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摘要
背景-溃疡性结肠炎的发病机制尚不清楚，但浸润黏膜的细胞毒性T淋巴细胞与黏膜损伤有关。Fas配体(FasL)在细胞毒性T淋巴细胞上表达，诱导表达Fas的细胞凋亡。
目的-分析溃疡性结肠炎中FasL在受影响结肠黏膜中的表达，以确定FasL与FasL的相互作用。
方法采用竞争性逆转录聚合酶链式反应对健康受试者和溃疡性结肠炎或克罗恩病患者的结肠粘膜标本中的-FasL mRNA进行定量检测。原位杂交法检测FasL mRNA定位。采用免疫组化方法分析结肠黏膜Fas的表达。流式细胞术检测表达FasL的固有层淋巴细胞表型。
结果-FasL mRNA在活动性溃疡性结肠炎病变中表达强烈，但在活动性克罗恩病或活动性直肠炎型溃疡性结肠炎病变中不表达。原位杂交显示FasL mRNA在浸润病灶的单个核细胞中表达。Fas在溃疡性结肠炎和克罗恩病以及正常人的上皮细胞中表达。流式细胞术显示，活动病灶内浸润固有层的CD3淋巴细胞表达FasL。
结论-FasL在浸润到溃疡性结肠炎的CD3淋巴细胞中表达，而在Crohn病病变中不表达，提示Fas-FasL诱导的细胞凋亡参与了溃疡性结肠炎的粘膜损伤。
- Fas配体
- 细胞凋亡
- 溃疡性结肠炎
- 逆转录聚合酶链反应
- T淋巴细胞
数据来自Altmetric.com
溃疡性结肠炎以局限于结肠粘膜的慢性炎症为特征。溃疡性结肠炎的发病机制尚未确定，但大量证据表明其与自身免疫机制有关。在临床上，所谓的自身抗体包括抗结肠抗体1抗中性粒细胞细胞质抗体2常在溃疡性结肠炎患者血清中检出。其中一些患者还表现出肠外并发症，如类风湿关节炎、红斑狼疮、硬皮病和原发性硬化性胆管炎，这可能是免疫起源。组织学上，溃疡性结肠炎黏膜病变包括广泛的单个核细胞浸润，特别是细胞毒性T淋巴细胞(ctl)，这是推定的粘膜损伤剂。动物模型包括缺乏白介素2基因的小鼠3.白细胞介素10基因，4或T细胞受体5；这些小鼠会患上炎症性肠病以及自身免疫性溶血性贫血。3.综上所述，上述发现与溃疡性结肠炎发病机制中免疫系统紊乱的参与是一致的。Fas是一种48 kDa的I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族。6，7Fas配体(FasL)是一种40 kDa的II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族。6，8，9据报道，由Fas-FasL系统诱导的程序性细胞死亡在T淋巴细胞的克隆耗尽中发挥生理作用，以抑制自身免疫反应。10病理上，小鼠Fas和FasL的遗传缺陷导致淋巴增生性疾病和类似于人类狼疮的自身免疫疾病。11，12在患有淋巴增生性综合征的儿童中检测到Fas突变，其中一些儿童也有自身免疫性疾病史。13，14一种对抗Fas的抗Fas抗体引起肝细胞的大量凋亡，提示可能与暴发性肝炎的发病有关。15，16FasL在ctl表面表达，17，18它在表达Fas的靶细胞中起凋亡效应。据报道，Fas在正常的结肠上皮细胞上表达。19溃疡性结肠炎中ctl对结肠黏膜的广泛浸润提示ctl上的FasL可能参与了特征性粘膜损伤。值得注意的是，FasL在溃疡性结肠炎发病机制中的作用尚未被研究。本文采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，分析了FasL mRNA的表达，并研究了其在溃疡性结肠炎患者结肠病变中的定位20.，21原位杂交(ISH)。检测溃疡性结肠炎患者结肠黏膜Fas的表达。我们的研究结果表明，FasL mRNA仅在活动性溃疡性结肠炎病变中强表达，这表明FasL -FasL系统参与了溃疡性结肠炎的发展。
材料与方法
粘膜标本
23例溃疡性结肠炎患者(男13例，女10例;平均(SD)年龄46.0(11.5)岁，活动性克罗恩病8例(男3例，女5例;31.4(9.3)年)，并从9个正常结肠粘膜标本中获得结肠息肉附近(对照组;五男四女;49.6(14.3)年)。活检前所有检查患者均知情同意。根据病变炎症程度，内镜下根据Matts分级(1 ~ 4级)对溃疡性结肠炎患者进行分级。221级和2级(轻度粘膜损伤)被认为是不活跃的，3级和4级(严重粘膜损伤)被认为是活跃的。
细胞
表达FasL的小鼠白血病细胞系CTLL-2来自日本理化学细胞库(Tsukuba, Japan)，并保存在RPMI 1640中，添加热灭活胎牛血清和抗生素。
老鼠
雌性Wistar大鼠(6周龄)购自Nihon Dohbutsu(日本大阪)，并在特定的无病原体条件下饲养。
用于扩增的寡核苷酸
为了通过巢式PCR扩增FasL cDNA，我们制备了以下两对引物，如图所示1: 5 ' -GTGGCCCATTTAAC AGG-3 ' (A-1)作为第一步5 '底漆，5 ' -CAGCACTGGTAAGATTG-3 ' (S-1)作为第一步3 '底漆，5 ' -CCTCTGG AATGGGAAGACAC-3 ' (A-2)作为第二步5 '底漆，5 ' -ACTGCCCCCA GGTAGCTGCT-3 ' (S-2)作为第二步3 '底漆。为了扩增28S rRNA，又合成了一对PCR引物。5 '引物序列为5 ' -CCATGTGAA CAGCAGTTGAA-3 ' (A-3)， 3 '引物序列为5 ' -CCCTGCCCTTCACAAAGAAA-3 ' (S-3)。如图所示1，源自FasL mRNA的人类和内标cdna均被相同的引物扩增，且只有FasL的人类PCR片段具有突变AlwN我限制网站。
Fas配体(FasL)转录物的定量方法。反转录(RT)，聚合酶链反应(PCR)扩增，AlwNI消解FasL PCR产物。
rt - pcr
用酸酚/硫氰酸胍法从活检标本、大鼠结肠和CTLL-2细胞中提取总rna。23FasL转录物采用竞争性RT-PCR方法定量20.，21使用人结肠RNA (500 ng)和CTLL-2 RNA (10 ng)的混合物或人结肠RNA (500 ng)和大鼠结肠RNA (500 ng)的混合物来测定单个样品中FasL mRNA的相对数量，并分别比较所有样品中FasL RNA的相对数量。简单地说，提取的rna在37°C下，在最终体积为25 ml 10 mM Tris/HCl缓冲液，pH 8.3中，转化为互补DNA (cDNA)，含有25 U rav2逆转录酶(Takara，京都，日本)，30 U RNase抑制剂(phhamacia LKB Biotechnology，东京，日本)，250 pmol随机引物(Takara)， 1.0 mM dNTP (Takara)， 15 mM KCl, 2 mM二硫苏糖醇，0.6 mM MgCl2，以及RNA混合物。FasL cDNA在含10 mM Tris/HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl的PCR缓冲液中扩增2， 0.0001%明胶，脱氧核苷三磷酸(dNTP)各400 μM，第一步A-1和S-1引物各1 mM, 0.25单位DNATaq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut, USA)。每个扩增曲线包括94℃变性1分钟，引物55℃退火2分钟，72℃延伸3分钟，重复30个循环。每个第一步PCR产物(0.5 μl)分别在含有1 mM第二步A-2和S-2引物的第二步PCR培养基中扩增。第二步PCR结束后，每个样品与含有第二步引物的40 μl新鲜PCR培养基结合，再进行一个循环，以防止人与CTLL-2 PCR产物之间形成异二聚体DNA。为了测定28S rRNA，以大鼠总RNA为内标，由人和大鼠28S rRNA转化而成的cDNA混合物，如前所述，用a -3和S-3引物扩增30个周期和一个额外的周期。20.，21
PCR产物定量
每个样品中FasL PCR产物的数量相对于同一样品中扩增的CTLL-2衍生FasL PCR产物的数量。为了比较所有检查样本中的FasL产物，FasL转录本的相对数量被归一化为活检标本的RNA含量，因为RNA含量在标本之间是不同的。据报道，28S rRNA PCR产物的数量与样品中总RNA含量有很好的相关性。20.，21因此，我们将相关FasL PCR转录物归一化至28S rRNA PCR产物，以评估活检标本中的FasL转录物水平。在本研究中，我们将归一化的FasL PCR产物定义为相对的FasL转录本含量。扩增步骤结束后，FasL mRNA的PCR产物被酶切AlwNI(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)。如图所示1对人来源的FasL PCR产物进行酶切，得到两个片段(184和85 bp)，而CTLL-2细胞来源的FasL PCR产物(269 bp)未被酶切AlwNI.如前所述，为了从CTLL-2衍生产品中分离出人类衍生产品，使用高效液相色谱(HPLC)系统分离两种样品的混合物。20.，21采用紫外分光光度法在260 nm处检测PCR产物，HPLC图谱显示3个不同的PCR产物。每个结肠标本中的FasL转录物被确定为同一样本中CTLL-2 FasL PCR片段(269 bp)归一化后184 bp片段的峰值高度。如前所述，对28S rRNA进行PCR。20.，21为了进行评估，将FasL转录本校正为同一样品中28S RNA的数量，反映样品中总RNA含量。
RNA探针的制备
制备FasL的RNA探针，FasL是人类FasL cDNA的1.0 kb片段24被亚克隆到Bluescript II pSK+质粒(Stratagene, La Jolla, California, USA)。质粒被线性化不I和T7 RNA聚合酶转录生成反义探针或线性化生态用T3 RNA聚合酶转录RV，生成感觉探针。根据制造商的推荐方案，使用DIG RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany)制备地高辛标记单链RNA探针。如前所述进行杂交。25简单地说，手术获得的人结肠粘膜标本用4%多聚甲醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中过夜，并用石蜡包埋。然后从每个组织块上切割3 μm厚的切片。FasL在50°C下杂交16小时，用核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim Biochemica)检测信号。
免疫组织化学
为了对Fas的表达进行免疫组织化学分析，手术后的结肠组织标本立即冷冻在液氮中。冷冻组织以6 μm厚度切片，用丙酮固定，用Dako生物素阻断系统(Dako, Carpinteria, California, USA)处理以阻断内源性亲和素结合活性。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤后，切片用马血清预处理，然后用S Nagata制备的小鼠抗人Fas单克隆抗体(4B4-B3)处理(未发表数据)，最终浓度为5.5 μg/ml，溶解在PBS和1%牛血清白蛋白中，在4℃下处理16小时。切片在PBS中清洗，用生物素化马抗小鼠免疫球蛋白处理，并用荧光素亲和素D染色(Vector Laboratories Inc.， Burlingame, California, USA)。
固有层淋巴细胞的制备
为制备LPLs，从溃疡性结肠炎或克罗恩病患者手术获得黏膜标本。取结肠癌患者切除的结肠标本，经镜检证实无癌细胞，制备正常对照LPLs。如前所述，LPLs从粘膜标本中分离出来。26简而言之，粘膜标本首先用不含钙或镁的汉克斯平衡盐溶液(HBSS)清洗，然后用含有1mm二硫苏糖醇(Sigma Chemical, St Louis, Missouri, USA)和抗生素的HBSS清洗。为了去除上皮细胞，标本在含0.5 mM EDTA的HBSS中孵育三次，在20°C下孵育20分钟。清洗三次后，将粘膜标本切丁，用25 U/ml胶原酶(Worthington, Freehold, New Jersey, USA)在含5%胎牛血清、10 mM Hepes和抗生素的HBSS中，在37°C、5% CO的潮湿环境中消化3或4小时295% O2．过滤去除碎片后，培养基中的细胞用HBSS洗涤两次，在含5%胎牛血清的HBSS中重悬，并在Ficoll-Paque溶液(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)上分层，通过密度梯度法分离LPLs。由此产生的单个核细胞的细胞活力始终超过95%，锥盼蓝排除证实。
流式细胞术
分离的LPLs在含2%胎牛血清的PBS中洗涤两次，并与仓鼠IgG在冰上预孵育15分钟，以防止抗体的非特异性结合。然后将细胞与仓鼠抗人FasL抗体一起在冰上孵育30分钟27或对照仓鼠IgG (Pharmingen, San Diego, California, USA)。用PBS冲洗后，用二次异硫氰酸荧光素偶联小鼠抗仓鼠IgG在冰上染色30分钟。然后清洗细胞，用小鼠IgG在冰上预孵育15分钟，并用藻红菊酯偶联小鼠抗人CD3抗体(Dako, Glostrup，丹麦)或藻红菊酯偶联对照小鼠IgG (Becton Dickinson, San Jose, California, USA)处理。PBS冲洗三次后，染色细胞在流式细胞仪上分析(FACS calber;正欲)。在直方图上对CD3淋巴细胞进行门控，并使用CellQuest软件(Becton Dickinson)分析FasL在CD3细胞上的表达。
结果
除直肠炎型溃疡性结肠炎外，溃疡性结肠炎患者活动性病变中FasL转录本增加
为了量化FasL转录物，我们检测了FasL PCR产物的数量与样本中RNA的数量之间的相关性。用结肠来源的RNA(0、80、160、320和640 ng)和4 ng CTLL-2 RNA混合，对FasL转录本进行PCR检测。当峰高比范围为0 ~ 0.6时，标准化FasL PCR产物的峰高比与RNA含量之间存在线性相关(数据未显示)。采用该方法，FasL PCR产物的所有值均在平均值的11%以内。据此，我们在此范围内定量了FasL PCR转录物的数量，并在后续的研究中采用该PCR方法对FasL转录物进行了定量。测定活动性溃疡性结肠炎病变、非活动性溃疡性结肠炎病变和克罗恩病病变中FasL转录本的数量，并与正常结肠黏膜中的数量进行比较。与非活跃性溃疡性结肠炎黏膜病变(0.014 (0.009)，p<0.005)、活跃性克罗恩病病变(0.028 (0.011)，p<0.005)和正常对照组(0.020 (0.011)，p<0.005)相比，活跃性溃疡性结肠炎病变中FasL转录本显著增加(0.074(0.057))(平均(SD))(图)2)．在非活动性溃疡性结肠炎或活动性克罗恩病患者中，FasL转录本基本上与正常对照组相同。接下来，我们根据溃疡性结肠炎受累部位在结肠中的分布(全结肠炎、左侧结肠炎和直肠炎型结肠炎)将活动性溃疡性结肠炎的受试者分为三个亚组，并分析FasL转录水平。所有活检标本均取自直肠。在组织学检查中，根据Matts分级系统，分析的溃疡性结肠炎粘膜病变的炎症严重程度在全结肠炎、左侧结肠炎和直肠炎型结肠炎之间没有明显差异。如图所示3.在全结肠炎和左侧结肠炎的直肠粘膜病变中，FasL转录本水平较高，但在直肠炎型溃疡性结肠炎中，FasL转录本水平没有比不活动的受试者增加。总的来说，结果表明，除直肠炎型溃疡性结肠炎患者外，在溃疡性结肠炎活动性病变中，FasL转录本增加，但在克罗恩病活动性病变中没有增加。
Fas配体(FasL)转录量与溃疡性结肠炎活性的关系。相对于CTLL-2衍生的FasL转录本，测定正常结肠黏膜、活动性和非活动性溃疡性结肠炎和活动性克罗恩病的结肠黏膜中的FasL转录本水平。每个结肠样本中FasL转录本的相对数量，通过定量PCR测定样本中RNA的数量与28S RNA的数量的相关性来校正。
Fas配体(FasL)转录本的相对数量和受累区域。根据溃疡性结肠炎累及结肠的情况，对活动性溃疡性结肠炎(n=15)和非活动性溃疡性结肠炎(n=5)患者的直肠黏膜标本中相关FasL转录本进行分析。活动性溃疡性结肠炎患者分为3个亚组:直肠炎(n=5)、左侧结肠炎(n=5)和全结肠炎(n=5)。
炎症部位FasL转录增加
为了评估FasL转录本的增加是否仅发生在受累黏膜，对同一例左侧结肠炎患者受累和未受累的结肠黏膜进行了FasL转录本的检测。如图所示4，受累黏膜的FasL转录本水平是未受累黏膜的1.7 ~ 5.6倍(3.7(1.5))。正常结肠黏膜的FasL转录水平与活检部位无关(数据未显示)。因此，FasL转录本的水平反映了局部炎症的程度。
在6个溃疡性结肠炎活动性病变中，同一患者未受累粘膜和受累病变之间Fas配体(FasL)转录的比较。受累病变的FasL转录本在所有病例中均显著增加(p<0.05, vs未受累病变)。
活动性溃疡性结肠炎粘膜病变浸润的单个核细胞中FasL mRNA的高表达
在活动性溃疡性结肠炎病变中，FasL mRNA被ISH定位。在浸润的单核炎症细胞上检测FasL mRNA信号(图5A、B)。上皮细胞及其他间质细胞均未检测到明显信号。在4个健康个体和4个克罗恩病患者的标本中，浸润细胞很少或没有染色(图2)5C和D)。混合也用感应探针进行，未检测到信号(数据未显示)。因此，定量RT-PCR检测到FasL转录量的增加是由于FasL在溃疡性结肠炎病变浸润的单个核细胞上的高表达。
通过原位杂交(ISH)检测结肠标本中Fas配体(FasL) mRNA的表达和定位。用FasL反义RNA探针对活动性溃疡性结肠炎病变(A, B)、正常结肠黏膜(C)和活动性克罗恩病病变(D)的切片进行ISH检查。代表性数据显示。每组中有四名受试者的结果相似。原放大倍率:A、C、D × 143;B， × 715。
正常受试者和溃疡性结肠炎患者结肠上皮中Fas的保守性表达
为了分析FasL表达细胞在溃疡性结肠炎病变中的致病作用，我们研究了Fas在溃疡性结肠炎上皮细胞上的表达。用免疫组织化学方法检测Fas的表达。如图所示6Fas在正常和溃疡性结肠炎患者的结肠上皮均有弥漫性表达。浸润炎性细胞呈弱免疫反应性。在克罗恩病或非活动性溃疡性结肠炎患者的结肠标本中，Fas在上皮细胞上保守表达(数据未显示)。
结肠黏膜Fas的免疫组化检测。活动性溃疡性结肠炎病变(A, C)和正常结肠(B, D)切片用小鼠抗人Fas单克隆抗体染色。原始放大倍率:× 129。
在浸润性溃疡性结肠炎病变的CD3 LPLs中FasL的表达
流式细胞仪检测表达FasL的LPLs的表型。用双色免疫荧光细胞术分析LPLs(图2)7)，在活动性溃疡性结肠炎病变的CD3 LPLs中检测到FasL阳性细胞。在6例活动性溃疡性结肠炎患者中，表达CD3 LPLs的FasL占总人数的16.9(8.9)%，而在5例正常人和5例活动性克罗恩病患者中分别仅占1.3%(0.9)和2.9(1.7)%。此外，在活动性溃疡性结肠炎结肠标本中，超过95%的LPLs被确定为CD3阳性(数据未显示)。ISH和流式细胞分析结果表明，FasL在浸润溃疡性结肠炎活动性病变的CD3淋巴细胞上高度特异性表达。相反，在克罗恩病活动性病变或正常结肠组织的LPLs中，FasL表达没有增加。
流式细胞术分析CD3固有层淋巴细胞Fas配体(FasL)表达。分别从(A)溃疡性结肠炎受累性结肠病变、(B)克罗恩病活动性病变和(C)对照结肠粘膜分离出CD3 LPLs，通过免疫荧光和FACS分析检测FasL在CD3 LPLs上的表达。用抗人FasL抗体(实线)或同型匹配对照抗体(虚线)对LPLs进行染色。分别展示了五到六个案例的代表性数据。(D) CD3 LPLs中FasL表达细胞的百分比。
讨论
在溃疡性结肠炎中，慢性炎症局限于结肠黏膜，其中结肠上皮细胞损伤常见于活动性病变。据报道，一种形式的上皮损伤涉及凋亡。在活动性溃疡性结肠炎病变中，结肠上皮细胞凋亡比例增加。28本文的数据表明，Fas在正常结肠和溃疡性结肠炎病变的上皮细胞上都是保守表达的。Fas介导的细胞凋亡可能参与了溃疡性结肠炎上皮细胞的损伤。本研究显示，活动性溃疡性结肠炎患者FasL转录本仅在病变黏膜中高表达，而浸润病变黏膜固有层的T淋巴细胞中FasL mRNA表达较强。这些发现表明，在T淋巴细胞上表达的FasL结合诱导表达Fas的结肠上皮细胞凋亡，导致溃疡性结肠炎患者出现严重的结肠炎症。在另一种慢性炎症性肠病克罗恩病中，在活动性病变中未检测到FasL转录本，这表明FasL与克罗恩病中观察到的炎症无关。与溃疡性结肠炎限于结肠黏膜上层不同，克罗恩病的炎性病变广泛经壁累及消化道。此外，与溃疡性结肠炎患者局限于结肠的粘膜病变不同，克罗恩病病变并不局限于结肠，而是跳过节段，包括回肠、空肠、十二指肠，甚至胃。在活跃的克罗恩病病变中，巨噬细胞，而不是ctl，与克罗恩病的发病和进展密切相关。29-31这些发现和我们的结果表明，溃疡性结肠炎的发病机制不同于克罗恩病。我们的结果可能反映了CTL诱导细胞凋亡在克罗恩病中的不显著性，从而导致了这两种炎症性肠病的不同临床特征。在已知的几种溃疡性结肠炎类型中，直肠炎类型具有独特的特点，仅累及直肠，临床病程较轻，预后优于其他类型。这些独特的表现提示直肠炎型溃疡性结肠炎的发病机制可能不同于其他类型的溃疡性结肠炎。本研究显示，FasL转录本在直肠炎型溃疡性结肠炎活动性病变中没有增加，而在其他两种类型中水平较高。因此，Fas-FasL介导的细胞凋亡不参与直肠炎型溃疡性结肠炎的发病机制，这也是直肠炎型溃疡性结肠炎的独特表现之一。在胃肠道中，FasL的表达被报道局限于一小部分固有层细胞32和潘氏细胞。33在溃疡性结肠炎患者的粘膜病变中，在化生Paneth细胞和表达FasL的炎症细胞中检测到FasL转录物水平的高度升高。33我们的研究显示，在溃疡性结肠炎患者的粘膜病变中，浸润炎性细胞中的FasL转录物显著增加。结果还表明，溃疡性结肠炎病变浸润的FasL mRNA阳性细胞以CD3 T淋巴细胞为主。因此，表面带有FasL的CD3 T淋巴细胞可能至少部分参与了溃疡性结肠炎的发病机制。先前的报道表明，抗Fas与Fas的交联可以刺激结肠上皮来源的HT-29细胞产生白介素8。34白细胞介素8已被发现能有效地诱导中性粒细胞和淋巴细胞的迁移。35-37FasL在溃疡性结肠炎中的高表达可能诱导结肠上皮产生和分泌白细胞介素8，促进淋巴细胞和中性粒细胞的迁移和活化。因此，活动性溃疡性结肠炎中CD3 T淋巴细胞上FasL的升高被认为通过以下两种机制在溃疡性结肠炎的慢性炎症中发挥作用:如上所述，直接通过诱导表达Fas的结肠上皮细胞凋亡，间接通过白细胞介素8的诱导，增强中性粒细胞和淋巴细胞的迁移和激活，导致溃疡性结肠炎黏膜病变的进展。总的来说，我们的结果表明，活动性溃疡性结肠炎中CD3 T淋巴细胞上的FasL增加，导致除直肠炎类型外的所有类型溃疡性结肠炎粘膜病变的进展。Fas-FasL系统的破坏可能部分参与了溃疡性结肠炎的发病机制，至少在活性型溃疡性结肠炎中是如此。有必要对溃疡性结肠炎的治疗进行进一步的研究，以确定增强Fas-FasL系统的溃疡性结肠炎特异性因素。
致谢
作者感谢M Yoshimura博士、H Yoshida博士和M Ogawa博士对细胞分析的建议，以及N Itoh博士对免疫组化程序的建议。
参考文献
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