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摘要
背景和目的:一部分复发性慢性肝炎的肝移植患者对干扰素加利巴韦林联合治疗有持续的病毒学应答。然而，在丙型肝炎复发患者中，抗病毒治疗对丙型肝炎病毒(HCV) RNA清除的长期益处仍然未知。这项研究检查了对抗病毒治疗有持续病毒学反应的复发性慢性肝炎移植患者的长期生化、病毒学和组织学结果。
患者和方法:54例复发型丙肝患者接受抗病毒治疗，包括联合诱导治疗(干扰素(IFN) +利巴韦林)6个月，利巴韦林维持治疗12个月。在抗病毒治疗结束后，随访了14例复发性慢性肝炎并对抗病毒治疗产生持续病毒学应答的患者3年。在观察期间，每三个月评估血清丙氨酸氨基转移酶。在随访期间，每6个月评估一次聚合酶链反应检测的血清丙型肝炎RNA，每年例行进行协议活检。采用诺德尔评分对同种异体移植物肝炎进行半定量组织病理学评估，并通过聚合酶链反应对冷冻移植物组织样本进行HCV检测。
结果:抗病毒治疗结束时，持续缓解率为26%。治疗结束3年后，13/14(93%)患者达到完全缓解(血清丙氨酸转氨酶水平正常，血清HCV RNA未检测到)。抗病毒治疗平均3年前后肝脏组织学结果的比较显示，12/14(86%)患者有明显改善。5/14例(36%)患者的最后一次活检显示组织学正常或接近正常。3年随访后，治疗前Knodell总分为3.2分(范围1-8)，8.3分(范围5-12)(p=0.001)。所有14例患者在治疗前均可检测到移植物HCV RNA, 13/14例(93%)患者在随访结束时未检测到。
结论:在由利巴韦林和干扰素诱导产生生化和病毒学反应的患者中，93%的患者在停止治疗后至少3年仍保持完全缓解。这种长期的应答与肝内无检测到的丙型肝炎RNA和显著的组织学改善有关。
- 丙型肝炎病毒
- 原位肝移植
- ALT,丙氨酸转氨酶
- 聚合酶链式反应
- DNA b-DNA,支
- 干扰素,干扰素
来自Altmetric.com的统计
在西欧和美国，由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝硬化是目前原位肝移植(OLT)最常见的适应证。1 -3.移植物的疾病被认为是一个严重的问题。4在缺乏有效预防的情况下，大约95%的患者在OLT后血清中检测到HCV。5 -7因为病毒仍然存在，新的移植物有复发疾病的风险。移植后疾病的自发缓解似乎很罕见，据报道，在OLT后高达62%的患者中，丙型肝炎的临床复发可导致进行性肝功能衰竭、肝硬化、8，9和死亡。10目前，联合治疗是唯一一种在根除病毒、正常化生化参数和改善组织学肝损伤方面显示出疗效的治疗方法。11，12然而，在HCV复发的移植患者中诱导长期生化和组织学缓解的最佳治疗方法仍然是一个挑战。事实上，关于组织学结果的信息很少，关于联合治疗在清除HCV和改善组织学方面的长期益处的问题仍有待回答。
为了解决这个问题，我们评估了14例移植上的HCV慢性肝炎患者的长期生化、病毒学和组织学结果，这些患者在干扰素(IFN)和利巴韦林联合治疗后有持续的病毒学应答。
患者和方法
研究人群
自1993年以来，在我们中心接受肝移植治疗的丙型肝炎肝硬化患者在移植后接受早期抗病毒治疗，如果他们符合以下标准:(1)肝移植后存活时间超过6个月;(2)移植物活检中存在慢性肝炎;(3)血清HCV-RNA阳性;(4)丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高大于正常值的1.5倍。在移植后经组织学证实复发型丙肝的肝受体中，免疫抑制没有调整。
在1992年至1995年在我中心开始联合治疗的54例移植后复发丙型肝炎患者中，14例(26%)在治疗后持续缓解的患者纳入本研究。从肝移植到开始治疗的平均时间为13个月(范围8-24)。持续反应定义为:(1)治疗结束后的前6个月，每个月血清ALT均严格正常;(2)联合治疗结束后6个月血清HCV RNA检测阴性。14例患者均在治疗结束后随访3年。
所有患者都接受了相同的治疗，包括两个阶段:IFN-α2b(内含子A;先灵公司，Kenilworth, New Jersey, USA)皮下注射，每周三次，剂量为3mu，同时口服利巴韦林(rebtol;先灵(Schering Inc .) 1000毫克，每日分两次服用，维持利巴韦林单药治疗12个月。在治疗的维持期，利巴韦林的剂量为8例患者每日800 mg, 6例患者每日600 mg。所有患者在治疗前三个月的活检显示移植物上有慢性肝炎;平均诺德尔总分为8.3分(范围5-12)。所有患者血清谷丙转氨酶水平超过正常上限1.5倍至少3个月，所有患者乙型肝炎表面抗原均为阴性。
使用的免疫抑制方案是常规的强的松龙5mg /天和环孢素双联治疗(诺华制药;Rueil-Malmaison，法国)的10例患者。只有4名患者接受了相同剂量的他克莫司(Fusisawa, Nanterre, France)和泼尼松龙。除了调整环孢素和他克莫司的剂量，使药物水平保持在治疗范围内(环孢素全血水平150-200 μg/l;他克莫司全血水平5 - 15ng /ml)。在移植后经组织学证实复发型丙肝的肝受体中，免疫抑制没有调整。
跟进
随访包括每3个月进行临床评估，至少每3个月测定血清谷丙转氨酶水平，每6个月用聚合酶链式反应(PCR)检测血清HCV RNA。
血清丙肝病毒核糖核酸
如前所述，定性的HCV RNA通过PCR检测，引物来自5 '非编码区。13该方法灵敏度下限为103.拷贝/毫升。我们检测了所有14名患者血清标本中HCV RNA的存在，这些标本在停药后6个月冷冻收集，然后在整个随访期间每6个月收集一次。所有血清样本采用Amplicor HCV 2.0版本(检测下限100拷贝/ml)进行HCV RNA回顾性检测。
丙肝病毒定量
在随访期间，采用定量分支DNA (bDNA)扩增试验(Quantiplex HCV 2;0;Chiron诊断公司，Emeryville, California, USA)用于持续检测到HCV RNA水平的患者。该方法灵敏度下限为0.2×106病毒等价物/毫升。
在治疗前或随访期间，移植标本中HCV RNA未定量。
HCV基因型和血清型
对13例有预处理血清样本的患者进行HCV基因分型。基因分型采用反向杂交试验(LiPA;InGeN, Rungis，法国)PCR扩增后。采用Simmonds分类法。14确定了以下基因型:1b (n=12)， 1a (n=1)和3a (n=1)。
肝脏组织学研究
在所有14例患者中，最后一次治疗后活检至少在抗病毒治疗结束3个月后进行，并每年重复。肝功能检查异常时，根据临床需要进行额外的肝活检。活检标本用苏木精和伊红染色。另外两种染色(伊红天狼星红，马松三色)用于纤维化分期。在治疗结束和随访期间获得的活检标本根据Knodell和同事的评分系统评估纤维化(0-4分)和活动性(0-18分)。15每位患者的肝活检标本由对HCV RNA状态一无所知的有经验的肝移植病理学家进行评估。对于活检是在治疗前还是治疗后，病理学家并没有盲目。治疗结束后，随访期间进行了59次移植物活检，平均每个患者获得4.2个活检标本(范围3-6)。组织学随访时间为治疗结束后3年。复发性肝炎的诊断基于存在门静脉、门静脉周围和小叶炎症，伴有小叶嗜酸体和/或小叶肝细胞溶解，所有这些都没有内皮炎。Knodell评分包括四个项目(门静脉周围坏死伴或不伴桥性坏死，小叶内变性和局灶性坏死，门静脉炎症和纤维化)。15如果总组织学评分<6分，复发性慢性丙型肝炎被定义为轻度，如果评分为6 - 9分，则为中度，如果评分为>9分，则为重度。通过比较预处理活检标本与治疗后最后一次活检标本，评估组织学改善。如果治疗后标本的组织学总分至少低2分或两个标本的组织学总分相同，则组织学改善定义为改善，如果治疗后标本的组织学总分更高则定义为恶化。
贪污丙肝病毒核糖核酸
14例患者在治疗结束时收集移植组织标本，并在每次活检时进行随访。只有1例患者在随访结束时无法检测。所有组织样本立即冷冻在液氮中，保存在−80°C。用引物从5 '非编码区PCR检测HCV RNA定性。13该方法的灵敏度下限为500拷贝/毫升。
统计分析
结果表示为平均值(范围)(最小值和最大值)。用Wilcoxon符号秩检验比较预处理值和处理后值。P值小于0.05被认为有统计学意义。
结果
14例持续缓解患者的特征见表1。研究开始时，共有10名男性和4名女性，平均年龄为50.9岁。所有患者在抗病毒治疗结束后随访3年。在54名接受治疗的患者中，抗病毒治疗的总副作用发生率为36%。最常报告的不良事件包括无力和贫血，占副作用的82%。6名患者(11%)因贫血停止利巴韦林治疗。1例患者在停用干扰素12个月后出现慢性排斥反应。血小板减少和白细胞减少也被检测出来，分别代表了3%和4%的副作用。
临床结果
随访结束时，14例患者均存活。治疗前有疲劳症状的14例患者中有7例(50%)表示，治疗后疲劳症状消失。14例患者中有3例因免疫抑制治疗出现严重副作用:1例在随访第二年出现巨细胞病毒疾病，但没有肝炎。在治疗前患有严重慢性肝炎的3例患者中，没有一例出现肝硬化。唯一一位在治疗前有肝硬化的移植物患者在没有失代偿的情况下保持稳定。随访期间，该患者未发生肝细胞癌，超声检查每6个月进行一次。随访期间，移植组织活检未发现急性或慢性排斥反应。
血清丙肝病毒核糖核酸
根据定义，在抗病毒治疗结束6个月后，没有患者血清中检测到HCV RNA。在长期随访期间，14例患者中13例(93%)血清HCV RNA持续未检测到。1例患者在治疗后7个月出现晚期复发，血清HCV RNA再次出现，在抗病毒治疗结束后22个月，血清ALT水平略有升高(正常上限1.5倍)。该复发者是研究开始时移植血管上HCV RNA阳性的唯一患者。
肝脏丙肝病毒核糖核酸
治疗前，所有14例患者的移植物标本中均检出HCV RNA。随访3年后，13/14(93%)患者移植物上HCV RNA呈阴性。1例血清HCV RNA阴性患者在移植体上HCV RNA阳性。该患者在治疗结束7个月后血清HCV RNA呈阳性，在停用利巴韦林单药治疗22个月后出现生化和组织学复发。此时，bDNA检测血清HCV RNA水平为22 Meq/ml。
肝脏组织学研究
治疗前，移植活检显示，4例(29%)慢性肝炎为轻度，7例(50%)为中度，3例(21%)为重度。
14例患者在治疗结束3年后进行了最后一次治疗后肝活检，对治疗前和治疗后的移植物活检标本进行了比较。对活检标本的分析显示，所有的改善都是在治疗结束时得到的，在治疗后的3年时间里，Knodell评分保持相对稳定(图1)。纤维化评分未见明显变化(图2)。治疗前，这14例患者的Knodell总分为8.3(范围5-12)。最后一次异体移植活检是在治疗后3年进行的，显示诺德尔平均总评分为3.2(范围1 - 8)(p=0.001)。14例患者中有5例(36%)组织学检查正常或接近正常(>2分)，4例(29%)患有轻度慢性肝炎，4例(29%)患有中度慢性丙型肝炎，1例(6%)患有严重慢性肝炎。比较预处理活检和最后一次活检标本的组织学评分，11/14例(79%)患者的>值有所改善(降低2)，只有1例(7%)患者没有变化，2例(14%)患者恶化。
治疗前、治疗结束时和抗病毒治疗后1-3年的Knodell总分。在治疗结束后的随访中，每年进行移植组织活检。
纤维化Knodell评分在治疗前，治疗结束时，抗病毒治疗1-3年后。在治疗结束后的随访中，每年进行移植组织活检。
讨论
治疗OLT后复发性慢性丙型肝炎的主要目的是防止进展为肝硬化，从而防止移植物的丢失。IFN-α和利巴韦林联合使用是有效的，在25%的患者中实现了持续的病毒学应答。12然而，评估长期效果以确定治疗是否确实改变了OLT后HCV感染的自然史已变得很重要。
我们描述了14例肝移植患者的病毒学和组织学过程，这些患者在抗病毒治疗结束时血清HCV RNA呈阴性。在治疗后的长时间随访期间，93%的纳入患者ALT水平持续正常，HCV RNA阴性。在这些患者中，血清和移植物中HCV RNA缺失，治疗后血清ALT水平恢复正常，组织学明显改善，很可能表明慢性HCV感染消除，随后疾病进展中断，移植物进一步复发或发展为肝硬化的风险较低。在非免疫功能低下的慢性肝炎患者中，以往的研究16日,17显示了类似的结果，但直到现在，在肝移植人群中没有类似的数据报道。为了证实这些结果，需要招募更多患者进行进一步的研究。
本研究以ALT归一化和阴性HCV RNA为终点。事实上，持续ALT正常化和HCV RNA阳性的患者的自然过程尚不清楚;有时可能发生晚期复发。此外，在移植活检标本中，ALT活性持续正常的慢性HCV病毒血症可能表现为慢性肝炎。使用这些标准，在联合治疗停止3年后，我们没有观察到93%的患者出现生化或病毒学复发(3/13持续完全缓解的患者在撰写本文时已随访超过4年)。尽管可检测到的血清HCV RNA持续消失可能不足以排除持续的低水平病毒感染，但在13/14 HCV RNA阴性并随访3年的患者中，正常的血清ALT水平表明病毒复制的持续抑制。因此，在治疗后6个月的随访期间，在血清HCV RNA检测缺失的情况下，正常的血清ALT水平似乎是持续缓解的可靠指标。
虽然4例患者在抗病毒治疗前出现严重慢性丙型肝炎，但随访期间未出现新的肝硬化病例;这表明在利巴韦林单药治疗一年后的联合治疗对HCV慢性肝炎移植患者有长期的益处。在我们的研究中，一名移植肝硬变患者出现了持续的病毒学应答，证实了即使在肝硬变患者中也可能存在长期应答。此外，该患者未发生失代偿和肝细胞癌。然而，在我们的研究中，肝硬化患者的数量太少，无法得出抗病毒治疗对移植物衰竭和肝细胞癌风险的影响的任何结论。
停药后3年随访，5/14(36%)患者组织学检查正常或接近正常。治疗结束后组织学改善，此后HAI评分保持稳定(图1)。这种改善是由于炎症评分降低，纤维化评分基本不变，如图2所示。然而，尽管血清ALT值正常，血清和肝脏HCV RNA检测结果为阴性，但有一名患者存在严重的无慢性排斥症状的肝脏炎症，持续了长达3年之久。对这一结果可以有两种解释。首先，炎症浸润的持续存在可能是由于对HCV的移植物细胞免疫反应在一定程度上持续存在，这种反应可能需要很多年才能消失。其次，该技术可能对检测低水平病毒感染不够敏感，不能完全排除移植物中持续低水平HCV RNA复制的解释。对于该病例的另一种假设是，在HCV- rna阴性数年后，活检炎症与HCV无关，可能是由于其他机制，如药物诱导的问题，新生自身免疫性肝炎，或不太可能是非典型排斥反应。
在13/14的患者中没有检测到移植物HCV- rna，这与抗病毒治疗可以清除HCV感染的观点一致，即使在免疫功能低下的患者中。这些结果表明，在抗病毒治疗结束时移植物HCV RNA的持续存在是复发的最重要因素。这与非移植患者的结果相似。18，19由于本研究中使用的技术不够灵敏，因此不能排除肝脏中存在低水平的HCV RNA，而PCR检测不到。然而，在我们的研究中，13例未移植HCV RNA的患者在治疗结束和随访期间均未复发。
在本研究中观察到的唯一一例晚期复发病例中，治疗结束时血清HCV RNA为阴性。这不是PCR的假阳性结果，因为血清也用PCR (Amplicor)检测，有相同的结果。这种情况可能表明，治疗不能完全抑制病毒复制，复制能力细胞(主要是肝细胞)的复制率仍然很低。在这个病例中另一个有趣的发现是在15个月没有肝炎的情况下检测到血清和移植物HCV RNA。这种晚期复发的观察提出了HCV对肝细胞的细胞致病性的问题，并提示除了直接细胞毒性外，HCV诱导的移植物损伤可能与其他机制有关。
总之，这是第一个在移植环境中表明在早期治疗后HCV复制可以得到持续抑制，患者可能治愈疾病的研究。复发型慢性丙型肝炎患者在治疗结束时缺乏可检测到的移植物HCV RNA似乎是长期生化和病毒学反应的可靠指标。此外，可检测的病毒血症的消失导致显著的组织学改善。