxl2, lysyl oxidase-like protein 2; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; wt, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Loxl2是必要的对PDAC内渗。(A - b)是指肺肿瘤重量±SD (A)野生型(+ / +,ID32) KPC和Het科威特石油公司(KPC);Loxl2+ / -ID86)细胞(蓝色)和KO科威特石油公司(KPC);Loxl2- / -ID90 ID98)细胞(红色)或(B)野生型(+ / +,ID15和ID29)(蓝色)和KPCL2 KPC细胞KI(KPC;R26L2+ /吻,ID63 KPC;R26L2KI /吻ID4)细胞(绿色)在NOD-SCID 4周后注射免疫缺陷小鼠(左)(ns,不重要;未配对学生t)。代表图像的提取肺(顶部,右)和圆)图像(底,对吧)。(C)试验装置对体内原位肿瘤建立在免疫缺陷小鼠NOD-SCID H2b-mCherry-labelled KPCL2KO(KPC;Loxl2- / -)细胞或EGFP + KPCL2KI(KPC;R26L2KI /吻)细胞,单独或在1:1的比例(分别为组1、3和2)。(D)意味着肿瘤重量±SD, 4周后原位注射,每组(n = 5老鼠/组)(左)。代表PDAC肿瘤(右)的图像。(eg)平均数(号)mCherry-positive(红色)或EGFP-positive(绿色)(E)肿瘤细胞匀浆,(F)血液或(G)肝匀浆,表示组(* p < 0.05, * * * * * p < 0.01, p < 0.001;ns,不重要;未配对学生t)。Het,杂合的;KI,敲入;KO,淘汰赛;Loxl2,lysyl oxidase-like蛋白2;PDAC,胰腺导管腺癌;wt,野生型。

    Loxl2影响胶原纤维取向和premetastatic利基市场的形成

    metastasis-promoting行动的液态氧和LOX-like蛋白质在不同肿瘤系统与细胞外基质等功能组织,特别是胶原纤维交联导致组织僵硬了19 43]。事实上,僵硬的肿瘤上皮高张力一直与更积极的PDAC表型导致更短的病人生存,10和初级肿瘤ECM组织可以提高因素(如液)的分泌,促进premetastatic利基调节辅助器官通过ECM重塑或基质细胞招聘,最终促进转移。

    因此,我们首先分析了myeloid-derived MØ人口在肝脏,这已被证明是必不可少的PDAC细胞转移,44 45作为一个潜在的解释观察到的差异在KPCL2转移KO和KPCL2KI老鼠。分析揭示了正面和负面的关联CD45的存在+CD11b+F4/80+细胞46在KPCL2KO和KPCL2KI小鼠,分别为(图7)。我们还评价了ECM的PDAC肿瘤,特别是胶原纤维方向/组织,已直接与Loxl2和肿瘤细胞。47虽然KPCL2方向直方图wt和KPCL2KI肿瘤描述单一主导峰在特定/优先方向,KPCL2KO肿瘤含有多个峰值,表明一个完全各向同性行为(图7 binsets)。量化的相对峰值频率确认组织的显著减少ECM的缺失Loxl2和增加组织当过表达(图7 c)。符合微分胶原纤维排列,我们观察到显著增加pSTAT3 KPCL2 pFAKKI肿瘤和减少表达pSTAT3 KPCL2 pFAK少的趋势KO肿瘤(在线补充图S15A, B),表明不同上皮紧张和僵硬的时候Loxl2是调制。10 14 48我们也评估mechanocontractility为pMLC-2染色,48和观察到更高的表达活性pMLC-2 KPCL2KI与KPCL2KO肿瘤(在线补充图S15A, B)。最后,有一个更一般的想法在KPCL2免疫时间KO和KPCL2KI老鼠,我们进行了免疫组织化学(包含IHC)和流式细胞术分析(在线补充图S16)。我们观察到的差异比较KPCL2时免疫时间KI和KPCL2KO各自wt同窝出生仔畜控制肿瘤。有趣的是,我们观察到染色KPCL2 CD3的增加KO和KPCL2KI肿瘤(在线补充图S16A, B),它可以验证通过流式细胞术(在线补充图S16C, D)。同样,巨噬细胞的数量(即F4/80 +)特别是M2分组人口(即CD206 +) KPCL2增加KIKPCL2肿瘤和减少KO模型,相比之下,各自wt垃圾伴侣控制和根据使用的方法(在线补充图S16A-D)。最后,虽然CD45包含IHC染色formalin-fixed并不健壮,石蜡包埋(FFPE)样品,流仪分析KPCL2 CD45的KO和KPCL2KI肿瘤明显下降,增加分别与各自的wt控制。因此,似乎缺乏或超表达Loxl2影响时间免疫细胞轮廓;然而,一个更详尽的分析需要进行小鼠相似的遗传背景之前任何明确的结论。

    Loxl2 affects collagen fibre orientation and premetastatic niche formation. (A) Mean percent (%) CD11b+, F4/80+ or CD11b+/F4/80+ cells ±SEM in liver homogenates from (top) wild type (+/+) KPC and Het KPC (KPC; Loxl2 +/-) mice (blue) and KO KPC (KPC; Loxl2 -/-) mice (red) or (bottom) wild type (+/+) KPC mice (blue) and KPCL2KI (KPC; R26L2+/KI and KPC; R26L2KI/KI) mice (green) determined at 14–16 weeks post birth. (*P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns, not significant; two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (B) Representative picrosirius red-stained images of pancreata. Overlay, representative fibre directionality analysis plots depicting the frequency of fibres in a specific orientation. (C) Mean maximum relative (max rel.) peak frequency ±SEM of directionality analysis plots for picrosirius red-stained images of pancreata shown in (B). (n=5–6 mice per genotype with 4–6 representative images analysed per mouse, *p<0.05, ****p<0.0001, two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (D) Experimental set-up for clodronate (Clod) in vivo studies. (E) Mean fold-change in Loxl2 (top) or Osm (bottom) relative mRNA levels ±SEM in pancreata from control liposome-treated vs clodronate liposome-treated KPC wt mice. Values were normalised to Hprt levels and control liposome-treated samples were set as 1.0. (n=8 mice per group, ****p<0.0001, two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (F) Representative picrosirius red-stained images of pancreata and overlaid fibre directionality analysis plots from control (Ctl)- and clodronate-treated KPC wt mice. (G) Mean maximum relative (max rel.) peak frequency ±SEM of directionality analysis plots for picrosirius red-stained images of pancreata shown in (F). (n=5 mice per group with three representative images analysed per mouse, ***p<0.001, two-sided t-test with Mann-Whitney U test). (H) Number of tumours and metastases detected in indicated groups. Het, heterozygous; Hprt, hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1; KI, knock-in; KO, knockout; Loxl2, lysyl oxidase-like protein 2; mRNA, messenger RNA; Osm, oncostatin M; PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma; wt, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    Loxl2影响胶原纤维取向和premetastatic利基市场的形成。(A)的意思是百分比(%)CD11b + F4/80±SEM +或CD11b + / F4/80 +细胞在肝匀浆(上)野生型(+ / +)KPC和Het科威特石油公司(KPC;Loxl2+ / -)小鼠(蓝色)和KO科威特石油公司(KPC);Loxl2- / -)(红色)或(底部)野生型小鼠(+ / +)(蓝色)和KPCL2 KPC老鼠KI(KPC;R26L2+ /吻KPC;R26L2KI /吻老鼠(绿色)决定在14 - 16周后出生。(* P < 0.05, * * * * * P < 0.01, P < 0.001;ns,不重要;双面四Mann-Whitney U测试)。(B)代表picrosirius pancreata红点的图像。叠加,代表纤维方向分析情节描述纤维的频率在一个特定的方向。(C)平均最大相对(max rel。)峰值频率±SEM的方向性分析情节picrosirius红点的pancreata (B)所示的图像。(n = 5 - 6小鼠每基因型与4 - 6代表图像分析了鼠标,* p < 0.05, * * * * p < 0.0001,双边t检验与Mann-Whitney U测试)。(D)试验装置对clodronate(笨蛋)体内研究。(E)的意思是叠化Loxl2(上)或Osm(底部)相对mRNA水平±SEM pancreata从控制liposome-treated vs clodronate liposome-treated KPC wt老鼠。值是正常产生Hprt水平和控制liposome-treated样本设置为1.0。每组(n = 8老鼠,* * * * p < 0.0001,双边t检验与Mann-Whitney U测试)。(F)代表picrosirius pancreata的红点的图像和覆盖纤维定向分析情节从控制(Ctl)和clodronate-treated KPC wt老鼠。(G)的意思是最大相对(max rel。)峰值频率±SEM的方向性分析情节picrosirius pancreata的红点的图像所示(F)。(n = 5老鼠每组有三个代表图像分析鼠标,* * * p < 0.001,双边t检验与Mann-Whitney U测试)。(H)中发现许多肿瘤和转移表示组。Het,杂合的;产生Hprt,次黄嘌呤phosphoribosyltransferase 1;KI,敲入;KO,淘汰赛;Loxl2,lysyl oxidase-like蛋白2;信使RNA信使RNA;Osm制瘤素M;PDAC,胰腺导管腺癌;wt,野生型。

    最后,使用一个同源的原位PDAC异种移植模型,小鼠治疗与控制或消除MØs clodronate脂质体(图7 d),我们之前的报道指出。49事实上,显著减少Osm和Loxl2表达式(图7 e)是衡量从clodronate-treated PDAC肿瘤小鼠,伴随的胶原原纤维取向显著降低(图7 f),减少相对峰值频率(图7 g),并降低整体转移(图7 h),确认MØs产生Osm,诱导Loxl2表达和促进适当的ECM组织,这对于转移是必要的。

    讨论

    这里,我们专注于LOXL2以前公布的研究显示LOXL2 PDAC样品中过表达和分泌或细胞系,50 51和它的表达与PDAC转移和药物抗性呈正相关。33 52-54然而,大多数这些研究观察或基于小干扰RNA沉默的LOXL2 PDAC细胞系建立。同样,没有研究迄今为止基因检查LOXL2在免疫活性的小鼠模型的PDAC概括人类疾病的所有方面。

    使用小鼠模型来准确地研究PDAC Loxl2的作用是强调通过我们的观察,人类PDAC pdx和PDX-derived细胞株表达低察觉Loxl2蛋白质水平。类似的结果在建立PDAC细胞系已观察到其他人,各种研究并存,只有mesenchymal-like PDAC细胞(如MiaPaCa和Panc1)表达LOXL2。33 54沿着这些线路,只有Panc265 PDX最近显示高转移性体内,37LOXL2表示。因此,我们生成的免疫活性的KPC和KC老鼠缺乏和过表达Loxl2准确的研究Loxl2在一个体内设置。最引人注目的结果Loxl2枯竭和超表达的抑制和增强转移,分别在KCL2转化为增加和减少操作系统KO/ KPCL2KO和KCL2KI/ KPCL2KI老鼠,分别。我们也观察到清晰的差异基因型之间的体内瘤内异质性,KPCL2KI老鼠引起更多的低分化肿瘤的表达增加EMT的因素。后者与观察LOXL2更鳞状PDAC肿瘤中高度表达,它的特点是侵袭性增加,EMT和减少操作系统。之前我们也演示了一个关系Loxl2 /去分化在中间多瘤病毒T抗原(PyMT)肿瘤,23并描述了积极监管Loxl2对EMT的影响一般和特别Snail1的稳定性和功能活动。23日25此外,一个积极的关系是KPCL2观察KI具备干细胞细胞的水平。因此,增加EMT和具备干细胞可以解释KPCL2中观察到的增强的转移KI老鼠。

    有趣的是,KPCL2KO和wt肿瘤表达了类似的EMT-associated蛋白质和类似于EMT抗病诱导剂TGFß1或Osm作出了回应。同样,KPCL2KO细胞能够移植,形成肺macrometastases wt KPC和KPCL2相似的水平KI细胞虽然减少了“具备干细胞”,表明细胞自动Loxl2并不影响EMT-responsiveness或转移这些细胞的能力。然而,由于入侵和内渗之前转移殖民化和增长,亏损Loxl2可能影响这些关键的早期事件转移级联,也取决于non-cell自治因素和过程,如时间矩阵刚度,可以激活肿瘤细胞EMT入侵和转移。10 55另一方面,基于KCL2的数据KO老鼠和ELDA tumourigenicity实验,Loxl2也可能在肿瘤启动一个重要的角色。尽管如此,因为最好的描述函数的LOXL2交联,稳定和胶原纤维组织,16我们认为,减少转移KPCL2中观察到KO老鼠是由于主要(但不仅限于)由细胞外Loxl2外在因素。事实上,我们能够拯救KPCL2的体内转移能力KO通过熔池肿瘤提取细胞通过细胞外Loxl2 KPCL2KI细胞。同样,胶原纤维方向和组织,以及mechanosignalling-associated蛋白质(pSTAT3, pFAK和pMLC-2), KPCL2KO和KPCL2KI原发性肿瘤显示反对表型,但没有显著差异的ECM观察,确认矩阵组织(刚度)是KPCL2妥协KO肿瘤。这是不同的克里森和他的同事们最近公布的数据,作者显示(1),基质的矩阵约束而不是促进PDAC,和(2)当ECM在小鼠同源的PDAC模型被废除使用anti-LOXL2马伯(AB0023,基列),小鼠PDAC发展增强,14其中作者属性减少ECM内容和纤维化。最近,Kalluri和他的同事们还显示,损耗的myofibroblast-derived Col1体内加速PanINs和PDAC的出现。15

    在我们的研究中,KPCL2KO小鼠改善操作系统和减少转移而逆转发生在KPCL2KI老鼠。重要的是要注意,在KPCL2KO老鼠,Loxl2是只在PDAC细胞和基因删除从出生,因此江直接比较吗等研究14不能做。同样,我们也不能排除其他细胞类型中出现的时间可能代表Loxl2备用源;然而,这种潜在的贡献可能是最小的胶原纤维交联以及组织一直在KPCL2妥协KO肿瘤。在我们同系的PDAC体内系统,而胶原蛋白纤维失调和减少Loxl2实现了clodronate治疗,类似的研究,14PDAC转移并没有增强,而是减少了。后者可能导致额外的巨噬细胞耗竭clodronate介导的脂质体,其他显示为PDAC转移是必要的。56事实上,我们观察到免疫时间影响Loxl2水平,这可能导致体内表型观察,独立的或结合,ECM组织。最后,结果从simtuzumab随机二期2017年的一项研究,一个人性化IgG4单克隆抗体(来自AB0023),抑制细胞外LOXL2,结合患者的一线治疗转移性PDAC吉西他滨(ClinicalTrials.gov,NCT01472198),表明添加simtuzumab吉西他滨没有改善临床结果57;然而,结合方法没有加速肿瘤进展。因此,这些不同的观点关于这个角色的PDAC LOXL2 tumourigenesis突出tumour-stroma交互的复杂的相互作用,需要进一步了解这个相声以及重新评估的效用anti-LOXL2抗体或小分子LOXL2抑制剂58治疗转移性PDAC。

    我们另外确定在本研究巨噬细胞和OSM作为重要的球员在这个相互作用。有趣的是,Dinca等最近在乳腺浸润性导管癌,OSM可以显示诱导LOXL2表达式,进而促进ECM的增加胶原纤维交联,从而增加了细胞的入侵。59同样,李等,最近表明,MØ-secreted Osm诱发炎症基因表达在战乱国家,创建一个PDAC pro-tumourigenic环境。60有趣的是,他们还表明,肿瘤细胞植入Osm−−/老鼠表现出一种epithelial-dominated形态以及减少肿瘤生长和转移。因此,我们的研究结果不仅明确链接LOXL2表达式macrophage-secreted PDAC OSM,但总的来说,这些研究强调针对巨噬细胞,OSM或两者(例如,使用目标CSF1R或GP130抑制剂),可以提供一个更有效的治疗策略治疗PDAC以及规避潜在问题与针对LOXL2孤单。

    数据可用性声明

    本手稿中使用数据集的数据可在公共、开放获取存储库。其他数据是可用的合理要求。https://www.nature.com/articles/ng.3398;https://bmccancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12885 - 016 - 2540 - 6;//www.marcconsult.com/content/66/9/1665。

    伦理语句

    病人同意出版

    伦理批准

    人类pdx体内的扩张,鼠标繁育和小鼠体内过程都是按照协议进行当地的动物实验伦理委员会批准的de Salud卡洛斯三世(PA 34 - 2012)或者使用马德里自治大学的动物保健委员会(UAM) (Ref # cei - 25 - 587)和Comunidad马德里(PROEX 335/14, 182/14或294/19)。体内实验,小鼠被安置根据机构的指导方针和实验过程都是按照制度执行的指导方针,实验动物的福利和伦理行为依照规定动物保健和使用的国际生物医学研究指导原则所涉及的动物,由国际医学科学组织理事会(帮助)。PDAC患者的血样和健康的捐赠者提供的生物医院Ramon y Cajal-IRYCIS (PT13/0010/0002)集成在西班牙国家生物银行网络(ISCIII生物库没有注册。B.0000678), ACar从收集的样本家族胰腺癌症登记处的卡洛斯三世研究所(ISCIII ref n°: C.0003953)。样本处理与适当的标准操作程序后批准,伦理和科学委员会(控制。不。控制:de - biob - 73 AC65 RG。B我OB-57 and RG.BIOB-54), with informed consent and according to Declaration of Helsinki principles. Tumours derived from surgical resections at Rechts der Isar Hospital, Technical University of Munich, were obtained with written informed consent and authorised by the Rechts der Isar Hospital Ethics Committee with Project number 1926/07 and 5510/12.

    确认

    感谢病人和医院生物Ramon y Cajal-IRYCIS (PT13/0010/0002)集成在西班牙国家生物银行网络协作,特别是,阿德里安Povo Retana巨噬细胞隔离和哈维尔·外交部博士。Regadera冈萨雷斯组织学援助。我们还要感谢Vanesa Bermeo,埃米利奥Gonzalez-Arnay和桑德拉Batres拉莫斯的无价的技术帮助。SV和PS-T接受者的奖学金Comunidad马德里,效果的“Contratacion德博士前的y Tecnicos de Laboratorio (pejd - 2017 -前/ bmd pej - 2017 tl / bmd的- 5062和- 7505),西班牙的马德里。

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    补充材料

    脚注

    • 废话,能联合高级作者J。

    • 推特@kivancgorgulu, @sainz_lab

    • MA-N和LR-C同样起到了推波助澜的作用。

    • 贡献者MV发起了这项研究。MA-N、PS、SA公斤,MV,密苏里州,PG-S, JCL-G, SV和LM-H进行体外实验和分析数据;MV, CP, LY和LR-C进行体内研究和分析数据;LG-B表现RNA FFPE拔牙;点,公斤,南都进行生物信息学分析;公斤,PS-T CS-P和DK进行组织学分析;鸡蛋是我们内部病理学家和协助体内组织学评估与PCH莫;GM-B执行包含IHC分析人类PDAC肿瘤;CH、PS和SMDT OSM的先导研究;我和ACar ELISA分析和提供初级病人血清和肿瘤样本; ME provided human resected tumor samples for RNA analyses; AM, FS, ACan and FP produced and characterised the Loxl2 mouse models. HA, KG, PCH and GM-B provided significant scientific input, analysed data and reviewed the manuscript. ACan, FP and BSJ developed the study concept, obtained funding, interpreted the data and drafted/edited the manuscript. BSJ acts as the guarantor, and accepts full responsibility for the finished work and/or the conduct of the study, had access to the data, and controlled the decision to publish. All authors edited the manuscript.

    • 资金JCL-G得到“la Caixa”基础的支持(ID 100010434)奖学金(LCF / BQ / DR21/11880011)。本研究支持ISCIII FIS赠款PI18/00757和PI21/01110 (BSJ)和PI18/00267 (LG-B)和赠款从西班牙经济和创新saf2016 - 76504 r(能和FP), pid2019 - 111052 - rb - i00 (FP) pid2019 - 104644 - rb - i00 (GM-B)·拉蒙-卡哈尔绩效奖ryc - 2012 - 12104 (BSJ)和ISCIII CIBERONC, CB16/12/00446 (ACar)和CB16/12/00295(能和GM-B),他们都在通过洋底Europeo de Desarrollo区域(菲德尔)“Una manera de做欧罗巴”;一个Fero基金会(BSJ);协调格兰特(GC16173694BARB) Fundacion Cientifica Asociacion诺拉魂斗罗el癌症(FC-AECC) (BSJ);米格尔Servet奖(CP16/00121) (PS);脱硫,德国研究基金会拨款项目没有:492 436 553(公斤);和德国癌症的马克斯•埃德尔奖学金援助(111746)(PCH)

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播本研究计划。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。

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