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摘要
背景与目的:在标准胃镜检查中，Barrett食管癌之前的特征性肠化生及其发育不良转化无法鉴别。本研究的目的是探讨激光诱导的原卟啉IX荧光是否允许在内镜检查中检测特征性肠化生和不典型增生，并以指导而不是随机的方式进行活检标本。
方法:在53例Barrett食管患者中，5-氨基乙酰丙酸被喷在粘膜上。大约60至120分钟后，根据体内原卟啉IX延迟荧光强度比的点样测量采集活检标本。两名独立的病理学家检查了采集的596个活检标本，其中168个标本被第三名病理学家选择进行调查。在这些标本中，只有至少两名病理学家一致诊断且p53表达作为附加标记的标本(n=141)被纳入分析。
结果:非发育异常特化肠化生(0.51,68% CI 0.09至1.92)和低度发育异常肠化生(1.89,68% CI 0.55至3.92)归一化荧光强度(延迟PpIX荧光强度与即时自身荧光强度之比)的中位数差异显著(p<0.005)。尽管标本较少，但不典型增生的检出率比筛查内窥镜高2.8倍。此外，首次发现了三种早期癌症。此外，该方法允许从连接型或胃底型上皮分化特化肠化生(p<0.013)。
结论:基于PpIX的延迟激光诱导荧光内镜首次能够在内镜检查中区分低级别发育不良与非发育不良的Barrett粘膜。此外，该方法有助于检测短巴雷特食管特化肠化生。
- 荧光光谱
- 巴雷特食管
- SIM，特征性肠化生
- LIFS，激光诱导荧光光谱
- LIFE，激光诱导荧光内窥镜
- HGD，高度发育不良
- 低级别发育不良
- 5-ALA, 5-氨基乙酰丙酸
- 原卟啉IX
- OPO，光学参量振荡器
- HV，高电压
- PBGD，卟啉素原脱氨酶
- R，归一化荧光强度
- 信噪比
数据来自Altmetric.com
- SIM，特征性肠化生
- LIFS，激光诱导荧光光谱
- LIFE，激光诱导荧光内窥镜
- HGD，高度发育不良
- 低级别发育不良
- 5-ALA, 5-氨基乙酰丙酸
- 原卟啉IX
- OPO，光学参量振荡器
- HV，高电压
- PBGD，卟啉素原脱氨酶
- R，归一化荧光强度
- 信噪比
在所有胃肠道肿瘤中，食管及胃食管交界处腺癌的发生率最高。1，2由于这些癌在Barrett食管发生一系列严重的发育不良并伴有特征性肠化生(SIM)，内镜下可见Barrett食管发育不良和短段Barrett可提供早期治疗的机会，从而改善预后。3 -6为此目的，开发了其他内窥镜方法，如染料喷涂、色内窥镜(例如亚甲基蓝)、激光诱导自体荧光或造影剂荧光，以及光学相干断层扫描。亚甲基蓝等染料是否能改善巴雷特粘膜短段和发育不良的检测仍存在争议。7 -11
激光诱导荧光光谱(LIFS)和激光诱导荧光内窥镜(LIFE)提供了区分癌前病变和恶性病变与正常黏膜的潜力，因为它们的荧光性质不同。随着从正常到瘤变的进展，绿色自发荧光的主要贡献减少，而较长波长的自发荧光(红色)增加。12因此，LIFS和LIFE被用于识别发育不良转化。通过LIFS或LIFE检测，高度不典型增生(HGD)具有高敏感性和中等特异性。12 -14然而，低级别发育不良(LGD)被错误地归类为正常。13此外炎症,13日,14甚至巴雷特粘膜也可能产生假阳性结果。13
然而，对于内窥镜监测，有必要检测所有三种类型的粘膜变化。SIM卡的存在3.15 -17对于巴雷特食道癌的发展是至关重要的，并且在癌症发生之前可能会出现低LGD或HGD，或者两者都有。18岁23
因此，我们的研究目的是检查是否有可能在内镜下定位Barrett食管中的LGD或HGD，并区分有SIM的柱状内衬食管和没有SIM的柱状内衬食管，特别是短Barrett的柱状内衬食管。与之前的调查相比13我们给药5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)24 -26刺激原卟啉IX (PpIX)的代谢产生，特别是在肿瘤组织中。此外，我们使用可调谐的脉冲固体激光系统在线记录即时和延迟荧光光谱，同时使用白光内窥镜检查。27 -29通过记录延迟荧光光谱，我们能够有效地抑制自发荧光背景，利用PpIX的长荧光衰减时间。
方法
实验设置
图1显示了用于激发和检测荧光光谱的实验装置。光学参量振荡器(OPO, model 355- a, GWU-Lasertechnik)，由三次谐波(λ=355 nm, E脉冲= 50-60 mJ，重复频率10 Hz)调q Nd:YAG激光器(quantum - ray GCR-11;光谱物理)，提供410 nm ~ 2.2 μm的激光辐射可调。输出脉冲的能量和脉冲宽度一般为2兆焦耳和3纳斯。将可调谐激光束的输出能量降低到150 μJ，并耦合到插入内窥镜的600 μm硬包层石英纤维中。组织的激光诱导荧光由同一纤维收集，并引导到光学多通道分析仪的入口狭缝，该分析仪由多色仪(McPherson)和冷却强化二极管阵列探测器(Princeton Instruments)组成。二向色分束器用于解耦激发光路和观测光路，分离激光诱导荧光和背散射激光。此外，一个长波通滤波器(λ50％= 550 nm)使剩余的背散射激发光被抑制。为了避免与用于内窥镜检查的白光产生干扰，二极管阵列探测器的增强器仅被打开20ns，由−180v的电脉冲门控。为此，由Nd:YAG激光器的电源提供的脉冲触发高电压(HV)脉冲发生器，并通过数字延迟发生器进行适当延迟。
实验建立。THG，三次谐波;SHG，二次谐波;OPO，光学参量振荡器。
所有的荧光光谱都校正了多色器的光谱透过率和增强二极管阵列探测器的光电阴极的光谱灵敏度，但没有校正长通滤波器(λ50％= 550 nm)和使用的二向色镜。此外，对探测器的电子背景进行了减除。由于荧光光谱校正激光脉冲的数量和他们的能量，立即和延迟光谱可以定量比较。
荧光团
5-ALA的合成是血液合成的第一步。这一途径受到终点抑制的严格调控。给药5-ALA导致恶性组织和癌前组织中血红素的直接前体PpIX的积累，30.可能是因为卟啉素原脱氨酶(PBGD)和铁螯合酶之间的不平衡。24，31PpIX在甲醇中的激发谱由401 nm处的Soret带和505、532、580和630 nm处的四个较小的q带组成。我们使用λ=505 nm的q波段进行激发。PpIX在甲醇中的发射光谱为635 nm和699 nm。
荧光光谱和数据分析
作为一个工作假设，我们假设异常增生病变的荧光光谱以PpIX荧光为主，因为PpIX在恶性组织和癌前组织中更好地积累。观察到，在广泛的自身荧光背景上，异常增生病变的即时荧光光谱在λ=635 nm和λ=699 nm处显示出PpIX荧光带，如图2B所示。相比之下，我们预期在非发育不良的巴雷特粘膜中有较宽的自身荧光光谱，没有明确的光谱特征(图2A)。
非发育不良和发育不良巴雷特粘膜的荧光光谱。注:不典型增生和正常黏膜的即时光谱有一定程度的相似，而延迟光谱有明显的差异，特别是其相对PpIX荧光差异约为20倍。(A) Barrett粘膜的典型荧光光谱。即刻光谱:无异常增生的周围黏膜荧光光谱较宽，没有清晰的光谱特征，因此不能将PpIX波段与自身荧光背景区分开。延迟荧光光谱(检测时间延迟20ns):在延迟光谱中，可以识别出635 nm处微弱的PpIX波段。(B)发育不良的典型荧光光谱。即时光谱(检测时间延迟为0 ns):在光谱中，在λ=635 nm和λ=699 nm处，清晰的荧光带出现在广阔的背景上，这是由组织自身荧光引起的。延迟荧光光谱(检测时间延迟20 ns):由于PpIX (τ=16 ns)和自发荧光(τ约2-4 ns)的荧光衰减时间不同，荧光光谱几乎没有自发荧光背景，只显示PpIX荧光带。为了进行比较，将提示谱归一化到最大强度，并针对不同的采样时间和激发能量对相应的延迟谱进行校正。
由于自身荧光的衰减时间(τ= 2-4 ns)比PpIX的荧光寿命(τ=16 ns)短，因此可以通过延迟观测来抑制自身荧光背景。28，29为此，我们将用于打开探测器的电脉冲相对于激光脉冲延迟了20ns。在λ=635 nm时，即在ppix主荧光带的峰值处，高强度的延迟荧光被认为是不典型增生的特异性标记(图2B)。另一方面，低强度延迟荧光与非发育不良黏膜相关(图2A)。然而，应该注意的是，所记录的荧光强度受到几何因素的强烈影响，例如探针与粘膜之间的距离，以及组织的光学特性——即吸收和散射特性。为了定量，我们将延迟PpIX荧光强度I (635 nm, 20 ns)归一化，用从λ=599 nm的即时荧光光谱中提取的自身荧光强度I (599 nm, 0 ns)。R=I (635 nm, 20 ns)/I(599 nm, 0 ns)的比值极大地降低了几何因素和组织光学特性的影响。
患者与手术
53例Barrett食管患者(短34例，长19例，男38例，女15例，中位年龄:56岁;范围27-87)被纳入我们的研究。只有三名病理学家中至少有两名诊断为短Barrett食管时，诊断才被接受。对所有筛查胃镜的患者进行胃镜检查(视频胃镜，GIF Q 140, Olympus公司)，每厘米进行四个象限活检(Wilson Cook: maxum可重复使用活检钳;波士顿科学公司:兆钳，多齿钳)。在内镜筛查后8周进行内镜随访。胃镜检查时，将0.5 g 5-ALA在50ml 8.4%碳酸氢钠和50ml 0.9%氯化钠中的水溶液喷在粘膜上(PW-5L-1，奥林巴斯公司)。大约60 ~ 120分钟后，行荧光引导胃镜检查。光纤通过内窥镜的仪器通道之一插入，并以圆周方式与食管组织接触。光纤允许从一个小区域(1毫米)收集荧光2)．用激光脉冲激发后，记录延迟荧光光谱，将一秒内获得的所有光谱添加到显示器上以提高信噪比。从这些光谱中获得PpIX的荧光强度和活检(Wilson Cook: maxum可重复使用的活检钳;波士顿科学公司(Boston Scientific):兆钳，多齿钳)在巴雷特切片中显示高、中、低PpIX荧光强度的位置进行采集，作为比较。此外，活检标本取自胃体、食管远端和疝(如果存在)。一般采用双通道内窥镜(GIF 2 T 20，奥林巴斯公司)在光纤存在下进行活检，用高荧光强度标记发育不良组织的病灶区域。每个活检标本的位置是通过测量距离牙缘和时钟位置来确定的。记录所有离体活检的即时和延迟荧光光谱，以检查内窥镜检查时的采样误差。通过这种方法，我们发现在内窥镜检查过程中有27%的抽样误差。因此，我们只比较了离体荧光数据与组织学检查和p53。
组织学诊断
共采集596例活检标本，由来自两个不同机构的两名病理学家独立进行盲法组织学评估。所有经至少一名病理学家诊断为发育不良的组织学标本(n=69)和随机选择的正常样本(n=99)由来自第三家机构的第三位病理学家进一步检查。在最终的分析中，只有活检样本(n=141)被包括在内，并由所有三位病理学家进行了评估——至少有两位病理学家同意诊断(一致诊断)。病理学家不知道内窥镜图片、活检的位置、其他病理学家的诊断以及荧光强度值。所有活检标本均固定于4%中性甲醛中，并用石蜡包埋。用苏木精-伊红(H&E)和周期性酸性希夫(PAS)染色后，连续切片(4 μm)。根据WHO分类定义为发育不良，柱状细胞化生中如有杯状细胞，则诊断为SIM。32岁的33归一化的体外PpIX荧光强度(见上文)与共识诊断相关。此外，还计算了病理学家、p53分析和归一化荧光强度之间的一致性(表1)。
P53蛋白表达
由第三位病理学家检查的所有168个活检样本随后被检查p53蛋白表达作为额外的生物学标记。34研究人员对内窥镜、组织学检查和荧光光谱的结果没有事先的信息。对4 μm切片固定组织和石蜡包埋组织进行免疫组化检测p53蛋白表达。切片用二甲苯脱蜡，用分级酒精复水化。在3%双氧水中培养10分钟，内源性过氧化物酶活性被阻断。用柠檬酸缓冲液微波处理3次，700 W，获得固定组织中的抗原。在正常马血清中预孵育载玻片后，切片用DO-1单克隆小鼠抗体(癌基因科学公司，剑桥，美国)以1:100的稀释率孵育1小时。使用的DO-1抗体识别野生型p53蛋白以及p53突变体的表位。结合的DO-1抗体使用Vectastain ABC试剂盒(Vector, Burlingame, USA)检测。最后，用苏木精反染玻片。从已知表达p53蛋白的组织中制备阳性对照标本，用非免疫血清上清代替一抗，从原始石蜡块中制备阴性对照玻片。
道德准则
试验遵循的规程得到了洪堡大学医学院伦理委员会(Charité)的批准。获得每位患者的书面知情同意。
结果分析和统计
由于中心68%质量是对数正态分布的特征，除非另有说明，否则结果以括号中68%置信区间(CI)的中位数表示。35采用Mann-Whitney U检验检验非正态分布数据的差异是否有统计学意义。36采用SPSS 10.07-G统计软件进行统计学分析。
为了提高具有不同样本数量的组(例如，LGD，非发育异常)归一化荧光强度(R)的可比性，我们使用归一化累积频率作为说明参数R分布的一种方式。病理诊断为特定类型的活检样本的归一化累积频率是活检样本的总和(按R值的增加排序)归一化到活检样本的总数。37岁的38
结果
53例Barrett食管患者行55例荧光引导内镜检查。从596个活检标本中，只有141个样本得到至少两名病理学家的一致诊断，并在最终分析中纳入了额外的p53表达测量。所有患者对5-ALA和内窥镜耐受良好。
筛选内镜与荧光引导内镜的比较
LIFS导致检测到发育不良的数量显著增加。根据两位病理学家的一致诊断，53例患者中有14例(4例HGD患者，10例LGD患者)通过LIFS观察到发育不良，而这些患者中只有5例在之前的常规筛查程序中发现了发育不良。在LIFS检测到的14例发育不良患者中，8例Barrett长段发育不良，6例Barrett短段发育不良。相比之下，常规筛查内窥镜仅在长段内发现发育不良。有趣的是，尽管取的活检标本更少，但LIFS改善了异常增生的检出率(LIFS中位数:7;中位筛选内窥镜:28)。此外，LIFS在3例患者中检测到早期癌症。其中一例患者经筛查内窥镜检查怀疑为HGD。
发育不良和非发育不良黏膜的荧光数据
非发育不良黏膜和发育不良黏膜的典型荧光光谱分别如图2A和图2B所示。我们绘制了归一化累积频率(见图3)37岁的38与荧光强度R(见部分荧光光谱和数据分析)，根据共识诊断分为长巴雷特和短巴雷特粘膜发育不良或非发育不良的活检标本。50例LGD活检标本归一化荧光强度R的中位数为R中位数= 1.89 (CI: 0.55 ~ 3.92)，而R中位数91例巴雷特粘膜非发育不良标本中= 0.51 (CI: 0.09 ~ 1.92)。异常增生组织的归一化荧光强度中位数明显高于非异常增生的巴雷特粘膜与SIM (p<0.001)，这清楚地证实了我们的工作假设，即PpIX在恶性组织和癌前组织中更好地积累，因此导致更高的归一化PpIX荧光强度。加HGD的9个样品归一化后荧光强度为R中位数=0.95 (CI 0.4 ~ 2.30)在LGD的r值范围内。R的意思是早期癌标本的SD为1.73(1.3)。根据这些结果，Rdiscr=0.8的活检归一化荧光强度被用来区分异常增生(R≥0.8)和非异常增生(R<0.8)组织。按照这种方法，根据共识诊断，50例发育不良的活检标本中有38例被正确分类为恶性，91例非发育不良的巴雷特粘膜中有58例被正确分类为良性。通过这种方法，灵敏度为76%，特异性为63%，阳性预测值(PPV)为52%，阴性预测值(NPV)为82%。在一个鉴别器值R处discr>0.8，假阳性的数量会减少，同时增加低级别发育不良的假阴性的数量。更重要的是，HGD假阴性的数量将是不可接受的。R的值discr=0.8导致LGD和HGD的特异性大致相同。
一致组织学诊断与正常化的PpIX荧光强度比较:发育不良与非发育不良的巴雷特粘膜(SIM)比较。
推测对于进一步的治疗决策，通过记录至少一个高于0.8的标准化荧光强度值(灵敏度100%，特异性67%，PPV为89%，NPV为100%)，就足以怀疑患者的异型增生。
短Barrett食管荧光资料
在本节中，我们将归一化荧光强度R与内镜下仅短巴雷特氏病活检标本的病理联系起来(图4)。分析是基于共识诊断进行的。SIM柱状上皮归一化荧光强度中位数为R中位数=0.91 (CI: 0.2 ~ 2.50)，而R中位数胃底型或交界型上皮为0.31 (CI: 0.07 ~ 1.55) (p<0.02)。我们选择了一个R值discr=0.7通过归一化荧光强度区分SIM (R≥0.7)与交界型或胃底型(R<0.7)，其敏感性为67%，特异性为70%，PPV为53%，NPV为81%。
一致组织学诊断与正常化的PpIX荧光强度比较:短巴雷特连接或胃底型上皮与SIM比较。
P53蛋白表达及荧光数据
在图5中，归一化的p53阴性的累积频率(R中位数=0.64, CI: 0.05 ~ 2.9)，活检阳性(R中位数=1.55, CI: 0.4至4.5)绘制与归一化荧光强度R的关系discr选择=0.7作为鉴别，灵敏度为68%，特异性为52%，PPV为49%，NPV为71%。
P53表达与归一化PpIX荧光强度的关系。
讨论
常规内镜筛查Barrett食管的疗效仍存在争议，尽管已知癌症发生前Barrett粘膜发育不良。一方面，即使取四象限活检标本，也可能会漏诊异常增生和癌症，因为在白光内镜下正常的黏膜也可能发生异常增生和癌症。3.另一方面，由于总体癌症发病率较低，监测的成本效益值得怀疑。由于Barrett食管发育不良和腺癌主要与SIM相关，39 -43如果只对患有SIM的患者进行筛查，那么诊断出的每一种癌症的费用就会降低。44除了SIM、发育不良和癌症，不同类型的柱状上皮在白光内镜下不能通过外观来区分，因此可能被忽略。45岁的46因此，引入了几种新方法(例如染料染色、LIFS、LIFE、光学相干断层扫描)，目的是在内镜检查中使SIM、发育不良和小癌可见。
Panjehpour等13激光诱导自荧光光谱法对Barrett食管的治疗取得了良好的效果。该技术使HGD与非发育不良黏膜具有高敏感性和中等特异性。然而，HGD只有在大面积受累时才能检测到。此外，混合HGD和LGD仅在28%的活检标本中被正确归类为癌前病变，而LGD被归类为良性。此外，作者从初步数据中得出结论，活动性炎症可能被错误地归类为癌前病变。
在本研究中，我们提供的证据表明，在延时PpIX荧光光谱的帮助下，LGD可以从非发育不良的巴雷特粘膜中区分出来，敏感性为76%，特异性为63%。此外，短巴雷特食管的SIM和其他类型的柱状上皮也有区别。
一种可能的解释是，与之前使用的波长(λ=410 nm)相比，与较长激发波长(λ=505 nm)相关的激光穿透深度更大。13此外，使用绿光而不是蓝光可以减少荧光团的漂白13日,14导致对发育不良病变的敏感性增加。此外，与自身荧光光谱检测的内源性荧光团(如胶原蛋白、弹性蛋白、NADH、黄素)相比，对这些优先积聚在恶性组织中的荧光团前体(5-ALA)的患者进行预处理，可能会提高检测异常增生的敏感性。13在本例中，我们利用了PpIX荧光较长的荧光衰减时间(τ约16 ns)，而自体荧光的荧光衰减时间(τ约2-4 ns)27 -29利用激光诱导荧光延迟观察抑制自发荧光背景。此外，脉冲激发和20ns内的观察允许在正常内窥镜条件下(即在永久白光照明下)记录荧光光谱。
病理学家之间的意见分歧很大，主要是由于LGD与非发育不良粘膜的区别造成的。然而，这与已发表的文献一致，有高度(约40%)的观察者间变异性的报道。47 -51为了解决这个问题，我们最终分析的所有样本都经过了三位不同的病理学家的诊断，此外还测定了p53的表达。为了比较正常化荧光强度和p53表达与组织学检查，我们采用共识诊断，51胃肠道病理学家对LGD的共识诊断表明，LGD进展为HGD或癌的风险增加。52
尽管归一化荧光强度与p53表达在一定程度上相关(见表1)，但后者参数不能取代共识诊断。尽管有这些保留，时间门控荧光光谱似乎是检测巴雷特粘膜低级别发育不良患者的可靠方法。与筛查性内窥镜相比，不典型增生的检出率几乎增加了两倍，这一结论得到了支持。此外，延迟观察PpIX荧光有助于检测短巴雷特特化。
我们的荧光引导内窥镜系统的价格相当高，但一个专用的系统可以更便宜地建造。然而，荧光光谱检查所需的组织学活检标本数量的减少(中位数为7，而常规内窥镜检查中位数为28)将在本研究中降低筛查程序的费用。此外，我们的设备还可用于其他疾病的筛查，如溃疡性结肠炎、早期胃癌、扁平腺瘤、息肉等。
总之，我们的数据表明，时间门控检测的原卟啉IX荧光改善了短巴雷特(SIM)和发育不良病变的指纹识别在内镜下的目标活检。此外，该技术还可以对LGD进行局部定位。我们目前设置的是一个研究仪器，它不打算用于常规的内窥镜检查。然而，基于相同原理的商业工具可以为此目的而设计。
致谢
本研究由Charité大学和1997年路德维希·戴姆林奖资助。