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摘要
客观的由于肠道通透性的增加，细菌转移到包括人体脂肪组织在内的各种器官，这一点目前尚不清楚。我们假设:(1)细菌的存在是高度组织特异性的，(2)在组成和数量上与免疫炎症和代谢负担有关。
设计我们对75名肥胖或不肥胖的2型糖尿病(T2D)患者的血液和AT样本(网膜、肠系膜和皮下)中的细菌16S rRNA基因进行了量化和测序，并使用催化报告物沉积(CARD) -荧光原位杂交(FISH)检测AT中的细菌。
结果在对污染物严格的实验和生物信息学控制下，在血液和网膜、皮下和肠系膜AT样品中检测到0.1至5 pg/µg DNA分离物。此外，CARD-FISH还可以检测到活的AT-borne细菌。变形菌门而且厚壁菌门细菌数量与免疫细胞浸润、炎症和代谢参数以组织特异性的方式相关。有和没有T2D的受试者之间的细菌组成不同，与相关的临床指标相关，包括全身和组织特异性炎症标志物。最后，在体外用细菌DNA处理脂肪细胞刺激了TNFA而且白细胞介素6．
结论我们的研究为肥胖和T2D中的几种AT中细菌和细菌DNA的存在提供了污染意识证据，并表明细菌在启动和维持局部AT亚临床炎症中发挥了重要作用，因此影响了肥胖的代谢后遗症。
- 肥胖
- 炎症
- 肠道通透性
- 肥胖手术
- 细菌易位
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
西方饮食可以改变肠道微生物的组成和功能。
肠道微生物组的改变导致宿主病理，包括肥胖、炎症、胰岛素抵抗和2型糖尿病。
肥胖等代谢表型可通过菌群转移传播。
动物模型研究显示，“漏肠”是一种机制，通过饮食诱导的肠道菌群变化导致代谢性疾病状态。
细菌转移到人体脂肪组织的情况仍不甚清楚，其对新陈代谢的影响仍然难以捉摸。
新的发现是什么?
细菌存在于人体脂肪组织中。
细菌DNA在人网膜、皮下和肠系膜脂肪组织中以0.1-5 pg/µg DNA分离物存在。
人体脂肪组织中的细菌组成让人联想起肠道微生物组。
变形菌门而且厚壁菌门是脂肪组织中的主要门。
肠系膜脂肪组织是细菌易位的主要部位，反映在组织中细菌多样性最高。
脂肪组织中的细菌数量与免疫细胞浸润、炎症和代谢参数相关。
在可预见的未来，它将如何影响临床实践?
我们的研究为肥胖和2型糖尿病患者的几种脂肪组织中细菌和细菌DNA的存在提供了污染意识证据。
研究表明，细菌在引发和维持局部脂肪组织亚临床炎症中起着重要作用，因此影响肥胖的代谢后遗症。
了解特定的细菌对局部和全身代谢状态的贡献，可能导致基于组织特异性传递保护细菌成分的新治疗方法，就像对巴氏灭菌细菌系统所做的那样(例如，Akkermansia muciniphila)从而减少肥胖和改善新陈代谢。
简介
有令人信服的证据表明，肠道微生物的组成和功能可以被西方饮食改变，这些改变导致宿主病理，包括肥胖、炎症、胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2D)，这些表型可通过微生物群转移传播。1 - 5在此背景下，代谢性疾病的一个鲜为人知的特征是伴随肠通透性增加的肠屏障的改变和功能障碍。肠通透性的调节主要通过两种途径:跨细胞途径，即控制上皮细胞间溶质的运输，以及细胞旁途径，即通过细胞间的细胞连接来调节。毒素、微生物、营养物质或食物污染物对这一错综复杂的平衡系统的破坏，可导致肠道通透性的改变，主要是通过细胞旁途径增加和控制不当的流入。620世纪50年代的初步研究表明，循环中的内毒素(革兰氏阴性菌的脂多糖)的增加是肠通透性增加的结果。7最近，肠道通透性改变被认为是饮食诱导的肠道菌群改变导致动物模型中代谢性疾病状态的一种机制:高脂饮食(HFD)喂养的小鼠肠道菌群改变与肠道炎症、肠通透性增加、细菌肠粘膜粘附和经粘膜细菌向肠系膜脂肪组织(AT)和血液转运有关。8 - 11这些事件与肥胖和体重增加、肠系膜AT炎症、导致小鼠代谢失调和胰岛素抵抗的全身和组织炎症标志物的增加有关。8 - 11抗生素干预显著改善这些异常，包括肠道完整性，即使在HFD挑战。8日12综上所述，这些结果支持在小鼠模型中细菌易位对肥胖、炎症和代谢功能障碍的促进作用。此外，细菌易位的差异可能导致肥胖相关病理的巨大差异。然而，肥胖和糖尿病本身可能会影响肠通透性，如王所示等，13他们观察到瘦素缺乏(ob / ob)和高瘦素血症但瘦素受体突变体(db / db)小鼠,14构成了肥胖和T2D中广泛使用的动物模型。然而，人类是否存在类似的微生物诱导病理机制，以及特定的细菌类群是否可能起关键作用，仍有待确定。15日16很少有人体研究证明肠通透性与内脏脂肪有关17肥胖人群的代谢综合症，18在T2D患者中升高，且与血清C反应蛋白(CRP)水平显著相关。19此外，循环细菌DNA的数量已被证明在心血管事件的发展中发挥作用20.和T2D。21基于这些结果，假设循环中的细菌也可能迁移到其他器官，如AT，有助于在胰岛素抵抗和T2D中常见的慢性低级别炎症。然而，导致其发生的病理过程在人类中尚不清楚。
因此，我们旨在研究肥胖受试者的不同AT库中是否存在细菌DNA，以及这些细菌的数量和组成是否与他们的代谢和/或炎症状态有关。
方法
研究的总体设计在在线补充图1．
研究对象
德国莱比锡大学医学中心招募了75名接受腹腔镜Roux-en-Y胃旁路手术的肥胖患者。排除标准包括慢性或急性炎症(根据白细胞计数和/或高敏感性CRP (hsCRP)以及临床症状、手术前2个月内的抗生素治疗、怀孕和/或哺乳)。所有受试者均进行常规临床分型，包括口服糖耐量试验、人体计量学(年龄、性别和体重指数(BMI))和代谢参数的收集，如空腹血糖(FPG)、空腹血浆胰岛素、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇、胰岛素抵抗稳态模型评估(HOMA-IR)、糖化血红蛋白(HbA1c)和血细胞计数。
炎症状态评估
白细胞计数和hsCRP按当地实验室常规方法测定。肿瘤坏死因子α (TNF-α)和白细胞介素6 (IL-6)的循环水平通过高灵敏度ELISA (R&D Systems, Minneapolis;HSTA00E和HS600B)根据制造商的协议使用未稀释的血清。脂多糖结合蛋白(LBP)采用酶联免疫吸附法(Hycult Biotech, Uden, Netherlands， #HK315-02)，使用稀释血浆(1:1000)，根据制造商协议进行测定。
样品制备
在打开肠道之前收集AT活检(腹部皮下、网膜-内脏和肠系膜-内脏)，以防止腹腔镜检查时溢出污染。常规手术在滤镜CO下进行2，尽量减少收集的纸巾与手术室内空气的接触。从左中腹中中段第一套管针切口取皮下AT，大网膜自由部中段取网膜组织，空肠中段肠系膜近肠壁处取肠系膜组织，立即放入经紫外线预处理的猎鹰，随后由外科医生亲自冷冻。在预pcr实验室处理组织之前，层流罩和所需的实验器具(管、移液管和仪器包括离心机)用紫外线预处理至少90分钟。转移和混合后，样品立即在液氮中冷冻，并在−80℃保存。所有操作步骤均由佩戴长手术手套、一次性手术服和手术帽的人员完成。所有采取的对策的摘要说明在在线补充图1．
使用Qiagen DNeasy Kit以0.25 mg/mL稀释的附加溶菌酶降解步骤分离DNA (L7615, Sigma-Aldrich, Missouri, USA)。每次分离都包括阴性对照(紫外线处理PBS)，并包括在所有后续步骤中。使用Qiagen RNeasy脂质组织迷你试剂盒分离RNA，并使用Super Script III (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)进行逆转录。
免疫组化(IHC)和催化报告蛋白沉积荧光原位杂交(CARD-FISH)
用于免疫组化的等分样品在4%多聚甲醛PBS中孵育至少24小时，并嵌入石蜡中。将石蜡块切成6µm玻片，用pH=9的DAKO提取液热蒸汽处理30min。用抗周磷脂-1(山羊，1:200;Abcam，剑桥，英国)和带有抗iba1的巨噬细胞(兔，1:50 00;富士胶片Wako化学，东京，日本)。用驴血清作为阻断缓冲液，一抗4℃孵育过夜。驴抗山羊抗体Alexa Fluor 488(1:200)和驴抗兔抗体Alexa Fluor 568 (1:200;采用CellSens软件(OLYMPUS Life Science, sh宿，Japan)进行监督自动分析，评估at中的脂肪细胞计数、直径以及巨噬细胞和冠状结构计数。
此外，石蜡包埋切片收集在聚赖氨酸涂层玻片上，用CARD-FISH观察细菌细胞。包括所有缓冲配方的扩展方案可以在补充中找到(在线补充方法和表格)．所有步骤都是在无菌条件下进行的，所有实验室器皿都是UV处理或蒸压处理，用0.2 μ m PC等孔膜(Merck, Darmstadt, Germany)蒸压制备缓冲液的milliq水和过滤器消毒。缓冲液总是在使用前立即准备好，并进行充分的阴性对照以验证所有步骤的无菌性，即包括空聚赖氨酸载玻片、含载玻片的石蜡切片和含有杂交缓冲液滤液的过滤器。简单地说，脱蜡切片依次用蛋白酶K缓冲液、SDS缓冲液、溶菌酶缓冲液和无色肽酶缓冲液在37°C下处理5分钟，以达到渗透作用。与hrp标记的CARD-FISH探针(EUB338I, II, III和NON338;0.17 ng / mL)22 - 24在46℃下进行3小时，然后在1×PBS用洗涤缓冲液在48℃下处理15分钟，并在室温下处理15分钟。CARD-FISH方法:46℃扩增缓冲液中孵育切片20 min，用1×PBS在室温下冲洗切片10 min，用DAPI(1µg/mL)在室温下染色10 min。植入安装介质后，切片在- 20°C下保存，然后进行成像。根据定量结果选取高、中、低三节段患者的皮下at，随机选取30个不同的连续切片，彼此间隔至少60 μ m，进行CARD-FISH检测。
基因表达
使用TaqMan探针和2倍PCR主mix (Applied Biosystems, Foster City, USA)在LightCyler 480 (Roche, Basel, Switzerland)上以384孔格式检测基因表达。在Pipetmax平台上移液(Gilson, Wisconsin, USA)。为了达到最佳的正常化，我们测试了9个参考基因在胰岛素敏感和胰岛素抵抗受试者所有分析组织中的稳定性。选择GAPDH和B2M两个基因作为最终的内参基因。PCR效率计算使用重复的标准曲线在每次运行。标准曲线需要有R²>0.98的运行被包括在内。PCR平均效率为1.85±0.06。采用ΔΔCt方法进行分析。25
细胞培养
来自30-40岁非糖尿病男性供体(LONZA Walkersville, Maryland, USA)的有条件永生化的人皮下前脂肪细胞在添加人表皮生长因子、地塞米松、l-谷氨酰胺、胎牛血清和庆大霉素/两性霉素- b的skbm2培养基(LONZA)中生长。将前脂肪细胞分裂到6孔板上，在33°C和5% CO的5 mL生长培养基中培养至95%融合290%的湿度才开始分化。分化培养基为含葡萄糖4.5 g/L的DMEM，并添加L-谷氨酰胺、胎牛血清、庆大霉素/两性霉素- b、地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛。分化培养基培养条件改为37℃，5% CO290%的湿度和前脂肪细胞分化10天，约有38万个活细胞。下面描述的所有细胞培养实验都是三倍的。以人体细胞中相当于1% (~0.014 ng/well)的细菌DNA作为最低处理条件，取标准大肠杆菌基因组(4.7 MBp)作为参考。以增加10倍的额外浓度作为阳性对照，细胞孵育4、24或72小时。每个时间点以等效体积水作为负对照，实验计算折射率变化。
细菌DNA的定量
按Amar法定量血中细菌DNA和AT等．20.引物(5 ' -CGGTGAATACGTTCCCGG-3 '和5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ')在优化的PCR条件下使用(98°C 2分钟;42个循环，95°C/15秒，60°C/30秒，72°C/20秒)，使用高分辨率熔融主混合料(罗氏，瑞士巴塞尔04909631001)。复制的标准曲线使用购买大肠杆菌使用JM 109 DNA稀释剂(Promega, Madison, USA)进行定量。结果与市售试剂盒(Zymoresearch, California, USA)一致(n=13, r=0.74, p=0.004)，并被证明更敏感(Δ)Ct= 3.9)。
16S rRNA V4V5区扩增及测序
测试了多种16S引物;然而，由于样本中细菌DNA含量非常低，所以大多数样本都观察到了非特异性的人类DNA扩增。因此，引物改编自核糖体数据库项目26和Claesson等27放大V4/V5区域(V4- f: 5 ' -actgggcgtaaagcg-3 ';V5-R: 5 ' -ccgtcaattcctttgagtt -3 ')。此外，根据目前的文献，V4V5区域几乎没有引入偏倚，28更多的可重复的结果29和其他区域相比，扩增子更多。30.在对各种聚合酶进行广泛测试后，选择高保真Q5校对阅读聚合酶进行扩增(New England BioLabs, Ipswich, USA)。所有测试引物和聚合酶的详细摘要可在在线补充表S4和S5．所有阴性对照以及每次试验附加的pcr阴性对照均被纳入，扩增和测序。配对端测序由华大基因(深圳，广东，中国)在HiSeq 2500平台上进行，平均生reads为2×1 57 045(±68 730)。
统计数据
所有统计数据在R 3.5.1 (R核心团队，2018年)和SPSS V.24 (IBM，阿蒙克，纽约)中执行。所有数据都是在R 3.5.1中使用ggplot2 v3.1.1生成的，31phyloseq v1.26.1,32素食v2.5-433和circlize v0.4.734并使用Adobe Illustrator (Adobe Inc, California, USA)重新贴上标签。非正态分布数据的相关分析采用Spearman秩相关检验。基于数据分布的组间比较采用学生t检验和Wilcoxon符号秩检验/Mann-Whitney U检验，采用Kolmogorov-Smirnov检验。如果没有其他说明，则通过FDR调整解决了多个测试问题，并给出了标称(p)和调整(q)值。
16S数据分析
预处理和质量过滤的配对端测序数据(平均112,973±48 825 reads)来自华大基因。预处理包括删除一定比例的低质量的读(20个碱基(读原长度的20%)，删除被适配器污染的读(5个碱基与读和适配器重叠，最多允许3个碱基不匹配)，删除碱基模糊的读和删除低复杂度的读(连续10个碱基相同的读)。数据导入Qiime2 v2018-1135使用引用软件包的QIIME2插件执行所有后续步骤。使用DADA2进行对端连接和去噪，36在370个样本(包括阴性对照)中留下3663个特征，中位数频率为77 601(40 141-103 152)次读取，平均长度为325.6±15.1个碱基对。使用对齐到树mafft-fasttree生成了一个根树。37使用q2-特征分类器进行分类，38使用SILVA 132版本的99% OTU数据集对使用过的引物进行训练。39随后，分类法和生成的特征表被导入到phyloseq v1.26.1中32进行进一步分析。所有不属于细菌的特征以及线粒体和叶绿体特征都被排除在外(∑=193)。Decontam V.1.2.140利用序列阴性对照，在属水平上过滤出高概率为污染物的特征。采用基于流行的污染物识别，阈值分数为0.5，过滤掉41%的潜在污染物特征，留下309个属。此外，只含有污染物的样本被排除在外，导致317个样本被进一步分析。比较α多样性(观察到，Shannon)在系统序列和排序分析中进行，包括计算布雷-柯蒂斯不相似度，41使用纯素v2.5-4对群分散的多元同质性和基于距离的冗余分析进行分析。33用DESeq2 v1.22.2计算差异丰度，42应用poscount类型进行尺寸因子估计，然后采用局部拟合进行Wald显著性检验。使用R v1.4.2的微生物组包对感兴趣标记的属进行相关性分析43运用斯皮尔曼的等级相关性。
结果
研究队列中的炎症负担和代谢损伤
75例接受减肥手术的患者纳入本研究，其中33例患有T2D。糖代谢参数包括FPG、HOMA-IR和HbA1c，循环炎症标志物如TNF-α、IL6和CRP在T2D患者中明显高于非T2D患者(表1)．T2D患者年龄显著高于对照组(45.2±11.0岁vs 52.5±11.3岁，p=0.006)。正如预期的那样，炎症指标与HOMA-IR和HbA1c呈正相关，与hdl -胆固醇呈负相关。
此外，循环炎症参数如TNF-α (rho=0.29, p=0.02)和CRP (rho=0.32, p=0.01)与LBP水平显著相关，而LBP水平又与BMI (rho=0.32, p=0.01)和空腹血浆胰岛素(rho=0.28, p=0.03)呈正相关，在T2D患者中升高，但不显著(11.5±3.9 vs 13.9±5.7 ng/µL, p=0.05) (表1)．
细菌DNA可在AT中检测到
我们在人类AT和血液中检测到细菌16S rRNA基因，其含量范围为0.1-5 pg /µg总DNA。在整个实验过程中，包括DNA分离(图1一个)．血液中总DNA含量最高，为1.12 (0.58 ~ 1.84)pg/µg，其次为肠系膜AT (0.65 (0.49 ~ 1.02) pg/µg，皮下AT (0.64 (0.25 ~ 1.62) pg/µg)。大网膜AT仅略高于阴性对照组(0.24 vs 0.21 pg/µg, p=0.04)。与阴性对照的平均数量相比，所有血液样本的88.0%、肠系膜样本的78.7%、皮下样本的69.3%和网膜AT样本的46.7%的细菌DNA含量较高(图1一个)．作为阳性参考，从粪便样本中分离的DNA包含0.39(0.20-0.72)µg/µg总DNA细菌DNA (图1 b)．使用大肠杆菌基因组(4.6 Mbp)作为参考，估计AT中高达0.7%的细胞是细菌起源的。
细菌的DNA数量。(A)与所有阴性对照相比，所有脂肪组织和血液中pg/µg DNA分离物中细菌DNA的数量，(B)将所有脂肪组织与粪便样本进行对数刻度(ng/µg DNA分离物)的比较，Tukey-Whiskers箱线图和平均值(◆);给出了p值和fdr调整的q值;(C)细菌数量与脂肪组织巨噬细胞(ATM) (Sc和Om)、组织特异性基因表达(mes、Sc和Om)和循环炎症标记物(全部)的Spearman秩相关图。标称显著值为:*:p<0.05， **: p<0.01， ***: p<0.001，并突出显示fdr调整后的显著结果，并说明各自的q值。ADIPOQ脂联素;Bact细菌;CCAAT增强子结合蛋白α;IGT，糖耐量受损;白细胞介素1β和6;脂多糖结合蛋白;地蜡瘦素;Mes,肠系膜;数控、消极控制;NGT，正常糖耐量;Om,网膜的;PPARG，过氧化物酶体增殖物激活受体γ;SC,皮下;T2D, 2型糖尿病;TNF-α，肿瘤坏死因子α。
CARD-FISH可以检测AT中的活细菌细胞
在无菌条件下，使用催化报告物沉积荧光原位杂交技术(CARD-FISH)实现了皮下AT中活细菌细胞的可视化，该技术采用一般的真细菌单链DNA探针。我们可以看到，每个组织切片中有13个(IQR: 8-25) EUB阳性杂交细菌细胞，每个细胞包含约900个脂肪细胞。杂交的细菌细胞通常被观察为单个或成对的(图2 a, C, E)而很少出现在更多的细胞群中(图2 g)．在同一病人的连续切片和切片中，细菌细胞数量是高度异质性的。在所有三名患者的所有杂交切片中，使用EUB338I-III在独立杂交事件中不断观察阳性杂交细胞。无义探针(NON338)和未添加探针的杂交细胞均无假阳性(在线补充图2A, C, E, G)，尽管通过DAPI染色可以观察到AT中微生物细胞的存在(在线补充图2B, D, F, H)与结合细菌rRNA的探针的特异性有关。无菌对照在其表面未见阳性杂交或dapi染色细胞。
用卡片鱼可视化活细菌。用hrp标记的EUB338 I-III探针混合物(红色)和DAPI染色(蓝色)CARD-FISH获得的代表性的表观荧光显微照片显示了皮下脂肪组织横切面上杂交细菌细胞的存在和分布;(A、B)皮下脂肪组织横切面(dpi -蓝色)和混合细胞(alexa594 -红色)全景图;(C-F)脂肪细胞横截面内单个细菌细胞的分布;(G和H)脂肪组织(紫色)中杂交细菌单细胞簇(红色)。CARD-FISH，催化报告物沉积荧光原位杂交;合,辣根过氧化物酶。
细菌DNA的数量与炎症标志物相关
在脂肪储备特异性的方式下，细菌DNA负荷与炎症标志物相关，包括表达TNFA(rho=0.25, p=0.04在皮下AT)和IL1B(rho=0.34, p=0.007在肠系膜AT)和巨噬细胞浸润在网膜AT (rho=0.46, p=2.0×10−4；图1 c)．亚组分析显示，一些观察到的相关性是由T2D状态驱动的，具有很强的相关性，例如，组织巨噬细胞和网膜AT中的细菌负荷之间(rho=0.62, p=3.1×10)−4)进行治疗(图1 c)．然而，AT中的细菌DNA数量与任何人体计量学、葡萄糖或脂质代谢参数无关，除了肠系膜AT与BMI呈负相关(rho= - 0.32, p=0.01)。此外，在有和没有T2D的受试者之间，AT中的细菌DNA数量没有差异。
宿主隔室显示出隐藏细菌DNA多样性的显著差异
观察到的细菌丰富度和香农距离，粪便明显高于血液和AT库的总和(17.9±4.0 vs 4.9±3.2,p=2.8×10)-43年1.3±0.3 vs 0.6±0.52,p=3.3×107分别)(图3一)．考虑AT库和血液，肠系膜AT的观察多样性和Shannon距离alpha多样性最高(分别为5.7±0.3和0.82±0.06)，显著高于血液和内脏AT (p<0.001)。皮下AT的α多样性也略高于血液和网膜AT (p<0.01)。alpha多样性的测量在有和没有T2D的受试者之间没有差异(在线补充图S1)．
细菌的多样性。(A)在控制污染物的属水平后，观察到所有脂肪组织、血液和粪便的多样性和香农指数，(B) bry - curtis上的PcoA不相似性与组方差指示(betadisper);(C-F)解释变量拟合的基于距离的冗余分析(dbRDA);置换分析后显著影响变量用红色表示;完整的解释变量包括(如果适用):脂多糖结合蛋白(LBP)，肿瘤坏死因子α (TNF-α)，白细胞介素(IL)-6，年龄，体重指数，C反应蛋白(CRP)，胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA-IR)，糖化血红蛋白(Hb) A1c，脂肪细胞大小，脂肪组织巨噬细胞(ATM)和细菌负荷。Mes,肠系膜;Om,网膜的;SC,皮下。
炎症和胰岛素抵抗决定了组织间成分的不同
布雷-柯蒂斯不相似度用于评估感兴趣组织之间的成分不相似度。组织间的分散没有同质性，即不同组织间的差异显著不同(图3 b)．基于距离的Bray-Curtis不相似度冗余分析用于估计收集到的变量对排序的影响，从而估计细菌群落组成。在所有三种at中，细菌负荷、炎症标志物如组织巨噬细胞、TNF-α和IL-6以及胰岛素抵抗标志物如HOMA-IR是显著形成群落组成的参数(在线补充表S1，图3汉英)．在血液中，只有炎症标志物(循环TNF-α和IL-6, CRP和LBP)和受试者的年龄占样本的聚类(在线补充表S1，图3 f)．
变形菌门而且厚壁菌门是AT的主要门
门水平上的分类学以变形菌门而且厚壁菌门在所有的AT仓库。其他突出的门共同的所有脂肪仓库包括放线菌而且Patescibacteria（图4一)．Chloroflexi而且Planctomycetes多见于血液中(平均q=0.001和q=0.01;图3 d)．肠系膜和皮下AT都有很大一部分门，平均丰度低于1%，其中包括拟杆菌门而且Tenericutes．相比之下，网膜AT的低丰度门的比例更小。被试组织显示出特定的分类学特征(在属水平上显示)图4罪犯，在线补充表S2)．
分类法。门(A)的相对分布和属的相对分布变形菌门(B)和厚壁菌门(C);(D)圆形图，显示所有观察到的属的对数转换平均丰度在条形图(最外面的轨道)中按门(标记在图的边缘)分类的每个分析组织，如向内的第二个轨道所示。下面的轨迹显示了反映外部条形图的每个门所有属的累积数量。最里面的圆圈描绘了在不同组织间丰度有显著差异的门(透明的彩色区域)和属(彩色线，所选属已标记);颜色表示在相应颜色的组织中增加存在，即属肠杆菌属(用橙色表示)在皮下脂肪组织中的含量明显高于其他组织链球菌与血液相比，在网膜和皮下脂肪组织中都更丰富。Mes,肠系膜;肠系膜;Om,网膜的;SC,皮下。
细菌组成反映了属水平上独特的血液和AT特征
总的来说，分析的AT之间差异丰度的属数较少(平均5.3)，有12个差异丰度属，在皮下AT和血液之间观察到大多数差异。其中属不动杆菌显著升高(平均log(2)FC=6.7, q=2.2×10−8),Tahibacter显著降低(平均日志(2)FC=−20.7,q=1.7×10−3)与血液相比，AT含量更高。与两种内脏AT库相比，血液中存在更多的另一种属是Delftia(平均日志(2)FC =−27.7 q = 7.5×10−20） (图3 d)．这两个主要存在于血液中的属都与糖尿病有关，Thahibacter积极(日志(2)FC = 26.8 q = 1.1×10−18),而Delftia负面(日志(2)FC =−27.3 q = 3.3×10−19） (图4一)．其中，网膜和肠系膜的AT较皮下的AT更相似，显示出更多的差异丰富属。在他们中间肠杆菌属(平均日志(2)FC = 28.9, q = 1.6×10−22),Gemella(平均日志(2)FC = 25.0, q = 3.6×10−22)显著增加皮下AT (图4 d)．
AT中的细菌组成及其丰度差异与代谢性疾病有关
在309个被分析的属中，有18个被发现在有或没有T2D的受试者之间存在差异。在血液和肠系膜AT中观察到的差异最大。对于三个属，观察到组织之间方向一致的重叠:Rhodoferax糖尿病患者皮下和肠系膜AT含量较低(log(2)FC=−27.0,q=1.2×10−18；日志(2)FC =−8.0 q = 0.03),Lactococcus血液和皮下AT (log(2)FC=−30.0,q=8.9×10−23；日志(2)FC =−30.0 q = 2.3×10−22),乳酸菌血液和网膜AT (log(2)FC=−30.0,q=8.9×10−23；日志(2)FC =−27.3 q = 7.6×10−19) (图5一个)．还观察到这些属与相关临床标记物的相应关联(图5 b)．大量的Lactococcus与血液中HOMA-IR、皮下AT中BMI呈负相关。在皮下组织中观察到较多的相关性，尤其是与年龄、细菌DNA数量和HOMA-IR的相关性。在血液中观察到的相关性最小，其中属主要与循环的IL-6和循环细菌DNA的数量相关。
组织细菌及其代谢联系;(A)糖尿病患者和非糖尿病患者之间的差异丰富属;(B)属的存在和数量与炎症、人体计量学和代谢参数之间的相关性分析。ADIP,脂肪细胞;ATM，脂肪组织巨噬细胞;Bact细菌;BMI，身体质量指数;C反应蛋白;糖化血红蛋白;HOMA-IR:胰岛素抵抗的稳态模型评估; IL6, interleukin 6; LBP, lipopolysaccharide binding protein; TNF-α: tumour necrosis factor alpha.
细菌DNA诱导脂肪细胞炎症反应
微量的细菌DNA，相当于大约每100个脂肪细胞中有一个细菌细胞，或反映初始量化结果的六孔板中每孔0.014纳克，足以诱导脂肪细胞因子的表达增加白细胞介素6而且TNFA在一个明显健康、瘦削的受试者的不朽皮下脂肪细胞中孵育4小时(白细胞介素6足球俱乐部0.014 ng= 1.36±0.08;TNFA足球俱乐部0.014 ng= 1.41±0.1,p < 0.001;图6)．反应是剂量依赖性的，在孵育4小时后反应最强(白细胞介素6足球俱乐部1.4 ng= 16.4±0.6;TNFA足球俱乐部1.4 ng= 19.4±1.3,p < 1×10−7)， 24小时后效果下降，72小时后几乎没有变化(图6)．这种反应是可复制的，进一步增加浓度同样也增加了两种基因的表达(白细胞介素6足球俱乐部14 ng= 105.8±6.3;TNFA足球俱乐部14 ng= 124.4±11.1,p < 1×10−7，图6 b)．此外，增加的表达IL1B而且NFKB观察(IL1B足球俱乐部14 ng= 6.7±0.4;NFKB足球俱乐部14 ng= 5.6±0.3,p < 1×10−7，图6 b)．相反，用细菌DNA处理并没有改变TLR9识别，IRAK4，MyD88，CASP1而且CASP8在任何时间点或浓度(数据未显示)。此外，检测了各种脂肪因子的表达，高浓度的细菌DNA对脂肪因子的表达有轻微的损害PPARG(FC14 ng= 0.64±0.1,p = 5.4×10−4), chemerin (FC14 ng= 0.76±0.07,p = 8.7×10−4),脂联素(FC14 ng=0.88±0.06,p=0.006)和瘦素(FC14 ng= 0.72±0.06,p = 7.7×10−5)．
体外用细菌DNA处理脂肪细胞。用不断增加的细菌DNA (大肠杆菌)，孵育4、24和72小时，测定基因表达(A)，孵育4小时，进一步增加稀释倍数重复实验(B);所有实验均重复3次(n=6);每个时间点分别生成与未处理对照相比的平均折率变化，误差条表示SD，星号表示经过Benjamini-Hochberg调整(单样本t检验)后与阴性对照相比的显著变化。IL1B，白介素1 β;白细胞介素6、白细胞介素6;活化B细胞核因子kappa-光链增强子NFkB;TNFA，肿瘤坏死因子。
讨论
循环和AT中存在细菌的证据正在出现，但存在争议。10 15 16 20 44 45在目前的研究中，在无菌处理和污染物生物信息学控制的严格实验条件下，我们检测了细菌DNA，它与各种人类脂肪库中巨噬细胞浸润相关。此外，我们还证实了组织特异性的定量、分类和成分细菌特征是由炎症标记物和代谢特征以组织依赖性的方式驱动的，并与之显著相关。
尽管在动物实验中有证据表明AT中存在细菌，10在人类AT中的验证仍然具有挑战性。Burcelin等44当他们提出“组织菌群”假说时，提出了第一个探索性数据。直到最近，这些数据都缺乏强有力的支持，大多数出版物都未能解释污染的原因;2016年,Zulian等未能从人类AT中扩增出细菌DNA，并宣布该课题是一个悬而未决的问题。45最近,暗褐等46报告了在几个AT库、肝脏和血浆中存在细菌DNA，并指出在肠系膜AT中存在组织特异性的细菌片段区隔化和T2D细菌特征。考虑到以往研究的不一致性，人们会认为AT中的细菌DNA丰度很低，使其实验验证具有很高的挑战性。主要存在的人类DNA是阻碍细菌16S rRNA基因成功扩增的主要因素之一。试剂、处理和交叉污染会引入进一步的噪声，在很大程度上影响实验过程的结果。因此，实验优化和污染物控制是人类组织细菌检测研究中需要解决的两个主要问题。47在这里，我们使用了高保真Q5验证阅读聚合酶和V4/5 16S区域的引物对，这并不倾向于扩增人类18S或人类基因组DNA丰度中的其他相关基因。选择适当的聚合酶和引物对似乎至关重要，因为大多数测试的引物对和引物酶没有扩增细菌DNA (在线补充表S3、S4)．为了减少污染，所有步骤都是在预pcr室的层流罩下进行的，而且似乎必须将所有器具进行至少90分钟的紫外线处理。47此外，阴性对照(用UV处理过的PBS)在每次试验的整个方案中进行，包括测序。我们还利用生物信息统计方法对潜在污染进行了解释，该方法主要基于进行的阴性对照。40经过对低细菌生物量样本中高危污染的严格实验和生物信息学控制，我们的结果与最近的发现一致，46从而为肥胖和T2D受试者AT中细菌DNA含量低提供了进一步的证据。除此之外，我们使用CARD-FISH为皮下AT中活菌的存在提供了第一个证据，这在与AT切片同时进行的阴性对照中无法类似地显示。每个脂肪细胞的细菌细胞数量约为1.4%，反映了从AT分离的整个DNA中细菌DNA的数量，进一步说明我们报告的细菌数量确实，至少部分来自活细菌。更重要的是，观察到的细菌细胞被包裹在脂肪细胞内，通常在脂肪细胞-脂肪细胞交界处，强调了它们的组织来源。这些结果证实了之前对小鼠进行口服贴有标签的实验的发现大肠杆菌由Denou等他们报告了这些活细菌在内脏AT和AT基质血管部分的易位和存在。48
诚然，我们只能推测检测到的细菌DNA的来源。肠道通透性的测量，如乳酸糖/甘露醇试验，可以表明细菌从肠道转位到AT，我们的研究队列中没有。此外，我们最近发现，常用的肠通透性生物标志物珠蛋白(前碰珠蛋白2)并不是一个适当的选择，因为市售的ELISA试剂盒不能检测到前碰珠蛋白2，而是不能特异性地测量其他可能与“珠蛋白家族”相关的蛋白质。49对肠道渗漏和细菌易位的作用尚不明确。
我们最令人信服的发现之一是肠系膜AT在被测AT中含有最多的细菌数量和多样性。肠系膜AT可能是肠道和全身暴露于细菌之间的“守门人”，在细菌成分到达其他组织之前清除它们。为了支持我们的数据，在小鼠模型中进行的实验表明，在饮食诱导肥胖的小鼠中，细菌DNA可以沿着肠道进入AT。10这在人体研究中也得到了证实，高血糖已被证明与肠道屏障损伤有关50以及像LPS这样的细菌成分的流入51和循环中的细菌DNA。10一个矛盾的发现是，血液中含有最多的细菌DNA，这强调了血液中其他来源的细菌DNA的相关性，如口腔52 53和皮肤。54
在本研究测试的组织中最常观察到的门是厚壁菌门而且变形菌门,紧随其后的是放线菌．这与Burcelin的数据一致等和暗褐等他报告了人类AT基质血管部分中的细菌DNA44或整个AT样品。46血液微生物组也显示出类似的细菌组成55 56细菌特征与肥胖的病理如肝纤维化有关55还有肝硬化患者的全身炎症。57
与“肠漏”假说和细菌易位引起的AT低级别炎症一致，在我们的研究中，细菌的数量和分布都与患者的全身炎症和组织特异性炎症密切相关。不可否认，“漏肠”一词的定义很差，它被等同于肠道通透性增加、细菌产物循环增加或宿主反应性标记物增加。在这个程度上，我们提出的AT中的细菌和细菌DNA挑战后炎症反应增加的证据，为代谢性疾病中细菌易位增加以及局部宿主-微生物相互作用的概念提供了最直接的证据，并扩展了营养过剩后内毒素血症和肠通透性增加的解释力量。58在这方面，我们的数据与已发表的关于AT中肠漏假说和低级别全身和组织炎症的文献一致。例如，细菌成分的潜在作用通过LPS刺激AT巨噬细胞和脂肪细胞被证明，这导致通过TLR2和4增加炎症，以及TNF-α和IL-6的更高表达。59 60因此，AT中的细菌特征与代谢变化和炎症有关，而血液细菌组成主要与炎症有关，与循环代谢参数无关。除了细菌DNA和AT炎症之间的相关联系外，我们还发现，用细菌DNA对脂肪细胞进行体外处理，炎症细胞因子的表达与细菌DNA的数量成正比，进一步支持了细菌引起的局部炎症是增加的肠道通透性、AT炎症和肥胖和胰岛素抵抗中随后的全身炎症之间联系的假定潜在途径。了解特定的细菌对局部和全身代谢状态的贡献，可能导致基于组织特异性传递保护细菌成分的新治疗方法，就像对巴氏灭菌细菌系统所做的那样(例如，Akkermansia muciniphila)从而减少肥胖和改善新陈代谢。61 62
这项研究有几个优点和缺点，必须承认。据我们所知，这是第一个为人类AT中存在细菌DNA和活细菌提供证据的污染意识研究，并表明它与肥胖患者的代谢和炎症状态有关。相对较大的样本量包括75个代谢特征良好的受试者和3个AT库，可以生成关于细菌DNA的可靠和可重复的数据，并测试细菌负荷、AT免疫细胞浸润和临床表型之间的相关性。在未来，将具有健康代谢表型的瘦削受试者与肥胖患者进行比较也可能是可取的。必须承认的是，糖尿病患者和非糖尿病患者之间的比较分析受到糖尿病患者明显年龄较大这一事实的限制。最后，应该谨慎看待R2 <0.2的相关关系，因为尽管它们具有统计学意义，但这种关系的生物学相关性可能值得怀疑，需要进一步的复制。
总之，我们的研究为肥胖患者AT中细菌DNA数量和组成的存在和库特异性差异提供了证据，并表明细菌在各种AT库的分子特征中发挥了重要作用，可能有助于肥胖的代谢后果。
致谢
我们要感谢所有参与研究的人，特别是我们的研究对象。作者要感谢Ingo Bechmann提供的有益建议和讨论，感谢Stefanie Ziesche、Eileen Bösenberg和Judith Kammer持续提供的出色技术支持。我们感谢Helmholtz环境研究中心的化学显微镜中心(ProVIS)使用了他们的样品制备和显微镜设备。特别感谢Katja Nerlich在原位杂交和荧光显微镜图像采集过程中的支持。
脚注
LM和RC贡献相当。
贡献者采用LM、RC、AC、HH、PK设计研究;LM、RC、AC、MS、PK撰稿编辑。所有实验均由LM、RC和AC完成;LM和RC分析了数据;ST和MG进行免疫组化;NM计划和监督催化报告沉积荧光原位杂交(CARD-FISH)协议，ST执行CARD-FISH协议和后续分析;KDD进行实时表达实验;JF、MvB、S-BH和HH提供生物信息专业知识，HH收集患者数据;AD和MB负责样品采集。
资金这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft (DFG，德国研究基金会-项目编号209933838 - SFB 1052;B01, B03和B09)和来自IFB AdiposityDiseases (AD2-060E, AD2-06E95和AD2-K7-117)。IFB肥胖疾病由德国联邦教育和研究部(BMBF)支持，FKZ: 01EO1501。ProVIS得到了欧洲区域发展基金(EFRE -欧洲萨克森基金)的支持。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众的参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
病人同意发表不是必需的。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。
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