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摘要
客观的由于肠道渗透性增加，细菌转移到包括人体脂肪组织(AT)在内的各种器官仍然知之甚少。我们假设:(1)细菌的存在具有高度的组织特异性;(2)细菌的组成和数量与免疫炎症和代谢负担有关。
设计我们对75名肥胖伴或不伴2型糖尿病(T2D)的受试者的血液和AT样本(网膜、肠系膜和皮下)中的细菌16S rRNA基因进行了量化和测序，并使用催化报告沉积(CARD) -荧光原位杂交(FISH)检测AT中的细菌。
结果在严格的污染物实验和生物信息学控制下，在血液和大网膜、皮下和肠系膜AT样本中检测到0.1至5 pg/µg DNA分离物。此外，CARD-FISH允许检测活的AT-borne细菌。变形菌门而且厚壁菌门为优势门，细菌数量与免疫细胞浸润、炎症和代谢参数在组织特异性的方式相关。有和没有T2D的受试者之间的细菌组成不同，并与相关的临床指标相关，包括全身和组织特异性炎症标志物。最后，在体外用细菌DNA处理脂肪细胞刺激了细胞的表达TNFA而且白细胞介素6．
结论我们的研究为肥胖和T2D中的几种AT中细菌和细菌DNA的存在提供了污染意识证据，并提示细菌在启动和维持局部AT亚临床炎症中发挥重要作用，从而影响肥胖的代谢后果。
- 肥胖
- 炎症
- 肠道通透性
- 肥胖手术
- 细菌易位
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
肠道微生物的组成和功能可以通过西方饮食而改变。
肠道微生物组的改变会导致宿主病理，包括肥胖、炎症、胰岛素抵抗和2型糖尿病。
肥胖等代谢表型可通过微生物群转移传播。
对动物模型的研究揭示了“漏肠”是一种机制，饮食诱导的肠道微生物群变化有助于代谢性疾病状态。
细菌转移到人体脂肪组织仍然知之甚少，其对代谢的影响仍然难以捉摸。
新的发现是什么?
细菌存在于人体脂肪组织中。
细菌DNA存在于人类网膜、皮下和肠系膜脂肪组织中，范围为0.1-5 pg/µg DNA分离物。
人体脂肪组织中的细菌组成让人联想到肠道微生物群。
变形菌门而且厚壁菌门是脂肪组织中的优势门。
肠系膜脂肪组织是细菌易位的主要部位，反映在各组织中细菌多样性最高。
脂肪组织中的细菌数量与免疫细胞浸润、炎症和代谢参数有关。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究为肥胖和2型糖尿病患者的几种脂肪组织中存在细菌和细菌DNA提供了污染意识证据。
该研究表明，细菌在启动和维持局部脂肪组织亚临床炎症中起着重要作用，因此影响肥胖的代谢后遗症。
了解特定细菌对局部和全身代谢状态的贡献可能会导致基于组织特异性传递保护性细菌成分的新治疗方法，就像对巴氏消毒细菌系统所做的那样(例如，Akkermansia muciniphila)，从而减少肥胖和改善代谢。
简介
有令人信服的证据表明，肠道微生物的组成和功能可以被西方饮食改变，这些改变导致宿主病理，包括肥胖、炎症、胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2D)，这些表型可通过微生物群转移传播。1 - 5在这种情况下，代谢疾病的一个鲜为人知的特征是肠屏障的改变和功能障碍伴随肠通透性的增加。肠通透性通过两种主要途径进行调节:跨细胞的，即控制溶质在上皮细胞间的运输;细胞旁的，即由细胞间的细胞连接调节。毒素、微生物、营养物质或食品污染物破坏了这一复杂平衡的系统，可导致肠道渗透性的改变，主要是由于通过细胞旁途径的流入增加且控制不当。620世纪50年代的首次研究表明，内毒素(即循环中的革兰氏阴性细菌的脂多糖)的增加是肠道渗透性增加的结果。7最近，在动物模型中，肠道通透性改变被认为是饮食诱导的肠道微生物群转移导致这些代谢性疾病状态的机制:高脂饮食(HFD)喂养小鼠的肠道微生物群改变与肠道炎症、肠道通透性增加、细菌肠粘膜粘附和经粘膜细菌易位到肠系膜脂肪组织(AT)和血液有关。8 - 11这些事件与肥胖和体重增加、肠系膜AT炎症、导致小鼠代谢失调和胰岛素抵抗的全身和组织炎症标志物的增加有关。8 - 11抗生素干预可以显著改善这些异常，包括肠道完整性，即使在HFD挑战下也是如此。8日12综上所述，这些结果支持细菌易位在小鼠模型中对肥胖、炎症和代谢功能障碍的贡献作用。此外，细菌易位的差异可能导致肥胖相关病理的巨大差异。但正如Wang所示，肥胖和糖尿病本身也会影响肠道的通透性等，13他们观察到瘦素缺乏(ob / ob)和高瘦素血症但瘦素受体突变体(db / db)小鼠,14它们构成了肥胖和T2D中广泛使用的动物模型。然而，微生物诱导的病理在人类中是否存在类似的机制，以及特定的细菌类群是否可能起关键作用，仍有待确定。15日16很少有人体研究表明肠道通透性与内脏脂肪有关17肥胖个体的代谢综合症，18与血清C反应蛋白(CRP)水平显著相关。19此外，循环细菌DNA的数量已被证明在心血管事件的发展中发挥作用20.和T2D。21基于这些结果，我们假设循环中的细菌也可能迁移到其他器官，如AT，导致胰岛素抵抗和T2D中常见的慢性低度炎症。然而，导致这一结果的病理过程在人类中尚不明确。
因此，我们的目的是调查细菌DNA是否存在于肥胖受试者的不同AT库中，以及这些细菌的数量和组成是否可以归因于他们的代谢和/或炎症状态。
方法
总体研究设计在在线补充图1．
研究对象
德国莱比锡大学医学中心招募了75例接受腹腔镜Roux-en-Y胃旁路手术的肥胖患者。排除标准包括慢性或急性炎症疾病(由白细胞计数和/或高敏感CRP (hsCRP)定义)、临床症状、术前2个月内抗生素治疗、怀孕和/或哺乳。所有受试者均进行常规临床分型，包括口服糖耐量试验、人体测量(年龄、性别和体重指数(BMI))和代谢参数，如空腹血糖(FPG)、空腹血浆胰岛素、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)、血红蛋白aba1c (HbA1c)以及血细胞计数。
炎症状态评估
白细胞计数和hsCRP测定根据当地实验室的常规做法。采用高灵敏度ELISA法检测肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素6 (IL-6)的循环水平(R&D Systems, Minneapolis;HSTA00E和HS600B)使用未经稀释的血清，根据制造商的协议。脂多糖结合蛋白(LBP)采用酶联免疫吸附法(Hycult Biotech, Uden, Netherlands， #HK315-02)，使用稀释血浆(1:1000)，根据制造商的方案进行测定。
样品制备
在打开肠道之前收集AT活检(腹部皮下，网膜-内脏和肠系膜-内脏)，以防止腹腔镜期间溢出污染。手术常规在过滤器CO下进行2，尽量减少收集的纸巾在手术室接触空气。从左中腹部第一个套管针切口取皮下AT，从大网膜自由部中部取大网膜组织，从靠近肠壁的空肠中段肠系膜取肠系膜组织，立即放入经UV预处理的鹰式胶囊，随后由外科医生自行冰敷。在预处理pcr实验室中处理组织之前，层流罩以及所需的实验室器皿(试管、移液管和仪器，包括离心机)用紫外线预处理至少90分钟。转移和并列后，样品立即在液氮中冷冻并保存在−80°C。所有操作步骤均由个人佩戴长手术手套、一次性手术服和手术帽完成。所采取的所有对策的摘要载于在线补充图1．
DNA用Qiagen DNeasy试剂盒分离，并加入0.25 mg/mL稀释的溶菌酶降解步骤(L7615, Sigma-Aldrich, Missouri, USA)。每次分离都纳入阴性对照(紫外线处理的PBS)，并纳入所有后续步骤。使用Qiagen RNeasy脂质组织迷你试剂盒分离RNA，并使用Super Script III (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)进行反转录。
免疫组化(IHC)和催化报告沉积荧光原位杂交(CARD-FISH)
免疫组化样品在4%多聚甲醛PBS中孵育至少24小时，并包埋石蜡。石蜡切片成6µm载片，用DAKO回收液(pH=9)热蒸汽处理30 min。脂肪细胞用抗周周磷脂-1染色(山羊，1:200;Abcam, Cambridge, UK)和抗iba1的巨噬细胞(兔，1:500;富士和科化学，东京，日本)。以驴血清为阻滞缓冲液，一抗4℃孵育过夜。作为二抗，Alexa Fluor 488驴抗山羊(1:200)和Alexa Fluor 568驴抗兔子(1:200;使用CellSens软件(OLYMPUS Life Science, Shinjuku, Japan)进行监督自动分析，以评估at中的脂肪细胞计数和直径以及巨噬细胞和冠状结构计数。
此外，在聚赖氨酸镀膜玻片上收集石蜡包埋切片，使用CARD-FISH对细菌细胞进行可视化。包括所有缓冲配方在内的扩展方案可在补充品中找到(在线补充方法和表格)．所有步骤都在无菌条件下进行，所有实验室器皿都经过UV处理或高压灭菌，用于制备缓冲液的milliq水经过高压灭菌，并用0.2微米PC等孔膜(Merck, Darmstadt, Germany)对过滤器进行消毒。缓冲液总是在使用前立即准备好，并包括足够的阴性对照来验证所有步骤的无菌性，即空的聚赖氨酸载玻片、含有载玻片的石蜡切片和含有混合缓冲液滤液的过滤器。简单地说，脱亲和切片依次用蛋白酶K缓冲液、SDS缓冲液、溶菌酶缓冲液和褪色肽酶缓冲液在37℃下处理5分钟以达到渗透。与hrp标记的CARD-FISH探针(EUB338I, II, III和NON338;0.17 ng / mL)22 - 24在46°C下进行3小时，然后用洗涤缓冲液在48°C下处理15分钟，在1×PBS中室温处理15分钟。CARD-FISH方法为:切片在46℃扩增缓冲液中孵育20分钟，用1×PBS在室温下冲洗10分钟，用DAPI(1µg/mL)在室温下染色10分钟。在安装介质中嵌入后，切片在成像前保存于- 20°C。CARD-FISH在30个不同的连续和随机选择的切片上进行，每个切片之间间隔至少60µm，这些切片来自根据定量结果选择的高、中、低梯次患者的皮下at。
基因表达
在384孔格式的LightCyler 480 (Roche, Basel, Switzerland)上，使用TaqMan探针和2倍PCR主杂交(Applied Biosystems, Foster City, USA)检测基因表达。在Pipetmax平台上移液(Gilson, Wisconsin, USA)。为了获得最佳的正常化，我们测试了9个内参基因在胰岛素敏感和胰岛素抵抗受试者所有分析组织中的稳定性。选择GAPDH和B2M两个基因作为最终的内参基因。PCR效率计算使用重复的标准曲线在每次运行。标准曲线需要有一个R²>0.98来包含运行。平均PCR效率为1.85±0.06。根据ΔΔCt方法进行分析。25
细胞培养
有条件永生化的人皮下前脂肪细胞来自一名非糖尿病患者，30-40岁男性供体(LONZA Walkersville, Maryland, USA)，在添加了人表皮生长因子、地塞米松、l-谷氨酰胺、胎牛血清和庆大霉素/两性霉素b的SkBM-2培养基(LONZA)中培养。将前脂肪细胞分裂到6孔板上，在5ml生长介质中，33°C, 5% CO中培养至95%合流2且开始分化前湿度为90%。分化培养基含葡萄糖4.5 g/L的DMEM，添加L-谷氨酰胺、胎牛血清、庆大霉素/两性霉素b、地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛。分化培养基的培养条件改为37℃，CO含量为5%290%湿度和前脂肪细胞分化10天，约有38万个活细胞。下面描述的所有细胞培养实验均以三重复进行。以相当于人体细胞1% (~0.014 ng/well)的细菌DNA作为最低处理条件，并以此为标准大肠杆菌基因组(4.7 MBp)为参考。以10倍增量的额外浓度作为阳性对照，细胞孵育4、24或72小时。每个时间点均以等量水作为负对照，并实验计算折叠变化。
细菌DNA的定量
根据Amar进行血液和AT中细菌DNA的定量等．20.引物(5 ' -CGGTGAATACGTTCCCGG-3 '和5 ' - tacggctaccttgttacgacactt -3 ')在优化的PCR条件下使用(98°C 2 min;42个循环，95°C/15秒，60°C/30秒，72°C/20秒)，高分辨率熔融主混合(Roche, Basel, Switzerland 04909631001)。复制标准曲线使用购买大肠杆菌采用JM 109 DNA稀释剂(Promega, Madison, USA)进行定量。结果与市售试剂盒(Zymoresearch, California, USA)一致(n=13, r=0.74, p=0.004)，并证明更敏感(Δ)Ct= 3.9)。
16S rRNA V4V5区扩增及测序
测试了多种16S引物;然而，由于样本中细菌DNA的含量非常低，大多数样本中观察到非特异性人类DNA扩增。因此，引物采用核糖体数据库项目26和Claesson等27扩增V4/V5区(V4- f: 5 ' -actgggcgtaaagcg-3 ';V5-R: 5 ' -ccgtcaattcctttgagttt-3 ')。此外，根据目前的文献，V4V5区域几乎没有引入偏见，28更可重复的结果29与其他区域相比，扩增子更多。30.在对各种聚合酶进行广泛测试后，选择高保真Q5校对聚合酶进行扩增(New England BioLabs, Ipswich, USA)。所有测试引物和聚合酶的详细摘要可以在在线补充表S4和S5．所有阴性对照以及每次试验的额外pcr阴性对照均被纳入、扩增和测序。配对端测序由华大基因(深圳，广东，中国)在HiSeq 2500平台上进行，平均原始reads为2×1 57 045(±68 730)。
统计数据
所有统计数据均在R 3.5.1 (R Core Team, 2018)和SPSS V.24 (IBM, Armonk，纽约)中执行。所有图形都是在R 3.5.1中使用ggplot2 v3.1.1生成的，31phyloseq v1.26.1,32素食v2.5-433并圈出v0.4.734并使用Adobe Illustrator (Adobe Inc, California, USA)重新标记。非正态分布数据的相关分析采用Spearman秩相关检验。基于数据分布的组间比较采用学生t检验和Wilcoxon符号秩检验/Mann-Whitney U检验，数据分布采用Kolmogorov-Smirnov检验。多个测试问题通过FDR调整解决，如果没有另行说明，并给出了标称(p)和调整(q)值。
16S数据分析
预处理和质量筛选的配对末端测序数据(平均112,973±48825 reads)来自华大基因。预处理包括去除一定比例的低质量读(20个碱基)(占读原长度的20%)，去除被适配器污染的读(5个碱基被读和适配器重叠，最多允许3个碱基不匹配)，去除碱基不明确的读和去除复杂度低的读(连续10个相同碱基的读)。数据导入Qiime2 v2018-1135使用引用软件包的QIIME2插件执行所有后续步骤。使用DADA2进行成对端连接和去噪，36在370个样本(包括阴性对照)中留下3663个特征，中位频率为77 601(40 141-103 152)个reads，平均长度为325.6±15.1个碱基对。使用align-to-tree mafft-fasttree生成根树。37使用q2特征分类器进行分类分配，38使用SILVA 132发布的99% OTU数据集对使用过的引物进行训练。39随后，分类法和生成的特征表被导入到phyloseq v1.26.132以便进一步分析。所有不属于细菌的特征，以及线粒体和叶绿体特征均被排除(∑=193)。Decontam V.1.2.140使用序列阴性对照，在属水平上过滤掉高几率为污染物的特征。采用基于流行度的污染物识别，阈值评分为0.5，过滤掉41%的特征作为潜在污染物，留下309属。此外，仅含有污染物的样品被排除，导致317个样品被进一步分析。在系统序列和排序分析中进行了α多样性(观察到的，Shannon)的比较，包括计算Bray-Curtis不相似性，41使用vegan v2.5-4进行群体分散的多元同质性和基于距离的冗余分析。33用DESeq2 v1.22.2计算差异丰度，42应用poscount类型进行大小因子估计，然后采用局部拟合进行Wald显著性检验。使用R v1.4.2的微生物组包对感兴趣的标记进行属的相关性43采用斯皮尔曼等级相关。
结果
研究队列中的炎症负担和代谢损伤
这项研究招募了75名接受减肥手术的患者，其中33人患有T2D。T2D患者的FPG、HOMA-IR和HbA1c等糖代谢参数以及循环炎症标志物TNF-α、IL6和CRP等明显高于无T2D患者(表1)．T2D患者年龄明显偏大(45.2±11.0 vs 52.5±11.3岁，p=0.006)。正如预期的那样，炎症测量与HOMA-IR和HbA1c呈正相关，与hdl -胆固醇呈负相关。
此外，循环炎症参数如TNF-α (rho=0.29, p=0.02)和CRP (rho=0.32, p=0.01)与LBP水平显著相关，而LBP又与BMI (rho=0.32, p=0.01)和空腹血浆胰岛素(rho=0.28, p=0.03)呈正相关，并且在T2D患者中升高，但不显著(11.5±3.9 vs 13.9±5.7 ng/µL, p=0.05) (表1)．
AT中可检测到细菌DNA
我们在人AT和血液中检测到细菌16S rRNA基因，范围为0.1-5 pg /µg总DNA。在包括DNA分离在内的整个实验过程中，与阴性对照相比，所有生物样本的细菌DNA数量均显著增加(图1一个)．血液中总DNA最高，为1.12 (0.58-1.84)pg/µg，其次是肠系膜AT (0.65 (0.49-1.02) pg/µg和皮下AT (0.64 (0.25-1.62) pg/µg)。大网膜AT仅略高于阴性对照(0.24 vs 0.21 pg/µg, p=0.04)。与阴性对照组的平均数量相比，所有血液样本的88.0%、肠系膜样本的78.7%、皮下样本的69.3%和网膜AT样本的46.7%的细菌DNA含量较高(图1一个)．作为阳性参考，纳入了从粪便样本中分离的DNA，其含量为0.39(0.20-0.72)µg/µg总DNA细菌DNA (图1 b)．使用大肠杆菌以基因组(4.6 Mbp)为参考，估计AT中高达0.7%的细胞是细菌来源。
细菌DNA数量。(A)与所有阴性对照相比，所有脂肪组织和血液中pg/µg DNA分离物中的细菌DNA数量(B)在对数标度上将所有脂肪组织与粪便样本进行比较(ng/µg DNA分离物)，Tukey-Whiskers箱线图和平均值(◆);给出了p值和fdr调整后的q值;(C)细菌数量与脂肪组织巨噬细胞(ATM) (Sc和Om)、组织特异性基因表达(mes、Sc和Om)和循环炎症标志物(全部)的Spearman秩相关图。标称显著值表示为:*:p<0.05， **: p<0.01， ***: p<0.001，并突出显示fdr调整后显著结果，分别表示q值。ADIPOQ脂联素;Bact细菌;CEBPA, CCAAT增强子结合蛋白;IGT，糖耐量受损;IL1B和6，白细胞介素1β和6;LBP，脂多糖结合蛋白;地蜡瘦素;Mes,肠系膜;NC，负控;NGT，葡萄糖耐量正常;Om,网膜的;PPARG，过氧化物酶体增殖物激活受体γ;SC,皮下;T2D, 2型糖尿病;肿瘤坏死因子α。
CARD-FISH可以检测AT中的活细菌细胞
在无菌条件下，使用催化报告沉积荧光原位杂交(CARD-FISH)技术，使用普通真菌单链DNA探针，实现了皮下AT中活细菌细胞的可视化。我们可以在每个组织切片中看到13个(IQR: 8-25) EUB阳性杂交细菌细胞，每个细胞包含约900个脂肪细胞。杂交的细菌细胞通常为单个或成对(图2 a, C, E)，并且很少在更多的细胞簇中(图2 g)．在同一病人的连续切片和切片内，细菌细胞数量高度不均匀。使用EUB338I-III在所有3例患者的所有杂交切片中，持续观察阳性杂交细胞的独立杂交事件。无义探针(NON338)和未添加探针的杂交均无假阳性杂交细胞(在线补充图2A, C, E, G)，但通过DAPI染色可以观察到AT中存在微生物细胞(在线补充图2B, D, F, H)与探针结合细菌rRNA的特异性有关。无菌对照在其表面未见任何阳性杂交或dapi染色细胞。
使用CARD-FISH活细菌的可视化。典型的荧光显微照片由CARD-FISH使用hrp标记的EUB338 I-III探针混合物(红色)和DAPI染色(蓝色)获得，显示了皮下脂肪组织横切面中杂交细菌细胞的存在和分布;(A和B)皮下脂肪组织横切面(dapi -蓝色)与杂交细胞(alexa594 -红色)的总体图像;(C-F)横切面脂肪细胞内单个细菌细胞的分布;(G和H)脂肪组织(紫色)中杂交细菌(红色)的单细胞簇。CARD-FISH，催化报告子沉积荧光原位杂交;辣根过氧化物酶。
细菌DNA的数量与炎症标志物相关
在脂肪库特异性的方式，细菌DNA负荷与炎症标志物相关，包括表达TNFA(rho=0.25, p=0.04)和IL1B(rho=0.34，在肠系膜AT中p=0.007)以及网膜AT中的巨噬细胞浸润(rho=0.46, p=2.0×10−4；图1 c)．亚组分析显示，一些观察到的相关性是由T2D状态驱动的，例如，组织巨噬细胞和大网膜AT中的细菌负荷之间(rho=0.62, p=3.1×10)−4)对患有T2D的受试者(图1 c)．然而，AT中的细菌DNA数量与任何人体测量、葡萄糖或脂质代谢参数无关，除了肠系膜AT与BMI呈负相关(rho=−0.32,p=0.01)。此外，在有和没有T2D的受试者之间，AT中的细菌DNA数量没有差异。
宿主区室在细菌DNA多样性方面显示出显著差异
粪便中观察到的细菌丰富度和Shannon距离明显高于血液和AT库的总和(17.9±4.0 vs 4.9±3.2,p=2.8×10-43年1.3±0.3 vs 0.6±0.52,p=3.3×107，分别)(图3一)．在AT库和血液中，肠系膜AT的alpha多样性和Shannon距离均最高(分别为5.7±0.3和0.82±0.06)，显著高于血液AT和内脏AT (p<0.001)。皮下AT的α多样性也略高于血液AT和网膜AT (p<0.01)。在有和没有T2D的受试者之间，alpha多样性的测量没有差异(在线补充图S1)．
细菌的多样性。(A)在基于属水平控制污染物后，观察所有脂肪组织、血液和粪便的多样性和Shannon指数，(B) PcoA在Bray-Curtis不相似性上具有组方差指示(betadisper);(C-F)解释变量拟合的距离冗余分析(dbRDA);置换分析后影响显著的变量用红色表示;完整的解释变量包括(如果适用):脂多糖结合蛋白(LBP)，肿瘤坏死因子α (TNF-α)，白介素(IL)-6，年龄，体重指数，C反应蛋白(CRP)，胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)，糖化血红蛋白(Hb) A1c，脂肪细胞大小，脂肪组织巨噬细胞(ATM)和细菌负荷。Mes,肠系膜;Om,网膜的;SC,皮下。
炎症和胰岛素抵抗决定了组织之间的成分差异
用Bray-Curtis不相似性来评估感兴趣组织之间的成分不相似性。组织间的分散性不均匀，即不同组织间的方差有显著性差异(图3 b)．基于距离的Bray-Curtis差异冗余分析用于估计收集变量对排序和细菌群落组成的影响。在所有三种at中，细菌负荷、炎症标志物(如组织巨噬细胞)、TNF-α和IL-6以及胰岛素抵抗标志物(如HOMA-IR)是显著影响群落组成的参数(在线补充表S1，图3汉英)．在血液中，只有炎症标志物(循环TNF-α和IL-6, CRP和LBP)和受试者的年龄对样本的聚类有影响(在线补充表S1，图3 f)．
变形菌门而且厚壁菌门AT的优势门是什么
门水平上的分类以变形菌门而且厚壁菌门在所有的AT仓库。其他突出门共同的所有脂肪仓库包括放线菌而且Patescibacteria（图4一)．Chloroflexi而且Planctomycetes主要见于血液(平均q=0.001和q=0.01;图3 d)．肠系膜和皮下AT都有很大一部分门，平均丰度低于1%，其中包括拟杆菌门而且Tenericutes．相比之下，大网膜AT中低丰度门的比例较小。被试组织显示出特定的分类特征(在属水平上显示)图4罪犯，联机补充表S2)．
分类法。门(A)的相对分布和属属的相对分布变形菌门(B)和厚壁菌门(C);(D)圆形图，显示所有观察到的属的对数转换平均丰度，在条形图(最外面的轨迹)中，按门(标记在图的边缘)对每个分析组织进行分类，如第二条向内的轨迹所示。下面的轨迹显示了每门所有属的累积数量，反映了外部条形图。最里面的圆圈表示各组织间丰度有显著差异的门(透明的彩色区域)和属(彩色线，所选属被标记);颜色表示组织中相应颜色(即属)的存在增加肠杆菌属(橙色)在皮下脂肪组织中明显比所有其他组织更丰富，并且链球菌与血液相比，在网膜和皮下脂肪组织中含量更高。Mes,肠系膜;肠系膜;Om,网膜的;SC,皮下。
细菌组成在属水平上反映了独特的血液和AT特征
总的来说，所分析的AT之间差异丰度较少(平均5.3个)，其中12个差异丰度属，在皮下AT和血液中观察到的差异最大。在这些属中，不动杆菌均显著高于(average . log(2)FC=6.7, q=2.2×10−8),Tahibacter显著降低(average . log(2)FC=−20.7,q=1.7×10−3)与血液相比，AT含量丰富。与内脏AT库相比，血液中更多存在的另一个属是Delftia(average . log(2)FC=−27.7,q=7.5×10−20) (图3 d)．这两种主要存在于血液中的属都与糖尿病有关，Thahibacterpositive (log(2)FC=26.8, q=1.1×10−18),而Delftianegative (log(2)FC=−27.3,q=3.3×10−19) (图4一)．在AT中，网膜AT和肠系膜AT与皮下AT相比更相似，具有更多差异丰富的属。在他们中间肠杆菌属(average . log(2)FC=28.9, q=1.6×10−22),Gemella(average . log(2)FC=25.0, q=3.6×10−22)均显著增加(图4 d)．
AT中的细菌组成及其丰度差异与代谢性疾病有关
在309个分析属中，有18个在有或没有T2D的受试者之间存在差异。在血液和肠系膜AT中观察到大部分差异。对于三个属，观察到组织间方向一致的重叠:Rhodoferax糖尿病患者的皮下和肠系膜AT含量较低(log(2)FC=−27.0,q=1.2×10−18；日志(2)FC =−8.0 q = 0.03),Lactococcus(log(2)FC=−30.0,q=8.9×10−23；日志(2)FC =−30.0 q = 2.3×10−22),乳酸菌血液和网膜AT (log(2)FC=−30.0,q=8.9×10−23；日志(2)FC =−27.3 q = 7.6×10−19)（图5一个)．这些属与相关临床标记物也有相应的关联(图5 b)．大量的Lactococcus与血中HOMA-IR及皮下AT中BMI呈负相关。皮下组织与年龄、细菌DNA数量、HOMA-IR相关性最大。在血液中观察到的相关性最小，其中属主要与循环IL-6和循环细菌DNA的数量相关。
组织细菌及其代谢环节;(A)糖尿病患者和非糖尿病患者在所有血液和血液中的丰富属的差异;(B)属的存在和数量与炎症、人体测量和代谢参数之间的相关性分析。ADIP,脂肪细胞;ATM，脂肪组织巨噬细胞;Bact细菌;BMI，身体质量指数;C反应蛋白;糖化血红蛋白;HOMA-IR，胰岛素抵抗的稳态模型评估; IL6, interleukin 6; LBP, lipopolysaccharide binding protein; TNF-α: tumour necrosis factor alpha.
细菌DNA诱导脂肪细胞炎症反应
微量的细菌DNA，相当于大约每100个脂肪细胞中有一个细菌细胞，或在6孔板中每孔0.014 ng，足以诱导脂肪细胞因子表达的增加白细胞介素6而且TNFA在一个明显健康、瘦弱受试者的永生化皮下脂肪细胞中，经过4小时的孵育时间(白细胞介素6足球俱乐部0.014 ng= 1.36±0.08;TNFA足球俱乐部0.014 ng=1.41±0.1,p均<0.001;图6)．反应呈剂量依赖性，4小时后反应最强(白细胞介素6足球俱乐部1.4 ng= 16.4±0.6;TNFA足球俱乐部1.4 ng=19.4±1.3,p均<1×10−7)， 24小时后效果减弱，72小时后几乎没有变化(图6)．这种反应是可重复的，进一步增加浓度同样增加了这两种基因的表达(白细胞介素6足球俱乐部14 ng= 105.8±6.3;TNFA足球俱乐部14 ng=124.4±11.1,p均<1×10−7，图6 b)．此外，的表达增加IL1B而且NFKB观察到(IL1B足球俱乐部14 ng= 6.7±0.4;NFKB足球俱乐部14 ng=5.6±0.3,p均<1×10−7，图6 b)．相反，用细菌DNA处理并没有改变TLR9识别，IRAK4，MyD88，CASP1而且CASP8在任何时间点或浓度(数据未显示)。此外，还检测了各种脂肪因子的表达，高浓度的细菌DNA对脂肪因子的表达有轻微的损伤PPARG(FC14 ng= 0.64±0.1,p = 5.4×10−4)，趋化素(FC .14 ng= 0.76±0.07,p = 8.7×10−4)，脂联素(FC .14 ng=0.88±0.06,p=0.006)和瘦素(FC14 ng= 0.72±0.06,p = 7.7×10−5)．
用细菌DNA体外处理脂肪细胞。用增加数量的细菌DNA处理永生化的皮下脂肪细胞(大肠杆菌)，孵育4、24和72小时，测量基因表达(A)，并在孵育4小时时进一步增加稀释度重复实验(B);所有实验均重复3次(n=6);各时间点与未处理对照(单独生成)相比，以平均折叠变化表示，误差柱表示SD，星号表示Benjamini-Hochberg调整后与阴性对照相比发生显著变化(单样本t检验)。IL1B，白细胞介素1 β;白细胞介素6;活化B细胞核因子kappa轻链增强子NFkB;TNFA，肿瘤坏死因子。
讨论
有新的但有争议的证据表明细菌存在于循环和AT。10 15 16 20 44 45在本研究中，在严格的实验条件下，重点是无菌处理和污染物的生物信息学控制，我们检测到细菌DNA，这与各种人类脂肪库中的巨噬细胞浸润相关。此外，我们还证实了组织特异性的定量、分类学和组成细菌特征是由炎症标志物和代谢特征以组织依赖的方式驱动并与之显著相关的。
尽管在动物实验中，AT中存在细菌的证据很有吸引力，10在人类AT中的验证仍然具有挑战性。Burcelin等44当他们提出“组织微生物群”假设时，首次提出了探索性数据。直到最近，这些数据都缺乏强有力的支持，大多数出版物都没有解释污染;2016年，祖联等未能从人类AT中扩增细菌DNA，并宣布该课题是一个悬而未决的问题。45最近，Anhê等46报道了在几个AT库、肝脏和血浆中存在细菌DNA，并指出在肠系膜AT中存在组织特异性的细菌片段区室化和T2D细菌特征。考虑到之前研究的不一致性，人们可以预计AT中的细菌DNA丰度非常低，这使得其实验验证具有很大的挑战性。主要存在的人类DNA是阻碍细菌16S rRNA基因成功扩增的主要因素之一。试剂、操作和交叉污染会带来进一步的噪声，在很大程度上影响实验程序的结果。因此，实验优化和污染物控制是人类组织中细菌检测研究中需要解决的两个主要问题。47在这里，我们使用了高保真Q5校对阅读聚合酶和V4/5 16S区域的引物对，这并不倾向于在人类基因组DNA的丰度中扩增人类18S或其他相关基因。适当的聚合酶和引物对的选择似乎至关重要，因为大多数测试的引物对和聚合酶没有扩增细菌DNA (联机补充表S3, S4)．为了减少污染，所有步骤都在预pcr室的层流罩下进行，并且所有器皿都必须进行至少90分钟的紫外线处理。47此外，阴性对照(紫外线处理的PBS)在每次运行的整个方案中进行，包括测序。我们还通过采用主要基于阴性对照的生物信息统计方法来考虑潜在的污染。40在对低细菌生物量样本进行严格的实验和生物信息学控制后，我们的结果与最近的研究结果一致，46从而为肥胖和T2D受试者AT中存在低量细菌DNA提供了进一步的证据。除此之外，我们使用CARD-FISH技术提供了皮下AT中存在活细菌的第一个证据，这在与AT切片一起运行的阴性对照中无法类似地显示。每脂肪细胞的细菌细胞数量约为1.4%，反映了每整个AT分离DNA的细菌DNA数量，进一步说明我们报告的细菌数量确实，至少部分地，突出于活细菌。更重要的是，所观察到的细菌细胞被包裹在脂肪细胞内，通常在脂肪细胞-脂肪细胞边界处可见，强调了它们的组织源性。这些结果证实了之前的实验结果，这些实验用小鼠口服，标记大肠杆菌由Denou等他们报告了这些活细菌在内脏AT以及AT间质血管部分的易位和存在。48
诚然，我们只能推测检测到的细菌DNA的起源。肠道渗透性的测量，如乳果糖/甘露醇试验，可以表明细菌从肠道转位到AT，在我们的研究队列中是不可用的。此外，我们最近发现，肠渗透性常用的生物标志物佐努林(前触珠蛋白2)并不是一个合适的选择，因为市上可用的ELISA试剂盒不检测前触珠蛋白2，而是不特异性地测量其他可能与“佐努林家族”相关的蛋白质。49在肠道渗漏和细菌易位中的作用尚不明确。
我们最引人注目的发现之一是肠系膜AT在测试的AT中拥有最高的细菌数量和多样性。肠系膜AT可能是肠道和全身暴露于细菌之间的“守门人”，在细菌成分到达其他组织之前清除它们。为了支持我们的数据，在小鼠模型上的实验表明，在饮食诱导的肥胖小鼠中，细菌DNA可以沿着肠道进入AT。10这在人体研究中也得到了证实，高血糖已被证明与肠屏障损害有关50以及细菌成分如脂多糖的涌入51以及循环中的细菌DNA。10一个矛盾的发现是，血液中细菌DNA的含量最高，这强调了血液中其他细菌DNA来源的相关性，如口腔52 53和皮肤。54
在本研究测试的组织中最常见的门是厚壁菌门而且变形菌门，然后是放线菌．这与Burcelin的数据一致等和暗褐等他在人类AT的间质血管部分中发现了细菌DNA44或整个AT样品。46血液微生物组也显示出类似的细菌组成55 56哪些细菌特征与肥胖的病理(如肝纤维化)有关55也有肝硬化患者的全身炎症。57
在我们的研究中，细菌的数量和分布与患者的全身炎症以及组织特异性炎症密切相关，这与“漏肠”假说和细菌易位引起的AT低级别炎症一致。不可否认，“漏肠”一词的定义很差，它被等同于肠道渗透性增加、细菌产物循环增加或反应性宿主标记物增加。在这个程度上，我们提出的AT中的细菌和细菌DNA挑战后炎症反应增加的证据构成了代谢性疾病中细菌易位增加以及局部宿主-微生物相互作用概念的最直接证据，并扩展了营养过剩后内毒素血症和肠通透性增加的解释能力。58在这方面，我们的数据与已发表的关于AT中漏肠假说和低度全身和组织炎症的文献一致。例如，用LPS刺激AT巨噬细胞和脂肪细胞证明了细菌成分的潜在作用，这导致炎症通过TLR2和4增加，TNF-α和IL-6表达增加。59 60因此，AT中的细菌特征与代谢变化和炎症有关，而血液细菌组成主要与炎症有关，与循环代谢参数无关。除了存在细菌DNA和AT炎症之间的关联之外，我们还表明，用细菌DNA体外治疗脂肪细胞后，炎症细胞因子的表达与细菌DNA的数量成正比，进一步支持细菌引起的局部炎症是增加肠道通透性、AT炎症和肥胖和胰岛素抵抗中随后的全身炎症之间联系的假定潜在途径。了解特定细菌对局部和全身代谢状态的贡献可能会导致基于组织特异性传递保护性细菌成分的新治疗方法，就像对巴氏消毒细菌系统所做的那样(例如，Akkermansia muciniphila)，从而减少肥胖和改善代谢。61 62
这项研究有几个优点和缺点，必须承认。据我们所知，这是第一个污染意识的研究，为人类AT中细菌DNA和活细菌的存在提供了证据，并表明它与肥胖患者的代谢和炎症状态有关。75个代谢特征良好的受试者和3个AT库的相对较大的样本量确实允许生成关于细菌DNA的可靠和可重复的数据，并测试细菌负荷、AT免疫细胞浸润和临床表型之间的相关性。在未来，将具有健康代谢表型的瘦削受试者与肥胖患者进行比较也可能是可取的。还必须承认，糖尿病患者和非糖尿病患者之间的比较分析受到糖尿病患者年龄明显较大这一事实的限制。最后，应谨慎看待R2 <0.2的相关关系，因为尽管具有统计学意义，但这种关系的生物学相关性可能值得怀疑，需要进一步复制。
综上所述，我们的研究为肥胖患者AT中细菌DNA的数量和组成的存在和库特异性差异提供了证据，并提示细菌在各种AT库分子特征中的重要作用，可能有助于肥胖的代谢后果。
致谢
我们要感谢所有参与研究的人，特别是我们的研究对象。作者要感谢Ingo Bechmann提供的有益建议和讨论，以及Stefanie Ziesche、Eileen Bösenberg和Judith Kammer提供的持续出色的技术支持。我们感谢亥姆霍兹环境研究中心的化学显微镜中心(ProVIS)使用他们的样品制备和显微镜设备。特别感谢Katja Nerlich在原位杂交和荧光显微镜图像采集过程中的支持。
脚注
LM和RC的贡献相当。
贡献者LM、RC、AC、HH、PK设计研究;LM、RC、AC、MS、PK撰写并编辑稿件。LM、RC、AC完成所有实验;LM和RC分析了数据;ST、MG进行免疫组化;NM计划并监督催化报告沉积荧光原位杂交(CARD-FISH)方案，ST执行CARD-FISH方案及后续分析;KDD进行实时表达实验;JF、MvB、S-BH和HH提供生物信息专业知识，HH收集患者数据;AD和MB负责样品采集。
资金这项工作得到了德国研究基金会(DFG，德国研究基金会-项目编号209933838 - SFB 1052;B01, B03和B09)和IFB脂肪疾病(AD2-060E, AD2-06E95和AD2-K7-117)。IFB肥胖疾病由德国联邦教育和研究部(BMBF)支持，FKZ: 01EO1501。ProVIS由欧洲区域发展基金(EFRE -欧洲萨克森基金)支持。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
患者发表同意书不是必需的。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
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