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摘要
背景:虽然有报道称，不同的乙型肝炎病毒(HBV)基因型会导致慢性肝病(CLD)患者的不同临床特征，但很少有报道详细介绍急性肝病中HBV基因型的分布。
方法:在61例急性肝病患者(45例为急性自限性肝炎(AH)， 16例为暴发性肝炎(FH))和531例CLD患者(包括19例严重急性加重的CLD患者)中测定了HBV基因型。我们还分析了增强子II、核心启动子和前核区序列是否存在突变。
结果:B基因型在急性肝病患者中的表达明显高于慢性肝病患者(39.3%)v分别为11.7%;p < 0.001)。此外，基因型B在FH患者中的表达明显高于AH患者(62.5%)v分别为31.1%;p = 0.027)。与AH相比，FH中发现的前核突变A1896和核心启动子突变nt 1753和1754位点更频繁，且无论是否存在这些突变，B基因型在FH中均占主导地位。
结论:乙型肝炎病毒基因型在急性肝病患者中比在慢性肝病患者中更常见，在FH患者中比在AH患者中更常见。这些结果表明，至少在日本千叶的患者中，这种HBV基因型可能比其他病毒基因型引起更严重的肝损伤。
- 急性自限性肝炎
- 重型肝炎
- 乙型肝炎病毒
- 基因型
- AH，急性自限性肝炎
- 谷丙转氨酶
- 慢性肝病
- 酶联免疫吸附试验
- FH，暴发性肝炎
- 乙型肝炎病毒
- HBeAg，乙型肝炎e抗原
- HBsAg，乙型肝炎表面抗原
- 抗hcv，丙型肝炎病毒抗体
- 抗丁型肝炎病毒抗体
- PCR，聚合酶链式反应
- A1896, nt 1896前区G到A突变
- T1762和A1764，核心启动子区1762 nt A向T突变，1764 nt G向A突变
- C/A/G 1753和/或C/G1754, C/A/G在1753 nt向T突变和/或C/G在1754 nt向T突变
数据来自Altmetric.com
- AH，急性自限性肝炎
- 谷丙转氨酶
- 慢性肝病
- 酶联免疫吸附试验
- FH，暴发性肝炎
- 乙型肝炎病毒
- HBeAg，乙型肝炎e抗原
- HBsAg，乙型肝炎表面抗原
- 抗hcv，丙型肝炎病毒抗体
- 抗丁型肝炎病毒抗体
- PCR，聚合酶链式反应
- A1896, nt 1896前区G到A突变
- T1762和A1764，核心启动子区1762 nt A向T突变，1764 nt G向A突变
- C/A/G 1753和/或C/G1754, C/A/G在1753 nt向T突变和/或C/G在1754 nt向T突变
乙型肝炎病毒(HBV)是全球急慢性肝病的主要病因之一。根据HBV基因组序列的系统发育分析，将其分为7个基因型。前四种基因型(基因型A-D)由Okamoto及其同事首先描述。1六年后，又增加了两种基因型2(基因型E, F)和最近的基因型G被描述。3.这些基因型的地理分布不同。基因型A和D在欧洲和美国普遍存在4，5E、F基因型仅存在于非洲6并分别在中美洲和南美洲流行。7,8基因型B和C在东亚地区较为常见。9在日本，基因型B和C分别在12%和85%的慢性肝病(CLD)患者中报告。10最近，报道了携带不同基因型病毒的个体之间的CLD临床特征的差异，基因A型被证明比基因D型引起的肝病更轻。11Orito等此外，C型HBV患者发生血清转化的年龄可能比B型HBV患者晚。12据报道，基因型C比基因型B与更严重的组织学炎症相关。13日,14也有报道称，在慢性肝炎患者中，感染基因型C的患者对干扰素的反应低于感染基因型B的患者。15因此，在不同病毒基因型的患者中，急性肝病的临床病程也可能不同。因此，我们检查了急性肝病患者中HBV基因型的分布，并将其与慢性肝病患者和急性加重型慢性肝病患者中的分布进行了比较。
我们先前的研究表明，在HBV的前核区(A1896) nt的G到a突变和核心区的突变经常在致命的急性肝病中被发现。16日,17有一些报道已经描述了前核突变和暴发性肝炎(FH)之间的关系。18岁23同样,佐藤等报道了日本FH患者中未出现前核终止密码子突变的核心启动子区(T1762和A1764)存在1762位点A到T突变和1764位点G到A突变。24然而，一项针对美国和欧洲患者的研究未能揭示这种关联。25 -30.我们也报道了病毒增强子II/核心启动子区域的突变在FH患者中比在急性自限制性肝炎(AH)患者中更频繁地观察到，尽管核苷酸1762和1764的突变不常见。31因此，HBV核心启动子区和前核区突变是否参与FH的发展仍有争议，这些突变与不同病毒基因型之间的关系尚不清楚。为了研究这些突变与不同病毒基因型的关系，我们比较了每个基因型的核心启动子和前核区域的HBV序列。
材料与方法
病人
本研究对1980年至2001年间连续入住千叶大学医院的61例HBV相关急性肝病患者进行了检查。他们包括45例AH患者和16例FH患者(表1)。HBV相关急性肝病的诊断依据是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的出现或乙型肝炎核心抗原免疫球蛋白M (IgM)抗体>1滴度的存在。凝血酶原时间延长，低于对照值的40%，并且在AH的临床过程中出现脑病的患者被诊断为FH。HBsAg检测呈阳性的患者被认为是HBV携带者，那些在观察期间的某个时间点有异常谷丙转氨酶(ALT)水平的患者被诊断为CLD。在疾病的临床过程中，ALT升高超过600 IU/l，总胆红素超过3.0 mg/dl，或凝血酶原时间延长低于对照值的50%的CLD患者被诊断为严重急性加重。所有HBV相关急性肝病或严重急性加重的CLD患者抗丙型肝炎抗体(anti-HCV)或抗丁型肝炎抗体(anti-HDV)检测均呈阳性。从1980年至2001年间在千叶大学医院就诊的590名慢性肝病患者中，选取了531名对照慢性肝病患者:(1)为千叶地区居民，(2)抗- hcv和抗- hdv均为阴性。测定上述CLD患者的HBV基因型。本研究中检查的CLD患者的特征也包括在表1中。
在69例有血清样本的患者(45例AH患者中37例，16例FH患者中15例，18例急性加重型CLD患者中17例)中检测了HBV基因型和病毒核心启动子和前核区域的核苷酸序列。
血清学标记
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HBsAg、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和抗- hdv(美国伊利诺伊州芝加哥Abbot实验室)。抗- hcv的存在也通过ELISA检测(Ortho Diagnostics, Tokyo, Japan)。采用聚合酶链式反应(PCR)法(Amplicor HBV Monitor;Roche Diagnostics，东京，日本)。线性范围为2.6 ~ 7.6 log copies /ml。
HBV基因型测定
ELISA法检测患者血清HBV基因型(HBV基因型EIA;Tokushu-Meneki实验室，东京，日本)基于Usuda描述的方法等．32用Mizokami法检测基因型等在ELISA结果不确定的情况下。33简而言之，将半巢式PCR扩增出的s基因序列用限制性内切酶酶切，通过酶切产物的限制性内切片段长度多态性确定基因型。使用上述任何一种技术的结果都具有可比性。
HBV序列测定
PCR扩增后采用直接测序法测定HBV基因组序列。34为了扩增增强子II(1688年至1773年)、核心启动子(1742年至1849年)和前核区域(1814年至1900年)，制备了几种引物。第一次PCR引物为5 -GTCTGTGCCTTCTCATCTGCC-3(意义，nt 1553-1573)和5 -AGAATAGCTTGCCTGAGTGC-3(反义，nt 2060-2079)，第二次PCR引物为5 -ACGTCGCATGGAGACCACCG-3(意义，nt1603-1622)和5 -GAAAGAAGTCAGAAGGCAAA-3(反义，nt 1954-1973)。简单地说，从血清中提取10µl DNA，加入5µl dNTP, 1µl Ex-Taq聚合酶(Takara Syuzou，京都，日本)，5µl 10×Taq聚合酶缓冲液，以及100 pmol外义和反义引物。扩增剖面在96℃下进行2分钟，然后在96℃下进行25次循环1分钟(变性)，55℃下1分钟(退火)，72℃下1分钟(延长)。第二次PCR除外义和反义引物外，在相同的反应缓冲液中加入1 μ l第一次PCR产物。使用染料终止剂试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)对第二个PCR产物进行纯化和测序。将序列与各基因型(基因型A, X70185;基因型B, X97851;基因型C, X04615)。
统计数据
结果以平均值(SD)表示。用2×2 χ比较各组间的频率2测试，和组均值比较使用学生的t测试。p值小于0.05被认为有统计学意义。
结果
研究HBV基因型患者的特征
表1为调查HBV基因型患者的临床和实验室资料。AH、FH、CLD和急性加重CLD患者的平均年龄和性别差异无统计学意义。FH患者HBeAg阳性的比例明显低于AH患者(25.0%)v65.2%;p < 0.001)。急性肝病患者的平均HBV DNA水平明显低于慢性肝病患者(4.58(1.31))。v6.19(1.65)个日志拷贝/ml;p<0.001)，尽管在AH和FH患者中具有可比性(4.48(1.26))。v4.71 (1.40) log copies/ml;(6.19(1.65))，以及CLD和急性加重患者(6.19 (1.65))v5.91(1.74)个日志拷贝/ml;NS)。
急性肝病(CLD)患者HBV基因型的分布
HBV基因型在各种肝病中的分布情况见表2。在61例急性肝病患者中，病毒基因型A阳性6例(9.8%)，基因型B阳性24例(39.3%)，基因型C阳性31例(50.8%)。基因B型在急性肝病患者中明显高于慢性肝病患者(24/61(39.3%))。v62/531 (11.7%);p < 0.001)。CLD患者与急性加重CLD患者基因型B的频率无差异(62/531(11.7%))。v4/19 (21.1%);NS)。基因B型在FH患者中比AH患者中更常见(10/16 (62.5%))v14/45 (31.3%);p = 0.027)。
HBV基因型前核区(nt1896)突变
在对69例HBV序列进行调查的患者中，5例携带A基因型病毒，27例携带B基因型病毒，37例携带c基因型病毒。每个基因型的增强子II、核心启动子和前核区域的核苷酸序列如图1所示。关于前核区突变，A1896患者数量见表3。A1896在FH患者中比AH患者中更常见(p<0.001)。基因型B和C的A1896患者的比例相当(11/27 (40.7%)v10/37 (32.3%);NS)。在FH患者中，含A1896和不含A1896的HBV基因型A、B、C分布分别为0、7、4和1、3、0;因此，基因型B患者具有或不具有该突变的百分比具有可比性(7/11 (63.6%)v 3/4 (75%);NS)。因此，基因型B倾向于在FH中占主导地位，与A1896的存在与否无关。携带A基因型的患者没有A1896，尽管A基因型患者的数量非常少。因此，只在基因型B和C之间进行比较。
每个基因型都显示了从nt 1688到nt 1903的核苷酸序列，包括增强子II (nt 1688到1773)、核心启动子(nt 1742到1849)和前核区域(nt 1814到1900)，并与原型序列(基因型A, X70185;基因型B, X97851;基因型C, X04615)。所示HBV基因组核苷酸序列将出现在DDBJ/EMBL/Genbank核苷酸序列数据库中，登录号为AB090170-AB090230和AB099497-AB099504。
不同HBV基因型的核心启动子区(nt 1762和1764/nt 1753和1754)的突变
我们将我们的核心启动子突变数据与先前报道的HBV序列进行了比较。将nt 1762和1764以及nt 1753和1754与各自的原型序列进行比较时，发现了突变。这些都位于原型序列核心启动子区AT丰富的区域。T1762和A1764患者数量见表4。在FH患者和AH患者之间，这些突变的频率没有差异(5/15(33.3%))。v7/37 (18.9%);NS)。T1762和A1764在基因型C患者中出现的频率高于基因型B患者(16/37(43.2%))。v3/27 (11.1%);p = 0.005)。
C/A/G 1753和/或C/G1754患者数量见表5。这些突变在FH患者中比在AH患者中更常见(7/15 (46.7%))v4/37 (10.8%);p = 0.004)。基因型B和C突变的患者比例相当(9/27(33.3%)。v9/37 (18.9%);NS)。在FH患者中，伴有和不伴有这些突变的HBV基因型A、B、C分布分别为1、4、2和0、6、2;因此，基因型B患者具有或不具有这些突变的百分比具有可比性(4/7(57.1%))。v6/8 (75.0%);NS)。因此，基因型B倾向于在FH中占主导地位，而不依赖于这些突变的存在或不存在。
讨论
我们的结果显示，HBV基因型B和C分别存在于约40%和50%的急性肝病患者中。相比之下，86%的CLD患者和68.4%的CLD急性加重患者中发现了C基因型，这表明乙型肝炎病毒基因型在急性肝病中的分布高于慢性肝病中的分布。有趣的是，基因型B在FH患者中的分布高于AH患者，这表明基因型B与更严重的急性肝病有更强的相关性。
急性乙型肝炎被认为是水平传播的。因此，我们的结果可能反映了HBV基因型在一般人群中的分布。HBV基因型在急性肝病患者中的分布表明，基因型B的个体在一般人群中更普遍，也就是说，HBV基因型B在一般人群中的患病率可能高于慢性肝病患者。不借等报道乙肝e抗原抗体阳性的无症状携带者基因型B的发生率(43.2%)高于乙肝e抗原抗体阳性的肝细胞癌患者(5.9%)，尽管这些作者没有比较基因型B和C在慢性肝病中的患病率。35基因型B在急性肝病中分布较高的另一个原因可能是，与亚临床感染相比，基因型B患者的临床HBV感染比例可能高于基因型c患者等报道称，泰国儿童临床和亚临床HBV感染的比例为1:30，尽管他们没有比较HBV基因型之间的比例。36从我们的结果显示基因B型在FH患者中比AH更普遍，我们推测HBV基因B型可能比基因C型引起更多的肝损伤。
目前，我们不知道为什么基因B型病毒可能比基因C型病毒造成更多的肝损伤。由于HBV不是一种细胞毒性病毒，肝细胞死亡是由宿主对病毒感染的免疫反应引起的。因此，这些病毒复制自身的能力，和/或它们与肝细胞HLA I类分子(肽特异性CTL反应的目标)结合的氨基酸序列的差异可能起作用。37 -43基因型B病毒可能具有强结合HLA I类分子的基序，从而激活更强的免疫反应。为了更直接地解决这一问题，需要对FH中的HBV进行全基因组序列分析。
在我们目前的研究中，大多数FH患者被发现有A1896前核终止密码子突变，这证实了我们之前的报道，大多数日本致命FH或致命急性加重的CLD患者都有携带A1896的HBV。16有趣的是，包括FH患者在内的5名基因型A患者中均未发现前核终止密码子突变。据推测，A1896可能不会发生在HBV基因型A (T为1858)中，因为它在稳定包封序列的茎环结构中起作用。44与日本人群中较高的基因型B和C相比，欧洲和美国的主要HBV基因型是基因型A和d。因此，日本和美国FH患者A1896突变的频率需要根据HBV基因型进行检查。
Orito等报告显示，T1762和A1764在日本C型CLD患者中比B型CLD患者中更常见。12我们的结果表明，这种倾向也存在于急性肝病患者中。为什么T1762和A1764在基因型B的病毒中较少被发现还不清楚。
我们的数据还显示，与AH患者相比，在nt 1753和1754的FH患者中发现病毒突变的频率更高。据报道，nt 1753的T到C/A/G突变与CLD的进展密切相关。45这些突变在核心启动子富含AT的区域被发现，因此可能改变转录因子与核心启动子区域的结合效率，以及前核和核心信息的产生。
总之，我们发现，在日本千叶地区的队列患者中，乙型肝炎病毒基因型在急性肝病患者中比在慢性肝病患者中更频繁发生，在FH患者中比在AH患者中更频繁发生。在这些患者中，病毒基因型以及核心启动子和前核区域的突变可能与更严重的肝损伤有关。解释这些关联的分子机制仍有待研究。
致谢
我们感谢千叶大学医学研究生院公共卫生系的M岛渚博士就本研究中进行的统计分析提出的友好建议。