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摘要
背景:caspase激活募集结构域15/核苷酸寡聚结构域2 (CARD15/NOD2)基因的变异与克罗恩病(CD)的易感性有关。
目的:我们的目的是评估芬兰炎症性肠病(IBD)患者中CARD15变异R702W、G908R和1007fs的等位基因频率，并寻找CARD15变异与家族型IBD或复杂型CD的发生之间的可能联系。
患者和方法:我们调查了198名散发的CD患者，46名家族性CD的先证者，27名来自混合IBD家族的CD先证者，99名不相关的溃疡性结肠炎(UC)患者，以及300名CARD15基因变异R702W、G908R和1007fs的发生对照个体。
结果:在乳糜泻患者中，这些多态性的罕见变异的等位基因频率分别为3.3%、0.6%和4.8%(共8.7%)，而在健康对照组中相应的频率分别为1.8%、0%和1.7%(共3.5%)(8.7%)v3.5%;p < 0.01)。UC患者的等位基因频率与对照组相当。所有乳糜泻患者1007fs多态性变异等位基因的频率显著高于对照组(4.8%)v1.7%;p<0.01)，而CD组与UC组间等位基因频率差异无统计学意义。家族性乳糜泻的1007fs等位基因频率高于非家族性乳糜泻(10.9%)v3.5%;p < 0.01)。CD患者、UC患者和对照组之间R702W和G908R多态性的等位基因频率无显著差异。我们发现15.5%的乳糜泻患者、9.1%的UC患者和6.7%的对照组携带至少一种CARD15变体。在至少携带三种NOD2变异中的一种的乳糜泻患者中，回肠比非携带者乳糜泻患者更容易受到影响(90%)v73%;P <0.05)，狭窄或穿透性疾病发生率高于非携带者(88%)v56%;P <0.01)，对肠道手术的需求增加。
结论:在基因同质的芬兰人中NOD2基因变异的频率低于其他人群。1007fs变异与乳糜泻相关。CARD15变异的发生预示着回肠位置以及乳糜泻的狭窄和穿透形式。
- CARD15基因
- 疾病表型
- 克罗恩氏病
- 凋亡蛋白酶激活因子1
- caspase激活招募域
- CD,克罗恩病
- 炎症性肠病
- 有限合伙人,脂多糖
- LRR，富含亮氨酸的重复
- NFκB，核因子κB
- NOD，核苷酸寡聚结构域
- 聚合酶链式反应
- 加州大学,溃疡性结肠炎
来自Altmetric.com的统计
- 凋亡蛋白酶激活因子1
- caspase激活招募域
- CD,克罗恩病
- 炎症性肠病
- 有限合伙人,脂多糖
- LRR，富含亮氨酸的重复
- NFκB，核因子κB
- NOD，核苷酸寡聚结构域
- 聚合酶链式反应
- 加州大学,溃疡性结肠炎
克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是慢性炎症性肠病(IBD)中比较常见的主要形式。遗传和环境因素都可能诱发乳糜泻和UC。在芬兰人中，最近在15.6%的乳糜泻患者和13.8%的UC患者中发现了受影响的一级亲属，这一数据与欧洲其他地方报道的数据相当。1在不同人群中进行的一些连锁研究证实了乳糜泻与16号染色体的遗传联系。2 -10Hugot和他的同事们11和Ogura及其同事12已经独立解开了CD相关核苷酸寡聚结构域2 (NOD2)基因，该基因位于与CD连接最强的16q12染色体上。NOD2最近被重新命名为caspase激活募集结构域15 (CARD15)，似乎属于NOD1/凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1)相关蛋白家族，该蛋白调节细胞凋亡，并激活核因子κB (NfκB)。13日,14与NOD1和Apaf-1不同，CARD15主要在单核细胞中表达，而在淋巴细胞、正常结肠和小肠中不表达。CARD15的确切功能尚不清楚，但它似乎在革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)的胞内识别和随后的NFκB活化中发挥作用。15
在CARD15基因中已经发现了超过60个序列变异，其中3个主要变异(R702W, G908R和1007fs)被认为与CD的易感性有关。11，12，16 -19其中一个(1007fs)，显示出与乳糜泻最一致的关联，也被报道会导致表型后果。插入一个额外的胞嘧啶分子引起翻译移码，在CARD15的第10个富含亮氨酸重复序列(LRR)中产生一个过早停止密码子，这种改变已被证明可以降低LPS对NFκB的激活。12
本研究旨在评估芬兰IBD患者中CARD15变异R702W、G908R和1007fs的发生情况。我们的特别目标是寻找CARD15变异的杂合性或纯合性、家族型IBD和复杂型CD之间的联系。
材料和方法
参与者
赫尔辛基大学医院和玛丽亚医院的研究人员从首都赫尔辛基招募了连续患有家族性和散发性IBD的芬兰患者。此外，如前所述，来自图尔库、坦佩雷、库奥皮奥和奥卢大学医院的合作者招募了IBD家庭。1，20.患者及其受影响的一级亲属完成了一份关于其病史和疾病细节以及受影响和未受影响亲属数量的问卷。家族性乳糜泻患者至少有一个一级亲属患有IBD，而散发性乳糜泻患者则没有。在纯家族性乳糜泻中，同一家族的所有患者都患有乳糜泻。在混合家族中，先发者患有乳糜泻，且至少有一个一级亲属患有UC或不确定性结肠炎。IBD患者病程的详细信息来自患者记录。标准的内窥镜和组织学标准被用来建立诊断。21维也纳分级用于对CD分级。22对于疾病的位置，我们采用疾病的最大程度根据x-射线和内窥镜检查协议以及手术报告。如果在疾病过程中的任何时候存在腹腔内或肛周瘘，即使同时存在狭窄，该疾病的行为也被归类为穿透性。
我们总共研究了198例散发性乳糜泻患者的DNA样本，46例家族性乳糜泻的先证者，27例不相关的来自混合IBD家族的乳糜泻先证者，以及99例随机选择的家族性和散发性UC的不相关患者。获得所有患者的知情书面同意。通过芬兰红十字会血液服务中心(芬兰赫尔辛基)获得了300名健康献血者的DNA样本。从这些献血者那里获得的血液使用许可排除了任何临床数据的收集。
这项研究得到了每个参与中心的伦理审查委员会的批准。
CARD15变体分析
从静脉血样本中提取基因组DNA的标准程序使用蛋白酶K消化，然后苯酚/氯仿提取。每个CARD15变体的DNA样本采用聚合酶链式反应(PCR)进行初步扩增，随后PCR产物采用限制性内切酶切割和凝胶电泳在12%聚丙烯酰胺(R702W)或3-4%琼脂糖(G908R和1007fs)上进行分析。
R702W突变的正向引物为5 ' - agatcacagcagccttcctg -3 '，反向引物为5 ' - cacgctcttggcctaccc -3 '。PCR产物(185 bp大小)在37℃下用2 U MspI消化16小时，得到以下片段:R702R纯合子20、35、54和76 bp;R702W杂合子20、35、54、76、130 bp;W702W纯合子分别为20、35和130 bp。
G908R突变检测采用5 ' - ctcttttggccttcagattctg -3 '作为正向引物，5 ' - cagctcctccctcttccactt -3 '作为反向引物。引物PCR产物大小为163 bp。Hha I在37℃、2 U的条件下消化16小时后，得到以下片段:G908G纯合子中163 bp;G908R杂合子为27、136和163;R908R纯合子为27和136 bp。
为了检测1007fs突变，我们使用正向引物5 ' - GGCAGAAGCCCTCCTGCAGGGCC-3 '和反向引物5 ' - CCTCAAAATTCTGCCATTCC-3 '进行PCR，得到了大小为151 bp的扩增片段。37℃，2 U ApaI消化16小时后，得到如下面板(亮氨酸代表野生型等位基因中的密码子1007):Leu1007Leu纯合子151 bp;Leu1007Pro杂合子20、131、151 bp;Pro1007Pro纯合子20和131 bp。
统计分析
患者组与对照组的频率用Pearson χ进行比较2统计学或费雪精确判别法。学生的t未配对样本检验用于比较两组患者之间的连续数据。Bonferroni的修正被用来考虑测试的假设的数量。
结果
患者和对照组的等位基因频率
在198名不相关的散发性乳糜泻患者、46名不相关的家族性乳糜泻先证者、27名来自混合IBD家族的不相关先证者、99名随机选择的家族性和散发性UC患者和300名健康献血者中检测了CARD15基因变异R702W、G908R和1007fs。CARD15等位基因和基因型频率在表1中总结。家族性乳糜泻1007fs突变的等位基因频率为10.9%，散发性乳糜泻为3.5%，混合家庭乳糜泻为3.7%，UC患者为3.0%，对照组为1.7%。1007fs变异的等位基因频率在所有乳糜泻患者中显著高于对照组(4.8%)v1.7%;p<0.01)，家族性乳糜泻的相应频率高于散发性乳糜泻(10.9%)v3.5%;p < 0.01)。在所有患者类别和对照组中，R702W和G908R变异的频率都相对较低，组间无显著差异(表1):15.5%的CD患者、9.1%的UC患者和6.7%的对照组至少携带一种CARD15多态性。CD组与对照组的等位基因频率差异有统计学意义(p<0.01)。
198例散发性乳糜泻患者中1例，46例家族性乳糜泻患者中2例为1007fs纯合子突变。携带这三种变异的其他乳糜泻患者也是杂合子的(表1)。在99名UC患者中，共有9名(9.1%)是三种CARD15变异中的一种的杂合子携带者(表1)。乳糜泻患者中有两个与R702W和G908R变异相关的联合杂合子(一个散发型乳糜泻和一个家族性乳糜泻病例)，有一个与R702W和100fs多态性相关的复合杂合子。
CARD15等位基因与临床表型
当将罕见CARD15等位基因杂合或纯合的CD患者(n=42)与野生型CARD15等位基因纯合的CD患者(n=229)进行比较时，没有发现显著差异(表2)。相比之下，前者的中位疾病持续时间大约是后者的两倍(表2)。至少有一种罕见CARD15变异的乳糜泻患者回肠更容易受到影响(90%)v73%;P <0.05)和更多的是狭窄或穿透形式的疾病(88%)v56%;p<0.01)与非携带者CD患者相比(表3)。此外，CARD15变异等位基因携带者比非携带者接受肠外科手术的频率更高(67%)v46%;p<0.05)(表2)。与非携带者相比，携带三种CARD15变异的CD患者在使用5-ASA、甲硝唑、类固醇或免疫抑制剂(硫唑嘌呤、甲氨蝶呤或环孢素)方面无显著差异(表3)。
当UC患者被分为CARD15基因多态性的携带者和非携带者时，在平均年龄、诊断时的中位年龄、中位病程、是否需要药物治疗或是否需要手术(未显示)方面没有观察到显著差异。在CD患者中，48%为吸烟者，17%为前吸烟者或偶尔吸烟者，UC患者的相应频率分别为13%和35% (p<0.01)。
患者及其患病兄弟姐妹的特征为1007fs纯合子
CARD15 1007fs突变纯合子的两名家族性乳糜泻患者都有一个患病的兄弟姐妹也被发现1007fs多态性纯合子。作为一个组，这四名纯合子1007fs的乳糜泻患者具有一些表型特征:诊断时年龄为20岁或更小，只有回肠受影响，乳糜泻呈狭窄过程。1007fs等位基因纯合子的单例散发性乳糜泻患者与这两对兄弟姐妹的不同之处是，除了回肠，右结肠也受影响。他的疾病在13岁时被诊断出来，狭窄形成使疾病复杂化，患者接受了三次肠道切除。
讨论
自2001年以来，一些独立的研究表明，NOD2/CARD15基因变异在很大程度上导致了克罗恩病的风险。11，12，16 -19插入突变1007fs的等位基因频率在CD患者中为8-16%，而在美国的对照组中仅为2-4%，预计会导致CARD15蛋白的截断12或欧洲。11，16 -18另外两个突变(R702W和G908R)也显示出与乳糜泻风险的显著关系，11，17 -19而CARD15基因变异与UC风险之间无显著相关性。Hampe等估计1007fs杂合子发生CD的相对风险为2.6，纯合子为42.6。16卡斯伯特和他的同事们18据报道，三种CARD15基因变异的杂合子个体的相对乳糜泻风险为3.0，纯合子或复合杂合子的相对乳糜泻风险为23.4。根据Hugot等，相对危险度分别为3、38、44。11
我们的家族性乳糜泻资料有限，因为整个人口约有500万居民，其次，没有全国性的IBD登记，这使得招募患者更加困难。在我们的材料中，与许多其他西方人群相比，调查的所有CARD15变异的频率都很低。11，12，16 -19最近,井上等据报道，在日本乳糜泻患者中缺乏常见的NOD2变体。23我们的数据证实了CARD15 1007fs变异等位基因与CD之间的相关性，尽管CD组和UC组之间的等位基因频率没有差异。这种关联在芬兰人群中可能没有在迄今为止研究的其他高加索人群中那么强。另外两种CARD15基因变异(R702W和G908R)在CD和UC患者或对照组之间的等位基因频率无显著差异。与散发病例相比，CARD15 1007fs突变在家族疾病先证者中更为普遍。Hugot的研究等和Ogura等，显示CARD15突变与乳糜泻之间的关联，也包括家族病例。11，12正如井上观察到的那样等在芬兰，CARD15基因可能有其他致病多态性，或完全其他基因易患乳糜泻。在芬兰人中寻找其他临床显著的CARD15变异是有必要的。
芬兰人来自一个相对孤立的小的奠基人群体，在这个群体中，人口增长迅速，繁殖单位小。24对芬兰人口进行了广泛和成功的研究，以研究几种罕见的单基因疾病。25一些更常见的疾病，如家族性高胆固醇血症或长QT综合征，是由典型的芬兰人基因突变引起的。26日,27最近，在绘制复杂疾病的变异的孤立群体的特性已经被评估。24日,25，28日,29在一个快速增长的种群中，允许随机交配的频率为1%的等位基因的命运被计算机模拟，20代之后，最常见的等位基因的频率为6%，而一些等位基因则丢失了。24这意味着随机遗传漂变对快速增长的小群体的等位基因频率有很强的影响:罕见的等位基因可能会丢失或在异常高的频率下存活。24如果一种疾病基因有几个突变，一些可能已经丢失，而一些主要的突变保留了下来。
我们以前的研究表明，芬兰患者中家族性IBD的比例与其他欧洲人群相当。1在家族性或散发性疾病患者之间未观察到显著的临床差异。1在目前的研究中，三种CARD15变异中的任何一种，特别是1007fs突变的携带者状态，预测了乳糜泻的回肠定位以及乳糜泻并发症的可能性，如狭窄、瘘管和需要手术修改。最近，其他调查人员也报告了类似的发现。16 -19在一些独立的研究中已经报道了在回肠特异性疾病中CARD15突变的频率增加，17 -19和Hampe等还报道了CARD15变异与右结肠疾病的相关性，与左结肠特异性疾病的相关性比较。30.在我们的研究中，罕见的纯合子患者有一种乳糜泻，发病早，病程复杂，这一发现与Lesage和同事的发现惊人地相似19在法国人群中观察到的在本系列中，CARD15变异携带者的中位病程是其他乳糜泻患者的两倍。在表现型-基因型分析中使用维也纳分类，特别是行为，一直受到路易斯的强烈批评等．他们对297名乳糜泻患者进行了25年的随访，确定了其行为和疾病部位，发现乳糜泻的行为在病程中发生了巨大变化，而疾病部位相对稳定。31他们建议在疾病持续时间固定后，对患者进行基因型-表型分析分类;这在目前的系列中是行不通的。在我们的材料中，诊断年龄和CARD15变异携带者状态之间缺乏关联。我们选择使用诊断年龄而不是发病年龄，因为数据是从参与中心的患者记录中回顾性收集的。
CARD15基因产物属于凋亡调节因子Nod1/Apaf-1超家族，主要在单核细胞中表达。14CARD15包含两个N终端caspase激活招募域(CARD)和多个C末端富含亮氨酸重复序列(LRR)。14它参与了NFκB信号通路的激活。14CARD15 1007fs突变导致缺失部分LRRs的截断蛋白，在诱导LPS介导的NFκB激活方面存在缺陷。12NFκB系统已被证实在IBD中被激活。32，33糖皮质激素和磺胺氮嗪都能有效抑制NFκB。在我们的材料中，三种CARD15变异的携带者和非携带者在使用5-ASA或类固醇方面没有显著差异，这两组在使用甲硝唑或免疫抑制剂方面也没有显著差异(表3)。
总之，三个CARD15基因变异(R702W, G908R和1007fs)在芬兰人中的等位基因频率比迄今为止研究的其他人群低。1007fs变异等位基因与CD之间存在关联。在这项针对芬兰乳糜泻患者的回顾性研究中，NOD2基因变异与回肠疾病以及疾病的狭窄和贯通形式相关，而CARD15基因纯合子的乳糜泻患者往往发病早、病程复杂。在CD和UC患者中，三种CARD15变异的携带者与非携带者相比，在使用5-ASA、类固醇、甲硝唑或免疫抑制剂方面没有观察到显著差异。在芬兰人中可能有CARD15变异或基因易患乳糜泻，而不是先前在西方人群中调查的那些。
致谢
我们非常感谢David van Heel博士(英国牛津大学)为NOD2变异分析提供建议和对照DNA样本。讲解员Markus Perola为统计问题提供建议。我们感谢研究参与者和他们的家庭自愿参与这项研究。我们感谢我们的合作者Heikki教授Järvinen(赫尔辛基大学医院)、Heimo Nurmi博士(图尔库大学医院)、Anna- Liisa Karvonen讲解员(坦佩雷)、Risto Julkunen讲解员、Markku Heikkinen博士(Kuopio)和Seppo讲解员Niemelä (Oulu)。我们感谢Tuula sopela - loponen女士提供的出色技术援助。这项研究得到赫尔辛基大学中心医院国家特别基金的资助。